GENE CHIMERE CODANT POUR UN FACTEUR DE TRANSCRIPTION MYB30 ET EXPRESSION DANS LES PLANTES La présente invention concerne un nouveau gène chimère dont 1'expression dans les plantes module la réponse aux agressions pathogènes, les cellules végétales comprenant ledit gène chimère intégré de manière stable dans leur génome, et les plantes transformées comprenant ledit gène chimère intégré de manière stable dans leur génome et/ou comprenant les cellules végétales ci-dessus.

Dans leur environnement naturel, les plantes sont constamment soumises à des agressions par des organismes pathogènes. Ceux-ci, avant de pouvoir pénétrer au sein de la plante, doivent tout d'abord traverser les barrières structurales représentées par les dépôts de cutine et de subérine présents à la surface des feuilles et des tiges, ainsi que la paroi pecto-cellulosique de chaque cellule. Souvent ces barrières structurales constitutives sont suffisantes et la plante résiste à l'infection. Dans le cas contraire, I'agresseur pénètre via l'action d'enzymes lytiques telles que les cutinases et les cellulases, ou via des ouvertures naturelles (stomates, hydathodes, racines) ou accidentelles (blessure), et la plante doit développer des mécanismes de défense au sein de ses tissus. L'aptitude de la plante à mettre en place rapidement de nouvelles stratégies de défense pour lutter contre son envahissement, ainsi que la capacité du pathogène à les détourner, sont les déterminants de l'issue de l'interaction.

Un microorganisme phytopathogène donné (bactérie, virus, champignon) attaque un nombre limité d'espèces végétales, qualifiées de plantes"hôtes", toutes les autres espèces étant qualifiées de"non-hôtes". L'interaction est dite"compatible"lorsqu'une plante hôte "sensible"interagit avec un agent pathogène"virulent"qui se développe au sein de la plante, y provoquant la maladie. A l'inverse, I'interaction est dite"incompatible"lorsque la plante hôte"résistante"développe des réactions de défense empchant l'agent pathogène "avirulent"de se multiplier. Est également qualifiée d'incompatible une interaction ayant lieu entre une plante non-hôte et un agent pathogène virulent ou avirulent.

Au cours d'une interaction incompatible, 1'une des réponses de défense de la plante

les plus spectaculaires est la Réponse Hypersensible ou HR. Cette réponse forte et rapide est caractérisée par la mort des cellules au point d'infection, et de celles situées immédiatement autour. La HR peut tre déclenchée en réaction à l'infection par des agents pathogènes très variés et peut intervenir seulement quelques heures après contact entre la plante et l'agent pathogène entraînant une nécrose rapide et limitée. La mort cellulaire est programmée génétiquement, bien que les données expérimentales en ce sens soient encore fragmentaires. L'une des meilleures indications de l'existence de tels programmes de mort cellulaire est l'identification de mutants de plantes présentant des lésions spontanées (en l'absence de toute attaque par un agent pathogène) qui peuvent tre de deux types, nécrotiques ou chlorotiques. Ceci suggère l'implication de différents programmes de mort cellulaire au cours de la pathogénèse.

Le déclenchement de la HR est conditionné par la reconnaissance par la plante du pathogène. Cet événement initial de reconnaissance, via la transduction du (des) signal (aux) perçu (s), conduit à l'exécution d'un programme de mort cellulaire. La théorie dite "gène-pour-gène"définie par Flor en 1947 (Flor, 1947) décrit la spécificité de reconnaissance entre une plante hôte et un agent pathogène. Cette reconnaissance fait intervenir un gène de"résistance"ou gène R généralement dominant chez la plante, et un gène dominant d"'avirulence"ou Avr chez le pathogène. Un modèle"éliciteur/récepteur"fut proposé pour expliquer cette théorie. Dans ce modèle, les gènes Avr codent des éliciteurs reconnus directement ou indirectement comme ligands par les récepteurs codés par les gènes R (Keen, 1990). Il faut remarquer qu'une plante peut posséder de nombreux gènes R, comme un pathogène peut avoir de nombreux gènes Avr. Ainsi, il serait possible d'étendre la théorie gène-pour-gène aux interactions non-hôtes, où l'addition de plusieurs reconnaissances aboutiraient à la résistance.

Suite aux événements de reconnaissance entre la plante résistante et l'agent pathogène avirulent, les voies de signalisation conduisant à la réponse hypersensible mettent en jeu la phosphorylation/déphosphorylation de protéines, des flux d'électrolytes à travers la membrane plasmique, la production d'espèces réactives de l'oxygène, et probablement d'autres événements encore inconnus. Le rôle de chacune de ces modifications du métabolisme des cellules végétales n'est pas toujours démontré de façon stricte, mais un

faisceau de données expérimentales les met en exergue. Cependant, la séquence de ces événements de signalisation n'est pas clairement déterminée, et pourrait varier selon le pathosystème.

La mort cellulaire hypersensible est programmée génétiquement, comme indiqué par de nombreux travaux récents, et peut tre comparée avec d'autres formes de mort cellulaire programmée (pcd) chez les plantes et avec l'apoptose chez les animaux. Les composantes requises pour la régulation de la mort cellulaire hypersensible sont actuellement identifiées génétiquement par l'isolement de mutants"lésions spontanées", comme précédemment mentionné. Ces mutants montrent des phénotypes qui sont caractérisés par l'apparition de lésions nécrotiques similaires à celles observées lors d'une réponse hypersensible. Ces lésions peuvent tre délimitées, ou se propager. Une interprétation de ces phénotypes a été proposée (Walbot et al., 1983), suggérant que la mort cellulaire initiée par quelque stimulus que ce soit est autocatalytique et contrôlée par un système suppresseur. Des mutations causant l'apparition spontanée de lésions délimitées (mutants d'initiation) sont supposées affecter des gènes impliqués dans l'initiation de la mort cellulaire, tandis que des mutants montrant des lésions propagatives (mutants de propagation), sont supposés tre affectés dans des suppresseurs de la mort cellulaire ou des gènes impliqués dans la limitation de la mort cellulaire. Les gènes qui sont affectés par ces mutations joueraient un rôle dans la résistance, plusieurs de ces mutants montrant une expression de marqueurs histochimiques, biochimiques et moléculaires associés aux réponses de résistance des plantes.

Il existe à l'heure actuelle peu de données concernant les acteurs de la mort cellulaire ayant lieu au cours des interactions plantes/microorganismes pathogènes. La recherche de ces composantes est donc un terrain d'investigation particulièrement important à explorer.

. Diverses stratégies peuvent tre développées dans ce but : 1'une d'entre elles est l'identification de gènes dont l'expression est induite de façon spécifique au cours de la HR Cette approche, développée chez Arabidopsis thaliana, a abouti à l'isolement du gène AtMYB30, qui code un facteur transcriptionnel de type MYB (Lacomme, 1996). Les facteurs MYB sont des protéines régulatrices de la transcription d'autres gènes, présents chez la quasi totalité des tres vivants, particulièrement nombreux chez les végétaux, et notamment chez Arabidopsis, où leur famille compte plus d'une centaine de membres. Ils

sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques, mais aucun d'entre eux n'a encore été impliqué dans la régulation de la mort cellulaire.

La découverte de l'existence des facteurs MYB provient de travaux de recherche effectués dans le domaine animal. L'étude de la leucémie affectant les myéloblastes du Poulet causée par le virus de la myéloblastose des volailles ou AMV (pour Avian Myeloblastic Virus) a en effet conduit à l'identification de la séquence nucléotidique virale du gène responsable du pouvoir oncogène (Duesberg et al., 1980). Cette séquence présentait des homologies extrmement fortes avec un gène (PROTO-AMT) contenu dans 1'ADN cellulaire du poulet (Souza et al., 1980). Ce gène a été rebaptisé C MYB (pour cellular myeloblastosis) et la séquence transduite dans le génome du virus, V MYB (Klempnauer et al., 1982). Le passage de C-MYB vers V-MYB résulte d'un réarrangement de 1'ADN cellulaire impliquant des délétions d'une partie de chacune des extrémités 3'et 5' du gène C MYB. Par la suite, des gènes fortement homologues à C MYB ont été identifiés et clones chez toutes les espèces animales étudiées : l'homme possède quatre gènes MYB (HsMYB, A-MYB, B-MYB et HsMYBCDC5) (Bernstein and Coughlin, 1997 ; Majello et al., 1986 ; Nomura et al., 1988), la souris un seul (C-MYB) (Gonda et al., 1985), la drosophile au moins deux (D-MYB et DmMYBCDC5) (Katzen et al., 1985 ; Ohi et al., 1998).

Ces gènes sont aussi présents chez les levures Saccharomyces cerevisiae (ScMYBBASl, ScMYBREBI et ScMYBCDC5) (Ohi et al., 1998 ; Tice-Baldwin et al., 1989) et Schizosaccharomyces pombe (SpMYBCDC5) (Ohi et al., 1994), le champignon filamenteux ascomycète Aspergillus nidulans (AnMYBFLBD) (Wieser and Adams, 1995), le nématode Caenorhabditis elegans (CeMYBCDCS) (Ohi et al., 1998), et l'amibe Dictyostelium discoideum (DdMYBl et DdMYB2) (Otsuka and Van Haastert, 1998 ; Stober- Grasseretal., 1992).

Chez les végétaux, le premier gène codant un facteur transcriptionnel de type MYB identifié fut le gène ZmMYBCI du Maïs, correspondant à un locus étudié depuis 1984 (Rhoades, 1984 ; Paz-Ares et al., 1987). Contrairement à leurs homologues animaux, les gènes MYB végétaux sont représentés chez les plantes par des familles multigéniques beaucoup plus étendues : une dizaine de membres chez le Maïs (Chopra et al., 1996 ; Hattori et al., 1992 ; Marocco et al., 1989 ; Paz-Ares et al., 1987 ; Timmermans et al., 1999),

l'Orge (Gubler et al., 1995 ; Marocco et al., 1989 ; Wissenbach et al., 1993) et Antirrhinum majus (Jackson et al., 1991 ; Noda et al., 1994 ; Waites et al., 1998). Ils ont été identifiés chez de nombreuses autres espèces végétales : le Tabac (Yang and Klessig, 1996), le Pois (Uimari and Strommer, 1997), le Riz (Gubler et al., 1997 ; Magaraggia et al., 1997), la Tomate (Lin et al., 1996), la Pomme de Terre (Baranowskij et al., 1994), Craterostigma plantagineum (Iturriaga et al., 1996), le Persil (Feldbrügge et al., 1997) et Lolium temulentum (Gocal et al., 1999), ainsi que la mousse Physcomitrella patens (Leech et al., 1993). On peut notamment citer le Pétunia qui posséderait de 20 à 40 gènes MYB (Avila et al., 1993), et surtout Arabidopsis thaliana dont les membres de la famille MYB seraient au moins au nombre de cent (Kranz et al., 1998 ; Romero et al., 1998), comme précédemment mentionné.

De récentes estimations sur le nombre total de gènes chez Arabidopsis (16000 à 25000) indiquent que les gènes MYB représenteraient 0,2 à 0,6% de ce total, représentant la plus grande proportion connue à ce jour pour une famille de gènes de régulation chez les plantes (Romero et al., 1998). Il existe d'autres familles de taille égale ou supérieure chez les eucaryotes, telles que la famille des gènes codant les protéines à doigt de Zinc, qui représenterait environ 1% des gènes humains (Hoovers et al., 1992). Cependant, la conservation de séquence globale entre les gènes est très faible dans cette famille (Klug and Schwabe, 1995), alors que les facteurs MYB végétaux partagent de très fortes similitudes de séquence en acides aminés (Romero et al., 1998). Pour déterminer le potentiel global de régulation des facteurs MYB chez les plantes, la recherche de la fonction de tous les gènes de cette famille a été entreprise chez Arabidopsis thaliana via la formation d'un consortium européen regroupant quinze laboratoires. Kranz et collaborateurs (Kranz et al., 1998) publièrent une étude concernant 97 gènes MYB dont plus de 30 nouveaux. Leur distribution dans le génome d'Arabidopsis montre qu'ils couvrent 92% de sa surface : mme s'il existe quelques rares loci comprenant plusieurs gènes (jusqu'à six sur 4 cM sur le chromosome V), cette distribution semble homogène et aléatoire (Kranz et al., 1998).

Au regard des connaissances générales exposées ci-dessus, l'homme du métier aurait considéré que la surexpression d'un gène impliqué dans la mort cellulaire entraînerait la formation de nécroses importantes, impliquant un phénotype de retard de croissance très

marqué, un phénotype de type « lésions spontanées » ou un phénotype altéré pour la HR, incompatible avec le développement de plantes transgéniques susceptibles de développement commercial.

Or, contrairement à ce qui aurait pu tre attendu, la surexpression du gène AtMYB30 dans les plantes permet d'augmenter leur tolérance aux agressions pathogènes, sans entraîner de réponses phénotypique de type nécroses.

La présente invention concerne donc un nouveau gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes, une séquence d'acide nucléique codant pour un facteur MYB30 et une séquence de régulation terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes, les éléments ci-dessus étant liés de manière fonctionnelle pour permettre 1'expression du gène MYB30 dans les cellules végétales et les plantes.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la séquence codant pour le facteur MYB30 est une séquence d'origine végétale, en particulier d'Arabidopsis thaliana.

De manière préférentielle, la séquence codant pour un facteur MYB30 est la séquence codant pour le facteur AtMYB30 représentée par la SEQ ID NO 1.

La présente invention concerne également les séquences capables de s'hybrider de manière sélective avec la séquence SEQ ID NO 1 ci-dessus, les séquences homologues à la séquence ci-dessus, les fragments de ladite séquence, et les séquences qui diffèrent de la séquence ci-dessus mais qui du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour la mme protéine.

Selon la présente invention, on entend par « séquence d'acide nucléique » une séquence nucléotidique ou polynucléotide, pouvant tre de type ADN, notamment double brin, en particulier de type ADNc.

