Salzen davon

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue kristalline Modifikationen von N-α- (2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L)-phen ylalanin-4- ethoxycarbonylpiperazid und/oder Salzen davon, welche als pharmazeutische Mittel verwendbar sind, sowie diese neuen kristallinen Modifikationen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen und pharmazeutische Verwendungen.

Die neuen kristallinen Modifikationen der vorliegenden Erfindung, welche von einer Verbindung ausgehen, die unter dem chemischen Namen N-α- (2,4,6-TriisopropylphenylsulfonyI)-3-hydroxyamidino-(L)-phen ylalanin-4- ethoxy-carbonyl-piperazid bekannt ist, sind wirksame Inhibitoren der Serinprotease Urokinase und daher besonders geeignet zur Behandlung von Urokinase-assoziierten Erkrankungen, wie z.B. Tumore und Metastasierung, insbesondere zur oralen Verwendung. Die freie Basenform wird als WX-671 bezeichnet.

Der Plasminogenaktivator vom Urokinase-Typ (uPA) spielt eine Schlüsselrolle bei der Tumorinvasion und Metastasenbildung (Schmitt et al.,

J. Obst. Gyn. 21 (1995), 151-165). uPA wird in den verschiedensten Arten von Tumorzellen exprimiert (Kwaan, Cancer Metastasis Rev. 11 (1992), 291-

311) und bindet an den Tumor-assoziierten uPA-Rezeptor (uPAR), wo die

Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin stattfindet. Plasmin ist in der Lage, verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM), wie

Fibronectin, Laminin und Kollagen Typ IV, abzubauen. Es aktiviert auch einige andere ECM-abbauende Enzyme, insbesondere Matrix-

Metalloproteinasen. Hohe Mengen an Tumor assoziierten uPA korrelieren mit einem höheren Metastasierungsrisiko für Krebspatienten (Harbeck et al., Cancer Research 62 (2002), 4617-4622). Eine Hemmung der

proteolytischen Aktivität von uPA ist daher ein guter Ansatzpunkt für eine anti-metastatische Therapie.

Einige aktive und selektive Urokinase-Inhibitoren sind schon beschrieben. So werden uPA-lnhibitoren des Benzamidin-Typs in EP 1 098 651 , uPA- Inhibitoren des Arylguanidin-Typs in WO 01/96286 und WO 02/14349 offenbart. Ein gemeinsames Merkmal dieser synthetischen Inhibitoren ist ein basischer Rest bestehend aus einer Amidino- oder/und Guanidino-Gruppe.

Die internationale Patentanmeldung WO 03/072559 offenbart WX-671 als Zwischenprodukt, bei der Synthese des Urokinase-Hemmstoffs N-α-(2,4,6- TriisopropylphenylsulfonyO-S-amidino-CLJ-phenylalanin^-ethox ycarbonyl- piperazid. WO 03/072559 offenbart auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung WX-671 als freie Base oder in Form ihrer mit Säuren gebildeten Salze. Spezielle Salze, insbesondere die Hydrogensulfat- und die Sulfatform, sind nicht erwähnt. Ebenfalls nicht beschrieben sind Verfahren zur Kristallisierung. Bei den beschriebenen Verfahren wird die freie Base WX-671 als amorphes Produkt erhalten, welches thermisch leicht instabil und hygroskopisch ist und welches ungeeignete Filtrations- und Trocknungseigenschaften aufweist. Aus diesem Grund ist es zur Herstellung in großem Maßstab nicht geeignet und muss vor allem vor Wärme und Feuchtigkeit geschützt werden.

WO 2004/011449 offenbart ebenfalls Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin-Derivaten, welche auch als Salze, z.B. als Salze von Mineralsäuren oder als Salze von organischen Säuren, vorliegen können. Eine der hergestellten Verbindungen ist WX-671. Auch hier ist kein Hinweis darauf gegeben, dass die offenbarten Verbindungen auch in einer stabilen kristallinen Form erhalten werden können.

PCT/EP2004/005682 offenbart Hydroxyamin- und Hydroxyguanidin- Verbindungen als Urokinase-Hemmstoffe. Die offenbarten Arzneimittel umfassen als Wirkstoff u.a. WX-671 und die Wirkstoffe können als Salze,

z.B. als Hydrochlorid oder Hydrogensulfat oder als Salze von organischen Säuren, vorliegen. Für die dort beanspruchten Arzneimittel wurde eine bessere Bioverfügbarkeit bei oraler Verabreichung geltend gemacht. Auch diese Veröffentlichung offenbart jedoch keine Sulfatsalzverbindung der genannten Urokinase-Hemmstoffe.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung von kristallinen Modifikationen von N-α-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-3- hydroxyamidino-(L)-phenylalanin-4-ethoxycarbonylpiperazid und/oder Salzen davon, welche gegenüber den Verbindungen aus dem Stand der Technik vorteilhafte Eigenschaften aufweisen.

Die vorliegende Erfindung stellt kristalline Modifikationen von N-α-(2,4,6- Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L)-phenylalani n-4-ethoxy-car- bonylpiperazid und/oder Salzen davon bereit.

