Technisches Gebiet Die Erfindung betrifft Sulfonylester der allgemeinen Formel R1-COO-SO2-Z-R2, worin Z, R1 und R2 die im Anspruch 1 definierten Bedeutungen haben, eine Verwen- dung dieser Verbindungen zur Modifikation der Kinetik der enzymatischen Wirkung von Katalase, ein Verfahren zur Messung einer Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen wie Bakterien und/oder Pilze, insbesondere Schimmelpilze und/oder Hefen, in einer flüssigen Probe anhand der Entwicklung von Sauerstoff aus Wasserstoffperoxid, und eine Vorrichtung zur Ausführung dieses Verfahrens.

Stand der Technik Die Bestimmung der Keimbelastung von Lebensmitteln, Kühlschmierstoffen und der- gleichen, oder auch die Überprüfung der Wirksamkeit eines Biozides oder Desinfek- tionsmittels, erfolgt derzeit überwiegend durch mikrobiologische Methoden, die sich eines Wachstums der zu bestimmenden Mikroorganismen bedienen und deshalb langsam sind und sich nicht zur laufenden Kontrolle der Keimbelastung vor Ort eig- nen.

Die wichtigsten Verursacher der Keimbelastung sind bei Lebensmitteln hauptsächlich aerobe Mikroorganismen (wie Bakterien und/oder Pilze, insbesondere Schimmelpilze und/oder Hefen) und bei wässrigen Kühlschmierstoff-Emulsionen auch fakultativ an- aerobe Mikroorganismen. In allen Mikroorganismen, welche zur Energieerzeugung ein auf Cytochrom-Elektronentransport beruhendes Atmungssystem haben (und dies sind fast alle Mikroorganismen, die in Lebensmitteln und Kühlschmierstoff-Emul- sionen vorkommen) ist ein bestimmtes, Katalase genanntes Enzym zu finden, das chemisch ein tetrameres Eisen-Protein (Mr = 245000) mit 4 Häm-Mol in Form von Ferriprotoporphyrin IX mit Eisen (lit) ist. Katalase spaltet ausserordentlich rasch Was- serstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff, wobei die Sauerstoffentwicklung direkt proportional zur Enzymkonzentration verläuft. Darauf beruht ein bekanntes Verfahren zur Bestimmung der Keimbelastung, das schneller ist als vom Mikroorganismen-

wachstum abhängige Verfahren-vgl. dazu H. K. Frank & U. Hertkorn-Obst, Chem.

Mikrobiol. Technol. Lebensm. 6,143-149 (1980) und/oder R. G. Kroll, E. R. Frears & A. Bayliss, J. Appl. Bacteriol. 66,209-217 (1989). Die Messung der Sauerstoffent- wicklung kann auf verschiedene bekannte Weisen erfolgen, unter anderem mano- metrisch-vgl. dazu G. J. Wang & D. Y. C. Fung, J. of Food Safety 8, 46-47 (1986), so- wie EP-476850. Es ist bekanntlich vorteilhaft, die zu bestimmenden Mikroorganismen in eine wässrige Probe zu bringen und Wasserstoffperoxid in solcher Menge zu- zugeben, dass sich eine Konzentration von etwa 1 Vol.-% ergibt, wobei für die meis- ten zu bestimmenden Mikroorganismen der für die Messung optimale pH-Wert im neutralen Bereich bei 7 liegt.

Im übrigen sind, zur Bestimmung der Keimbelastung eines untersuchten Guts bzw. einer Probe davon, nur die lebenden Mikroorganismen zu erfassen, d. h. es ist nur die enzymatische Wirkung der aktiven intrazellulären Katalase dieser lebenden Mikroor- ganismen von Bedeutung und zu messen. Messfehler ergeben sich jedoch aus der enzymatischen Wirkung von in der Probe befindlicher aktiver endogener Katalase aus verschiedensten Quellen. So berichten sowohl H. K. Frank & U. Hertkorn-Obst wie auch R. G. Kroll, E. R. Frears & A. Bayliss über diverse Schwierigkeiten. Es ist ein besonderer Aufwand nötig, um zwischen lebenden und toten Hefezellen (Bierhefe) zu unterscheiden. Lebensmittel enthalten nicht-mikrobielle endogene Katalase, die durch Pflanzenteile (Gemüsesalate, Zwiebel), Saft (Apfelsaft, Zitronensaft) und tierisches Gewebe (Erythrozyten in Fleisch und Milch) in die Proben eingebracht wird und durch ihre enzymatische Wirkung die Messung deutlich verfälscht, es sei denn, die Wirkung dieser nicht-mikrobiellen endogenen Katalase sei vorgängig beispielsweise durch Hit- zebehandlung (Pasteurisierung, Konservierung) beseitigt worden. Auch Trinkwasser und Freiwasser enthalten störende Pflanzenreste und Schwebstoffe der verschie- densten Art, welche die Sauerstoffentwicklung bereits beim Einbringen des Wasser- stoffperoxids in die Probe katalysieren, es sei denn, diese Störsubstanzen werden durch Filtration beseitigt.