Par « séquence capable de s'hybrider de manière sélective », on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence ci-dessus à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut tre lié à l'hybridation d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ADNc présents dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de

s'hybrider de manière sélective et la séquence définies par la SEQ ID NO 1 ci-dessus est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut tre mesuré par exemple, par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32p L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCI 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50°C-60°C).

L'hybridation peut bien entendu tre effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambrook & al., 1989, Molecular Cloning : A Labratory Manual).

Par « homologue », on entend selon l'invention une séquence d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la SEQ ID NO 1 et codant pour le facteur de transcription AtMYB30. Ces modifications peuvent tre obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à 1'expression d'un mme acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par la SEQ ID NO 1 et l'homologue correspondant peuvent tre importantes. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement et de préférence neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire du facteur de transcription AtMYB30.

Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al., 1993, J. Mol.

Evol. 36 : 290-300 ; Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403-10).

Par « fragments », on entend selon l'invention des fragments des séquences d'ADN définies par les séquences ID ci-dessus, c'est à dire les séquences ci-dessus pour lesquelles des parties ont été délétées mais qui conservent la fonction des dites séquences, c'est à dire codant pour un facteur de transcription de fonction et activité similaire et/ou équivalente à celle du facteur de transcription AtMYB30.

Dans le gène chimère selon l'invention, la séquence de régulation promotrice

fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes, est avantageusement hétérologue vis à vis de la séquence codant pour le facteur MYB30. Par « hétérologue » on entend selon l'invention une région promotrice fonctionnelle différente de la région promotrice fonctionnelle native de la séquence codant pour le facteur MYB 30.

Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant tre utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CaMV 19S ou 35S).

On peut encore utiliser une séquence de régulation promotrice spécifique de régions ou de tissus particuliers des plantes.

On peut également employer un promoteur inductible avantageusement choisi parmi les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (tableau 3 US 5 670 349), le promoteur HMG2 (US 5 670 349), le promoteur de la ß-galactosidase (ABG1) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate synthase (ACC synthase) de pomme (WO 98/45445).

Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec les promoteurs ci- dessus, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de transcription du virus de la mosaïque du tabac (VMT) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (VET) décrit par Carrington & Freed.

Dans le gène chimère selon l'invention, la séquence de régulation terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes, est également avantageusement hétérologue vis à vis de la séquence codant pour le facteur MYB30.

Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser

toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, d'origine virale, comme par exemple le terminateur du CaMV 35S, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.

La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut tre constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention.

De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.

L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules végétales ou des plantes, par intégration d'au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus, transformation qui peut tre obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, en particulier par le vecteur selon l'invention.

Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes.

D'autres méthodes peuvent tre utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.

L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la cellule végétale ou de la plante à transformer. On citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants : US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5, 187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US

5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.

La présente invention concerne également une cellule végétale ou une plante transformée comprenant un gène chimère selon l'invention définie ci-dessus. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la cellule végétale ou la plante transformée comprend au moins un autre gène hétérologue codant pour un peptide ou une protéine particuliers d'intért. Le gène chimère selon l'invention et le ou les autres gènes hétérologues peuvent avoir été introduits dans l'organisme hôte simultanément au moyen d'un mme vecteur les comprenant, ou au moyen de plusieurs vecteurs, ou de manière séquencée au moyen de plusieurs vecteurs, ou encore par croisement de plusieurs organismes hôtes, cellules végétales ou plantes, chacun comprenant un gène hétérologue.

Par"cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.

Par gène hétérologue, on entend selon l'invention tout gène introduit de manière artificielle dans l'organisme hôte, et plus particulièrement intégré de manière artificielle dans son génome, les méthodes permettant cette introduction ou intégration pouvant tre celles décrites précédemment, le contenu des références citées étant incorporé ici par référence.

Le gène hétérologue autre que le gène chimère selon l'invention peut tre un gène comprenant une séquence codante et les éléments de régulation en 5'et 3'de ladite séquence codante non modifiés par rapport au gène naturel, réintroduit de manière artificielle dans le génome d'un organisme hôte pouvant tre de la mme espèce que celui d'où le gène a été isolé, ou d'une espèce différente. Le gène hétérologue peut également tre un gène chimère comprenant une séquence codante d'origine végétale, bactérienne, fongique, virale ou animale, sous le contrôle d'éléments de régulation fonctionnels dans l'organisme hôte, différents de ceux naturellement liés fonctionnellement à la séquence codante.

La séquence codante du gène hétérologue ci-dessus peut comprendre toute séquence codant pour une protéine d'intért que l'on souhaite exprimer dans une cellule

végétale ou une plante autre que le facteur de transcription MYB30.

Il peut s'agir d'un gène codant pour un marqueur de sélection comme d'un gène conférant à la plante transformée de nouvelles propriétés agronomiques, ou d'un gène d'amélioration de la qualité agronomique de la plante transformée.

Marqueurs de Sélection Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme 1'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103.

Gènes d'intért Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une résistance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies, etc. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128.

Tolérance herbicide Parmi les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, on peut citer le gène Bar conférant une tolérance au bialaphos, le gène codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible comme le glyphosate et ses sels (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR . 2 736 926), le gène codant pour la glyphosate oxydoréductase (US 5,463,175), ou encore un gène codant pour une HPPD conférant une tolérance aux herbicides ayant pour cible l'HPPD comme les isoxazoles, notamment 1'isoxafutole (FR 95 06800, FR 95 13570), les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631) ou les tricétones, notamment la sulcotrione (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195). De tels gènes codant pour une HPPD conférant une tolérance aux herbicides ayant pour cible l'HPPD sont décrits dans la demande de brevet

WO 96/38567.

Résistance aux Insectes Parmi les protéines d'intért conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).

Résistance aux Maladies Parmi les protéines ou peptides d'intért conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, l'oxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore des peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plante, ou bien les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al., 1993 ; Panabières & al., 1995).

Modification de la qualité On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés (Korit, A. A. & al., Eur. J. Biochem. (1991) 195,329-334 ; WO ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822).

Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, le gène hétérologue autre que le gène chimère selon l'invention est un gène codant pour une protéine ou peptide d'intért conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies.

La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées telles que définies ci-dessus, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées et leur descendance. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus.

La présente invention concerne aussi les plantes transformées, génétiquement

modifiées, dans le génome desquelles le gène chimère selon l'invention est intégré de manière stable et transmissible par reproduction sexuée.

La présente invention concerne également des plantes obtenues par croisement des plantes régénérées ci-dessus avec d'autres plantes. Elle concerne aussi les graines de plantes transformées.

On entend par"plante"selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le mais, le blé, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, le colza, le soja, etc, plus particulièrement les plantes dicotylédones, en particulier coton, colza ou soja, et de préférence des crucifères comme le colza.

La présente invention concerne également un procédé permettant d'améliorer la résistance des plantes aux agressions pathogènes, en particulier fongiques, ledit procédé consistant à surexprimer dans les dites plantes un facteur de transcription MYB30.

Par « surexprimer », on entend selon l'invention une expression du facteur MYB30 additionnelle à 1'expression naturelle du facteur MYB30 se trouvant nativement dans les plantes.

De manière avantageuse, la surexpression est assurée de manière constitutive, ou non induite dans un tissu donné de la plante, de manière à assurer une surexpression constante du facteur MYB30 dans les tissus susceptibles d'tre infectés par un agent pathogène.

La surexpression est de préférence assurée par l'intégration dans le génome de la plante d'un gène chimère selon l'invention tel que défini auparavant, en particulier un gène chimère dont la séquence de régulation promotrice est choisie parmi les promoteurs constitutifs comme les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876) le promoteur 19S ou 35S du virus de la mosaïque du chou fleur (CaMV 19S ou 35S), et les promoteurs spécifiques de régions ou de tissus particuliers des plantes.

De manière avantageuse, la plante est une plante transformée selon l'invention telle que définie auparavant.

La présente invention concerne également un procédé de traitement des plantes transformées selon l'invention avec une composition agrochimique les comprenant.

La présente invention concerne aussi un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention, le procédé consistant à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.

Par composition agrochimique, on entend selon l'invention toute composition agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités suivantes, herbicide, fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.

Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé selon l'invention, la -composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une activité complémentaire de celle du produite par le gène chimère exprimant le facteur MYB30 dans les plantes transformées selon l'invention.

De manière préférentielle, le spectre d'activité des composés fongicides est complémentaire du spectre de résistance aux agents pathogènes conféré par le gène chimère selon l'invention.

Par spectre complémentaire, on entend selon l'invention un spectre d'activité pour le gène chimère selon l'invention distinct du spectre d'activité des composés, ou un spectre d'activité portant sur des agents infectieux identiques mais permettant un contrôle identique ou amélioré pour de moindres doses d'application en composés fongicides.

L'expression du gène chimère selon l'invention dans les plantes transformées a montré, outre une résistance améliorée aux agressions fongiques sans phénotype de type « nécroses », « lésions spontanées » ou également altéré pour la HR, la possibilité d'obtenir un ralentissement du phénomène de vieillissement de certains tissus comme les feuilles.

Cettte propriété est particulièrement importante dans une stratégie de culture de plantes impliquant la création d'une biomasse élevée, notamment pour l'alimentation animale ou

humaine, ou dans le cas de plantes génétiquement modifiées pour produire des protéines d'intért à haute valeur ajoutée comme des enzymes de type additif alimentaire, par exemple des vitamines, de type vaccins ou à vocation thérapeutique.

L'emploi de promoteurs spécifiques de certains tissus permettra de retarder la sénescence des dits tissus. Par exemple, un promoteur de type lumière dépendant, comme un promoteur de la petite sous unité de la RuBisCo de plante, permettra d'orienter cette propriété de retard de la sénescence dans les seuls tissus verts comme les feuilles, permettant notamment l'augmentation de la biomasse.

Il est entendu que pour la présente invention, 1'expression d'un gène antisens MYB30 permettant d'obtenir les effets inverses, comme une diminution de la résistance aux pathogènes ou une accélération de la sénescence.

Les gènes chimères antisens correspondants aux gènes sens définis ci-dessus, c'est à dire pour lesquels la séquence codant pour un facteur MYB30 est remplacée par la séquence antisens correspodante, comme les cellules végétales ou plantes transformées correspondantes font également partie de la présente invention.

Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée.

Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au mme résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut tre utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au mme résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al ou dans Sambrook et al 1989.

Abréviations ACO ACC Oxydase ADN Acide Désoxyribonucléique ADN-T ADN de transfert AMV Virus de la myéloblastose aviaire (Avian Myeloblastic Virus) ARN Acide Ribonucléique

AtMYB30 Gène d'Arabidopsis thaliana"MYB30" AtMYB30 Protéine issue du gène AtMYB30 bp paire de bases (bases pair) CaMV Virus de la mosaïque du Chou-fleur (Cauliflower Mosaic Virus) cfu Unités formant des colonies (Colony Forming Unit) HR Réponse hypersensible (Hypersensitive Response) kb kilo paire de bases Isd lesion simulating disease resistance PAL Phénylalanine-ammonia-lyase PCR Réaction de la polymérase en chaîne (Polymerase Chain Reaction) -P.s. t. Pseudomonas syringae pv. tomato ROS Espèces Réactives de l'Oxygène (Reactive Oxygen Species) Xc. c. Xanthomonas campestris pv. campestris Matériel et Méthodes 1. Matériel végétal Les écotypes Col-0 (et les lignées transgéniques en dérivant), Sf-2 et Ws-0 d'Arabidopsis thaliana L. (Heynh) et les mutants Ids3, Isd4 et IsdS (Dietrich et al.,-1994) sont cultivés dans des conditions décrites précédemment (Lacomme and Roby, 1996). En général, des plantes âgées de 5 semaines sont employées dans les travaux expérimentaux.

Pour lsdl, les plantes sont cultivées dans les conditions décrites précédemment (Jabs et al., 1996). La procédure employée avec le mutant IsdS et les lignées suppresseurs est légèrement différente. Des graines pour culture stérile sont stérilisées en surface dans de l'eau de Javel 12% pendant 20 min, lavées 5 fois dans de 1'eau distillée stérile et semées sur un milieu Murashige and Skoog (MS) contenant 0.8% d'agar et 1% de saccharose. Les conditions pendant la croissance stérile sont de 16h de jour dans une chambre de culture avec une intensité lumineuse de 0.13 mE/s/m2. Les conditions induisant l'apparition des lésions correspondent à une intensité lumineuse supérieure (1.52 mE/s/m2). Les suspensions cellulaires sont cultivées comme précédemment décrit (Lacomme and Roby, 1996).

Le cultivar Bottom Special (BS) de Nicotiana tabacum L. et les lignées

transgéniques en dérivant sont cultivées comme précédemment décrit (Pontier et al., 1994).

2 Souches bactériennes 2.1 Escherichia coli Les bactéries utilisées pour la génération des différentes constructions sont des E. coli, souche DH5a. Elles sont cultivées à 37°C sur milieu LB (Miller, 1972) en absence ou en présence d'antibiotiques, selon les cas.

2.2 Agrobacterium tumefasciens Les souches d'Agrobacterium tumefasciens utilisées pour transformer sont la souche LBA4404 (Bevan, 1984) dans le cas du Tabac, et la souche GV3101 (Koncz and Schell, 1986) dans le cas d'Arabidopsis. Elles sont cultivées à 28°C sur mileu LB supplémenté par les antibiotiques correspondants aux génome des bactéries, aux plasmides"helper"et aux plasmides contenant les constructions génétiques selon les cas.

