Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Kupferverbindungen der allgemeinen Formel Cu(L) ₂ oder Hydraten davon, wobei die Liganden L unabhängig Melphalan und Tegafur bedeuten, als Antitumormittel.

Die Entwicklung neuer Chemotherapeutika, welche hochwirksam bei der Be¬ handlung maligner Tumoren sind und gleichzeitig eine hohe Selektivität besitzen und somit so wenig Nebenwirkungen wie möglich mit sich bringen, stellt ein wichtiges Ziel der heutigen Forschung dar. Es sind bereits eine Vielzahl von Cytostatika bekannt, die sich anhand ihrer unterschiedlichen Wirkungsmechanismen in mehrere Gruppen unterteilen lassen.

Beispielsweise stellen Pyrimidin-, Purin- und Pteridin-Derivate wie z.B. Fluor- oder Bromuracil Antimetaboliten dar, die den Ablauf biologischer Vor¬ gänge aufgrund ihrer Eigenschaft, strukturell ähnlich zu essenziellen natürli- chen Metaboliten zu sein und diese im Organismus ersetzen oder mit diesen in Konkurrenz treten zu können, hemmen oder fehlleiten können.

Zu der Gruppe der Mitosehemmer gehören z.B. die Pflanzeninhaltsstoffe Colzemid, Podophylin-Derivate und Vinka-Alkaloide, welche den Ablauf der Mitose in Zellen beeinträchtigen, wodurch die Zellteilung verhindert wird und auf diese Weise schnellwachsende Tumorzellen abgetötet werden.

Eine weitere Gruppe von Cytostatika sind alkylierende Verbindungen, deren Wirkung vor allem auf der Alkylierung von Nukleinsäuren beruht, wodurch die DNA verändert und als Folge davon die Zellteilung beeinträchtigt und letztlich der Zelltod eingeleitet wird. Beispiele für alkylierende Cytostatika sind N-Lost-Derivate wie Chlorambucil, Cyclophosphamid und Melphalan (4- [Bis-(2-chlorethyl)-amino]-L-phenylalanin).

Beispielsweise Melphalan wurde zur Behandlung verschiedener Krebser¬ krankungen vorgeschlagen. Alkeran® , das Melphalan als Wirkstoff enthält, ist ein Arzneimittel zur Anwendung bei multiplem Myelom, Ovarialkarzinom und Mammakarzinom. Ferner wurden Studien zu Melphalan bei fortge¬ schrittenem Prostatakrebs durchgeführt (Canada, A., et al., Cancer Chemo- ther. Parmacol. 1993, 32(1), 73-7; Houghton, A., et al., Cancer Treat. Rep. 1977, 61(8), 923-4). Weiterer Stand der Technik, der die Anwendungen von Melphalan zum Gegenstand hat, sind z.B. Stolfi, R.L et al., J. Natl. Cancer Inst. 1988, 80(/1), 52-5; Fisher, B. et al., N. Engl. J. Med., 1975, 292(16), 117-122) (Brustkrebs); Cornwell G.G. et al., Cancer Treat. Rep., 1982, 66(3), 475-81; GoIa, A. et al., Folia Haematologica, 1990, 117, 167 (Myelom/Leuk- ämie); Hendriks, J.M. et al., Ann. Thorac. Surg., 1998, 66(5), 1719-25; Ste¬ ven, M. P. et al., Gynecologic Oncology, 1986, 23, 168 (Adenokarzinom); Vrouenraets, B.C. et al., J. Surg. Oncol., 1997, 65(2), 88-94; Haffner, A.C. et al., Br. J. Dermatol., 199, 141 (Suppl Nov.), 935-36 (Sarkome) und Fraker, D.L. et al., J. Clin. Oncol., 1996, 14(2), 479-89; Ferdy L. et al., Annais of the new york academy of sciences, 1993, 680, 391-400 (Melanome)).

R. Tobey et al., Cancer Research 45 (1985) beschreiben eine zeitlich ge¬ trennte Applikation einer metallhaltigen Lösung und einer Melphalan- haltigen Lösung. Dabei wurde die Resistenz von Zellen gegenüber Melpha¬ lan untersucht.

Allgemein stellt die Tatsache, dass viele der bekannten Antitumorwirkstoffe stark toxisch sind und darüber hinaus selbst als Karzinogene oder Mutagene wirken, ein großes Problem bei der Anwendung der Cytostatika dar. Zudem können die Wirkstoffe häufig nur sehr eingeschränkt verwendet werden, da eine effektive Krebsbehandlung von der Art der zu behandelnden malignen Tumoren sowie der Form, dem Verlauf und Stadium der jeweiligen Er¬ krankung abhängig ist. So hat sich auch bei Melphalan herausgestellt, dass es für eine Antitumorbehandlung nur eine begrenzte Effizienz und Anwendungsbreite besitzt.