Die vorstehend erwähnten Schwierigkeiten machen die derzeit zur Verfügung ste- henden relativ schnellen Verfahren zur Bestimmung der Keimbelastung von Lebens- mitteln, Kühlschmierstoffen und dergleichen wie auch zur Überprüfung der Wirksam- keit eines Biozides oder Desinfektionsmittels unzuverlässig.

Aus EP-184260 ist ein Verfahren bekannt, mit dem der gesamte Gehalt an Katalase, nicht aber die Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen nach-

gewiesen wird. Bei diesem Verfahren wird sowohl die bakterielle wie auch die nicht- bakterielle d. h. endogene Katalase erfasst, was zu wesentlichen Differenzen führt.

Aufgrund des gestörten Zusammenhangs zwischen der Anzahl Kolonien bildender Einheiten (KbE) und den Katalase-Werten unter Biomasse-Einfluss ist somit nicht in jedem Fall eine Beurteilung der mikrobiellen Belastung bzw. die Messung der Kon- zentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen möglich.

Aus US-5610025 und/oder WO-93/15218 ist ein Verfahren bekannt, mit dem Was- serstoffperoxid zersetzende Enzyme in Gegenwart von Katalase nachgewiesen wer- den. Vor der Zugabe des Wasserstoffperoxids wird die Katalase durch Zugabe eines Hydroxylaminsalzes gehemmt. Zu einer Messung der Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen führt diese Lehre nicht.

Aufgabe der Erfindung ist es demnach, ein Verfahren zur Messung einer Konzentrati- on an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, dessen Messwert-Ergebnisse zuverlässig sind und insbesondere nicht von endogener Kata- lase verfälscht werden.

Aufgabe der Erfindung ist es demnach auch, chemische Verbindungen aufzuzeigen und zur Verfügung zu stellen, welche eine Modifikation der Kinetik der enzymatischen Wirkung von Katalase bewirken, insbesondere eine vorzugsweise irreversible Inakti- vierung der enzymatischen Wirkung von Katalase, insbesondere von aktiver endoge- ner Katalase, insbesondere ohne merkliche Inaktivierung der enzymatischen Wirkung von aktiver intrazellulärer Katalase.

Aufgabe der Erfindung ist es ebenfalls, ein Verfahren der vorgenannten Art, dessen Messwert-Ergebnisse schnell erhältlich und interpretierbar sind, sowie eine sich dazu eignende Vorrichtung zur Verfügung zu stellen.

Darstellung der Erfindung Zur Lösung dieser und weiterer Aufgaben, die aus der nachstehenden Beschreibung der Erfindung erkennbar sind, werden erfindungsgemässe neue chemische Verbin- dungen angegeben und deren erfindungsgemässe Verwendungen in den entspre- chenden Stoffansprüchen und Verwendungsansprüchen definiert.

Ebenfalls sind ein erfindungsgemässes Verfahren und bevorzugte Weiterbildungen davon in den entsprechenden Verfahrensansprüchen sowie eine bevorzugte erfin- dungsgemässe Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens und bevorzugte Weiterbildungen davon in den entsprechenden Vorrichtungsansprüchen definiert.

Dank der Einfachheit des erfindungsgemässen Verfahrens insbesondere im Zusam- menhang mit der erfindungsgemässen Vorrichtung zu dessen Ausführung ermöglicht die Erfindung, das Verfahren leicht, schnell und kostengünstig auszuführen, wobei eine direkte Anzeige einer Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorga- nismen ermöglicht wird.

Da beim erfindungsgemässen Verfahren sowohl die Reaktionszeit als auch die Mess- zeit gering sind, besteht beispielsweise die Möglichkeit, ein Lebensmittel direkt vor der Vermarktung oder kurz vor dem Verzehr einer Kontrolle zu unterziehen, um Chargen mit zu hoher Keimbelastung noch rechtzeitig zurückhalten zu können.

Insbesondere sind die Messwert-Ergebnisse des erfindungsgemässen Verfahrens in kürzerer Zeit als etwa einer halben Stunde und deshalb aktuell (praktisch in Echtzeit) erhältlich, was deren Verwendung vor Ort bei der Steuerung und/oder Kontrolle eines Verfahrens ermöglicht, wobei die aktive intrazelluläre Katalase diejenige von leben- den Mikroorganismen wie Bakterien und/oder Pilze, insbesondere Schimmelpilze und/oder Hefen, ist.

Zudem bewirken die von der Erfindung aufgezeigten und zur Verfügung gestellten chemischen Verbindungen eine Modifikation der Kinetik der enzymatischen Wirkung von Katalase, welche deren Verwendung zur Abtötung von Mikroorganismen ermög- licht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand der Zeichnungen näher beschrieben. Dabei zeigen : Figur 1 bis 8 aufeinanderfolgende Schritte eines erfindungsgemässen Verfahrens anhand schematischer Darstellungen von dazu verwendeten Gegen- ständen und Flüssigkeiten ;

Figur 9 ein schematisch dargestelltes Druckmessgerät einer Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens mit einem Druckson- denteil und einem Druckauswerteteil in jeweils schematischer Darstel- lung ; Figur 10 ein schematisch dargestelltes Entlüftungswerkzeug einer Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens ; und Figur 11 einen schematisch dargestellten Stopfen zur Verwendung mit einer Vor- richtung zur Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens.