Gemäß vorliegender Erfindung wurden neue kristalline Modifikationen des oben genannten Urokinase-Inhibitors gefunden, die gegenüber der amorphen Form dieser Verbindung entscheidende Vorteile aufweisen. Die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen besitzen bedeutende Vorteile in der Handhabung, Lagerung und Formulierung.

Überraschenderweise kann die Verbindung N-α-(2,4,6- Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L)-phenylalani n-4-ethoxy-car- bonylpiperazid und/oder Salze davon kristallisiert werden, was bisher nicht möglich war, und ist daher in ihren Eigenschaften den amorphen Verbindungen aus dem Stand der Technik überlegen. So zeichnen sich die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen durch eine sehr geringe Hygroskopie aus. Sie sind außerdem gegen Zersetzung sehr beständig und eignen sich daher auch für eine längere Lagerung. Außerdem weisen die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen verbesserte Filtrations- und Trocknungseigenschaften auf. Darüber hinaus eignen sich die kristallinen

Modifikationen ^• von N-α-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-3-

- A - hydroxyamidino-(L)-phenylalanin-4-ethoxy-carbonylpiperazid und dessen Salzen ideal zur Formulierung in Arzneimittelzusammensetzungen.

Wie hierin verwendet, bedeutet WX-671 die freie Base von N-α-(2,4,6- TriisopropyIphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L)-phenylalani n-4-ethoxy-car- bonylpiperazid. WX-671.1 bezeichnet das Hydrogensulfat der genannten Verbindung und WX-671.2 bezeichnet das Sulfat der genannten Verbindung.

Wie eingangs bereits ausgeführt, sind die erfindungsgemäße Modifikationen von WX-671 und Salzen davon im wesentlichen kristallin. Bisher war es nicht möglich, derartige Hydroxyamidin-Verbindungen in kristalliner Form herzustellen. Auch die im Stand der Technik bereits offenbarten Verbindungen waren nicht kristallisierbar.

Die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen von N-α-(2,4,6- Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L)-phenylalani n-4-ethoxy-car- bonylpiperazid und dessen Salzen umfassen vorzugsweise das Hydrogensulfatsalz (WX-671.1) und das Sulfatsalz (WX-671.2), sowie die freie Base (WX-671).

Die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen können Mischungen der freien Base und der Salze oder auch Mischungen der Salze umfassen. Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße kristalline Modifikation jeweils entweder die freie Base oder das Sulfatsalz oder das Hydrogensulfatsalz als kristalline Modifikation. Besonders bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße kristalline Modifikation Einkristalle der jeweiligen kristallinen Modifikation.

Die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen wurden durch Röntgendiffraktometrie untersucht und weisen vorzugsweise die in Tabelle 3.1 (für das Sulfatsalz WX-671.2), Tabelle 7.1 (für das Hydrogensulfatsalz WX-671.1) und Tabelle 11.1 (für die freie Base) dargestellten Peaks auf. Die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen weisen im Wesentlichen

die in den Figuren 5 (für das Sulfatsalz WX-671.2), 13 (für das Hydrogensulfatsalz WX-671.1) und 19 (für die freie Base) dargestellten Peaks auf.

Wie in den Beispielen unten beschrieben ist, wurden zusätzlich zu den Röntgendiffraktometrie-Analysen auch thermoanalytische Untersuchungen durchgeführt (Differential Scanning Calorimetry, DSC und Thermogravimetrie, TGA). Dabei zeigte sich, dass die kristalline Verbindung des Hydrogensulfatsalzes WX-671.1 sich bei einer Temperatur von etwa 175 °C-195 °C zersetzt, genauer im Bereich ab etwa 185 ⁰ C (bei einer Heizrate von 2 Kmin ^"1 ).

Die erfindungsgemäße kristalline Modifikation von WX-671.2 weist vorzugsweise N-α-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L) - phenylalanin-4-ethoxycarbonylpiperazid und Sulfat-Anionen in einem Molverhältnis von etwa 2:1 auf, wobei dieses Verhältnis in einem Bereich von 1 ,5 bis 2,5:1 variieren kann. Bevorzugt ist ein Verhältnis etwa 1 ,25 bis 2,25:1 , stärker bevorzugt 1 ,1 bis 2,1:1 und am stärksten bevorzugt im Verhältnis von etwa 2:1.

Die kristalline Modifikation von WX-671.2 weist vorzugsweise Einheiten aus jeweils 2 Molekülen N-α-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-3- hydroxyamidino-(L)-phenyIalanin-4-ethoxycarbonylpiperazid und einem Sulfat-Anion auf, wobei in jeder dieser Einheiten die 2 Moleküle N-α-(2,4,6- Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L)-phenylalani n-4-ethoxy- carbonylpiperazid in der gleichen Konformation vorliegen können oder sie können vorzugsweise auch in unterschiedlichen Konformationen vorliegen.

Zusätzlich liegt die kristalline Modifikation von WX-671.2 vorzugsweise als Hydrat, insbesondere als Trihydrat, vor, d.h. dass pro Mol Salz etwa 3 Mol Wasser vorhanden sind. Auch dieses Verhältnis kann natürlich geringen Schwankungen unterworfen sein, d.h. pro Mol Salz können im Durchschnitt zwischen 2,5 und 3,5 Mol Wasser vorhanden sein, vorzugsweise zwischen

2,25 und 3,25, stärker bevorzugt zwischen 2,2 und 3,2, stärker bevorzugt zwischen 2,1 und 3,1.