2.3 Ralstonia solanacearum Les souches sauvages avirulente GMI1000 et virulente K60 de R. solanacearum sont respectivement responsables du développement d'une HR observable dès 24 heures et -de la maladie dés 3 jours sur les feuilles de Tabac variété Bottom Special (BS). Ces souches sont cultivées 3 jours à 28°C sur boîte de Pétri contenant du milieu BGT (Boucher et al., 1985), puis 20 ml de milieu BGT liquide sont ensemencés avec une colonie isolée de cette boîte. Après une incubation de 12 h à 28°C sous agitation (200 tr/min), cette culture est centrifugée 5 min à 6000 g à 28°C. Le culot en résultant est lavé à l'aide de 10 ml d'eau stérile, et une vigoureuse agitation remet le culot en suspension. Une nouvelle centrifugation, dans les mmes conditions que précédemment, permet de culoter à nouveau les bactéries. Le nouveau culot est repris par 5 ml d'eau stérile, et une lecture de la densité optique à 600 nm est effectuée sur une dilution au dixième dans de 1'eau stérile. Le rapport 1 D06oo = 1.109 cfu/ml permet d'évaluer la concentration en bactéries. Afin d'inoculer les plantes de tabac, la suspension bactérienne est ajustée à 5.106,1.107 et 5.107 cfu/ml pour la souche GMI1000, et 5.107 cfu/ml pour la souche K60.

2.4 Xanthomonas campestris pv. campestris La souche 147 de Xanthomonas campestris pv. campestris (X. c. c.) est responsable du développement d'une HR observable dès 36 heures sur les feuilles de l'écotype

Colombia-0 d'Arabidopsis lorsque l'inoculum est de 1.108 cfu/ml. Elle est cultivée 3 jours à 28°C sur boîte de Pétri contenant du milieu Kado (Kado and Heskett, 1970) supplémenté en spectinomycine (100 jig/n-A), puis 20 ml de milieu Kado liquide (spectinomycine 100 ug/ml) sont ensemencés avec une colonie isolée de cette boîte. Après une incubation de 12 h à 28°C sous agitation (200 tr/min), cette culture est centrifugée 5 min à 6000 g. Le culot en résultant est lavé à l'aide de 10 ml d'eau stérile, et une vigoureuse agitation remet le culot en suspension. Une nouvelle centrifugation, dans les mmes conditions que précédemment, -permet de culoter à nouveau les bactéries. Le nouveau culot est repris par 5 ml d'eau stérile, et une lecture de la densité optique à 600 nm est effectuée sur une dilution au dixième dans de 1'eau stérile. Les rapports 1 D06oo = 1.109 cfu/ml permet d'évaluer la concentration en bactéries, et d'ajuster la supension bactérienne à 1.108 cfu/ml afin d'inoculer les plantes d'Arabidopsis.

3 Inoculations bactériennes des plantes 3.1 Inoculation du Tabac par Ralstonia solanacearum Les inoculations sont effectuées manuellement sur la face inférieure des feuilles les plus jeunes ayant atteint leur taille maximale (environ 30 cm de long sur 20 cm de large) sur des plantes âgées de huit semaines, à l'aide d'une seringue stérile de 1 ml sans aiguille, et ceci sur une surface d'environ 5 cm2. La grande surface des feuilles utilisées permet d'effectuer plusieurs inoculations sur la mme feuille.

3.1.1 Test de pathogénicité de la souche avirulente GMI1000 Des inoculations utilisant trois inocula (5.106,1.107et 5.107 cfu/ml) sont effectuées sur les deux côtés de la nervure centrale de deux feuilles de deux plantes pour chaque lignée testée. Les zones inoculées sont repérées en les délimitant à l'aide d'un marqueur noir.

L'apparition des symptômes au cours du temps est notée par appréciation visuelle de leur gravité et de leur étendue. Une notation étant indispensable, nous avons établi une hiérarchie dans la gravité des symptômes, selon le barème suivant : 1 : Apparition de petits groupes de cellules en"collapse"dans les zones inoculées.

2 : Apparition de zones plus étendues en"collapse"dans les zones inoculées.

3 : Les zones inoculées entières sont en"collapse".

L'expression des résultats se fait sur la base de la somme obtenue pour chaque temps

et pour chaque lignée. Le maximum étant de 24 (indice 3,2 zones pour 2 feuilles de 2 plantes), les résultats sont finalement exprimés en pourcentage de ce maximum. Le report de ces données sur un graphique temporel permet de comparer la vitesse d'apparition des symptômes, ainsi que leur gravité.

3.1.2 Souche virulente K60 Les inoculations sont effectuées avec un inoculum de 5.107 cfu/ml dans les mmes conditions que pour la souche avirulente GMI1000. Les symptômes sont observés au cours du temps. Ceux-ci étant très différents entre la lignée sauvage BS et certaines lignées transgéniques, il n'a pas été possible d'établir un barème de gravité, comme dans le cas de la souche GMI1000.

3.2 Inoculation d'Arabidopsis par Xanthomonas campestris pv. campestris Avant d'inoculer les plantes d'Arabidopsis, celles-ci sont placées dans une atmosphère à forte hygrométrie pendant 16 à 18 heures, de manière à provoquer l'ouverture des stomates. L'inoculation est effectuée sur la face inférieure des feuilles, de part et d'autre de la nervure centrale, sur cinq feuilles adultes de plantes âgées de quatre semaines, et ceci sur une surface totale équivalant au tiers de la surface totale de la feuille. Après inoculation, les plantes sont replacées dans une atmosphère à forte hygrométrie pendant 48 h afin de favoriser l'infection.

3.3 Mesure de la croissance bactérienne in planta (IGC) La mesure de la croissance bactérienne in planta se base sur le dénombrement au cours du temps des bactéries présentes dans des échantillons de tissus des plantes inoculées.

Ce type de mesure a été effectué lors d'inoculations de Tabacs par les bactéries R. solanacearum, avec la souche avirulente GMI1000 et la souche virulente K60 exprimant une résistance à la rifampicine. Pour chaque lignée et chaque point cinétique, est prélevé un disque de 0,5 cm2 sur six plantes différentes âgées de huit semaines à l'emporte-pièce dans la zone inoculée, ainsi que dans les tissus immédiatement autour dans le cas de la souche virulente K60. Ces six disques sont broyés dans 1 ml d'eau stérile dans un mortier à l'aide d'un pilon, et ce matériel est rincé dans 1 ml d'eau stérile. Cette suspension est soumise à une série de dilutions dans 1'eau stérile, de façon à obtenir, selon les expériences, des dilutions allant de 10 à 100 000. Cent microlitres de ces dilutions sont étalés sur des boîtes

de Pétri contenant du milieu BGT solide (1,5% Agar) supplémenté en rifampicine (50 pg/rnl) afin d'inhiber la croissance de microorganismes parasites, et les boîtes sont placées en chambre d'incubation à 28°C afin de permettre la croissance des bactéries R. solanacearum. Deux jours plus tard, les colonies de R. solanacearum sont comptées. Les résultats sont exprimés en log10 (cfu/cm2) (moyennes et écarts types).

4 Méthodologies de biologie moléculaire 4.1 Extraction d'ARN et analyse Northern Les extractions d'ARN totaux et les analyses de type Northern ont été réalisées comme décrit dans Lacomme and Roby (1996). Les sondes ont été obtenues à partir d'un fragment PstI du gène hsr2O3J du Tabac dans le cas de hsr203J, d'un fragment PstI du gène str246C du Tabac dans le cas de str246C, d'un fragment EcoRI/XhoI du gène ACC Oxydase NU ACON du Tabac dans le cas de ACO, et d'un fragment BglI/XbaI du plasmide pBEFI-a (don de Bernard Lescure) contenant le gène EFI-a d'Arabidopsis dans le cas de EFI-a.

Les filtres sont hybrides à 42°C avec les sondes dans une solution de 6XSSC, 0,5% SDS, 5X solution Denhardt's et 0,1 mg/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon. Les filtres sont ensuite lavés deux fois pendant 15 min avec 2XSSC, 0,1% SDS à température ambiante et deux fois pendant 20 min avec O, 1XSSC, 0,1% SDS à 55°C. Les fragments d'ADN correspondant aux clones d'ADNc longueur totale ont été employés comme sonde, dans le cas de AtMYB30 et Rail36 ; et un fragment HindIII du gène PAL-1 (Dong et al., 1991) a été employé dans le cas de la PAL.

4.2 Extraction d'ADN gnomique végétal Un échantillon de feuille (0,2 g) est broyé dans de l'azote liquide. La poudre obtenue est transférée dans 1 ml de tampon d'extraction (contenant, pour 100 ml : 2 g de CTAB ; 10 ml de Tris-HCI 1M pH8 ; 28 ml de NaCI 5M ; 4 ml d'EDTA 0, 5M pH8 ; 0,5 ml de ß- mercaptoéthanol rajouté extemporanément) et la suspension est incubée 20 min dans un bain-marie à 65°C. Après quoi, 600 ul de chloroforme sont ajoutés, les échantillons sont alors agités vigoureusement pendant 15 min à température ambiante, puis centrifugés à 10000 g pendant 10 min. La phase aqueuse est récupérée, et additionnée de 600 ul . d'isopropanol. Immédiatement après ils sont centrifugés à 10000 g pendant 20 secondes. Le

culot est récupéré et lavé avec de l'éthanol 70 % à température ambiante. Après une centrifugation de 10 min à 10000 g, le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 50 ut d'eau. Une aliquote d'une dilution au dixième dans de 1'eau stérile sera utilisée lors d'une réaction de type PCR pour un mélange final de 25 ut.

4.3 Clonage et séquençage du clone d'ADNc L'ADNc AtMYB30 a été clone comme précédemment décrit (Lacomme and Roby, 1996). Sa séquence nucléotidique a été déterminée sur les deux brins par la méthode de terminaison aux dideoxynucléotides selon le kit Sequenase (USB, Amersham). Les résultats ont été analysés en utilisant les programmes GCG (University of Wisconsin).

4.4 Analyse Southern L'ADN extrait des plantes selon le protocole décrit par Saghai-Maroof et al. (1984) est digéré avec des enzymes de restriction, séparé sur un gel d'agarose à 0.8% et transféré sur une membrane Hybond N+ (Amersham). L'hybridation est effectuée comme décrit précédemment (Lacomme and Roby, 1996) avec une sonde AtMYB30-3'-spécifique marquée au 32P et avec une sonde correspondant au domaine MYB 4. 5 RT-PCR Les extraits d'ARN sont traités à la DNAse I, RNAse-free (Boerhinger Manheim) et soumis à une extraction au phenol/chloroforme. Une PCR de contrôle est effectuée pour vérifier l'absence d'ADN gnomique. Un premier brin d'ADNc est synthétisé à partir de 2,5 à 20 ig d'ARN totaux sans ADN, employant une transcriptase reverse Superscript II RNAse H- (BRL), suivant les instructions du producteur. La ß-tubulin 4 (Marks et al., 1987) est employée comme contrôle interne constitutif et les ADNc d'AtMYB30, ou ß- tubulin 4 et de PR1 (Uknes et al., 1992) sont amplifiés en employant les sondes spécifiques ci-dessous durant la mme réaction PCR : GCTTACGAAT CCGAGGGTGC C et GTCCAGTGT CTGTGATATT GCACC pour la ß-tubulin 4.

GATTGGTATA ACTGAACAAA CATGG et GCCCAAGACA GTCCTCAAGA C pour PR1.

Toutes les réactions PCR sont effectuées avec un Robocycler gradient 96 (Stratagene). Les travaux sont effectués deux fois dans deux expériences indépendantes.

4.6 Réaction de la Polymérase en Chaîne (PCR) Les compositions et concentrations des différents composants de la réaction sont ceux indiqués par le fournisseur de 1'enzyme Taq polymérase (BRL). Les conditions de températures et de temps utilisées pour les réactions de PCR sont les suivantes : Température Temps Nombre de cycles <BR> <BR> 95°C 3 min<BR> 72°C 45 s 48°C 45s 95°C 1 min 48°C 45 s 32 72°C 45 s<BR> 72°C 10 min 4.7 Génération de constructions Les expériences de transformation des bactéries E. coli sont effectuées selon la méthode du choc thermique (Sambrook et al., 1989). Tous les plasmides sont extraits par minipréparation selon la méthode de la lyse alcaline (Sambrook et al., 1989) ou par Maxiprep (Qiagen). Les expériences de digestion d'ADN sont effectuées avec des enzymes de restriction Promega, et celles de purification d'ADN sur gel d'agarose (1%) font appel au kit Jetsorb (Genomed). La déphosphorylation des extrémités des fragments d'ADN est réalisée par la phosphatase alcaline de crevette (Pharmacia). Toutes les bactéries décrites sont des E. coli de souche DHSa, et les bactéries transformées sont sélectionnées sur milieu LB (Miller, 1972) supplémenté en ampicilline (50 pg/ml) ou en kanamycine (50 pg/ml) selon les cas.

4.7.1 Constructions témoin (pBI111), sens (pBIM131) et antisens (pBIW13) Le plasmide extrait du clone RaR015, contenant 1'ADNc du gène AtMYB30 (Lacomme, 1996), a été préparé par minipréparation et utilisé lors d'une expérience de PCR à l'aide des oligonucléotides MYB5 et MYB6 (figure 1). L'amplifiat de 999 pb en résultant contient l'entièreté de la région codante du gène AtMYB30, et l'utilisation de ce couple

d'oligonucléotides a permis d'insérer par mutagénèse ponctuelle un site de restriction HpaI aux deux extrémités du fragment. Ce fragment a été purifié et clone dans le vecteur pCRTMII (Invitrogen). L'insertion a été vérifiée par la digestion du plasmide de colonies isolées en utilisant les enzymes HpaI, EcoRI, et SacII/HpaI. Une colonie a été retenue, et le plasmide correspondant baptisé pCRM24 (figure 1). La séquence du fragment inséré a été entièrement lue à trois reprises sur les deux brins, et aucune mutation due à la PCR n'a été détectée à l'intérieur de la région codante du gène AtMYB30. La digestion HpaI de ce plasmide, suivie de sa purification sur gel d'agarose, a abouti à l'obtention d'un fragment de 935 pb à extrémités franches, et contenant l'entièreté de la région codante du gène AtMYB30. Ce fragment, baptisé"ORF AtMYB30"a été utilisé par la suite dans des expériences de clonage en vue de l'obtention des constructions utilisées au cours de ce travail (figure 1).