Ein gegenüber Melphalan verbessertes Antitumormittel wird in WO03/004014 offenbart. Darin werden Verbindungen der Formel D ₂ -M-T be¬ schrieben, die aus einem Metallatom wie Kupfer oder Mangan, zwei ß-Dike- ton-Liganden und einem Liganden, der eine Substanz mit mindestens einer N-, O- oder S-enthaltenden Gruppe darstellt, wie z.B. Melphalan, bestehen. Diese Metallverbindungen haben sich in in vivo Versuchen als wirksam zur Behandlung von z.B. Adenokarzinom, Sarkom, Leukämie, Melanom und Nierenzellkarzinom erwiesen, wobei im Vergleich zu Melphalan eine über- legene Wirksamkeit gezeigt werden konnte.

Angesichts der großen Anzahl Menschen, die heutzutage an den verschie¬ densten Arten von Tumorerkrankungen leiden, besteht trotz der großen Vielfalt an Verbindungen mit Antitumorwirksamkeit, die bisher beschrieben wurden, ein anhaltendes Bedürfnis für neue Cytostatika mit hoher Wirksam¬ keit bei gleichzeitig möglichst geringen Nebenwirkungen.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand daher darin, neue Ansätze für eine effektive Antitumorbehandlung bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung überraschenderweise festgestellt wurde, dass Ver¬ bindungen der allgemeinen Formel

Cu(L) ₂ ^• (H ₂ O) _x (I)

wobei L jeweils unabhängig ausgewählt ist aus Melphalan und Tegafur und x = 0,1 oder 2 ist, eine hohe Antitumorwirksamkeit besitzen und somit zur Verwendung als Wirkstoff bei der Behandlung maligner Tumoren geeignet sind.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung einer oder mehrerer Verbindungen der Formel (I) zur Antitumorbehandlung.

Gegebenenfalls enthält die Verbindung der Formel (I) Kristallwasser, ins¬ besondere zwei Moleküle H ₂ O (x = 2).

Die an das Kupferatom koordinierten Liganden L stellen 4-[Bis-(2- chlorethyl)-amino]-L-phenylalanin (Melphalan) oder/und 5-Fluor-1-(tetrahy- dro-2-furyl)-uracil (Tegafur) dar. Bevorzugt sind beide Liganden L Melphalan oder Tegafur, besonders bevorzugt stellen beide L Melphalan-Liganden dar.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte Verbindung ist Cu(Melphalan) ₂ bzw. die entsprechende Kristallwasser-enthaltende Ver¬ bindung. Diese Kupfer-Verbindung ist prinzipiell bekannt (M. D. Joesten et al., Inorganica Chimica Acta, 159 (1989) 143-148), wobei dort vorge¬ schlagen wurde, dass die Melphalan-Moleküle als zweizähnige Liganden fungieren, die sich zusammen mit zwei Molekülen Wasser um das Cu-Atom tetragonalbipyramidal-artig anordnen. Dabei liegen die Melphalan-Gruppen in den vier äquatorialen Positionen um das Kupfer vor, die Wassermoleküle sind axial zu dem Kupferatom angeordnet. Joesten et al. zeigen eine Syn¬ thesemöglichkeit für erfindungsgemäße Verbindungen auf. Eine mögliche antitumorale Aktivität der Verbindungen wird nicht angesprochen oder gar untersucht. Die erstaunliche Antitumorwirksamkeit von Cu(Melphalan) ₂ wurde erst im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt.

Die Verbindungen der Formel (I) erwiesen sich als sehr wirksame Antitumor- mittel. Insbesondere eignen sich die Verbindungen erfindungsgemäß zur Behandlung von Darmkrebs, Hirntumor, Augentumor, Pankreaskarziom, Harnblasenkarzinom, Lungenkrebs, Brustkrebs, Ovarialtumor, Gebärmutter¬ krebs, Knochentumor, Gallenblasen- und Gallengangkarzinom, Kopf-Halst- Tumor, Hautkrebs, Hodenkrebs, Nierentumor, Keimzelltumor, Leberkrebs, Leukämie, malignes Lymphom, Nerventumor, Neuroplastom, Prostatakrebs, Weichteiltumor, Speiseröhrenkrebs sowie Karzinomen bei unbekanntem Primärtumor.