Das Sulfatsalz von N-α-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino- (L)-phenylalanin-4-ethoxycarbonylpiperazid hat sich, unabhängig von der Kristallinität, als thermodynamisch stabile Verbindung herausgestellt. Daher stellt die vorliegende Erfindung auch die neue Verbindung des N-α-(2,4,6- Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L)-phenylalani n-4- ethoxycarbonylpiperazid-Sulfatsalzes bereit. Auch das nicht kristalline Sulfatsalz WX-671.2 eignet sich wie unten für die kristallinen Modifikationen beschrieben zur Herstellung von Arzneimitteln.

In der kristallinen Modifikation von WX-671.1 sind N-α-(2,4,6- Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L)-phenylalani n-4-ethoxy- carbonylpiperazid und Hydrogensulfat-Anionen vorzugsweise in einem Molverhältnis von 0,5 bis 1 ,5:1, stärker bevorzugt von 0,8 bis 1 ,2:1 , stärker bevorzugt 0,9 bis 1 ,1 :1 , stärker bevorzugt etwa 1 :1 vorhanden.

Eine kristalline Modifikation von WX-671.1 kann auch als Hydrat vorliegen.

Die kristalline Modifikation von WX-671 (freie Base) liegt vorzugsweise nicht als Hydrat vor. Eine Hydratform ist jedoch möglich.

Die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen können gegebenenfalls mit geeigneten pharmazeutischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen zur

Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden. Dabei ist eine

Verabreichung in Kombination mit anderen Wirkstoffen, z.B. anderen

Urokinase-Inhibitoren, wie etwa Antikörpern und/oder Peptiden, aber auch mit Chemotherapeutika und Zytostatika oder/und anderen zytostatischen und zytotoxischen Wirkstoffen möglich.

Die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen können somit in einer geeigneten Arzneimittelformulierung zubereitet werden, beispielsweise als

Tabletten, Dragees, Kapseln, Pastillen, Pulver, Sirup, Suspension, Lösung oder dgl. Bevorzugt ist insbesondere eine Arzneimittelzubereitung für die orale Verabreichung.

Die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen sind zur Bekämpfung von Krankheiten geeignet, die mit einer pathologischen Überexpression von uPA oder/und Urokinase-Plasminogen-Aktivatorrezeptor (uPAR) assoziiert sind. Sie ist beispielsweise in der Lage, hocheffizient das Wachstum oder/und die Ausbreitung maligner Tumoren sowie die Metastasierung von Tumoren zu hemmen. Beispiele hierfür sind Tumorerkrankungen, z.B. Brustkrebs, Lungenkrebs, Blasenkrebs, Magenkrebs, Cervixkrebs, Ovarienkrebs, Nierenkrebs, Prostatakrebs und Weichgewebesarkome, insbesondere mit einer hohen Metastasierungsrate assoziierte Tumore.

Die erfindungsgemäßen Modifikationen können allein oder in Kombination mit anderen physiologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, z.B. mit Radiotherapeutika oder mit zytotoxischen oder/und zytostatischen Mitteln, z.B. Chemotherapeutika, wie etwa cis-Platin, Doxorubicin, 5- Fluoruracil, Taxolderivaten, oder/und sonstigen chemotherapeutischen Agenzien, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe der alkylierenden Agenzien, Antimetaboliten, Antibiotika, Epidophyllotoxine und Vinca- Alkaloide. Ebenfalls möglich ist eine Kombination mit Strahlentherapie oder/und chirurgischen Eingriffen.

Weiterhin sind die erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen auch für andere uPA-assoziierte Erkrankungen wirksam. Beispiele für derartige Erkrankungen sind etwa pulmonärer Bluthochdruck und/oder Herzerkrankungen (z.B. WO 02/00248), Magen- und Darmerkrankungen, wie etwa inflammatorische Darmerkrankungen, prämaligne Colonadenome, entzündliche Erkrankungen, wie etwa septische Arthritis, oder andere Erkrankungen, wie Osteoporose, Cholesteatomie, Haut- und Augenerkrankungen, wie beispielsweise altersbedingte Makuladegeneration (AMD), sowie virale oder bakterielle Infektionen, wobei ausdrücklich auf die

in EP-A-O 691 350, EP-A-1 182 207 und US-Patent 5,712,291 genannten Erkrankungen Bezug genommen wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel, welches eine erfindungsgemäße kristalline Modifikation als Wirkstoff umfasst. Ein solches Arzneimittel kann gegebenenfalls zusätzlich pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Hilfsstoffe umfassen. Die

Arzneimittel können beim Menschen oder Tieren topisch, oral, rektal oder parenteral, z.B. intravenös, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, oder auch sublingual, nasal und/oder inhalativ verabreicht werden. Geeignete

Verabreichungsformen sind z.B. Tabletten, Dragees, Kapseln, Pastillen,

Pellets, Pulver, Suppositorien, Lösungen, Sirup, Emulsionen, Suspensionen,

Liposomen, Inhalationssprays oder transdermale Systeme, wie etwa

Pflaster. Eine besonders bevorzugte Arzneimittelzusammensetzungen ist für eine orale Verabreichung geeignet, z.B. auch als Slow-Release-Retard.

Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung der erfindungsgemäßen kristallinen Modifikationen zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzung für die Bekämpfung von Krankheiten bereit, welche mit einer pathologischen Überexpression von Urokinase und/oder dem Urokinase-Rezeptor assoziiert sind. Insbesondere eignet sich ein solches Arzneimittel mit dem erfindungsgemäßen Wirkstoff zur Tumorbehandlung und/oder -Prävention und insbesondere auch zur Behandlung oder Prävention von Metastasenbildung, zur Behandlung von Primärtumoren und Sekundärtumoren.

Durch die vorliegende Erfindung wird eine Möglichkeit zur Urokinasehemmung bei Lebewesen, insbesondere dem Menschen, durch Verabreichung einer wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Modifikation bereitgestellt. Die zu verabreichende Dosis hängt ab von der Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankungen. Beispielsweise liegt die Tagesdosis im Bereich von 0,01-100 mg/kg Wirksubstanz pro Körpergewicht, stärker bevorzugt 0,1-50 mg/kg, stärker bevorzugt 0,5-40

mg/kg, stärker bevorzugt 1-30 mg/kg, stärker bevorzugt 5-25 mg/kg.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer im wesentlichen kristallinen Modifikation eines N-α-(2,4,6- TriisopropylphenylsulfonyO-S-hydroxyamidino-CLJ-phenylalanin ^-ethoxy-car- bonylpiperazid-Salzes, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen der Verbindung N-α-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-3- hydroxyamidino-(L)-phenylalanin-4-ethoxycarbonylpiperazid oder eines ihrer Salze,

(b) Lösen oder/und Suspendieren der Verbindung oder des Salzes derselben aus Schritt (a) in einem zur Bildung der kristallinen Modifikation geeigneten Lösungsmittel,

(c) Abtrennen der kristallinen Modifikation.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die kristallinen Modifikationen von WX-671 , WX-671.1 und WX-671.2 auf einfache Weise in kristalliner Form hergestellt werden können. Vorzugsweise wird als

Ausgangsmaterial ein Salz von N-α-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-3- hydroxyamidino-(L)-phenylalanin-4-ethoxycarbonylpiperazid, besonders bevorzugt das Hydrogensulfatsalz, verwendet.

Es kommen jedoch auch weitere Salzverbindungen als Ausgangsverbindungenzur Bildung kristalliner Modifikationen in Frage, beispielsweise das Besylatsalz, Hydrochloridsalz, Mesylatsalz, Tatratsalz und andere.

Als Lösungsmittel für Schritt (b) können vorzugsweise verschiedene organische Lösungsmittel verwendet werden. Geeignet sind beispielsweise Wasser sowie verschiedene Alkohole, z.B. Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol und deren Isoformen, wie z.B. Isopropanol, Isobutanol etc., sowie weiterhin Glykole, Ether, Glykolether, Aceton und dgl. Weitere geeignete Lösungsmittel sind Tetrahydrofuran (THF) und Acetonitril. Bevorzugt sind als

Lösungsmittel insbesondere Aceton und Acetonitril.

Es kann jedoch auch Wasser als Lösungsmittel verwendet werden. Insbesondere zur Umkristallisation (siehe Schritt (d) ) wird vorzugsweise Wasser verwendet.

Wird zur Herstellung einer kristallinen Modifikation eines Salzes von N-α- (2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L)-phen ylalanin-4- ethoxycarbonylpiperazid als Ausgangsmaterial die freie Base verwendet, so werden zusätzlich in Schritt (b) geeignete Salze oder Säuren hinzugegeben, um das jeweilige gewünschte Salz von N~α-(2,4,6- Triisopropylphenylsulfonyl)-3-hydroxyamidino-(L)-phenylalani n-4-ethoxy- carbonylpiperazid zu erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch einen weiteren Schritt (d) des Umkristallisierens des kristallinen Verbindungen aus Schritt (c) umfassen. Dies gilt insbesondere für die Herstellung von WX-671.2 aus WX-671.1. Hierbei wird vorzugsweise die in Schritt (c) entstandene kristalline Modifikation wiederum in einem geeigneten Lösungsmittel oder einer Mischung von Lösungsmitteln umkristallisiert. Auch hier können als Lösungsmittel die zuvor genannten eingesetzt werden. Insbesondere ist Wasser bevorzugt, bzw. es wird vorzugsweise mit einem zur Bildung der gewünschten kristallinen Modifikation ausreichenden Gehalts an Wasser umkristallisiert. Wasser ist insbesondere dann bevorzugt, wenn, wie z.B. im Fall von WX-671.2, ein Hydrat (im Fall von WX-671.2 ein Trihydrat) gebildet wird.

Die Erfindung soll durch die folgenden Figuren und die Beispiele näher erläutert werden.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt einen Ortep-Plot (50 %) mit Bezeichnungschema für Molekül A (WX-671.2).

Figur 2 zeigt einen Ortep-Plot (50 %) mit Bezeichnungschema für Molekül B (WX-671.2).