Le plasmide pBI221 (Clontech) a été soumis à une double digestion SacI/SmaI (figure 1). L'extrémité digérée par SacI a été rendue franche par l'action du fragment Kleenow de 1enzyme ADN Polymérase I. Afin de faciliter la purification du fragment de 3,83 kb et d'éviter la co-purification du fragment de 1,87 kb (correspondant à la région codante du gène GUS), ce dernier est digéré en deux nouveaux fragments par 1'enzyme SnaBI. Par la suite, les extrémités du fragment de 3,83 kb sont déphosphorylées afin d'éviter la recircularisation du vecteur sur lui-mme lors des expériences de ligation. Ainsi est obtenu un fragment de 3,83 kb (baptisé"pBI221-GUS") correspondant au plasmide pBI221 linéarisé, dépourvu de la région codante du gène GUS, et dont les extrémités franches peuvent accueillir le fragment"ORF AtMYB30".

Les expériences de ligation utilisant le vecteur"pBI221-GUS"et le fragment"ORF AtMYB30", puis celles de transformation de bactéries, ont conduit à l'obtention de plusieurs centaines de colonies isolées par sélection sur ampicilline. 94 colonies différentes ont été soumises à une expérience de PCR à l'aide des oligonucléotides M13-20 et M13Rev, et 74 d'entre elles ont conduit à l'amplification d'un fragment de taille attendue (1995 pb). Afin de vérifier la taille et l'orientation du fragment"ORF AtMYB30", leur ADN plasmidique a été soumis à deux digestions (EcoRI/HindIII et PstI). L'analyse des résultats a montré qu'une colonie possédait un plasmide dont l'orientation était"sens", et que 25 colonies possédaient

un plasmide dont l'orientation était"antisens". Les plasmides"sens"et"antisens"ont été nommés respectivement"pBIM231"et"pBIW23" (figure 1). Leur nature a été vérifiée par digestion (EcoRI/HindIII et PstI), et leur séquençage sur les deux brins à trois reprises (oligonucléotides M13-20, M13Rev, MYB232,MYB25,MYB35) a permis de vérifier qu'aucune mutation n'était apparue dans la région codante du gène AtMYB30, et qu'elle était insérée correctement afin d'tre transcrite chez le plasmide pBIM231. Afin de sous-cloner ces constructions dans un vecteur binaire, les plasmides pBI231 et pBIW23 ont été digérés par les enzymes EcoRI et HindIII, et les fragments ont été purifiés sur gel d'agarose.

Le plasmide binaire pBI121 (Clontech, (Jefferson et al., 1987)) a également été soumis à une digestion par les enzymes EcoRI et HindIII. Le fragment de 10 kb a été purifié et déphosphorylé, puis utilisé lors d'expériences de ligation avec le fragment de 2,3 kb provenant des plasmides pBIM231 ou pBIW23. Le plasmide binaire contenant la construction"sens"a été nommé"pBIM131"et celui contenant la construction"antisens", "pBIW13". Leur séquençage sur les deux brins n'a révélé aucune anomalie dans la séquence de la région codante du gène AtMYB30, ni dans les jonctions créées lors de la génération de ces plasmides. Enfin, afin de générer une construction témoin (ne comportant pas la région codante du gène AtMYB30), le plasmide binaire pBI121 a été soumis à une digestion par les enzymes SacI et SnaBI en présence du fragment Kleenow de 1'enzyme ADN Polymérase I, puis à une digestion par 1'enzyme de restriction SmaI. La ligation de ce fragment a permis sa recircularisation, et le nouveau plasmide a été nommé"pBIlll". Sa séquence comprise entre le promoteur 35S et le terminateur NOS, entièrement lue à trois reprises, est identique à la séquence de pBI121 pour ces deux éléments.

4.7.2 Construction pGXM133 Le plasmide pGEX-2T (Pharmacia), choisi pour la production de la protéine recombinante AtMYB30 chez E. coli a été soumis à une digestion par 1'enzyme de restriction SmaI, et après déphosphorylation, a été utilisé lors d'une expérience de ligation avec le fragment"ORF AtMYB30". Un plasmide contenant la région codante du gène AtMYB30 en orientation"sens"a été retenu. Son profil de restriction a été vérifié, et la séquence nucléotidique dans et autour de la région codante du gène AtMYB30 a été lue sur les deux brins à trois reprises (oligonucléotides MYB25, MYB232 et MYB35),

démontrant l'absence de mutations vis-à-vis de la séquence originelle. Le plasmide correspondant a été nommé"pGXM133".

5 Production, purification de la protéine recombinante de fusion GST-AtMYB30 chez E. coli, et détection par analyse Western En vue de l'analyse de lignées transgéniques sur-ou sous-exprimant le gène AtMYB30, nous avons produit une protéine recombinante chez E. coli, qui a été purifiée, avant d'tre utilisée pour l'immunisation de lapins. L'analyse de leur sérum immun a révélé qu'il contenait des anticorps dirigés contre la protéine recombinante de fusion GST- AtMYB30.

5. 1 Production et purification de la protéine recombinante de fusion GST-AtMYB30 La région codante du gène AtMYB30 a été clonée dans le vecteur d'expression pGEX-2T (Pharmacia), et le plasmide en résultant, pGXM133, a été utilisé pour transformer des bactéries E. coli. L'induction de la synthèse de la protéine de fusion GST- AtMYB30, ainsi que sa purification, furent effectuées selon les instructions des fournisseurs. Cependant, il n'a pas été possible de produire cette protéine de fusion soluble et en quantités suffisantes en vue de purifier la protéine AtMYB30 par clivage à l'aide de la thrombine ou du Facteur Xa, et ceci, malgré nos efforts d'adaptation du protocole à des conditions plus favorables (souche bactérienne déficiente en protéases, température de culture abaissée de 37°C à 23°C). Cette protéine de fusion étant particulièrement réticente à la solubilisation, nous avons opté pour sa purification sur gel d'acrylamide de type SDS- PAGE, après l'élimination de la majeure partie des protéines insolubles contaminantes par lavages successifs à l'aide de tampons additionnés de SDS. Les fragments de gel d'acrylamide contenant la protéine de fusion furent utilisés pour l'obtention de deux lots de sérum immuns de lapin contenant des anticorps polyclonaux (Eurogentech).

5.2 Analyse Western Les expériences de type Western blot sont réalisées selon Sambrook etal. (1989).

Les échantillons analysés correspondent à des extraits contenant les protéines solubles de plantes âgées de quatre semaines (Tabacs et Arabidopsis) cultivées en terreau. Un sérum immun anti-GST-AtMYB30 (provenant de la saignée finale) dilué au 5000e, ainsi que des anticorps ovins anti-lapin en tant qu'anticorps secondaires, ont été utilisés. La révélation est

réalisée selon la méthode de la phosphatase alcaline, enzyme couplée aux anticorps secondaires.

Une expérience d'immunodétection des protéines recombinantes GST et GST- AtMYB30 a permis de déterminer le titre d'utilisation des anticorps. En effet, une dilution au 5 000e permet de détecter spécifiquement la protéine GST-AtMYB30, alors que la protéine recombinante GST, purifiée par affinité sur colonne glutathion-sépharose (Pharmacia) et fournie par Benoît Ranty (UMR UPS/CNRS 1456), n'est plus détectée à -cette dilution, dans une gamme allant de 0,002 ug à 2 ug. Par contre, la protéine de fusion GST-AtMYB30 est détectée dès que sa quantité déposée sur le gel excède 0,2 ug. Ce sont donc les conditions qui ont été retenues pour analyser les lignées transgéniques de Tabac et d'Arabidopsis.

6 Génération et caractérisation de lignées transgéniques de Tabac et d'Arabidopsis 6.1 Méthodes de transformation Arabidopsis thaliana est transformé selon la méthode de trempage (dérivée de (Bechtold et al., 1993)) des hampes florales dans une solution contenant les bactéries Agrobacterium tumefasciens préalablement transformées par les plasmides pBI111, pBIM131 ou pBIW13 par la méthode du choc thermique. Les agrobacteries sont cultivées sur boite de Pétri sur milieu sélectif LB (contenant les antibiotiques spécifiques de l'agrobactérie et du plasmide portant la construction) à 28°C. Après 3 jours de culture, une colonie isolée est mise quelques heures en préculture dans 50 ml de milieu LB sélectif sous agitation à 28°C, et cette préculture est utilisée pour ensemencer une culture de 1 litre de milieu LB sélectif sous agitation à 28°C. Les agrobactéries sont récupérées par centrifugation et remises en suspension dans 1 litre de solution MS contenant du Saccharose (50 g/1) et du Silouet (50 p1/1), afin que la densité optique de la solution lue à 600 nm soit comprise entre 1,8 et 2. Les hampes florales d'Arabidopsis sont trempées 30 secondes dans cette solution et les plantes sont placées en"aracons". Arrivées à maturité, les graines sont récoltées.

Le Tabac est transformé selon la méthode des disques foliaires décrite par Horsch et al. (1984). Les plantes transformées sont sélectionnées sur milieu MS solide (0,8% Agar)

supplémenté en kanamycine (100 pg/ml) et en carbénicilline (400 pg/ml). Les plantes transgéniques T1 sont amenées à floraison et leur autofertilisation permet d'obtenir plusieurs milliers de graines.

6.2 Caractérisation génétique des lignées transformantes L'estimation du nombre d'événements d'insertion de l'ADN-T chez les plantes transformées d'Arabidopsis et de Tabac est réalisée par un test de croissance des plantes sur un milieu gélosé MS supplémenté en kanamycine (50 llg/ml pour les Arabidopsis, 400 ug/ml pour le Tabac). En effet, l'ADN-T comporte, en plus des constructions témoin, sens ou antisens, un gène responsable de la production de la protéine Nopaline-synthase II ou NPT-11, responsable de la détoxication de la kanamycine. La détermination du pourcentage de plantes résistantes dans une population de graines semées individuellement est réalisée dès 10 jours après semis pour Arabidopsis, et 15 jours après semis pour le Tabac. Ce dénombrement permet d'estimer, selon les lois mendéliennes de la ségrégation des caractères dominants, le nombre d'événements d'insertion de l'ADN-T dans le génome des plantes de génération T1 pour chaque lignée. Pour ceci, 200 graines issues de plantes de première génération (T1) sont semées individuellement, et les plantes résistantes à la kanamycine sont comptées. Un test du K2 est alors effectué pour éprouver la validité de l'estimation du nombre d'insertions.

6.2.1 Lignées transformantes de Tabac Les expériences de transformation du Tabac par les constructions témoin (pBI111), sens (pBIM131) et antisens (pBIW13) ont conduit respectivement à l'obtention de 7,19 et 14 lignées indépendantes.

La nomenclature utilisée pour la dénomination des différentes lignées obtenues est expliquée à l'aide de 1'exemple suivant : la lignée"pBIM131-40A"comporte la construction sens pBIM131, et représente la première plante (A) issue du disque foliaire numéro 40.

Leur analyse génétique montre que la plupart des lignées transgéniques n'ont subi qu'un seul événement d'insertion de l'ADN-T : c'est le cas pour 71% (5 sur 7) des lignées témoins, 68% (13 sur 19) des lignées sens, et 57% (8 sur 14) des lignées antisens. Deux lignées témoin (29%) présentent deux événements d'insertion, de mme que trois lignées sens (16%) et quatre lignées antisens (28%). Trois événements d'insertion de l'ADN-T sont

estimés pour une lignée antisens (7%), mais pour aucune lignée sens ni aucune lignée témoin.

Parmi toutes les lignées obtenues, seule une lignée antisens (pBIW13-15A) ne présente pas une ségrégation mendélienne pour la résistance à la kanamycine (55% de plantes résistantes). Cependant, un biais peut s'tre insinué dans le dénombrement des plantes résistantes à la kanamycine puisque celles-ci sont petites et pâles, et difficiles à distinguer des plantes sensibles. Un test identique avec des concentrations plus faibles en kanamycine (100,200 et 300 pg/ml) dans le milieu a conduit aux mmes difficultés. Il est donc vraisemblable que l'ADN-T se soit inséré dans une partie du génome peu accessible à la machinerie de transcription chez cette lignée, conduisant à une production très réduite du transgène NPTII et à une difficile détoxication de la kanamycine, à l'origine d'une résistance à la kanamycine atteignant la limite du test utilisé. D'autre part, la lignée sens pBIM131-15A présente un très faible taux de germination, et il a fallu semer de très nombreuses graines pour pouvoir dénombrer les plantes résistantes à la kanamycine des plantes sensibles parmi 200 plantes ayant germé. De ce fait, ces deux dernières lignées n'ont pas été utilisées pour la suite des manipulations.

6.2.2 Lignées transformantes d'Arabidopsis Les expériences de transformation d'Arabidopsis par les constructions témoin (pBIlll), sens (pBIM131) et antisens (pBIW13) ont conduit respectivement à l'obtention de 2,3 et 7 lignées indépendantes.

La nomenclature utilisée pour la dénomination des différentes lignées obtenues est expliquée à l'aide de 1'exemple suivant : la lignée"pBIM131-A2"comporte la construction sens pBIM131, et représente la deuxième plante (2) issue de la première expérience (A) de transformation d'Arabidopsis.

Aucun événement d'insertion multiple de l'ADN-T n'a été détecté pour les lignées transgéniques d'Arabidopsis. Du fait du faible nombre de lignées obtenues, la génération d'autres lignées a été entreprise, et elles sont en cours de sélection.