Wege zur Ausführung der Erfindung Es wurde im Rahmen der Erfindung gefunden, dass gewisse chemische Verbindun- gen fähig sind, die Kinetik der enzymatischen Wirkung von Katalase zu modifizieren.

Diese Modifikation kann bei aktiver endogener Katalase oder aktiver intrazellulärer Katalase verschieden sein. In Abhängigkeit der verwendeten chemischen Verbindung und des Typus der davon modifizierten Katalase (endogen oder intrazellulär, in letz- terem Fall in Zellen verschiedener Mikroorganismen vorliegend) kann sich diese Mo- difikation als irreversible Inaktivierung der gesamten Katalase auswirken, und/oder es kann eine irreversible Inaktivierung von aktiver endogener Katalase ohne merkliche Inaktivierung der enzymatischen Wirkung von aktiver intrazellulärer Katalase erreicht werden. Daraus ergibt sich eine Vielfalt von Anwendungen, unter denen die Messung einer Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen und/oder die Ab- tötung von Mikroorganismen als von besonderem Interesse sind.

Die in diesem Zusammenhang in Frage kommenden Mikroorganismen können Bakte- rien und/oder Pilze, insbesondere Schimmelpilze und/oder Hefen sein.

Die in diesem Zusammenhang in Frage kommenden chemischen Verbindungen sind Sulfonylester der allgemeinen Formel R1-COO-S02-Z-R2 worin Z für Phenylen steht oder abwesend ist, R1 über ein primäres oder sekundäres Kohlenstoffatom mit dem Kohlenstoffatom des Säureradikals-COO-verbunden ist und für geradkettiges oder ver-

zweigtes Alkyl mit 2 bis 21000 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder ver- zweigtes Alkenyl mit 2 bis 21000 Kohlenstoffatomen, oder geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2 bis 21000 Kohlenstoffatomen steht, und R2 über ein sekundäres oder tertiäres Kohlenstoffatom mit dem Radikal Phenylen in Position ortho, meta oder para zum Radikal S02, wenn Z vorhanden ist, oder mit dem Radikal SO2, wenn Z abwesend ist, verbunden ist und für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 3 bis 100 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 3 bis 100 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 3 bis 100 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 3 bis 100 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Hydroxyalkyl mit 3 bis 100 Kohlenstoffatomen, wobei das Radikal Hydroxy über ein primäres oder sekundäres Kohlen- stoffatom mit dem Radikal Alkyl verbunden ist, oder Polyoxaalkyl mit 3 bis 100 Kohlenstoffatomen steht.

Unter diesen Verbindungen sind unter anderem bevorzugt : worin n und m natürliche Zahlen sind und 3 < (n+m) < 60, <BR> <BR> CH2=CH-COO-S02-CH2-CH=CH-C13H27,<BR> CH2=CH-COO-S02-0-C12H25, CH2=CH-COO-S02-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-C12H25 Herstellung und Untersuchung der Verbindung In einen 1000-ml-Erlenmeyer-Kolben werden 460 ml destilliertes Wasser gegeben und dann 94 g Dodecylbenzolsulfonsäure Natriumsalz zugegeben. Bei etwa 50°C wird mit einem Magnetrührer bis zur vollständigen Auflösung gerührt, dann wird die

Lösung etwa 15 Minuten zum Abkühlen stehengelassen. Daraufhin werden 2,4 ml wasserfreie Acrylsäure langsam unter Rühren zugegeben, und die Lösung wird weiter gerührt, bis sie die Raumtemperatur erreicht. Nach Stehenlassen dieser Lösung wäh- rend mindestens 24 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur werden in einen 250- ml-Erlenmeyer-Kolben 79,5 ml destilliertes Wasser gegeben und dann 0,5 ml einer 0,066 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,00) unter Rühren zugegeben. Anschlies- send wird 1 g des am Vortag erhaltenen Lösungsgemisches unter Rühren zugege- ben. Die so erhaltene Lösung der Titelverbindung hat einen pH-Wert von etwa 4,6.

Als Reagenzien werden bereitgestellt : Katalase aus Rinderleber (als aktive endogene Katalase) Katalase aus Aspergillus niger (als aktive intrazelluläre Katalase) Katalase aus Mikroorganismen () (als aktive intrazelluläre Katalase) (*) diverse Bakterien und/oder Pilze Entschäumer (RD von Dow Corning) Wasserstoffperoxid (Perhydrols 30% von Merck) Jede Probe enthält pro 1 mi destilliertes Wasser jeweils 35 Einheiten Katalase aus Rinderleber oder aus Aspergillus niger oder aus Mikroorganismen. Die 1-ml-Probe wird in ein 15-ml-Röhrchen (Vacutainer° 16 x 125 mm von Becton Dickinson) gege- ben, jeweils mit 7 mi der vorgenannten Lösung der Titelverbindung versetzt und damit vermischt (Mischgerät Vortex Genie 2 von Merck). Dann wird 1 Tropfen des genann- ten Entschäumers zugegeben und erneut vermischt. Danach werden 0,23 g des ge- nannten Wasserstoffperoxids zugegeben, und das Röhrchen wird sofort mit einem Stopfen aus chemikalienbeständigem elastischem Kunststoff (Vitono von Du Pont de Nemours) gasdicht verschlossen, mit Hilfe einer den Stopfen durchstechenden Hohl- nadel (injektionsnadel 0 1 mm) kurz (wenige Sekunden) entlüftet und gleich danach durch Zurückziehen der Hohlnadel aus dem Stopfen wieder gasdicht verschlossen.