Untersuchungen haben ergeben, dass die Verbindungen der Formel (I) und insbesondere Cu(Melphalan) ₂ vor allem eine effektive Behandlung von Nieren- und Lungenkrebs ermöglichen. Dabei hat sich herausgestellt, dass die erfindungsgemäß verwendeten Cu-Verbindungen der Formel (I) eine weitaus höhere Antitumorwirksamkeit besitzen als die Liganden selbst, also Melphalan oder Tegafur. Diese bei der Behandlung mit den Kupfer-Ver¬ bindungen gemäß Formel (I) erreichte Wirksamkeitserhöhung kann auf einen synergistischen Effekt zurückgeführt werden, welcher durch die Ein¬ bindung der Melphalan- bzw. Tegafur-Liganden in eine Cu-Verbindung ge- maß vorliegender Erfindung erhalten wird.

Neben ihrer hohen Wirksamkeit bei der Tumorbekämpfung wurde zudem gefunden, dass die Verbindungen der Formel (I) immunmodulatorische und anti-proliferative Eigenschaften sowie eine antiangiogene Wirksamkeit auf- weisen. Ferner besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen verglichen mit herkömmlichen Antitumormitteln eine stark erhöhte Hydrolysestabilität, wodurch sie in weiten Bereichen der Tumorbekämpfung einsetzbar sind. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Verbindungen der Formel (I) selektiv Tumorgewebe schädigen und gesundes Gewebe im Wesentlichen nicht beeinträchtigen. Somit ermöglichen die Verbindungen der Formel (I) im Gegensatz zu den meisten bekannten Chemotherapeutika eine Antikrebsbe- handlung ohne oder mit nur geringen Nebenwirkungen.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäß verwendeten Kupfer-Ver- bindungen ist, dass diese Verbindungen keine Arzneimittelresistenz hervor¬ rufen und unter bestimmten Bedingungen in der Lage sind, Apoptose bei Krebszellen herbeizuführen.

Die gemäß vorliegender Erfindung besonders bevorzugte Kupfer-Ver- bindungen Cu(Melphalan) ₂ ist ein blauer Feststoff, der chemisch stabil ist und eine lang anhaltende Wirkung besitzt. Darüber hinaus kann diese Ver¬ bindung die Blut-Hirn-Schranke überwinden, was somit die Behandlung von Gehirntumoren ermöglicht. Diese Verbindung erwies sich als weit wirksamer

als Melphalan, wie es z.B. durch Untersuchungen am Nierenzellkarzinom und der Lungenmetastasenbildung gezeigt werden konnte. Für die er¬ findungsgemäß weiterhin bevorzugte Verbindung Cu(Tegafur) ₂ konnte eine vergleichbare Wirksamkeit gezeigt werden. Im Gegensatz zu Tegafur alleine, das nur eine kurze Wirkdauer und Nebenwirkungen wie Diarrhoe und Stomatitis hervorruft und daher nur begrenzte Anwendungsmöglichkei¬ ten bietet, hat sich die erfindungsgemäße Kupfer-Tegafur-Verbindung als Antitumormittel herausgestellt, das diese Nachteile nicht aufweist und außerdem weitaus wirksamer ist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können Verbindungen der Formel (I) einzeln oder als Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Verbindungen zur Antitumorbehandlung eingesetzt werden. Gegebenenfalls können die Verbindungen der Formel (I) zusammen mit dem Fachmann bekannten her- kömmlich verwendeten pharmazeutischen Zusatz- und Hilfsstoffen formuliert bzw. verabreicht werden. Beispiele solcher Zusatz- oder Hilfsstoffe sind physiologisch verträgliche Trägersubstanzen, Verdünnungsmittel, Farb¬ oder/und Geschmacksstoffe.

Erfindungsgemäß kann die Kupfer-Verbindung der Formel (I) in einer zur to¬ pischen, parenteralen, intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intraperi¬ tonealen oder transdermalen Verabreichung geeigneten Form vorliegen. Vorzugsweise wird die Kupfer-Verbindung der Formel- (I) in Form von Tabletten oder als intravenöse Injektion bzw. Infusion bereitgestellt. In be- stimmten Fällen können die Verbindungen der Formel (I) gezielt in Kör¬ perhöhlen oder über einen Katheter in die Blutgefäße der Tumorregionen bzw. des Organs, in dem sich der Tumor befindet, eingespritzt werden.

Weiterhin können die Verbindungen der Formel (I) oder Mischungen aus solchen Verbindungen zusammen mit anderen Wirkstoffen verabreicht werden, wobei diese anderen Wirkstoffe z.B. ebenfalls Antitumormittel, Anti¬ biotika oder Substanzen mit anderen Wirkungen sein können.