Figur 3 zeigt unabhängige Moleküle innerhalb einer Elementarzelle einer Einheit aus zwei Molekülen WX-671.2 und Sulfatanion.

Figur 4 zeigt ein simuliertes Röntgendiffraktogramm unter Verwendung von Einkristalldaten von WX-671.2.

Figur 5 zeigt ein experimentelles Röntgendiffraktogramm von WX-671.2.

Figur 6a zeigt die Überlagerung des simulierten Röntgendiffraktionsmusters und des experimentellen Röntgendiffraktionsmusters gemäß der Figuren 4 und 5 für WX-671.2.

Figur 6b zeigt das DSC- und TGA-Thermogramm von WX-671.2 nach Rühren in Wasser.

Figur 7 führt die Kristalldaten und Struktur-Refinement für WX-671.2 auf.

Figur 8 zeigt die Bindungslängen [A] und Winkel [°] für WX-671.2.

Figur 9 zeigt die Torsionswinkel [°] für WX-671.2.

Figur 10 zeigt das DSC- und TGA-Thermogramm von WX-671.1 (Modifikation A).

Figur 11 zeigt das DSC- und TGA-Thermogramm einer Probe (Mesophase B) von WX-671.1.

Figur 12 zeigt das DSC- und TGA-Thermogramm der Mesophase C von WX-671.1.

Figur 13 zeigt das Röntgendiffraktogramm der Modifikation A von WX- 671.1.

Figur 14 zeigt das Röntgendiffraktogramm der Mesophase B von WX-671.1.

Figur 15 zeigt das Röntgendiffraktogramm der Mesophase C von WX-671.1.

Figur 16 zeigt das DSC- und TGA-Thermogramm der amorphen Ausgangssubstanz der freien Base WX-671.

Figur 17 zeigt das DSC- und TGA-Thermogramm einer aus Acetonitril im Gefrierschrank kristallisierten Probe der freien Base WX-671.

Figur 18 zeigt eine mikroskopische Aufnahme der freien Base WX-671 nach Kristallisation aus Acetonitril im Gefrierschrank.

Figur 19 zeigt das Röntgendiffraktogramm der freien Base WX-671 nach Kristallisation aus Acetonitril im Gefrierschrank.

Figur 20 zeigt die Sorptionsisotherme von Wasserdampf an die freie Base WX-671 bei 22 ⁰ C.

Beispiele

Beispiel 1

Herstellung verschiedener Salze von N-α-(2,4,6-Triisopropyl- phenylsulfonyI)-3-hydroxyamidino-(L)-phenylalanin-4-ethoxy-c arbonyl- piperazid

Die Salze wurden durch Lösen von 6.0 g WX-671 in 50 ml Aceton hergestellt. Die verwendeten Säuren wurden ohne Verdünnung in 25prozentigem Überschuss hinzugegeben und für zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Kristallisationsbedingungen

Tabelle 1.1

Säure Äquivalente Kristallisationsbedingungen Trocknung

HCl 1.25 mol eq. Klare Lösung Hochvakuum

H ₂ SO ₄ 1.25 mol eq. Aus Acetonlösung kristallisiert Hochvakuum

MsOH 1.25 mol eq. Aus Acetonlösung kristallisiert Hochvakuum

BsOH 1.25 mol eq. Klare Lösung Hochvakuum

Weinsäure 1.25 mol eq. Klare Lösung Hochvakuum

MsOH: Methansulfonsäure; BsOH: Benzolsulfonsäure

In einem zweiten Schritt wurden die Salze für 7 Tage in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert, filtriert und bei Raumtemperatur getrocknet.

Untersuchung der Kristallinität

Verfahren: Röntgendiffraktometrie (XRD); Mikroskopie

Tabelle 1.2

Spezies XRD Mikroskopie

Freie Base überwiegend kristallin Kleine Partikel

Besylat überwiegend amorph Agglomerate

Hydrochlorid komplett amorph Kleine Partikel

Mesylat flüssigkristallin Agglomerate

Hydrogensulfat flüssigkristallin Agglomerate

Tartrat komplett amorph Glas

Untersuchung der Hygroskopizität

Verfahren: Lagerung 1 Woche/85 % relative Feuchtigkeit; thermogravimetrische Analyse (TGA)

Tabelle 1.3

Spezies TGA

Freie Base 1 ,5 % (semihydrat)

Besylat 10,1 % (adsorptiv)

Hydrochlorid 7,5 % (adsorptiv)

Mesylat 7,8 % (adsorptiv)

Hydrogensulfat 0,8 % (adsorptiv)

Tartrat 10,5 % (adsorptiv)

Beispiel 2

Kristallisation und Einkristall Röntgenstrukturanalyse von WX-671.2

(Sulfatsalz)

Die neue Form von N-α-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-3- hydroxyamidino-(L)-phenylalanin-4-ethoxy-carbonyl-piperazid- Sulfat wird erhalten durch Suspendieren des Hydrogensulfatsalzes (WX-671.1) der Verbindung WX-671 in Wasser und durch Abtrennen der sich bildenden kristallinen Verbindung.