6.3 Caractérisation moléculaire des lignées transformantes Afin de vérifier l'insertion de chacune des constructions pBIlll, pBIM131 et pBIW13 dans le génome des plantes transformantes de Tabac et d'Arabidopsis, un test PCR

est effectué. Il utilise 1'ADN gnomique de la lignée à tester comme matrice, et un couple d'oligonucléotides spécifique de chaque construction comme amorces. La figure 2 présente la localisation des oligonucléotides utilisés pour ces tests sur les constructions témoin (pBIlll), sens (pBIM131) et antisens (pBIW13). Ainsi l'utilisation du couple FIN35S/NOS-TRev procure un fragment de 311 pb uniquement avec le plasmide pBI11 ou une plante transformée par la construction témoin, l'utilisation du couple FIN35S/RTMYB3 procure un fragment de 550 pb uniquement avec le plasmide pBIM131 ou une plante transformée par la construction sens, et l'utilisation du couple FIN35S/RTMYB5 procure un fragment de 1050 pb uniquement avec le plasmide pBIW13 ou une plante transformée par la construction antisens. Toutes les autres utilisations des ces couples ne conduisent à aucune amplification.

La vérification de l'insertion des ADN-T pour chaque lignée transgénique de Tabac et d'Arabidopsis a été effectuée sur leur ADN gnomique, en utilisant chacun des trois plasmides portant les trois constructions comme témoins positifs, et 1'ADN gnomique de la lignée sauvage BS ou de t'écotype sauvage Col-0 comme témoins négatifs. Sur la figure 3, sont reportés les résultats obtenus avec quelques-unes des lignées. Ainsi les lignées pBI111- 9A et pBIl 11-23A de Tabac et les lignées pBI111-Al et pBIl 11-A2 d'Arabidopsis portent bien la construction témoin pBIlll, les lignées pBIM131-27D, pBIM131-27F, pBIM131- 4C, pBIM131-13C, pBIM131-40A, pBIM131-47A et pBIM131-50A de Tabac et les lignées pBIM131-Al, pBIM131-A2 et pBIM131-A3 d'Arabidopsis possèdent la construction sens pBIM131, et les lignées pBW13-25C et pBW13-44B de Tabac et les lignées pBW13-Al et pBW13-A7 sont effectivement transformées par la construction antisens pBIW13. Par contre, la lignée sauvage de Tabac BS ou l'écotype sauvage Col-0 d'Arabidopsis ne montrent pas d'amplification avec aucun des trois couples d'oligonucléotides. De mme, aucune des 40 lignées de Tabacs ou des 12 lignées d'Arabidopsis n'est à l'origine d'une amplification non spécifique de la construction qu'elle possède (résultats non montrés) 7 Mesure du taux de mort cellulaire La méthode utilisée (méthode dite au"Bleu Evans" (Baker and Mock, 1994)), permet de détecter la mort des cellules végétales. En effet, le colorant"Bleu Evans"n'est

pas capable de pénétrer dans les cellules intactes, et n'est pas retenu par les cellules mortes.

Par contre, il est capable de traverser les membranes endommagées et est retenu par les cellules mourantes. Il est donc possible de comparer le taux de mort cellulaire entre deux échantillons végétaux par la quantité de colorant retenu. Ce type de mesure a été effectué lors d'inoculations de Tabacs par les souches avirulente GMI1000 et virulente K60 de R. solanacearum. Pour chaque lignée et chaque point cinétique, sont prélevés deux disques de 0,5 cm2 sur quatre plantes différentes (soit huit disques) à l'emporte-pièce dans la zone inoculée. Ces huit disques sont plongés 20 min dans une solution de Bleu Evans (0,25 %) sous agitation circulaire modérée (80 tr/min) à 25°C. Les disques sont ensuite abondamment rincés sur verre fritte à l'aide d'eau stérile (50 ml environ) de façon à éliminer tout le Bleu Evans non retenu. Les disques sont ensuite placés dans des tubes eppendorf, congelés dans l'azote liquide, puis conservés à-80°C jusqu'à l'extraction. Celle-ci consiste au broyage des disques dans l'azote liquide. La poudre obtenue est mise en suspension dans 1 ml de SDS 0,5%, puis elle est agitée vigoureusement pendant 1 min. Après une centrifugation de 3 min à 10 000 g, 250 ul du surnageant obtenu sont dilués dans 750 ul d'eau. Une lecture de la densité optique à 600 nm est effectuée pour chaque échantillon, et les résultats sont exprimés en unité DO600 (moyennes et écart-types) par cm2de tissu végétal.

8 Mesure du taux de chlorophylles a et b Les échantillons de feuille (0,5 g) sont broyés dans 5 ml d'acétone à 80%. La solution obtenue est agitée vigoureusement 5 min et filtrée sur laine de verre. Les résidus fixés à la laine de verre sont lavés avec de l'acétone 80 % jusqu'à ce que l'ensemble des pigments soient extraits. L'éluat est récupéré et ajusté à 20 ml avec de l'acétone 80%. Le dosage est réalisé par spectrophotométrie à 663 et 645 nm. Les concentrations en chlorophylles a et b sont calculées à partir des formules ci-dessous. Ces concentrations sont exprimées en milligrammes de chlorophylles a et b par gramme de poids frais de tissu végétal.

Chl a = (12,7 X D0645)- (2,69 X D0663) Chl b = (22,9 X DO645)- (4,68 X DO663) Chl a + b = ((Chla + Chl b) X 20))/ (10 X poids frais) Les résultats sont exprimés en % de la quantité de chlorophylles présentes chez la

lignée sauvage lors de la première extraction, pour chaque étage foliaire.

Exemple 1 Isolement de l'ADNc codant pour le facteur AtMYB30 Afin d'isoler des gènes spécifiquement induits lors des étapes précoces de la HR, un criblage différentiel a été entrepris chez A. thaliana (écotype Col-0) inoculé par la souche 147 de X c. c., une heure après inoculation, en présence de cycloheximide. Des suspensions cellulaires répondant de la mme façon que des plantes entières aux inoculations furent utilisées pour obtenir des réponses homogènes et reproductibles. L'utilisation du cycloheximide permit de se focaliser sur les toutes premières étapes de la réponse hypersensible en isolant des gènes dont l'activation transcriptionnelle est indépendante de la synthèse de novo de protéines. Les 27 clones d'ADNc indépendants isolés au terme de ce criblage différentiel peuvent tre répartis en sept familles ATHSR (pour Arabidopsis thaliana hypersensitivity-related genes) sur la base d'expériences d'hybridations croisées entre les clones et d'analyse de leur similitudes de séquences par interrogation des banques de données. Un des ADNc a été entièrement séquence pour les familles A THSR1 (correspondant au gène AtMYB30), ATHSR2 (le clone Rail21), et ATHSR3 (le clone RaR105), et une séquence partielle a été réalisée pour l'extrémité 5'pour tous les autres clones.

Le clone correspondant à la famille ATHSRI présente des similitudes de séquence très fortes avec les facteurs transcriptionnels de type MYB. Le gène ATHSR1 a été rebaptisé AtMYB30 afin de se conformer à la nomenclature internationale des facteurs MYB. La séquence nucléotidique de 1'ADNc d'AtMYB30 et la séquence en acides aminés de la protéine déduite sont montrées dans SEQ ID NO 1. L'ADNc a une taille de 1310 pb et l'ORF prédite de 969 pb code un polypeptide de 323 residus avec un poids moléculaire de 36 kDa. La séquence N-terminale d'AtMYB30 contient les répétitions MYB (R2, R3) généralement présentes chez les protéines MYB végétales. Ce motif est fortement similaire au domaine MYB caractéristique de cette famille de facteurs transcriptionnels (Martin and Paz-Ares, 1997). Les résidus tryptophane fortement conservés dans c-myb sont présents dans AtMYB30. Le premier résidu tryptophane de la répétition R3 est substitué par un résidu phenylalanine, une substitution qui est, en plus de l'isoleucine, communément trouvée à cette position chez les protéines MYB végétales.

La séquence en acides aminés d'AtMYB30 a ensuite été comparée avec celles d'autres protéines MYB d'A. thaliana, d'autres espèces végétales et d'animaux. Le degré de similitude parmi ces séquences indique que différentes sous-classes de protéines MYB végétales peuvent tre définies, au delà du groupe des protéines MYB animales. AtMYB30 appartient à un sous-groupe incluant AtMYB31 (antérieurement cY13), AmMYB306 et LeTHM6. AtMYB30 présente les plus fortes similitudes avec la protéine du Muflier AmMYB306 (Jackson et al., 1991) (60% d'identité et 74% de similitude), et à un moindre degré, à la protéine AtMYB31 d'A. thaliana (53% d'identité et 70% de similitude) et à la protéine LeTHM6 de la Tomate (66% d'identité et 72% de similitude). AtMYB30 partage aussi des similitudes avec d'autres protéines MYB, plus spécifiquement dans le domaine Myb. Aucune similitude significative n'a été trouvée dans la pertie C-terminale entre AtMYB30 et d'autres protéines MYB. Cependant, deux éléments de séquence, GQWERxLQTDIHxxKxALxxALS et TxYASSTENIAxLLxxW, sont conservés entre AtMYB30, AmMYB306, AtMYB31 et LeTHM6.

Une analyse Southern a été réalisée afin d'étudier l'organisation gnomique du gène AtMYB30. Afin d'éviter de détecter d'autres membres de la famille des gènes MYB, un fragment d'ADNc de 453 bp spécifique de la partie C-terminale de la protéine a été utilisée comme sonde. Un seul fragment a pu tre détecté pour les quatre digestions impliquant des enzymes qui ne coupent pas l'ADNc, indiquant qu'AtMYB30 est un gène unique. Par comparaison, un fragment de 193 bp correspondant au domaine Myb a également été utilisé comme sonde. Plusieurs fragments ont été détectés dans ce cas, confirmant l'existence d'une superfamille de gènes MYB chez A. thaliana (Kranz et al., 1998).

La question du rôle du gène AtMYB30 dans la HR a été abordée en mettant en Oeuvre trois stratégies complémentaires. La première stratégie correspond à l'étude précise de son profil d'expression au cours de diverses interactions entre Arabidopsis et des agents pathogènes, afin d'apporter d'éventuelles données permettant d'établir une corrélation temporelle entre l'activation du gène et la HR. La deuxième stratégie a été entreprise via l'analyse de la régulation de la transcription du gène AtMYB30 chez des mutants Isd d'Arabidopsis affectés dans les programmes de mort cellulaire (Dietrich et al., 1994), ainsi que chez les suppresseurs phx correspondants (Morel and Dangl, 1999), dans le but

d'explorer l'hypothèse de l'existence d'une relation entre les phénotypes mutants observés et son expression. La troisième stratégie se base sur la génération et l'analyse de lignées transgéniques de plantes sur-ou sous-exprimant le gène AtMYB30, afin d'avoir un accès direct aux conséquences phénotypiques éventuelles d'une dérégulation de ce gène.

Expression d'AtMYB30 au cours du developpement et en reponse aux agents pathogenes Afin d'étudier 1'expression du gène AtMYB30, nous avons analysé la régulation développementale ainsi que les effets d'agents pathogènes bactériens virulents et avirulents sur le niveau de transcrits AtMYB30. Dans les plantes d'A. thaliana, il n'a pas été possible de détecter des transcrits AtMYB30 par analyse Northern, indiquant qu'ArMYB30 est exprimé à très faible niveau, comme précédemment mentionné pour différents gènes MYB (Leech et al., 1993 ; Li and Parish, 1995). Par conséquent, nous avons déterminé le niveau des transcrits AtMYB30 par RT-PCR en utilisant le gène de ß-tubuline 4 exprimé constitutivement comme contrôle interne.

Les ARN messagers d'AtMYB30 s'accumulent au cours des étapes précoces du développement, à savoir dans des plantules âgées de deux semaines, mais demeurent à peine détectable au cours des autres étapes développementales, dans toute la plante. Afin d'étudier 1'expression d'AtMYB30 en réponse aux agents pathogènes, une préparation d'ARN a été réalisée à partir de cellules en culture inoculées par X. c. c., le système biologique d'origine pour l'isolement du clone d'ADNc. Des sondes PAL et Rail36 (un clone constitutivement exprimé dans les cellules, résultats non publiés) ont servi de contrôle de l'infection des cellules et de la viabilité cellulaire, respectivement. Les transcrits AtMYB30 n'ont pas pu tre détectés au cours de l'interaction compatible, ni en réponse au mutant hrp-de X. c. c., incapable de causer de symptômes chez Arabidopsis (Arlat et al., 1991). Au contraire, les transcrits d'AtMYB30 s'accumulent transitoirement une heure après inoculation avec l'isolat bactérien avirulent. Par comparaison, les transcrits PAL s'accumulent au cours de la HR à un taux maximal 24 heures après inoculation. Une accumulation similaire des transcrits PAL est observée au cours de l'interaction compatible, mais les niveaux sont significativament plus faibles. Comme attendu, 1'expression constitutive de RaRl36 a été observée dans tous les cas, sauf dans des cellules infectées pendant 24 heures. Cette exception peut tre

expliquée par une viabilité réduite des cellules tardivement après infection. L'accumulation des transcrits AtMYB30 a aussi été évaluée dans des plantes d'Arabidopsis infectées par le mme pathogène. Il a été montré qu'AtMYB30 est exprimé transitoirement entre une et deux heures, et spécifiquement au cours de la réponse hypersensible (interaction entre l'isolat avirulent 147 et l'écotype résistant Col-0). Aucune expression n'a pu tre détectée au cours de l'interaction compatible (interaction entre l'isolat 147 et l'écotype sensible Sf-2) ou en réponse à un traitement par de l'eau. En réponse à un autre agent pathogène bactérien, -Pseudomonas syringae pv. tomato (isolat DC3000 (Whalen et al., 1991)), comportant (ou non) le gène d'avirulence avrRpml (Debener et al., 1991) ou le gène d'avirulence avrB (Wanner et al., 1993), AtMYB30 est exprimé transitoirement et préalablement à l'apparition de la mort cellulaire, à savoir une heure après inoculation (la mort cellulaire hypersensible étant observée 9 heures et 7 heures après inoculation, respectivement), dans nos conditions expérimentales. Au cours de l'interaction compatible, aucune expression d'AtMYB30 n'a pu tre détectée.