Gemäß vorliegender Erfindung kann die Verbindung der Formel (I) in ver¬ schiedenen Stadien der zu behandelnden Tumorerkrankung eingesetzt werden. So kann mit der erfindungsgemäß verwendeten Kupfer-Verbindung eine Linderung der mit der Tumorerkrankung verbundenen Symptome, eine Verringerung des Ausmaßes der Tumorerkrankung (z.B. eine Verringerung des Tumorwachstums), eine Stabilisierung des Zustandes der Tumorer¬ krankung (z.B. eine Inhibierung des Tumorwachstums), eine Verhinderung einer weiteren Ausbreitung der Tumorerkrankung (z.B. eine Metastasierung), eine Verhinderung des Auftretens oder Wiederauftretens einer Tumorerkrankung, eine Verzögerung oder Verlangsamung des Verlaufs der Tumorerkrankung oder/und eine Verbesserung des Zustandes der Tumorerkrankung (z.B. eine Verkleinerung des Tumors) erreicht werden. Dabei wird die Verbindung der Formel (I) in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um den jeweils erwünschten Zweck zu erzielen. Die jeweils wirk- same Menge ist dabei von verschiedenen Faktoren abhängig, wie z.B. der Wahl des Komplexes, der Art der Verabreichung, der Art und dem Ausmaß der Tumorerkrankung und dem Alter, Gewicht und Allgemeinzustand des Patienten. Vorzugsweise werden die Verbindungen der Formel (I) in einer Dosis von 1 μg/kg Körpergewicht des Patienten bis zu 8 mg/kg Körperge- wicht des Patienten, vorzugsweise bis zu 7,5 mg/kg Körpergewicht des Pati¬ enten, mehr bevorzugt bis zu 5 mg/kg Körpergewicht des Patienten verab¬ reicht. Insbesondere werden 1 μg/kg Körpergewicht des Patienten bis 0,5 mg/kg Körpergewicht des Patienten und besonders bevorzugt von 10 μg/kg Körpergewicht des Patienten bis 0,1 mg/kg Körpergewicht des Patienten der erfindungsgemäßen Verbindungen verabreicht.

Die Herstellung der Kupfer-Verbindungen der Formel (I) kann in Anlehnung an im Stand der Technik beschriebene Synthesevorschriften leicht herge¬ stellt werden (siehe z.B. M. D. Joesten, Inorganica Chimica Acta, 159 (1989) 143-148). Ein weiterer wichtiger Vorteil gemäß vorliegender Erfindung ist, dass die erfindungsgemäß verwendeten Kupfer-Verbindungen in hoher Reinheit synthetisch leicht zugänglich sind, was eine wichtige Voraus¬ setzung für die Bereitstellung als Arzneimittel darstellt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer Verbindungen der Formel (I) zur Herstellung eines Me¬ dikaments zur Behandlung von Tumoren.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Abbildungen, Beispiele und Versuchsergebnisse näher erläutert.

Abbildungen Abbildung 1 zeigt ein IR-Spektrum (KBr) von Cu(Melphalan) ₂ .

Abbildung 2 zeigt ein Massenspektrum von Cu(Melphalan) ₂ .

Abbildung 3 ist die Darstellung eines Strukturvorschlags für Cu (MeI) ₂ • 2H ₂ O. Unter der Strukturformel sind die molekulare Zuammen- setzung und das Molekulargewicht aufgeführt.

Abbildung 4 ist ein Syntheseschema der Synthese von Cu(Tf) ₂ gemäß Beispiel 2.

Abbildung 5 ist ein Diagramm, in welchem ein Vergleich von Nierengewicht und Nierenvolumen der gemäß Beispiel 3 behandelten Kon¬ trollmäuse und mit Cu(MeI) ₂ gemäß vorliegender Erfindung behandelten Mäuse dargestellt ist.

Abbildung 6 ist ein Diagramm, in welchem das Lungengewicht und die Anzahl der Lungenmetastasen bei den gemäß Beispiel 3 be¬ handelten Mäuse dargestellt ist. Dabei werden die Kontrollgruppe (Lösungs¬ mittel), Cu(Mel) ₂ -Gruppe (5 mg/kg/D 10-18), Cu(Mel) ₂ -Gruppe (7,5 mg/kg/D 10-18) und die nur mit Melphalan behandelten Mäuse gegenübergestellt.

Abbildung 7 zeigt einen Vergleich der Gefäßdichten der gemäß Beispiel 3 behandelten Kontrollmäuse und mit Cu(Melphalan) ₂ behandelten Mäuse (CD 31 Auswertung).

Abbildung 8 zeigt das durchschnittliche Tumorvolumen im

Verlauf der Behandlung mit Cu(Melphalan) ₂ verglichen mit Melphalan.

Abbildung 9 zeigt die relativen Tumorvolumina (RTV) für mit Kupfer-Melphalan bzw. mit Melphalan alleine behandelten Gruppen.

Abbildung 10 zeigt eine statistische Analyse der beiden Dosis¬ gruppen aus Abbildung 9.

Beispiele

1. Synthese von Cu(Melphalan) ₂

Die Synthese wurde in Anlehnung an Joesten, M. D., Inorganica Chimica Acte, 159 (1989) 143-148 durchgeführt.