Kristallines WX-671.2 wurde auf zwei verschiedene Arten erhalten:

a) Ca. 50 mg WX-671.1 wurden in ca. 0,5 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach 6 Tagen wurde die Suspension filtriert und der Rückstand bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet.

b) Ca. 0,2 g WX-671.1 wurden in ca. 2 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wurde bei 25 ⁰ C geschüttelt. Nach 3 Tagen wurden der

Rückstand abfiltriert und die Kristalle von WX-671.2 bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet.

Aus dem hierbei hergestellten kristallinen Material (WX-671.2) wurde die Röntgenstruktur bestimmt. Es wurden hierbei auch Einkristalle erhalten.

Die Kristallstrukturbestimmung wurde durchgeführt unter Verwendung eines Bruker-Nonius Diffraktometers ausgestattet mit einem Proteum-CCD Flächendetektor, einer FR591 rotierenden Anode mit CuKα-Strahlung, Montel Spiegel als Monochromator und einem Kryoflex Niedrigtemperaturgerät (T=90K). Vollsphären Datenermittlung omega und phi Scans. Verwendete Programme: Datensammlung Proteum V.1.37 (Bruker-Nonius 2002), Datenreduzierung Saint+Version 6.22 (Bruker-Nonius 2001) und Absorptionskorrektur SADABS V.2.03 (2002). Kristallstrukturauflösung wurde erreicht mittels direkte Methoden wie in SHELXTL Version 6.10 (Sheldrick, Universität Göttingen) implementiert und mittels XP-Programm visualisiert.

Durch differenzielle Fourier Synthese wurden fehlende Atome lokalisiert und der Atomliste hinzugefügt. „Least Squares refinement" auf F2 über alle gemessenen Intensitäten wurden mit dem Programm SHELXTL Version 6.10 (Sheldrick, Universität Göttingen, 2000) vorgenommen. Alle Nicht- Wasserstoffatome wurden „refined" unter Einschluss der „anisotropic displacement parameters".

Tabelle 2.1

H. D. Flack, Ada Cryst, 1983, A39, 876-881

H. D. Flack, G. Bemardinelli, Acta Cryst, 1999, A55, 908-915

H. D. Flack, G. Bernardinelli, J. Appl. Cryst, 2000, 33, 1143-1148

Die Ergebnisse der Röntgenstrukturanalyse sind in Figuren 1 bis 3 und 7 bis 9 dargestellt.

Beispiel 3

Röntgendiffraktometrie von WX-671.2 (Sulfatsalz)

Röntgendiffraktogramme wurden unter Verwendung eines Debye-Scherrer Diffraktometers STOE STADI-P erhalten, ausgestattet mit einem positions¬ sensitiven Detektor (PSD, 5 °) , einem Germanium [1 1 1 ]-primär

Monochromator und einer CuKa 1 ,6 kW Keramik Röntgenröhre (1 ,5406 A). Verwendetes Programm: Stoe WinXpow, Version 2.03 (2003).

Tabelle 3.1

Röntgendiffraktometrie-Peakliste für WX-671.2

WX 671.2

Reflexe Reflexe

2 Theta 2 Theta

3,7 26,8

4,2 27,2

7,1 27,5

7,4 27,8

10,3 28,1

10,8 29,1

11 ,1 29,7

11 ,6 30,2

12,1 30,6

12,6 31 ,1

13,3 31 ,4

13,8 31 ,9

14,2 32,1

14,8 33,2

15,1 33,8

15,7 34,2

16,4 36,3

16,8 37,3

17,3

17,8

18,0

18,6

19,2 19,8 20,1 20,4 20,8 21 ,0 21 ,2 21 ,8 22,2 22,9 23,4 23,9 24,6 25,0 25,5 26,2 26,3 26,5

Beispiel 4

Umkristallisationen von WX-671.1 (Hydrogensulfatsalz)

WX-671.1 wurde in Solventien (Isopropanol, Ethanol, Methanol) unterschiedlicher Polarität gelöst. Die Lösungen wurden filtriert, geviertelt und die Lösungsmittel mit unterschiedlicher Geschwindigkeit entfernt.

WX-671.1 existiert in seiner kristallinen Form (Modifikation A) und zwei Mesophasen B und C. Er zersetzt sich ab ca. 185 ⁰ C (Modifikation A und Mesophase B) bzw. 156 ⁰ C (Mesophase C). Zum Nachweis der Kristallinität von Modifikation A wird eine Röntgenstrukturbestimmung durchgeführt. Modifikation A ist die thermodynamisch stabile Form bei Raumtemperatur.

Beispiel 5

Differential Scanning Calorimetry (DSC) und Thermogravimetrie (TGA) von WX-671.1 (Hydrogensulfatsalz)

In diesem Beispiel wurden Thermogramme durch Differential Scanning Calorimetry (DSC) und Thermogravimetrie (TGA) erstellt. Die Figur 10 zeigt das DSC- und TGA-Thermogramm des eine Woche bei 25 ⁰ C in Isopropanol

gerührten WX-671.1 (Modifikation A). Er zersetzt sich ab ca. 180 ⁰ C (exothermer Peak im DSC-Thermogramm, Masseverlust im TGA- Thermogramm im entsprechenden Temperaturbereich). Die Zersetzungstemperaturen sind stark Heizraten-abhängig und wurden im DSC-Kalorimeter bei einer Heizrate von 2 Kmin ^"1 bestimmt. Die abgebildeten DSC-Übersichtsmessungen wurden mit einer Heizrate von 2 Kmin" ¹ aufgenommen. Die Zersetzung wird entsprechend bei höheren Temperaturen registriert.