Das gasdicht verschlossene Röhrchen wird bei Raumtemperatur während 15 Minuten stehengelassen. Danach wird das horizontal gekippte Röhrchen 10mal hin und her geschüttelt, um sicherzustellen, dass die Zellmembranen aufplatzen. Dann wird der Druck im Röhrchen gemessen (vgl. weiter unten die Beschreibung des bevorzugten Druckmessers).

Es wird festgestellt, dass sich der Druck im Röhrchen nicht erhöht. Daraus folgt, dass die Titelverbindung sowohl aktive endogene Katalase als auch aktive intrazelluläre Katalase inaktiviert. Daraus folgt auch, dass die Titelverbindung zur Abtötung von

Mikroorganismen verwendbar ist, da diese Mikroorganismen, deren intrazelluläre Ka- talase inaktiviert ist, wegen des Fehlens der Wirkung dieser Katalase absterben.

Herstellung und Untersuchung der Verbindung CH2=CH-COO-S02-0-C12H25 In einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben werden 200 ml destilliertes Wasser gegeben und dann 25 g Natriumlaurylsulfat zugegeben. Bei etwa 70°C wird mit einem Magnet- rührer bis zur vollständigen Auflösung gerührt. Unter Beibehaltung der Temperatur werden daraufhin 1,07 g Polyacrylsäure (M, = 500000 bis 1000000) langsam unter Rühren zugegeben, und die Lösung wird während 45 Minuten weiter gerührt. An- schliessend werden 5 ml einer 0,25 M Lösung von Dinatriumhydrogenphosphat- Dihydrat in destilliertem Wasser zugegeben, und dann werden alle 15 Minuten jeweils 2 ml der Lösung nachdosiert, bis insgesamt 12 ml der Lösung verbraucht sind. Das erhaltene Lösungsgemisch wird zunächst unter Beibehaltung der Temperatur wäh- rend 60 Minuten weiter gerührt und dann auf Raumtemperatur gekühlt. Das so erhal- tene Lösungsgemisch hat einen pH-Wert von etwa 5,9. Nun werden in einen 250-ml- Erlenmeyer-Kolben 42 ml destilliertes Wasser gegeben und dann 5 ml einer 0,066 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,00) unter Rühren zugegeben. Anschliessend wer- den 3 g des vorhin erhaltenen Lösungsgemisches unter Rühren zugegeben. Die so erhaltene Lösung der Titelverbindung hat einen pH-Wert von etwa 6,4.

Es werden die gleichen Reagenzien bereitgestellt, die bereits im vorangehenden be- schrieben wurden, und es wird auf gleiche Weise wie im vorangehenden die Katalase der Wirkung der Titelverbindung ausgesetzt und die sich danach ergebende Aktivität der Katalase über die Sauerstoffentwicklung (Druckerhöhung) untersucht.

Wenn in der Probe nur aktive endogene Katalase vorliegt, wird festgestellt, dass sich der Druck im Röhrchen nicht erhöht. Wenn jedoch in der Probe auch aktive intrazellu- läre Katalase aus Mikroorganismen wie Bakterien und/oder Pilze, insbesondere Schimmelpilze und/oder Hefen, vorliegt, wird festgestellt, dass sich der Druck im Röhrchen erhöht. Daraus folgt, dass die Titelverbindung aktive endogene Katalase inaktiviert, jedoch aktive intrazelluläre Katalase nicht merklich inaktiviert.

Verwendungen der erfindungsgemässen Verbindungen Die vorangehenden Beispiele von Herstellung und Untersuchung von erfindungsge- mässen chemischen Verbindungen zeigen auf, dass letztere eine Modifikation der Kinetik der enzymatischen Wirkung von Katalase bewirken. Es hat sich gezeigt, dass sich je nach der verwendeten erfindungsgemässen Verbindung und je nach den da- mit behandelten Mikroorganismen eine reversible oder irreversible Inaktivierung der enzymatischen Wirkung von Katalase ergibt, wobei es durch geeignete Wahl der er- findungsgemässen chemischen Verbindungen möglich ist, entweder nur aktive endo- gene Katalase oder sowohl letztere wie auch aktive intrazelluläre Katalase insbeson- dere von lebenden Mikroorganismen wie Bakterien und/oder Pilze, insbesondere Schimmelpilze und/oder Hefen, in ihrer enzymatischen Wirkung zu inaktivieren.

Erfindungsgemässe chemische Verbindungen, welche die aktive intrazelluläre Kata- lase von lebenden Mikroorganismen wie Bakterien und/oder Pilze, insbesondere Schimmelpilze und/oder Hefen, in ihrer enzymatischen Wirkung irreversibel inaktivie- ren, bewirken das Absterben dieser Mikroorganismen.

Nachstehend wird das Vorgehen zur Verwendung der erfindungsgemässen chemi- schen Verbindungen zur Messung einer Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen wie Bakterien und/oder Pilze, insbesondere Schimmelpilze oder Hefen, beschrieben.