0,30 g Melphalan (0,98 mmol) wurden unter Rühren zu einer Suspension von Cu(OH) ₂ (0,050 g, 0,52 mmol in 3,5 ml Wasser) zugegeben. Nach 1 Stunde bildete sich ein blau-lila Präzipitat, welches unter Vakuum filtriert und mit einer großen Menge an heißem Wasser gewaschen wurde.

2. Synthese von Cu(Tegafur) ₂

0,20027 g Tegafur wurden zu 10 ml einer 0,1 N ethanolischen NaOH gege¬ ben und unter Rückfluss auf 62 bis 65 ⁰ C erwärmt, wobei sich alles löste. Zu dieser Lösung wurden 0,06901 g Kupfer(ll)-Chlorid (wasserfrei) zugegeben, wobei eine gelblich-dunkelgrüne transparente Lösung entstand. Es wurde 2

Stunden unter Rückfluss auf 62 bis 65 ⁰ C erhitzt, wobei nach etwa 5 Minuten ein blauer Niederschlag ausfiel, die Lösung blieb gelblich-dunkelgrün. Man ließ die Reaktionsmischung abkühlen und weitere 48 Stunden bei Raum¬ temperatur mittels eines Magnetrührers rühren. Es entstand eine gelblich- dunkelgrüne Lösung mit Niederschlag. Die Gesamtlösung wurde in Zentri¬ fugengläser umgefüllt und für 4 Minuten bei 4000 Umdrehungen/Minuten zentrifugiert. Es blieb eine blaue Substanz als Sediment zurück, die über¬ stehende Lösung zeigte eine gelblich-grüne Färbung. Die überstehende Lö¬ sung wurde verworfen. Es wurden 5 ml Ethanol (rein) zum Sediment zugegeben, geschüttelt und der Feststoff wurde erneut bei 4000 Umdre¬ hungen/Minuten für 4 Minuten abzentrifugiert. Die überstehende Lösung zeigte eine gelblich-grüne Färbung und wurde verworfen. Es wurden wieder¬ um 5 ml Ethanol (rein) zum Sediment zugegeben, geschüttelt und der Fest¬ stoff wurde bei 4000 Umdrehungen/Minute für 4 Minuten abzentrifugiert, die gelblich-grüne Lösung wurde verworfen. Die Reinigung wurde solange wiederholt, bis die überstehende Lösung farblos war, wobei dafür in der Regel insgesamt ungefähr 25 ml Ethanol (rein) erforderlich sind. Der Fest¬ stoff wurde an Luft getrocknet und nach dem Trocknen erhielt man ein hell¬ blaues, sichtbar homogenes Produkt, das leicht sehr gut und ganz fein pulverisiert werden konnte.

Das Löslichkeitsverhalten der erhaltenen Kupfer-Tegafur-Verbindung ent¬ sprach in etwa dem eines Kupfer(ll)-Salzes, in Wasser erhielt man eine hell¬ blaue Färbung der Lösung und die Bildung eines Schaumes beim Schütteln. Die Eigenschaften der Substanz weisen darauf hin, dass die Verbindung Cu (Tf) ₂ salzartigen Charakter besitzen könnte.

Die Synthese von Cu(Tf) ₂ ist in Abbildung 4 anhand eines Schemas ver¬ anschaulicht.

3. Antitumorwirksamkeit von Cu(MeI) ₂

Anhand eines murinen Nierenzellkarzinom-Modells (RENCA) der Balb/c- Maus wurde eine Untersuchung der Wirkung von MeI-Cu-MeI auf den Primärtumor, die Metastasen und die Gefäßdichte durchgeführt. Dafür wurden die Tumorzellen orthotop in die linke Nierenkapsel syngener Mäuse appliziert, wobei die verabreichte Dosis pro Therapietag betrug: 5 mg/kg- Maus und 7,5 mg/kg-Maus, jeweils 5 Tiere zuzüglich 5 Tiere zur Lösungs¬ mittelkontrolle. Das erfindungsgemäße Antitumormittel Cu(MeI) ₂ wurde intra- peritonial appliziert. Das Therapieschema war wie folgt:

Tag 0 Applikation der Tumorzellen

Tag 1 - 9 Wachstum des Tumors Tag 10 - 18 Verabreichung der Substanz

Tag 19 Tötung der Tiere und Befund.

Als Kontrolle dienten 5 Tiere, denen kein Wirkstoff verabreicht wurde und zum Vergleich wurde einer Gruppe von 5 Tieren Melphalan alleine verab¬ reicht.