L'expression d AtMYB30 est induite dans des mutants affectes dans l'initiation de la mort cellulaire programmée, et supprimée chez les suppresseurs correspondants Des mutants d'Arabidopsis montrant des lésoins nécrotiques mimant la réponse de résistance en l'absence de pathogène ont été caractérisés (Dietrich et al., 1994 ; Greenberg et al., 1993 ; Greenberg et al., 1994). Ils sont supposés tre affectés dans le contrôle de la mort cellulaire hypersensible, et donc offrent l'opportunité d'explorer les relations entre l'activation spécifique d'AtMYB30 et la mort cellulaire programmée. L'expression d'AtMYB30 a été étudiée chez trois mutants d'initiation, Isd3, Isd4 et Isd5, dont le phénotype"lésions"est sous la dépendance de la lumière. Les lésions sont visibles 24h, 4 jours et 6 jours après transfert des plantes dans les conditions permissives, respectivement pour IsdS, Isd3 et Isd4. En parallèle, I'expression du gène PRI, dont l'accumulation des transcrits est corrélée à l'apparition des lésions chez ces mutants, a aussi été analysée, en tant que témoin. Tandis que les transcrits PRI ne s'accumulent que lorsque les trois mutants conditionnels montrent des lésions, AtMYB30 est aussi exprimé en l'absence de lésions : constitutivement et fortement chez les mutants IsdS et Isd4. Au contraire, AtMYB30 n'est

pas exprimé chez le mutant Isd3 en l'absence de lésions. Aucune expression d'AtMYB30 n'est détectée chez l'écotype sauvage Ws-0 dont dérivent les mutants Isd3, Isd4 et IsdS.

Pour une meilleure compréhension des relations existant entre les mutations lsd5 et lsd4, qui conduisent à 1'expression constitutive d'AtMYB30, et 1'expression d'AtMYB30, différentes lignées suppresseurs produites à partir du mutant IsdS ((Morel and Dangl, 1999), et résultats non publiés), ont été analysés. Selon nos résultats, lors du transfert dans les conditions permissives, des lignées doubles mutants ne montrent plus de lésions nécrotiques (phxlllsd5, pAx211sdS, et phxll-lllsdS) ou montrent des lésions de taille beaucoup plus réduite (phx3/lsd5 et phxl0/lsd5). Comme précédemment décrit, AtMYB30 est exprimé chez quelles que soient les conditions. Au contraire, les transcrits d'AtMYB30 ne sont détectés chez aucune des lignées suppresseurs, ou chez l'écotype sauvage Ws-0. De mme, l'activation du gène AtMYB30, constitutive chez le mutant lsd4, est supprimée chez la descendance du croisement phxlllsd4. II a été montré que le mutant phxl supprime la mort cellulaire normalement provoquée par la mutation (Morel, résultats non publiés). <BR> <BR> <P>L'expression d'AtMYB30 n'est pas alteree chez le mutant lsdl, affecte dans la propagation de la mort cellulaire Le mutant lsdl d'A. thaliana montre une altération du contrôle de la mort cellulaire en l'absence de pathogène : il est incapable de contrôler l'étendue de la mort cellulaire une fois qu'elle est initiée (Dietrich et al., 1994 ; Jabs et al., 1996). Ce mutant représente un excellent outil pour explorer le rôle d'AtMYB30 dans la limitation de la mort cellulaire.

Dans ce but, 1'expression d'AtMYB30 a été analysée chez des plantes Isdl montrant ou non des lésions, en comparaison avec des plantes sauvages dans les mmes conditions. Comme auparavant, 1'expression du gène PRI a également été suivie, en tant que témoin, elle accompagne la formation et la propagation des lésions. Il a été montré que ce marqueur de défense s'accumule systématiquement dans les plantes montrant des lésions. De façon surprenante, 1'expression d'AtMYB30 n'a pas pu tre détectée chez Isdl, quel que soit la phénotype observé. Des données similaires ont été obtenues avec un suppresseur de la mutation Isdl, phx21, ou chez l'écotype sauvage Ws-0.

Exemple 2 Constructions permettant la modulation de 1'expression du gène AtMYB30 chez des plantes transgéniques Les plasmides pBIM131, pBIW13, et pBIlll (figure 4) dérivent des plasmides pBI221 (Clontech), pBI121 (Clontech, (Jefferson et al., 1987)) et du plasmide correspondant au clone RaR015 comportant 1'ADNc du gène AtMYB30 (Lacomme, 1996).

Le plasmide pBIM131 est un plasmide binaire dont I'ADN-T comprend un gène responsable de la résistance à la kanamycine, et une construction où la région codante du gène AtMYB30 est placée sous la dépendance du promoteur 35S du CaMV et du terminateur NOS d'Agrobacterium tumefasciens. Ce plasmide a été utilisé pour transformer des plantes de Tabac et d'Arabidopsis pour la surproduction de la protéine AtMYB30 chez des lignées "sens". Le plasmide pBIW13 est un plasmide binaire dont l'ADN-T comprend un gène responsable de la résistance à la kanamycine, et une construction où la région codante du gène AtMYB30 est placée en orientation antisens sous la dépendance du promoteur 35S du CaMV et du terminateur NOS d'Agrobacterium tumefasciens. Cette construction a été utilisée pour transformer des plantes de Tabac et d'Arabidopsis pour inhiber la production de la protéine AtMYB30 chez Arabidopsis, et d'inhiber la production de la protéine orthologue chez le Tabac chez des lignées"antisens". Le plasmide pBI111 est un plasmide binaire dont l'ADN-T comprend un gène responsable de la résistance à la kanamycine, et une fusion entre le promoteur 35S du CaMV et le terminateur NOS d'Agrobacterium tumefasciens. Ce plasmide a été utilisé pour transformer des plantes de Tabac et d'Arabidopsis, dans le but d'obtenir des lignées"témoins"dans les deux cas, afin de n'imputer la cause des phénotypes des lignées"sens"et des lignées"antisens"qu'aux différences entre les contructions, et non pas à l'événement de transformation ou à la nature insertionnelle de la transformation.

Ces trois plasmides ont été soumis à la vérification de leur séquence nucléotidique à trois reprises, sur les deux brins de l'ADN. Elle n'a révélé aucune mutation dans la région codante du gène AtMYB30 chez les plasmides pBIM131 et pBIW13, et toutes les fusions créées lors des expériences de ligation lors de la génération des trois plasmides (pBIlll, pBIM131, et pBIW13) ont été vérifiées.

Exemple 3 Analyse des lignées sens de Tabac

Dix-huit lignées transformantes comportant la construction sens du gène AtMYB30 sous la dépendance du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur CaMV ont été examinées. Chez des plantes âgées de 2 mois, aucun phénotype ne semblait les différencier de la lignée sauvage BS (Bottom Special). Or, la relation forte entre son expression et la mort cellulaire hypersensible établie chez Arabidopsis laissait présager l'obtention d'un phénotype de type"lésions spontanées"ou d'un phénotype altéré pour la HR. Aucune lésion spontanée n'étant observée sur les lignées transgéniques obtenues, et afin de tester cette hypothèse, un test de pathogénicité a été effectué sur l'ensemble de nos lignées"sens" (possédant la construction sens pBIM131). Ce test consiste à inoculer les plantes par les souches avirulente GMI1000 et virulente K60 de R. solanacearum, bactéries nécrotrophes qui provoquent respectivement la HR en 24 heures et la maladie à partir de trois jours sur la lignée sauvage BS avec des inocula de 5.107 cfu/ml.

3.1 Des lignées sens présentent des phénotypes altérés en réponse à des inoculations bactériennes L'inoculation de dix-huit lignées sens, ainsi que de la lignée sauvage BS, par la souche avirulente GMI1000 et la souche virulente K60 de R. solanacearum a permis d'observer une différence nette entre les phénotypes de la lignée sauvage et de certaines des lignées sens.

3.1.1 Des lignées sens présentent une résistance accrue vis-à-vis de la souche avirulente GMI1000 de R. solanacearum L'inoculation de la souche avirulente GMI1000 de R. solanacearum des lignées sens a conduit à l'observation de phénotypes différents de celui de la lignée sauvage BS. Ces différences dans la vitesse d'apparition et la gravité des symptômes a pu tre quantifiée, et a permis de classer les dix-huit lignées sens testées en trois classes, selon le phénotype observé (tableau 1 ci-dessous et figure 7). Tableau 1 Classification des différentes lignées sens de Tabacs en fonction de leur phénotype par rapport à la lignée sauvage BS lors d'inoculations par la souche avirulente GMI1000 de R. solanacearum.

Classes Lignées sens Les phénotypes sont comparables à ceux pBIM131-25A pBIM131-27A pBIM131-27B de la lignée sauvage BS pBIM131-27C pBIM131-27D pBIM131-27F Les symptômes apparaissent plus tôt et pBIM131-2A pBIM131-4A pBIM131-4C sont plus graves que ceux de la lignée pBIM131-16ApBIM131-19ApBIM131-19D sauvage BS-Vitesse identique Les symptômes apparaissent plus tôt et pBIM131-4D pBIM131-13A pBIM131-13C sont plus graves que ceux de la lignée pBIM131-40A pBIM131-47A pBIM131-50A sauvage BS-Vitesse plus grande 3.1.2 Des lignées sens présentent une sensibilité altérée vis-à-vis de la souche virulente K60 de R. solanacearum Des inoculations de la souche virulente K60 de R. solanacearum ont été effectuées sur les 18 lignées sens et la lignée sauvage. Une inoculation de cette souche à la concentration de 5.10'cfu/ml provoque l'apparition d'une chlorose des tissus (la couleur passe du vert profond au vert clair) trois jours après inoculation qui s'aggrave (les tissus deviennent jaunes) et s'étend au-delà de la zone inoculée chez la lignée sauvage après cinq jours. Ces observations sont typiques d'une interaction compatible conduisant à la maladie.

L'observation des symptômes après inoculation montre pour les lignées sens pBIM131-4D, pBIM131-13A, pBIM131-13C, pBIM131-40A, pBIM131-47A et pBIM131-50A un phénotype très différent de la lignée sauvage. Les zones inoculées ne présentent pas de chlorose évasive, mais apparaissent des taches nécrotiques qui confluent, et aboutissent à la formation de lésions nécrotiques brunes limitées aux zones inoculées, et entourées d'un faible halo chlorotique. Ces lésions rappellent celles observées lors d'une interaction débouchant sur la réponse hypersensible, mais leur couleur est plus sombre, et leur aspect est beaucoup moins lisse.

3.1.3 Les classes phénotypiques identifiées sont corrélées à la quantité de protéine AtMYB30 produite chez les plantes transgéniques L'hypothèse d'une corrélation entre les phénotypes observés lors d'inoculations par les souches avirulente GMI1000 et virulente K60 de R. solanacearum et le taux de production de la protéine AtMYB30 chez les différentes lignées sens a été testée par des . analyses de type Western blot. Les protéines solubles de lignées représentant les différentes classes phénotypiques observées ont été extraites et la production de la protéine AtMYB30 a été évaluée en utilisant des anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine de fusion recombinante GST-AtMYB30. Les lignées qui ont été utilisées sont la lignée sauvage BS, deux lignées se comportant comme cette dernière (pBIM131-27D et pBIM131-27F), quatre lignées dont le phénotype est particulièrement fort (pBIM131-13C, pBIM131-40A, pBIM131-47A et pBIM131-50A), et une lignée présentant un phénotype intermédiaire (pBIM131-4C). Les résultats de cette analyse montrent que la protéine AtMYB30 n'a pas pu tre détectée chez la lignée sauvage BS ou les deux lignées pBIM131-27D et pBIM131- 27F, mais qu'il est possible de détecter clairement une bande protéique chez les autres lignées, d'un poids moléculaire d'environ 36 kDa, poids moléculaire attendu pour le produit protéique du gène AtMYB30. Une mme analyse de type Western blot, effectuée dans les mmes conditions, n'a pas permis de détecter la protéine AtMYB30 chez deux lignées témoins (pBlll-9A et pBIlll-23A) possédant la construction témoin pBIlll (résultats non montrés).

Pour la suite des manipulations, nous avons choisi d'utiliser la lignée pBIM131-40A car elle représente la catégorie de lignées sens dont le phénotype est très clairement altéré par comparaison avec celui de la lignée sauvage, et qu'elle ne présente qu'un seul événement d'insertion de l'ADN-T. La lignée pBIM131-4C a aussi été utilisée lors de certaines manipulations en raison de son phénotype intermédiaire et de son événement unique d'insertion de l'ADN-T. La lignée sauvage BS, ainsi que la lignée témoin pBIl 11-23A, ont respectivement servi de témoin négatif, et de lignée témoin.

3.1.4 Mesure de la croissance bactérienne in planta La mesure de la croissance bactérienne in planta ou IGC permet d'obtenir des informations sur la façon dont les bactéries se multiplient dans les tissus végétaux, et éventuellement d'en

déduire l'efficacité des réactions de défense des plantes dans la limitation de la croissance des bactéries. Dans le but d'étudier le rôle du gène AtMYB30 dans ce phénomène de restriction de la croissance de R. solanacearum au sein des tissus de Tabac, des expériences d'IGC ont été réalisées après inoculation par les souches avirulente GMI1000 et virulente K60 chez la lignée sauvage BS, et les lignées témoin pBIl 11-23 A et sens pBIM131-40A.

La croissance de la souche avirulente GMII000 de R. solanacearum est alteree chez la lignée sens pBIMl 31-40A Les six premiers jours d'observation ne permettent pas de distinguer de différence de croissance bactérienne entre la lignée sauvage BS, la lignée témoin pBIl 11-23 A et la lignée sens pBIM131-40A, bien que la concentration en bactéries chez cette dernière lignée soit inférieure à celle détectée chez la lignée sauvage et la lignée témoin dès le troisième jour (72 heures). En effet, dans tous les cas, une chute du taux de bactéries mesuré dans les zones inoculées est d'abord détectée lors des premières 24 heures. Par la suite, les bactéries se multiplient (une croissance correspondant à une ou deux unités logarithmiques est observée entre 24 et 48 heures) et leur nombre reste relativement constant jusqu'à six jours après inoculation. Au-delà de ce point cinétique, une disparité entre la lignée sauvage et la lignée témoin d'un côté, et la lignée sens de l'autre, est détectée : une diminution brusque et forte des bactéries entre 6 et 14 jours après inoculation caractérise la lignée pBIM131-40A, alors que cette chute est beaucoup moins brutale, et mme moins forte en fin de cinétique pour l'inoculum le plus concentré, chez la lignée sauvage BS et la lignée témoin pBIl l 1-23A.