Verfahren zur Messung einer Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikro- organismen in einer Probenflüssigkeit Das erfindungsgemässe Verfahren zur Messung einer Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen in einer Probenflüssigkeit wird nachstehend an- hand der Figuren 1 bis 8 beschrieben. Es beruht auf der Bestimmung der Entwicklung von Sauerstoff aus Wasserstoffperoxid, das der gegebenenfalls verdünnten und/oder gepufferten Probenflüssigkeit zugegeben und durch in der Probenflüssigkeit enthalte- ner Katalase schnell zu Sauerstoff und Wasser abgebaut wird.

Figur 1 zeigt einen bereitgestellten, im wesentlichen zylindrischen Behälter in einer Ausbildung als Reagenzglas 1, welches beispielsweise ein 15-ml-Röhrchen Vacutai- nero 16 x 125 mm von Becton Dickinson ist, und das mit einem darauf aufsetzbaren

Stopfen 2 aus chemikalienbeständigem elastischem Kunststoff beispielsweise aus Viton'3 von Du Pont de Nemours gasdicht verschliessbar ist. Zur Veranschaulichung ist in Figur 1 der Stopfen 2 auf das Reagenzglas 1 aufgesetzt dargestellt.

Figur 2 veranschaulicht, dass 1 ml der zu untersuchenden Probenflüssigkeit 3 in das Reagenzglas 1 eingesetzt wird. Nicht dargestellt ist dabei, dass die Probenflüssigkeit 3 gegebenenfalls aus einer ursprünglichen Probe durch Verdünnung und/oder Puffe- rung (vorzugsweise auf einen pH-Wert zwischen 6 und 7) gewonnen wurde.

Figur 3 veranschaulicht, dass der Probenflüssigkeit 3 nun 7 mi einer Reagenzflüssig- keit 4 zugemischt werden, die eine etwa 0,05 M wässrige Lösung des erfindungsge- mässen Wirkstoffes d. h. einer erfindungsgemässen chemischen Verbindung oder eines Gemisches von erfindungsgemässen chemischen Verbindungen ist. Dabei wird, im Hinblick auf die angestrebte Messung einer Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen, der erfindungsgemässe Wirkstoff so gewählt, dass er die enzymatische Wirkung von in der Probenflüssigkeit allenfalls vorhandener endogener Katalase inaktiviert, jedoch die enzymatische Wirkung von intrazellulärer Katalase der zur messenden Mikroorganismen nicht merklich inaktiviert.

Figur 4 veranschaulicht, dass den in Figur 3 veranschaulichten Flüssigkeitsmengen 3 und 4 nun, vorzugsweise durch dosiertes Eintropfen, etwa 0,2 ml (etwa 0,23 g) einer 30 Gew. -% igen wässrigen Wasserstoffperoxidlösung 5 zugemischt werden, worauf sich nach erfolgter Vermischung eine Konzentration von etwa 1 Vol.-% Wasserstoff- peroxid im resultierenden (in Figur 5 veranschaulichten) Gemisch 6 einstellt. Gege- benenfalls ist es hilfreich, vor der Zugabe der Wasserstoffperoxidlösung einen oder einige wenige Tropfen Entschäumer zuzugeben.

Figur 5 veranschaulicht, dass sofort nach der in Figur 4 veranschaulichten Zugabe der Wasserstoffperoxidlösung 5 der Stopfen 2 auf das Reagenzglas 1 aufgesetzt wird, um das Gemisch 6 gasdicht darin zu verschliessen.

Figur 6 veranschaulicht, dass sofort nach dem in Figur 5 veranschaulichten gasdich- ten Verschliessen des Reagenzglases 1 mit dem Stopfen 2 letzterer mit einer Hohl- nadel 7, welche beispielsweise eine Injektionsnadel 0 1 mm ist, durchstochen wird, worauf sich der im Reagenzglas 1 herrschende Gasdruck dem atmosphärischen Druck angleicht. Nach wenigen, vorzugsweise 1 bis 2 Sekunden wird die Hohlnadel 7 aus dem Stopfen 2 zurückgezogen, worauf letzterer dank seiner Elastizität und weil er

im Bereich des Reagenzglases 1 radial zusammengedrückt wird, einen von der zu- rückgezogenen Hohlnadel 7 hinterlassenen (nicht dargestellten) Durchstechkanal gasdicht verschliesst.

Figur 7 veranschaulicht, dass nun das Gemisch 6 im verschlossenen Reagenzglas 1 während einer vorbestimmten Reaktionszeit, die ab dem Zurückziehen der Hohlnadel 7 aus dem Stopfen 2 gezählt wird, vorzugsweise während 15 Minuten, gasdicht ein- geschlossen bleibt und dabei im horizontal gekippten Reagenzglas 1 geschüttelt wird, vorzugsweise durch ein 10maliges kräftiges Hinundherschütteln, das durch den Dop- pelpfeil 8 symbolisiert wird. Während dieser Reaktionszeit findet die Entwicklung von Sauerstoff aus dem im Gemisch 6 enthaltenen Wasserstoffperoxid statt.