Die Ergebnisse der Untersuchung sind in den Abbildungen 5 bis 7 darge¬ stellt. Daraus geht hervor, dass die erfindungsgemäße Verbindung Cu(MeI) ₂ im Vergleich zur Kontrolle zu einem wesentlich geringeren Nierengewicht und Nierenvolumen führte (siehe Abbildung 5), was die Wirksamkeit der er- findungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung maligner Tumoren ver¬ anschaulicht. Ferner kann der Abbildung 6 entnommen werden, dass auch das Lungengewicht der mit Cu(MeI) ₂ behandelten Mäuse gegenüber der Kontrolle und gegenüber Mäusen, denen Melphalan alleine verabreicht worden war, verringert ist. Die vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Metastasenbildung in der Lunge wird außerdem besonders durch den rechten Teil der Abbildung 6 deutlich, wo die Lungen- metastasenbildung der erfindungsgemäß behandelten Mäuse, der Kontroll¬ mäuse und der nur mit Melphalan behandelten Mäuse gegenübergestellt ist.

Die erfindungsgemäß behandelten Mäuse zeigten eine beträchtlich geringe¬ re Lungenmetastasenbildung als die Kontrollmäuse und als die nur mit MeI- phalan behandelten Mäuse.

Ferner wurden die Testmäuse auf die Gefäßdichte hin untersucht, wie es in Abbildung 7 dargestellt ist. Daraus geht deutlich hervor, dass die erfindungs¬ gemäßen Verbindungen antiangiogen wirksam sind.

4. In vivo Untersuchungen zur antitumoralen und antiangiogen Wirksamkeit von Kupfer-Melphalan an einem orthotopen Nierenzellkarzinom-Modell (RENCA) der Maus

Die Untersuchungen wurden an einem murinen Nierenzellkarzinom-Modell (RENCA) der Balb/c Maus durchgeführt. Die Applikation der Tumorzellen er¬ folgte orthotop in die linke Nierenkapsel syngener Mäuse. Untersucht wurde die Wirkung der durchgeführten Therapie auf Primärtumor (in der implan¬ tierten Niere), Metastasen (vorwiegend in Lunge, Milz und intestinalen Lymphknoten) und Gefäßdichte.

Methode:

Nach Anästhesie mittels Isoflurannarkose (O ₂ - flow ca. 2,0 I mit 0,5-1,5 % Isofluran) wurde ein kleiner Einschnitt in der linken Flanke der Maus vorge¬ nommen. Die Niere wurde aus dem Peritoneum frei präpariert und darge- stellt. Eine 27G Nadel wurde über den unteren Nierenpol bis unter die Nierenkapsel unter Sichtkontrolle eingeführt und einmalig 4x10 ⁵ Tumorzellen in je 70 μl Aliquots appliziert. Das Entstehen einer sichtbaren flüssigkeitsge¬ füllten Blase zwischen Nierenparenchym und Nierenkapsel sowie die Entfär¬ bung der Niere galten als Kriterium für die erfolgreiche Applikation. An- schließend wurde die Niere reponiert und die Inzision in der Bauchwand mit¬ tels Faszien- und Kutannaht mit resorbierbarem Nahtmaterial geschlossen. Es wurden fünf Versuchsgruppen mit jeweils zehn Tieren gebildet. Gruppe 1 Negativkontrolle, Gruppe 2 Positivkontrolle Melphalan (Fa. Glaxo), Gruppe 3

und 4 MOC-Melphalan 2,5 mg/kg bzw. 5mg/kg. Bei der Gruppe 5 wurde eine antiangiogen wirksame Substanz als Positiv-Kontrolle appliziert. Der Thera¬ piebeginn wurde für Cu-(Melphalan) ₂ auf den Tag 1 post. Op. Festgelegt. Es wurde bis zum Tag 7 täglich therapiert (siehe Behandlungsschema). Nach 19 Tagen wurde der Versuch beendet, da die Kontrolltumoren aufgrund der Tumorgröße einen Abbruch aus ethischen Gründen erforderten.

Behandlungsschema:

Der Implantationstag wurde als Tag 0 gezählt. Laufzeit des Versuches 19 Tage.

Anzahl Tiere zu Beginn des Versuches 50, kein Tier während der Op. Verstorben, 3 Tiere aus der Kontrollgruppe wurden am 14. bzw. 15. Tag verendet aufgefunden.

Die gewählte Dosierung der Prüfsubstanz orientierte sich an einem frühe¬ ren Vorversuch zur Dosisfindung und Wirksamkeit.

Primärtumor

Datenblatt Nierenvolumen (cm ³ )

Datenblatt Nierengewicht (gr.)

Lunqenmetastasen

Datenblatt: Zahl der Lungenmetastasen

Datenblatt Lungengewicht (gr.)