La croissance de la souche virulente K60 de R. solanacearum est altérée chez la lignée sens 31-40A Les mmes expériences d'IGC ont été réalisées en employant la souche virulente de R. solanacearum, K60. Dans ce cas, la croissance des bactéries dans les tissus situés immédiatement autour des zones inoculées a également été mesurée. L'analyse des résultats indique que le nombre de bactéries présentes chez la lignée sauvage et chez la lignée témoin est comparable. Dans les zones inoculées, il apparaît que les bactéries virulentes sont capables de se multiplier au sein des tissus pendant les six premiers jours. Leur nombre est supérieur dans le cas de la lignée sens pBIM131-40A au troisième jour suivant l'inoculation.

Par la suite, l'importance de la chute du nombre de bactéries au delà de six jours est réellement plus importante chez cette lignée que chez la lignée témoin pBI111-23A ou la lignée sauvage BS : à dix et quatorze jours après inoculation, le taux de croissance bactérien est dix fois inférieur chez la lignée pBIM131-40A. La croissance bactérienne a aussi été évaluée dans les tissus immédiatement adjacent aux zones inoculées. Les bactéries sont détectées dès trois jours après inoculation, se multiplient et atteignent un maximum, puis leur nombre chute pour ne plus tre détectable quatorze jours après inoculation. Si les trois courbes partagent le mme profil, le pic de croissance des bactéries apparaît clairement plut tôt (6 jours) pour la lignée pBIM131-40A que pour la lignée témoin ou la lignée sauvage (10 jours). Dans tous les cas cette croissance est transitoire, ce caractère étant plus marqué pour la lignée sens pBIM131-40A.

La figure 6 présente les résultats obtenus sur la croissance bactérienne in planta de R. solanacearum inoculée à 5.107 CFU/ml dans des plantes transgéniques de Tabac. A, Interaction incompatible avec la souche bactérienne avirulente Gui1000. B, Interaction compatible avec la souche virulente K60. Dans les deux cas (A et B) les prélèvements ont été effectués dans la zone d'infiltration. Les résultats présentent les moyennes et les écarts- types obtenus sur deux séries de prélèvements. Les résultats montrent un maintien de la population bactérienne jusqu'à 3 jours après l'inoculation dans la zone inoculée. Cette phase est suivie par une diminution progressive des populations bactériennes chez les lignées sauvage, témoin et antisens, qui ne s'accentue qu'après 9 jours. Cependant, après seulement 6 jours, une diminution très importante de la population bactérienne est observée chez la lignée sens, avec une extinction presque totale de la souche GM/7000, 13 jours après l'inoculation.

3.1.5 Mesure du taux de mort cellulaire après inoculation bactérienne L'observation des symptômes et des profils de croissance bactérienne in planta lors d'inoculations par les souches avirulente GMI1000 et virulente K60 de R. solanacearum ont permis de mettre clairement en évidence le phénotype mutant de certaines lignées sens (et notamment la lignée pBIM131-40A) en comparaison avec la lignée sauvage ou la lignée témoin pBIlll-23A. Afin d'apporter des données complémentaires à ces résultats

expérimentaux, nous avons cherché à savoir si la cinétique du déclenchement et/ou de 1'extension de la mort cellulaire était aussi altérée chez cette lignée surproduisant la protéine AtMYB30. Pour ceci, nous avons réalisé des tests de type"Bleu Evans"selon la méthode décrite par Baker et Mock (1994).

Des expériences utilisant la souche avirulente GMI1000 de R. solanacearum ont été effectuées. La figure S illustre les résultats obtenus sur la mesure de la mort cellulaire par -coloration au Bleu Evans (Backer et Mock, 1994) sur Tabac après inoculation avec cette souche bactérienne, à un inoculum faible (107 cfu/ml). Les cinétiques présentées montrent l'apparition d'un pic de pénétration du colorant dans le cas de la lignée sens, correspondant à l'apparition des symptômes, 19 heures après l'inoculation. Après le'collapse'des tissus, les nécroses apparaissent, et le colorant n'est plus retenu. Ce pic représentatif de la mise en place de la réponse hypersensible apparaît plus précocement et est trois fois plus élevé chez la lignée sens que chez la lignée sauvage où il est relativement faible du fait de l'inoculum peu concentré utilisé lors de cette expérience. Une rétention moindre du Bleu Evans est également observée plus tardivement chez la lignée antisens.

L'interaction entre la souche virulente K60 de R. solanacearum et la lignée sauvage BS ou la lignée témoin pBIlll-23A conduit à la maladie. Dans ce cas, les profils de croissance bactérienne in planta présentés par ces deux lignées sont identiques : la mort cellulaire est détectée environ 48 heures après l'inoculation de la bactérie, et son taux chute à trois jours, pour devenir indétectable dès six jours. Le profil obtenu avec les plantes de la lignée sens pBIM131-40A est très différent. La mort cellulaire est détectée plus tôt (dés 24 heures après inoculation), son taux est plus fort deux jours après inoculation, et elle n'est plus détectable à partir de trois jours. De plus, ce taux est beaucoup plus important que chez la lignée sauvage ou la lignée témoin, puisqu'il est possible de mesurer une différence atteignant un facteur dix entre ces deux lignées et la lignée sens pBIM131-40A.

3.1.6 L'expression de gènes liés à la pathogénicité est altérée chez la lignée sens pBIM131-40A Le profil d'expression des gènes str246C et hsr203J du Tabac a été étudié lors d'inoculations par les bactéries avirulente GMI1000 et virulente K60 de R. solanacearum chez la lignée sauvage BS, la lignée témoin pBII l l-23A, et la lignée sens pBIM131-40A.

Alors que ces deux gènes montrent une expression similaire chez les deux premières lignées, des différences importantes ont été observées chez la lignée sens pBIM131-40A. Lors de ces expériences, le gène EF-la d'Arabidopsis est utilisé comme témoin interne constitutif.

L'expression du gène str246C est altérée chez la lignée sens pBIM131-40A Alors que le gène str246C n'est pas induit lors de l'inoculation par de 1'eau chez la lignée sauvage ou chez la lignée témoin pBII l l-23A, son expression est détectée très tôt (dès 6 heures) et jusqu'à 6 jours après inoculation chez la lignée sens pBIM131-40A. En outre, cette expression est plus précoce et plus forte en réponse aux souches avirulente GMI1000 et virulente K60 de R. solanacearum. Cependant, elle n'est pas détectée chez les plantes non inoculées, quelle que soit la lignée : 1'expression du gène str246C n'est donc pas constitutive chez la lignée sens pBIM131-40A, mais plus rapidement et plus fortement induite lors des trois inoculations chez cette lignée.

L'expression du gène hsr203Jest altérée chez la lignée sens pBIM131-40A Chez la lignée sauvage BS ou la lignée témoin pBII l l-23A, le gène hsr203J est essentiellement exprimé lors des premières étapes de l'interaction incompatible avec la souche GMI1000, puisqu'elle est détectée 6 heures et 12 heures après inoculation. En revanche, elle est à peine détectable lors de l'interaction compatible, et absente chez les plantes non inoculées ou inoculées par de l'eau. Par contre, le gène hsr203J présente un profil d'expression différent chez la lignée sens pBIM131-40A. Cette expression est aussi détectée 6 heures après inoculation par la souche GMI1000, mais maintenue plus longtemps que chez la lignée sauvage. De plus, elle est détectée très clairement au cours de l'interaction compatible 12 heures après inoculation. Enfin, ce gène n'est pas exprimé en absence d'inoculation..

3.2 La sénescence des feuilles de lignées sens est retardée Lors de l'étude du processus de sénescence des feuilles de Tabac, les huit premières feuilles adultes (en partant de la base de la plante) ou huit premiers étages foliaires de quatre plantes différentes sont prises en compte pour chaque lignée. Leur couleur et leur degré de nécrose sont estimés visuellement. En effet, les feuilles changent de couleur au cours de ce processus développemental. Cette dernière passe progressivement du vert profond au jaune, et l'étape ultime de cette évolution est caractérisée par la nécrose des feuilles, qui prennent

une teinte brunâtre, et se dessèchent progressivement. Cette séquence d'événements est dépendante de t'âge des feuilles, et se produit d'abord pour les feuilles les plus âgées.

3.2.1. L'observation du phénotype de lignées sens montre un retard de la sénescence des feuilles Lors de l'étude du processus de la sénescence des feuilles chez les lignées sens, une différence de phénotype par rapport à la lignée sauvage a été clairement observée. Alors que les premiers étages foliaires de la lignée sauvage BS et de la lignée témoin pBIlll-23A présentent une sénescence avancée (les dix premières feuilles sont nécrosées), les plantes issues de la lignée sens pBIM131-40A ne présentent que le début de ce processus : n'apparaissent qu'une ou deux feuilles nécrosées, et la perte de couleur des étages foliaires supérieurs est relativement faible. Il faut remarquer que l'observation de cette altération de la sénescence foliaire chez les différentes lignées sens a abouti à la mme classification établie lors de l'étude de la réponse des lignées sens à l'inoculation par la souche avirulente GMI1000 et la souche virulente K60 de R. solanacearum, et de la détection de la protéine AtMYB30. De façon générale, les feuilles des plantes issues des lignées sens semblaient avoir une taille légèrement supérieure à celles de la lignée sauvage. Afin de quantifier ces observations, le nombre de feuilles vertes et de feuilles nécrosées parmi les huit premiers étages foliaires, a été déterminé chez quatre plantes des lignées sens pBIM131-40A et pBIM131-4C, de la lignée témoin pBIlll-23A, ainsi que de la lignée sauvage BS. Les résultats obtenus traduisent parfaitement l'impression visuelle ressentie lors des observations des lignées sens en général, et montrent un retard dans le déclenchement et un ralentissement du processus de sénescence foliaire chez les lignées sens pBIM131-4C et pBIM131-40A. Le retard observé se traduit, notamment pour la lignée pBIM131-40A, par l'apparition différée des premières feuilles nécrosées : quatre-vingt-dix jours après semis pour cette lignée, soixante jours pour la lignée sauvage. Le ralentissement du processus de sénescence peut tre évalué par l'importance des pentes des différentes courbes : elles sont globalement plus faibles chez les deux lignées sens que chez la lignée témoin ou la lignée sauvage.

3.2.2 Les pigments chlorophylliens sont conservés plus longtemps Afin de confirmer les différences observées visuellement lors du processus de

sénescence foliaire, une mesure de la quantité de chlorophylles dans les feuilles au cours du temps a été réalisée. Ces expériences ont été effectuées sur les plantes ayant servi aux dénombrements des feuilles vertes ou nécrosées. Les huit premiers étages foliaires ont été soumis à 1'extraction des pigments chlorophylliens. La lignée sens analysée, pBIM131-40A, montre une diminution de la quantité de chlorophylles beaucoup plus lente que la lignée sauvage ou la lignée témoin pBIlll-23A pour les quatrième et huitième étages foliaires.

Ceci est vrai pour les huit étages foliaires pour lesquels cette mesure a été effectuée (résultats non montrés). II est notamment frappant de voir que la quatrième feuille de la lignée pBIM131-40A possède encore 50% de la quantité initiale de chlorophylles quatre- vingt-dix jours après semis, alors qu'il n'a pas été possible de détecter ces pigments chez la lignée sauvage à cette date. Il faut aussi remarquer que la différence constatée entre la lignée sens d'un côté, et la lignée sauvage et la lignée témoin de l'autre, est clairement visible dès le soixante-dixième jour de culture des plantes.

3.2.3 L'expression du gène ACC oxydase est diminuée Afin de confirmer nos observations phénotypiques et biochimiques lors du processus de sénescence des feuilles des lignées sens pBIM131-4C et pBIM131-40A, nous avons entrepris une étude moléculaire de ce processus, via la détection de 1'expression du gène ACC Oxydase ou ACO. L'ACC Oxydase (précédemment EFE pour Ethylene-Forming Enzyme) catalyse la dernière étape de la voie de biosynthèse de l'éthylène (Adams and Yang, 1979), hormone végétale fortement impliquée dans la maturation des fruits (Balagué et al., 1993). et la sénescence des tissus végétaux (Nadeau and ONeill, 1995), notamment des feuilles et des fleurs. Cette enzyme peut tre considérée comme un marqueur de la sénescence, et elle permet d'estimer l'implication de la voie de biosynthèse de l'éthylène dans le processus de sénescence des feuilles de nos lignées transgéniques de Tabac. Des échantillons provenant des septièmes et huitièmes étages foliaires ont été regroupés pour les différents temps de mesure, et soumis à une extraction d'ARN. La sénescence étant plus avancée pour la lignée sauvage et la lignée témoin pBIlll-23A, il n'a pas été possible d'extraire des ARN en quantités suffisantes au delà du soixante-dixième jour de culture des plantes, alors que ces extractions ont pu tre réalisées jusqu'au quatre-vingt-quatrième jour de culture pour les lignées sens pBIM131-4C et pBIM131-40A. Les résultats obtenus

montrent que 1'expression du gène ACO est globalement plus faible chez les lignées sens que chez la lignée sauvage ou la lignée témoin, mme si elle est très forte au soixante-dizième jour de culture chez la lignée pBIM131-4C. Ceci est particulièrement vrai pour la lignée pBIM131-40A, puisque cette expression est à peine détectable aux soixantième et soixante- dizième jours de culture, alors qu'elle est forte chez la lignée sauvage BS et la lignée témoin pBIlll-23A. Par la suite, c'est-à-dire aux quatre-vingtième et quatre-vingt-dizième jours après semis, 1'expression du gène ACO est plus facilement détectée chez la lignée pBIM131- 40A, et présente un niveau comparable à celui observé au soixantième jour de culture pour la lignée sauvage.