Figur 8 veranschaulicht, dass am Ende der vorbestimmten Reaktionszeit der im Rea- genzglas 1 herrschende Druck gemessen wird, indem der Stopfen 2 von einer Hohl- nadel 9, welche beispielsweise ebenfalls eine Injektionsnadel 0 1 mm ist, durchsto- chen wird, wobei diese Hohinadel 9 mit einem schematisch dargestellten Drucksen- sor 10 verbunden ist. Dieser Drucksensor 10 ist seinerseits Teil eines Druckmessge- räts 11, das weiter unten im Zusammenhang mit Figur 9 näher beschrieben wird.

Aus einem Vergleich der Figuren 6 und 8 ist erkennbar, dass der Stopfen 2 von der Hohinadel 7 (zum Druckausgleich) und von der Hohlnadel 9 (zur Druckmessung) an verschiedenen Stellen durchgestochen wird, um ein Entweichen von Gas aus dem Reagenzglas 1 bei einem Einstechen der Hohlnadel 9 in den im Stopfen 2 von der zurückgezogenen Hohlnadel 7 hinterlassenen (nicht dargestellten) Durchstechkanal (und sich daraus ergebende Messfehler) zu vermeiden.

Bei der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens ist normalerweise bekannt, ob und in welchem Verhältnis das untersuchte Gut bzw. die Probe davon verdünnt wurde, um die Probenflüssigkeit 3 zu ergeben. Auch ist normalerweise aus Erfahrung bekannt, welche Arten von Mikroorganismen im untersuchten Gut vorherrschend auf- treten, so dass auch der Wirkungsgrad bzw. die Aktivität der im untersuchten Gut vorkommenden Katalase normalerweise bekannt ist. Mit Hilfe dieser Informationen und nachdem ein Blindwert sowie mit bekannten Konzentrationen gleichartiger Mikro- organismen eine Kennlinie des Druckmessgeräts 11 ermittelt worden sind, lässt sich aus dem gemessenen Druck die Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikro- organismen in der Probe errechnen. Es ist ein leichtes und braucht hier nicht näher beschrieben zu werden, im Druckmessgerät 11 einen Mikroprozessor 22 und Daten-

speicher 23 vorzusehen (vgl. dazu die Beschreibung weiter unten im Zusammenhang mit Figur 9), um darin die erwähnten Daten zu speichern und so zu verarbeiten, dass die Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen in der Probe auto- matisch errechnet und vorzugsweise direkt als Zahlenwert angezeigt wird.

Vorrichtung zur Messung einer Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroor- ganismen in einer Probenflüssigkeit Figur 9 veranschaulicht ein gesamthaft mit 11 bezeichnetes Druckmessgerät einer Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens. Das Druckmessge- rät 11 umfasst einen schematisch dargestellten und gesamthaft mit 12 bezeichneten Drucksondenteil und einen schematisch dargestellten und gesamthaft mit 13 be- zeichneten Druckauswerteteil, die über elektrische Leitungen eines abgeschirmten mehradrigen elektrischen Kabels 14 miteinander verbunden sind.

Der Drucksondenteil 12 umfasst einen Sockel 15 in Form einer zylindrischen blinden Hülse, deren Bohrung 16 beim Gebrauch vertikalachsig angeordnet ist. In diese Boh- rung 16 passt das Reagenzglas 1 mit geringem Spiel, wobei es etwa bis zur Hälfte seiner Länge axial darin einführt werden kann. Ein ringförmiger Rand des Sockels 15 am Ende der Bohrung 16 bildet eine Anschlagfläche 17, die dem ganz in die Bohrung 16 eingesteckten Reagenzglas 1 zugeordnet und zu diesem in vorbestimmter Lage positioniert ist, unabhängig davon, ob und wie weit hinein ein Stopfen 2 in das Rea- genzglas 1 eingeschoben ist, um letzteres zu verschliessen. Ferner umfasst der Drucksondenteil 12 die bereits genannte Hohlnadel 9 und den bereits genannten Drucksensor 10 sowie eine zylindrische blinde Positionierhülse 18, deren Bohrung 19 beim Gebrauch vertikalachsig angeordnet ist. Koaxial zur Bohrung 19 sind die Hohl- nadel 9 fest am Drucksensor 10 und dieser fest an der Positionierhülse 18 angeord- net. Ein ringförmiger Rand der Positionierhülse 18 am Ende der Bohrung 19 bildet eine Anschlagfläche 20 in fester Lage und Zuordnung zur Positionierhülse 18 und folglich über den Drucksensor 10 und die Hohlnadel 9 zu deren Spitze 21. Die axiale Länge der Positionierhülse 18 ist so bemessen, dass beim Gebrauch des Druckson- denteils 12 der Stopfen 2 soweit von der Hohinadel 9 durchstochen wird, letztere je- doch nur soweit in das Innere des Reagenzglases 1 eingeführt werden kann, dass ihre Spitze 21 oberhalb des im Reagenzglas 1 enthaltenen Gemisches 6 in einem dort befindlichen Gasraum bleibt. Schliesslich sind, wie aus Figur 9 ersichtlich, der Drucksondenteil 12, das Reagenzglas 1 und deren zugeordnete Anschlagflächen 17

und 20 so bemessen und zueinander positioniert, dass beim Durchstechen des Stop- fens 2 mit der Hohinadel 9 nur diese mit dem Stopfen 2 in Kontakt kommt, so dass letzterer nur geringfügig und vorwiegend nur radial belastet und folglich nicht in das Innere des Reagenzglases 1 eingedrückt wird, was eine Volumenänderung und sich daraus ergebende Messfehler verursachen würde, die somit vermieden werden.