Lymphknotenmetastasen

Datenblatt: Zahl intestinaler Lymphknotenmetastasen

Gefäßdichtefenti-CD31-AB)

Methode:

Nach der Sektion der Tiere wurden die zu untersuchenden Gewebe rasch in flüssigen Stickstoff übergeführt und dann bei -80 ⁰ C tiefgefroren. Von den Gewebestücken wurden Schnitte mit einer Dicke von 5-10 μm angefertigt. Die Präparate wurden mit einem anti-CD31 -Antikörper (Pecam-1) immun- histochemisch gefärbt und die Gefäßanzahl in Kontroll- und Behandlungs¬ gruppe gezählt. Dabei wurden von jedem Tumor zwei Schnitte mit jeweils drei Arealen für die Zählung der Gefäße herangezogen.

Datenblatt: Gefäßdichte (Durchschnitt aus drei gezählten Arealen pro Schnitt)

Während des Versuches wurden keine Toxizitäten beobachtet und es gab auch keine wesentlichen Reduktionen des Körpergewichts als Hinweis auf Nebenwirkungen. Bei der Sektion waren keine besonderen pathologischen Befunde zu sehen.

Cu-(Melphalan) ₂ ist sowohl in der Dosierung von 2,5 mg/kg als auch 5 mg/kg signifikant antitumoral wirksam, wobei es bei etwa halbäquimolarer Do¬ sierung eine bessere Wirksamkeit als Melphalan alleine zeigt. Bei etwa vierteläquimolarer Dosierung wird eine vergleichbare Wirksamkeit zu Mel¬ phalan erhalten.

Bei der Auswertung der gebildeten Lungen metastasen konnte im Versuch eine signifikante antimetastatische Wirkung von Cu-(Melphalan) ₂ bei einer Dosierung von 5 mg/kg nachgewiesen werden.

Bei der Auswertung der gebildeten intestinalen Lymphknotenmetastasen konnte eine signifikante antimetastatische Wirkung von Cu-(Melphalan) ₂ in der Dosierung von 2,5 und 5 mg/kg nachgewiesen werden.

Mit dem gewählten Behandlungsschema konnten bei beiden Dosierungen keine antiangiogene Wirksamkeit beobachtet werden. Dieser Befund kor¬ reliert mit den Ergebnissen anderer zytostatisch wirksamer Substanzen in diesem Modell.

Beispiel 5

Studienprotokoll:

Das Studienprotokoll entspricht dem von Beispiel 4, es wurde lediglich ein anderes Therapieintervall gewählt und andere Dosisgruppen. Es wurden vier Versuchsgruppen mit jeweils zehn Tieren gebildet. Gruppe 1 Negativkon¬ trolle, Gruppe 2 Positivkontrolle Melphalan (Fa. Glaxo), Gruppe 3 und 4 Cu- (Melphalan) ₂ 5mg/kg bzw. 7,5 mg/kg. Der Therapiebeginn wurde für alle Gruppen auf den Tag 10 post. Op. Festgelegt. Es sollte von Tag 10 bis zum Tag 17 täglich therapiert werden (siehe Behandlungsschema). Aufgrund von Toxizitäten verringerte sich der Behandlungszeitraum auf Tag 10-14. Nach 18 Tagen wurde der Versuch beendet, da die Kontrolltumoren aufgrund der Tumorgröße einen Abbruch aus ethischen Gründen erforderten.

Behandlungsschema:

Der Implantationstag wurde als Tag 0 gezählt. Laufzeit des Versuches 18 Tage.

Anzahl Tiere zu Beginn des Versuches 40, kein Tier während der Op. ver¬ storben.

Ergebnisse:

Primärtumor

Datenblatt Nierenvolumen (cm ³ )

Lungenmetastasen

Datenblatt: Zahl der Lungenmetastasen (späte Behandlung Tag 10-14)

Versuchs-Gruppen

Kontrolle Positiv-Kontrolle Cu-(Melphalan) ₂ Cu-(Melphalan) ₂ Melphalan 16,4 μmol/kg 8,8 μmol/kg 13,2 μmol/kg

92 71 431 77

- 750 - 750

750 500 - 300

750 46 750 4

750 750 0 10

750 304 28 0

128 614 0 3

182 317 - 0

0 5 21 0

87 750 345 0

•

Datenblatt Lungengewicht (gr.)