Exemple 4 Impact de la modulation de l'expression d'AtMYB30 sur la résistance à différents agents pathogènes chez le Tabac.

Des souches bactériennes virulentes (Pseudomonas syringe pv. tabac), avirulentes (Pseudomonas syringae pv. pisi et Pseudomonas fluorescens exprimant de façon constitutive le gène de la harpine) ou ne causant aucun symptôme (Pseudomonas fluorescens) ont été inoculées à deux concentrations différentes. En réponse aux deux souches avirulentes, 25 heures après inoculation, des lésions nécrotiques localisées à la zone d'inoculation sont observées sur la lignée sur-exprimant AtMYB30 ; ces mmes symptômes apparaissent plus tardivement (48 heures après l'inoculation) chez les autres lignées. De façon surprenante, des chloroses plus marquées sont observées chez les plantes de la lignée sens inoculées par P. syringe pv. tabaci, en comparaison avec les autres lignées, indiquant par conséquent un comportement différent de cette lignée vis-à-vis de deux bactéries pathogènes R. solanacearum et P. syringe. Dans le cas de P. fluorescens ne contenant pas le plasmide codant une harpine, aucun symptôme n'est observé, et ce sur toutes les lignées.

Par ailleurs, des champignons pathogènes ont été testés sur ces lignées transgéniques en collaboration avec la société Biogemma. Deux agents pathogènes fongiques du Tabac ont été retenus en raison de leurs modes d'invasion différents : Chalara elegans, agent pathogène racinaire et Cercospora nicotianae, agent pathogène foliaire. Aucune différence significative dans les symptômes n'a pu tre observée en réponse à une infection racinaire par Chalara elegans, quelle que soit la lignée. En revanche, une inoculation foliaire par le

champignon Cercospora nicotianae a permis d'observer un différentiel net entre les lignées.

Alors que les lignées sauvage et témoin présentent des symptômes marqués, aucun symptôme n'est observé sur la lignée sens. La lignée antisens présente des symptômes similaires, ou légèrement inférieurs, aux témoins.

Exemple 5 Analyse des lignées antisens de tabac Les phénotypes observés lors d'inoculations des lignées sens pBIM131 (mort cellulaire, croissance bactérienne in planta) nous ont amenés à effectuer des études similaires sur huit des lignées antisens disponibles. Leur phénotype après inoculation par les souches avirulente GMI1000 et virulente K60 de R. solanacearum a été observé, de mme que lors de la sénescence des feuilles et de la floraison.

4.1 Des lignées antisens présentent des phénotypes altérés en réponse à des inoculations bactériennes Les expériences d'inoculation des lignées antisens par la souche avirulente GMI1000 et la souche virulente K60 de R. solanacearum ont conduit à l'observation de phénotypes altérés vis-à-vis de la lignée sauvage BS.

Des lignees antisens presentent une resistance diminuee vis-a-vis de la souche avirulente GMI1000 de R. solanacearum L'inoculation des feuilles de lignées antisens par la souche avirulente GMI1000 de R. solanacearum a permis d'observer une altération du phénotype par rapport à la lignée sauvage BS. En effet, la vitesse d'apparition des symptômes caractéristiques de la HR est souvent diminuée, de mme que leur gravité finale. Une quantification de ces symptômes a abouti à la classification des lignées antisens testées en quatre classes phénotypiques.

Observation des phénotypes Bien que, lors de cette expérience, les symptômes obtenus avec la lignée sauvage BS aient été plus forts, et leur apparition plus précoce que lors de toutes les autres inoculations, les résultats obtenus sont extrmement clairs, et permettent notamment de distinguer plusieurs types de comportements parmi les huit lignées antisens testées vis-à-vis de la souche avirulente GMI1000. Nous avons aussi inoculé deux lignées témoins (pBI11 1-9A et pBII l l-23A, choisies pour leur événement unique d'insertion de l'ADN-T) dans les mmes

conditions, et celles-ci présentent les mmes phénotypes que la lignée sauvage (résultats non montrés). Les symptômes obtenus quatre jours après inoculation avec les lignées pBIW13- 28A et pBIW13-28B sont très particuliers : ils ne ressemblent en aucune manière à ceux obtenus avec la lignée sauvage BS. Pour les trois inocula testés (5.106,1.107, et 5.107 cfu/ml), les symptômes sont caractérisés quatre jours après inoculation par une nécrose sèche et localisée au niveau des zones inoculées, tout comme pour la lignée sauvage, mais chacune d'entre elles présente un phénotype original au delà de la zone nécrotique. Il s'agit d'une forte chlorose autour des lésions nécrotiques pour la lignée pBW13-28A, alors que les nécroses de la lignée pBW13-28B ne restent pas confinées aux zones inoculées, mais s'étendent en dehors. Les symptômes obtenus avec les autres lignées antisens analysées diffèrent également du phénotype de la lignée sauvage, mais de manière moins atypique (résultats non montrés). Alors que la plupart des lignées sens montraient une accélération de la HR et une aggravation des symptômes nécrotiques, des lignées antisens montrent un phénotype tout à fait contraire : les symptômes apparaissent plus tard, et les lésions nécrotiques ne s'étendent que rarement à la totalité des zones inoculées. Mises à part les lignées pBIW13-28A et pBIW13-28B, les lésions nécrotiques dues à la souche avirulente GMI1000 de R. solanacearum ne s'étendent jamais au delà des limites des zones inoculées.

L'évolution des symptômes est achevée 72 heures après inoculation.

La quantification des symptômes permet de répartir les lignées antisens en quatre classes phénotypiques De la mme façon que pour les lignées sens, il a été possible de quantifier les symptômes observés. Les symptômes observés chez la lignée sauvage avec l'inoculum de 5. 106 cfu/ml sont visibles dès 15 heures après inoculation avec l'apparition de grandes zones de"collapse"des tissus, qui se limitent à la surface des tissus inoculés dès 24 heures après inoculation. Les symptômes sont encore plus précoces (12 heures après inoculation) et atteignent le maximum de sévérité dès 24 heures après inoculation pour les deux autres inocula, 1.107 et 5.107 cfu/ml. Quatre jours après inoculation, ils sont caractérisés par des nécroses ayant envahi la totalité des zones inoculées pour les trois inocula. Chez les lignées antisens testées, quatre classes phénotypiques peuvent tre identifiées, en se basant sur la vitesse d'apparition et la gravité des symptômes, en comparaison avec la lignée sauvage.

Tout d'abord, les lignées pBW13-3A, pBW13-21A et pBW13-25D, et particulièrement pour les deux inocula les plus faibles, développent beaucoup moins rapidement la réponse, et son étendue finale est bien moindre. Ensuite, les lignées pBW13-41B et pBW13-4B se distinguent par un phénotype intermédiaire entre la lignée sauvage et les trois lignées antisens sus-citées : cette distinction dans la sévérité et la rapidité d'apparition des symptômes n'est décelable qu'au plus faible inoculum pour la lignée pBW13-41B (5.106 cfu/ml). Enfin, la lignée pBIW13-25C présente un phénotype très similaire à celui de la lignée sauvage, et ceci pour les trois inocula testés. Ces différences sont d'autant plus fortes que l'inoculum est faible : elles sont difficilement détectables pour l'inoculum le plus fort (5.107 cfu/ml), mais elles sont très claires lorsque l'inoculum est de 5.106 cfu/ml. La quatrième classe comprend les deux lignées pBIW13-28A et pBIW13-28B qui présentent des phénotypes tout à fait remarquables, car très différents de la lignée sauvage.

Des lignées antisens présentent une sensibilité modifiée vis-à-vis de la souche virulente K60 de R. solanacearum L'inoculation de lignées antisens de Tabac par la souche virulente K60 de R. solanacearum a révélé que toutes les lignées ne réagissaient pas comme la lignée sauvage BS. Alors que la chlorose des tissus inoculés, caractéristique de la maladie, apparaît aux environs du troisième jour, et qu'elle s'étend par la suite en dehors de cette zone chez la lignée sauvage, la plupart des huit lignées antisens testées ne développent pas les mmes symptômes. Parmi ces lignées, il est possible de déterminer quatre groupes, selon l'importance et la rapidité des symptômes causés par la souche K60. Ces groupes correspondent exactement à ceux identifiés grâce aux observations effectuées pour les inoculations par la souche avirulente GMI1000. La lignée pBW13-25C est comparable à la lignée sauvage pour la vitesse d'apparition des symptômes, mme s'ils sont un peu moins forts. Parmi les lignées réagissant plus vite (I'apparition de la chlorose est visible dés 48 heures après inoculation) que la lignée sauvage, il est possible de distinguer les lignées pBIW13-3A, pBW13-21A, pBW13-25D, pBW13-41B et pBIW13-44B d'une part, et les lignées pBW13-28A et pBW13-28B d'autre part. Les premières se distinguent par une légère aggravation des symptômes (la chlorose est plus marquée, et elle s'étend sur une surface augmentée d'environ 50% par rapport à la lignée sauvage), et les dernières sont

différentes de par la vitesse d'apparition des symptômes, qui est beaucoup plus rapide (ils apparaissent dès 36 heures après inoculation), et par la nature mme de ces symptômes. La lignée pBW13-28A est caractérisée par une très forte chlorose dans la zone inoculée, qui laisse rapidement place à des larges lésions nécrotiques dans cette zone, alors qu'une chlorose particulièrement forte s'étend au-delà des zones inoculées. Les symptômes observés chez la lignée pBW13-28B sont très différents, puisque clairement nécrotiques.

Ces nécroses sont brunes, et recouvrent environ le dixième de la surface de tissu inoculé, et ne s'étendent par par la suite. Ces zones nécrotiques correspondent précisément à l'endroit où l'injection à la seringue a été faite, donc où les bactéries ont été les plus nombreuses.

Exemple 6 Isolement de lignées transformantes d'Arabidopsis thaliana 8.1. Sélection des plantes transformées Les constructions utilisées pour la transformation du Tabac, comprenant soit la phase ouverte de lecture d'AtMYB30 en orientation sens, en orientation antisens, ou sans cette orf (construction témoin), en aval du promoteur 35S du CaMV, avaient été introduites chez Arabidopsis thaliana écotype Ws-0. A partir des graines issues des plantes transformées, la sélection des lignées transformées a été réalisée. Cette étape, effectuée sur milieu MS supplémenté en kanamycine (50mg/1), a permis l'obtention respectivement de 25,15 et 6 transformants pour les constructions sens, antisens, et témoin.

8.2. Analyse moléculaire et génétique des transformants La présence du transgène a été validée chez toutes les lignées sens, et dans la majeure partie des plantes transformées antisens et témoin. L'utilisation d'un couple d'amorces spécifiques de chaque construction a permis la vérification de la bonne orientation du transgène dans les lignées sens et antisens. Par ailleurs, le nombre d'insertions de l'ADN-T renfermant chaque construction a été évalué. Toutes les lignées transformées vérifiées d'un point de vue moléculaire et ne présentant qu'un seul locus d'insertion ont été menées à graines. Le phénotype de ces lignées au cours du développement a été observé sur 15 plantes de chaque lignée et s'est révélé dans la majorité des cas, similaire à la lignée sauvage Ws-0. Seules quelques lignées transformées présentent un développement altéré, caractérisé par un phénotype nain. A l'issue de cette étape, nous disposons de 18 lignées sur-exprimant

potentiellement AtMYB30, de 8 lignées le sous-exprimant et de 4 lignées témoins.

8.3. Analyse du phénotype en réponse à une bactérie pathogène avirulente Le pathosystème retenu est l'interaction Arabidopsis thaliana/Xanthomonas campestris pv. campestris (X. c. c.). 10 plantes de chaque lignée transformée, ainsi que 10 plantes sauvages Ws-0, ont été inoculées avec la souche Xc. c. 147. L'observation de la mise en place et du développement de la réponse hypersensible a permis de classer les différentes lignées transformées en fonction de l'intensité des symptômes observés. Chez la lignée sauvage, les plantes inoculées par X. c. c. 147 présentent dès 10 heures après l'infection les premiers symptômes de la réponse hypersensible, à savoir un'collapse'des cellules végétales dans la zone d'inoculation. Ces premiers symptômes évoluent jusqu'à constituer des lésions nécrotiques localisées à la zone d'inoculation 30 à 48 heures après l'inoculation.

Parallèlement à cette cinétique de référence, les résultats montrent que certaines lignées sens présentent des nécroses nettement plus fortes que la lignée sauvage et que certaines lignées antisens développent des symptômes nécrotiques moindres. Les lignées témoin ne diffèrent pas phénotypiquement de la lignée Ws-0. Afin de confirmer ces observations visuelles, une mesure du taux de mort cellulaire par la technique du Bleu Evans a été effectuée sur l'ensemble des lignées testées 30 heures après l'inoculation, temps où le taux de mort cellulaire est maximal chez l'écotype sauvage. Les résultats montrent une corrélation intéressante entre l'intensité des symptômes observés et le taux de mort cellulaire mesuré.

Pour la suite des expériences, 2 lignées sens (131.17A et 131.20A), 2 lignées antisens (W13. 1A et W13. 19A) ainsi qu'une lignée témoin (111. 23 A) ont été retenues.

8.4. Impact de la modulation de 1'expression d'AtMYB30 sur la mort cellulaire hypersensible chez Arabidopsis thaliana Les lignées sens sélectionnées inoculées par Xc. c. 147 présentent une intensification de la réponse hypersensible particulièrement marquée. En plus d'une augmentation, la mort cellulaire est détectée plus précocement chez une des lignées sens. Ces résultats montrent que les différentes lignées sélectionnées sont affectées dans la résistance à cette bactérie pathogène et constitueront un outil de choix pour valider le rôle d'AtMYB30 chez Arabidopsis thaliana dans la régulation de la réponse hypersensible.

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