Der Druckauswerteteil 13 umfasst einen Mikroprozessor 22 und Datenspeicher 23, die vom Drucksensor 10 im Drucksondenteil 12, über das Kabel 14, Daten erhalten.

Ausserdem sind zumindest ein Teil der Datenspeicher 23 (beispielsweise als EPROM, Flash-Memory oder sonstige auswechselbare und einsetzbare Speicher) und damit auch der Mikroprozessor 22 programmierbar. Somit können im Druckaus- werteteil 13 Daten zum Blindwert des Druckmessgeräts 11 wie auch Daten zu einer Kennlinie des Druckmessgeräts 11 gespeichert werden. Die Bestimmung dieser Kennlinie erfolgt mit bekannten Konzentrationen an lebenden und/oder aktiven Mik- roorganismen der gleichen Art wie diejenigen, die sich erwartungsgemäss in der Pro- benflüssigkeit 3 befinden, und in den Daten zur Kennlinie des Druckmessgeräts 11 können auch Daten zur Probenverdünnung subsumiert werden. Der so programmier- te Mikroprozessor 22 errechnet einen Wert der Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganismen in der Probe aus den Daten zum Druckwert, die vom Druck- sondenteil 12 über das Kabel 14 geliefert werden, sowie aus den Daten, die der Mik- roprozessor 22 aus den Datenspeichern 23 erhält. Dank dieser automatisierten und progammierten Errechnung ist es möglich, einen errechneten Wert zu erhalten, der direkt als Zahlenwert die Konzentration an lebenden und/oder aktiven Mikroorganis- men in der Probe darstellt und im Druckauswerteteil 13 auf einer Anzeige 24 er- scheint.

Figur 10 veranschaulicht ein schematisch dargestelltes und gesamthaft mit 32 be- zeichnetes Entlüftungswerkzeug einer Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsge- mässen Verfahrens. Einige Teile in diesem Entlüftungswerkzeug 32 sind entspre- chenden Teilen im Drucksondenteil 12 gleich, es kann sich sogar um dieselben Teile in anderer Funktion handeln : solche äquivalente Teile werden hier nur mehr erwähnt, es wird auf die weiter oben gegebene Beschreibung ihrer Äquivalente im Zusammen- hang mit dem Drucksondenteil 12 verwiesen.

Das Entlüftungswerkzeug 32 umfasst einen Sockel 25, der dem Sockel 15 gleich ist.

In eine Bohrung 26, die der Bohrung 16 gleich ist und beim Gebrauch ebenfalls verti- kalachsig angeordnet ist, passt das Reagenzglas 1 auf gleiche Weise. Ein ringförmi-

ger Rand des Sockels 25 am Ende der Bohrung 26 bildet eine Anschlagfläche 27, die der Anschlagfläche 17 gleich ist. Ferner umfasst das Entlüftungswerkzeug 32 die be- reits genannte Hohinadel 7 sowie eine zylindrische blinde Positionierhülse 28, deren Bohrung 29 beim Gebrauch vertikalachsig angeordnet ist. Parallel zur Achse der Boh- rung 29 aber nicht koaxial dazu d. h. exzentrisch ist die Hohlnadel 7 fest an der Positi- onierhülse 28 angeordnet. Ein ringförmiger Rand der Positionierhülse 28 am Ende der Bohrung 29 bildet eine Anschlagfläche 30 in fester Lage und Zuordnung zur Posi- tionierhülse 28 und folglich über die Hohlnadel 7 zu deren Spitze 31. Die axiale Länge der Positionierhülse 28 ist so bemessen, dass beim Gebrauch des Entiüftungswerk- zeugs 32 der Stopfen 2 nur soweit von der Hohlnadel 7 durchstochen wird und letzte- re nur soweit in das Innere des Reagenzglases 1 eingeführt werden kann, dass ihre Spitze 31 oberhalb des im Reagenzglas 1 enthaltenen Gemisches 6 in einem dort befindlichen Gasraum bleibt. Schliesslich sind, wie aus Figur 10 ersichtlich, das Ent- lüftungswerkzeug 32, das Reagenzglas 1 und deren zugeordnete Anschlagflächen 27 und 30 so bemessen und zueinander positioniert, dass beim Durchstechen des Stop- fens 2 mit der Hohinadel 7 nur diese mit dem Stopfen 2 in Kontakt kommt, so dass letzterer nur geringfügig und vorwiegend nur radial belastet und folglich nicht in das Innere des Reagenzglases 1 eingedrückt wird, was eine Volumenänderung und sich daraus ergebende Messfehler verursachen würde, die somit vermieden werden.