Bei 150 ⁰ C wird kein signifikanter Masseverlust registriert. Der schwach ausgeprägte endotherme Effekt vor dem Zersetzungspeak könnte durch teilweises Schmelzen oder partielle Umwandlung hervorgerufen werden.

Figur 11 zeigt das DSC-Thermogramm einer für dieses Screening eingesetzten Probe von WX-671.1 (Mesophase B). Die Modifikation A und die Mesophase B sind thermoanalytisch identisch. Die Mesophase A wurde aus Isopropanol (Raumtemperatur/Kühlschrank) und Ethanol (Raumtemperatur) erhalten.

Die Figur 12 zeigt das DSC- und TGA-Thermogramm des Wirkstoffs nach einem Kristallisationsversuch aus Methanol bei Raumtemperatur (Mesophase C). Er zersetzt sich ab ca. 156 ⁰ C (Heizrate 2 Kmin ^"1 ). Bis 175 ⁰ C wird eine Masseverlust von 4,5 % registriert. Im DSC-Thermogramm fehlt der endotherme Effekt vor dem Zersetzungspeak. Diese Form liegt in einem weniger geordneten Zustand vor als die Modifikation A und die Mesophase B. Sie ist nach Kristallisationsversuchen aus Methanol (Raumtemperatur, Kühlschrank) und Ethanol (Kühlschrank) entstanden. Bei den Proben wurden Masseverluste zwischen 4,5 und 4,8 Gew.-% registriert. Der stöchiometrische Wert für den Masseverlust von 2 Molekülen Wasser pro Wirkstoffmolekül beträgt 4,7 %. Bei dieser Form handelt es sich jedoch nicht um ein Hydrat.

Beispiel 6

Thermomikroskopie von WX-671.1 (Hydrogensulfatsalz)

Von einer Probe von WX-671.1 wurden thermomikroskopische Aufnahmen getätigt (nicht dargestellt). Es wurden Agglomerate beobachtet, die keinen spezifischen Habitus zeigen. Der Wirkstoff zersetzt sich unter Blasenbildung ab ca. 197 ⁰ C. Unterschiede zur im DSC-Kalorimeter beobachteten

Zersetzungstemperatur kommen durch die unterschiedlichen Heizraten zustande. Aus Lösungsmitteln wird WX-671.1 in unspezifischer Form erhalten. Der Wirkstoff zeigt z.T. Doppelbrechung, wie es für kristalline und mesomorphe Substanzen charakteristisch ist.

Beispiel 7

Röntgend iffraktometrie von WX-671.1 (Hydrogensulfatsalz)

Das Röntgendiffraktogramm der Modifikation A (Figur 13) zeigt das für kristalline Phasen charakteristische Muster von zahlreichen scharfen Peaks bei höheren 2-Theta-Winkeln. Zur Bestätigung der Existenz einer kristallinen Phase werden weitere Untersuchungen, z.B. eine Röntgenstrukturanalyse, durchgeführt.

Im Röntgendiffraktogramm der Mesophase B (Figur 14) wurde ein scharfer Peak bei einem 2-Theta-Winkel von ca. 5° und weitere Reflexe mit geringer Intensität zwischen ca. 8° und ca. 25° beobachtet. Lage und Anzahl der Peaks ähneln denen der Modifikation A. Der bei niedrigem Theta-Winkel vorhandene Peak deutet auf das Vorhandensein einer Fernordnung der Moleküle hin, die Peaks mit geringer Intensität belegen das Vorhandensein einer Nahordnung. Daraus lässt sich schließen, dass die Mesophase B weder in kristalliner noch in amorpher Form, sonder vermutlich als Mesophase vorliegt.

Das Röntgendiffraktogramm der Mesophase C (Figur 15) zeigt ebenfalls ein für mesomorphe Verbindungen charakteristisches Muster: einen intensiven

Peak bei niedrigem 2-Theta-Winkel. Das Röntgendiffraktogramm belegt, dass Mesophase C keine kristalline Phase ist und wegen der vorhandenen Fernordnung nicht der amorphen Phase zugerechnet werden kann. Ein Vergleich mit dem Röntgendiffraktogramm von Mesophase B zeigt, dass Mesophase C vermutlich eine Phase mit einem geringeren Ordnungsgrad bildet. Ein Hinweis darauf, sind die bei Mesophase B stärker ausgeprägten und intensiveren Reflexe zwischen den 2-Theta-Winkeln von ca. 8° und ca. 25°.

Durch einwöchiges Rühren in Isopropanol bei Raumtemperatur wandelt sich die Mesophase B in die Modifikation A um. Durch Rühren in Wasser: Ethanol (1:1) verändert sie sich nicht. Durch mechanischen Stress (Mörsern, Pressen mit 9 kbar) wandelt sie sich ebenfalls nicht um.