Versuchs-Gruppen

Kontrolle Positiv-Kontrolle Cu-(Melphalan) ₂ Cu-(Melphalan) ₂ Melphalan 16,4 μmol/kg 8,8 μmol/kg 13,2 μmol/kg

0,13 0,11 0,13 0,13

- 0,38 - -

0,61 - - -

0,78 0,10 0,21 -

0,31 0,31 0,13 -

0,40 0,14 0,11 0,11

0,14 0,15 ' 0,14 0,13

0,13 0,13 - 0,10

1,10 0,13 0,11 -

0,11 0,28 0,15 -

Lymphknotenmetastasen

Datenblatt: Zahl intestinaler Lymphknotenmetastasen

Die Therapie wurde aus Verträglichkeitsgründen am Tag 14 abgebrochen. Cu-(Melphalan) ₂ ist sowohl in der Dosierung von 8,8 μmol/kg als auch 13,2 μmol/kg signifikant gegenüber dem Primärtumor antitumoral wirksam. Gegenüber Lungenmetastasen und Lymphknotenmetastasen wurde eine si¬ gnifikant antimetastatische Wirkung einer Dosierung von 13,2 μmol/kg fest¬ gestellt. In einer Dosierung von 8,8 μmol/kg ist Cu-(Melphalan) ₂ auch signifi¬ kant antiangiogen wirksam.

Beispiel 6

Wirksamkeit von Cu(Melphalan) ₂ verglichen mit Melphalan in NOD/SCID Mäusen injiziert mit OVCAR-3 Tumorzellen

2 x 10 ⁶ OVCAR-3/P19 Tumorzellen wurden in weibliche NOD/SCID-Mäuse s.c. injiziert. Die Mäuse wurden wie folgt behandelt.

Die Behandlung begann bei einem mittleren Tumorvolumen von 80 mm ³ . In der Kontrollgruppe wurde ein stabiles und stetiges Tumorwachstum beob¬ achtet. Das durchschnittliche Tumorvolumen im Verlauf der Behandlung ist in Abbildung 8 dargestellt.

Um mögliche Unterschiede der Tumorvolumina bei Beginn der Behandlung in den einzelnen Gruppen zu nivellieren und Unterschiede aufgrund der geringen absoluten Volumina in den Behandlungsgruppen evident zu ma¬ chen sind die relativen Tumorvolumina (RTV) analysiert worden. Das re- lative Tumorvolumen ergibt sich aus dem Verhältnis des Volumens am Tag x und des Tumorvolumens bei Beginn der Behandlung beim gleichen Ver¬ suchstier. Die RTVs ab Behandlungsbeginn für die mit Chemotherapeutika behandelten Gruppen sind in Abbildung 9 dargestellt. Diese zeigt deutlich, dass Kupfer-Melphalan eine bessere Wirksamkeit als Meiphalan aufweist. Das mittlere RTV am Tag 37 der Gruppe 3 (Kupfer-Melphalan) erreicht nur 61 ,3 % der Gruppe 2 bzw. 8,2 % der Kontrolle. Bereits nach 7 Tagen ist das Tumorwachstum in Gruppe 2 gestoppt. Nach 3 Tagen mit konstantem Tumorvolumen setzt ab Tag 30 (10. Tag der Behandlung) eine Tumorre¬ gression in den mit Kupfer-Melphalan behandelten Versuchstieren ein.

Abbildung 10 zeigt eine statistische Analyse beider Dosisgruppen. Am Tag 37 wiesen beide Behandlungsgruppen (Gruppe 2 und 3) sowohl beim Tumorvolumen als auch beim relativen Tumorvolumen gegenüber der Kon¬ trollgruppe eine statistische Signifikanz (p<0,01, student's t-test) auf. Zusätz- lieh konnte eine statistisch signifikant bessere Wirkung durch Kupfer-Mel¬ phalan gegenüber Meiphalan am Ende der Behandlung (Tag 37) bestätigt werden. Die p-Werte für das mittlere Tumorvolumen bzw. das mittlere RTV am Tag 37, getestet mit einem Mann-Whitney rank sum test waren p = 0,021 bzw. P = O ₁ OL

Weiterhin wurde, wie die folgende Tabelle zeigt, festgestellt, dass im Gegen¬ satz zur Behandlung mit Kupfer-Melphalan das Tumorvolumen in Mäusen, die nur mit Meiphalan behandelt werden, am Ende der Studie über dem Tumorvolumen bei Behandlungsbeginn gelegen hat. Am Tag 37 hatten 6 von 8 Mäusen (75%) ein RTV > 1. Insgesamt lagen die Versuchstiere der Gruppe 2 am Ende der Behandlung zwischen von 20 % Tumorregression bzw. 98 % Wachstum. In der Gruppe 3 hatte ein Versuchstier ein RTV von 2,78, alle anderen waren in einem Bereich von 0,43 bis 0,78. Somit konnte

in 88 % der Mäuse in Gruppe 3 am Tag 37 eine Tumorregression zwischen 22 % und 57 % beobachtet werden. Sowohl die Häufigkeit der Tumorre¬ gression als auch die Stärke der Regression war in der Kupfer-Melphalan behandelten Gruppe deutlich höher.

Gruppe 1

Gruppe 2

Gruppe 3