Figur 11 veranschaulicht Einzelheiten des schematisch im axialen Längsschnitt dar- gestellten Stopfens 2. Um zu gewährleisten, dass der Stopfen 2 einerseits das Rea- genzglas 1 gasdicht zu verschliessen vermag, andererseits von den Hohlnadel 7 und 9 durchstochen werden kann, ist dieser Stopfen 2 aus einem chemikalienbestän- digem elastischem Kunststoff hergestellt und im wesentlichen pilzförmig ausgebildet mit einem in das Reagenzglas 1 einführbaren Zylinder 33, an dem oben ein Kopf 34 und unten eine hülsenförmiger Dichtungslippe 35 angeformt sind. Bei mit dem Stop- fen 2 verschlossenen Reagenzglas 1 liegen, radial komprimiert, der Zylinder 34 und die Dichtungslippe 35 voll innerhalb des Reagenzglases 1, während der etwas breite- re Kopf 33 ausserhalb des Reagenzglases 1 bleibt und dessen Mündung überdeckt.

Wenn beispielsweise das Reagenzglas 1 ein 15-ml-Röhrchen Vacutainer 16 x 125 mm von Becton Dickinson ist und der Stopfen 2 aus Viton von Du Pont de Nemours besteht, beträgt die gesamte von den Hohlnadel 7 und 9 durchzustechende Höhe des Stopfens 2 etwa 5 mm, und der Zylinder 34 wird radial um etwa 7% komprimiert.

Im vorstehenden wurde die Erfindung anhand einzelner Beispiele beschrieben, die sich auf die Herstellung der erfindungsgemässen Substanzen und die Herbeiführung

und/oder Verwendung einer Modifikation der Kinetik der enzymatischen Wirkung von Katalase bezogen. Es bieten sich viele Einsatzmöglichkeiten für die erfindungsge- mässen Substanzen, für deren Verwendung zur Modifikation der Kinetik der enzyma- tischen Wirkung von Katalase und gegebenenfalls zur Abtötung von Mikroorganis- men, für das erfindungsgemässe Verfahren zur Messung einer Konzentration an le- benden und/oder aktiven Mikroorganismen und für die entsprechende erfindungsge- mässe Vorrichtung. Es können, in einer Auflistung von Beispielen ohne jegliche Ein- schränkung darauf, als Einsatzmöglichkeiten zur Messung, zur Kontrolle und/oder zur Verfahrenssteuerung, sowie zur Abtötung von Mikroorganismen, genannt werden : bei Lebensmitteln auf Stufe Konsum, Handel und Industrie (gegen mikrobiellen Verderb) ; bei der spanabhebenden Werkstoffverarbeitung (bezüglich wassermischbare Kühl- schmierstoffe usw. ) ; bei der Humanmedizin und der Tiermedizin insbesondere bei der Versorgung und Entsorgung in Spitälern und medizinischen Labors (Blut, Urin, Anla- gen und Instrumente, Verbandzeug usw. ) ; bei der Frischwasserversorgung, der Was- servorratshaltung und der Abwasserklärung ; bei Lüftungs-und Klimaanlagen (Frisch- luftreinigung, Luftzirkulation, Abluftentsorgung) ; und bei der Forschung und Entwick- lung auf den vorgenannten oder anderen Gebieten.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass mit dem dargestellten und be- schriebenen erfindungsgemässen Katalase-Verfahren a) auch sehr niedrige Keimzahlen aus einer Probe durch Filtration mittels geeig- neter Membranfilter nachgewiesen werden können ; b) eine Differenzierung zwischen Bakterien einerseits, Pilze und Hefen anderer- seits, durch Filtration mittels geeigneter Membranfilter möglich ist ; und c) eine höhere Empfindlichkeit der Messwerte erreicht wird, weil im Vergleich zum Bisherigen empfindlichere Druckaufnehmer-Sonden verwendet werden können ; und dass die erfindungsgemässe Verbindung sowohl aktive endogene Katalase als auch aktive bakterielle Katale inaktiviert und als aktive Desinfektionskomponente al- lein oder für die weitere Einarbeitung in Desinfektionsmitteln zu Abtötung von Mikro- organismen verwendbar ist.

Liste der Bezugszeichen 1 Reagenzglas 2 Stopfen 3 Probenflüssigkeit 4 Reagenzflüssigkeit 5 Wasserstoffperoxidlösung 6 Gemisch 7 Hohlnadel zum Druckausgleich 8 Hinundherschütteln 9 Hohlnadel zur Druckmessung 10 Drucksensor 11 Druckmessgerät 12 Drucksondenteil 13 Druckauswerteteil 14 elektrisches Kabel 15 Sockel des Drucksondenteils 12 16 Bohrung im Sockel 15 17 Anschlagfläche am Sockel 15 18 Positionierhülse 19 Bohrung der Positionierhülse 18 20 Anschlagfläche an der Positionierhülse 18 21 Spitze der Hohlnadel 9 22 Mikroprozessor 23 Datenspeicher 24 Anzeige 25 Sockel des Entlüftungswerkzeugs 32 26 Bohrung im Sockel 25 27 Anschlagfläche am Sockel 25 28 Positionierhülse 29 Bohrung der Positionierhülse 28 30 Anschlagfläche an der Positionierhülse 18 31 Spitze der Hohinadel 7 32 Entlüftungswerkzeug 33 Zylinder des Stopfens 2 34 Kopf des Stopfens 2 35 Dichtungslippe des Stopfens 2