Tabelle 7.1

Röntgendiffraktometrie-Peakliste für kristalline Modifikation von WX- 671.1 (Hydrogensulfatsalz)

WX 671.1

Reflexe 2 Theta

4,3

8,6

10,1

10,3

10,6

11 ,0

11 ,2

11 ,3

11 ,6

12,0

12,3

13,8

14,8

15,9

17,5

17,7

19,3

Beispiel 8

Umkristallisationen von WX-671 (freie Base)

Der Wirkstoff WX-671 wird thermoanalytisch (DSC ₁ TGA), durch Röntgendiffraktometrie sowie durch Kristallisationen aus organischen Solventien auf Polymorphie untersucht. WX-671 kristallisiert in einer Modifikation (Modifikation A). Der Wirkstoff zeigt eine sehr geringe Kristallisationstendenz.

Die Modifikation A die thermodynamisch stabile Form bei Raumtemperatur. Eine abschließende Bewertung der Polymorphie und Pseudopolymorphie von WX-671 ist erst nach Durchführung einer Polymorphiestudie möglich.

WX-671 wurde in Solventien (Tetrahydrofuran, Acetonitril, Methanol) unterschiedlicher Polarität gelöst. Die Lösungen wurden filtriert, geviertelt und der Wirkstoff mit unterschiedlicher Geschwindigkeit kristallisiert. Nach

Trocknung bei Raumtemperatur wurden die Thermogramme (DSC, TGA) und die Röntgendiffraktogramme registriert.

Die für das Polymorphiescreening eingesetzte Ausgangssubstanz konnte in überwiegend kristalliner Form hergestellt werden. Die Kristallisation gelang aus Acetonitril im Gefrierschrank bei ca -18 ⁰ C.

Beispiel 9

Differential Scanning Calorimetry (DSC) und Thermogravimetrie (TGA) von WX-671 (freie Base)

Die Figur 16 zeigt das DSC- und TGA-Thermogramm der amorphen Ausgangssubstanz. Ebenso wie die DSC- /TGA-Thermogramme des größten Teils der übrigen untersuchten Proben zeigt es einen thermischen Effekt im Bereich zwischen 45 ⁰ C und 85 ⁰ C. Im Rahmen des Polymorphiescreenings konnte dieser thermische Effekt nicht zugeordnet werden. Es könnte sich dabei um eine Glasumwandlung handeln. Daraus ergeben sich Rückschlüsse auf eine Kristallform mit einem Schmelzpunkt von ca. 190 ⁰ C. Die Substanz zersetzt sich in Abhängigkeit von der Heizrate ab ca. 155 ⁰ C. Aus diesem Grund kann der Schmelzpunkt der kristallinen Probe (GBA 190903-8c) nicht ermittelt werden. Die Thermogramme der amorphen und kristallinen Substanz sind deshalb weitgehend identisch (Figuren 16 und 17).

Beispiel 10

Mikroskopie von WX-671 (freie Base)

Aus Acetonitril kristallisiert WX-671 im Gefrierschrank in Form von Prismen (Figur 18). Aus anderen Lösungsmitteln kristallisiert der Wirkstoff nicht oder nur zu sehr geringem Anteil, aus der Schmelze kristallisiert er nicht.

Beispiel 11

Röntgendiffraktometrie von WX-671 (freie Base)

Die Figur 19 zeigt das Röntgendiffraktogramm des Wirkstoffs nach Kristallisation aus Acetonitril im Gefrierschrank (Modifikation A).

Tabelle 11.1

Röntgendiffraktometrie-Peakliste für WX-671 (freie Base)

Probe wurde aus Acetonitril im Gefrierschrank kristallisiert.

WX 671

Reflexe 2 Theta 3,2 5,5 6,4 8,5 9,7 10,2 10,7 11 ,2 11 ,5 11 ,7 12,1 13,4 13,8 14,1 14,6 14,8 15,5 16,5 18,1 19,1 19,7 20,5 20,7 21,3 22,4 22,7 23,6 26,5

Beispiel 12

Feuchtesorption von WX-671 (freie Base)

Figur 20 zeigt die Sorptionsisotherme von Wasserdampf an WX-671 bei 22 ⁰ C. Der amorphe Wirkstoff nimmt von 0 % r.F. Bis 95 % r.F. kontinuierlich Wasser auf. Bei der Trocknung wird dieses Wasser wieder abgegeben. Bei den meisten Punkten der Isotherme wurde innerhalb der jeweiligen Haltezeit kein Gleichgewichtszustand erreicht. Das Probengewicht stieg bzw. fiel weiter. Es gab in diesem Versuch keine Hinweise auf Hydratbildung.

Beispiel 13

Stabilität von WX-671 (freie Base)

Durch einwöchiges Rühren in Diisopropylether und Ethanol/Wasser (1 :1) bei Raumtemperatur kristallisiert der Wirkstoff nicht bzw. zu sehr geringem Anteil in Modifikation. A. Er wandelt sich in keine andere polymorphe Form um. Durch mechanischen Stress (Mörsern, Pressen mit 9 kbar) wandelt er sich ebenfalls nicht um, lediglich die Kristallinität nimmt weiter ab.