Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Klonierungssystem und ein Verfahren zur Untersuchung von Interaktionen zwischen drei Proteinpartnern, das dazu geeignet ist, für bereits bekannte, miteinander interagierende Proteinpaare einen weiteren Interaktionspartner in einem Hochdurchsatz-Maßstab zu identifizieren.

Aus dem Stand der Technik ist das sog. Yeast Two Hybrid (Y2H)-Verfahren bekannt (1), das zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen verwendet werden kann. Dabei handelt es sich um ein Zwei-Komponenten-System, bei dem zwei potentielle Interaktionspartner (Bait und Prey) jeweils eine Komponente eines Reportersystems tragen. Das Reportersystem wird erst aktiviert, wenn sich das ßa/f-Protein und das Prey-Protein zu einem Komplex zusammenlagern. Beim Y2H-Verfahren werden an das ßa/f-Protein eine DNA-Bindedömäne und an das Prey-Protein eine Aktivator- Domäne gekoppelt. Bei der Bildung eines Komplexes zwischen den beiden zu untersuchenden Interaktionspartnern formen das Bait- und das Prey-Protein ein DNA-Aktivierungsprotein, das z.B. einem Transkriptionsfaktor entspricht. Dieser aktiviert die Transkription der Reporter-Gene. Das Verfahren hat den Nachteil, dass die Interaktion der zu untersuchenden Proteine im Zellkern der Hefe stattfinden muss, da der Transkriptionsfaktor an die DNA binden muss. Viele biochemische und strukturelle Prozesse im Zytoplasma einer Zelle werden somit erst gar nicht erfasst. Denn es ist gut möglich, dass sich Proteine im Milieu des Zellkerns ganz anders falten als am Ort ihres üblichen Vorkommens im Zytoplasma einer Zelle, oder dass durch die Verkürzung größerer Proteine beim Transport in den Zellkern wichtige Interaktionsdomänen verloren gehen oder maskiert werden. Dadurch kann es zu falschen Versuchsergebnissen kommen. Außerdem lassen sich bestimmte Proteine nicht in den Zellkern transportieren, wie beispielsweise Membranproteine.

Ein weiteres aus dem Stand der Technik bekanntes Verfahren zur Untersuchung von Proteinwechselwirkungen ist das sog. Split-Ubiquitin-System (SUS), mit dem es zum ersten Mal möglich war, nichtkernlokalisierte, wie z.B. membrangebundene Proteine, aber auch Transkriptionsfaktoren zu untersuchen (2). Bei diesem Verfahren wirkt der Komplex aus den aneinander gelagerten Bait- und Prey-Proteinen nicht selbst als Reporter, sondern er setzt einen Reporter frei, der räumlich unabhängig von den interagierenden Proteinen aktiv werden kann. Beim SUS-Verfahren werden zwei Hälften eines Ubiquitin-Moleküls (Nub und Cub) jeweils an das Bait- und das Prey- Proteine gekoppelt. Erst bei einer Interaktion zwischen den beiden zu

untersuchenden Proteinen entsteht ein funktionelles Ubiquitin-Molekül, wodurch der entstandene Komplex von spezifischen Ubiquitin-Proteasen erkannt und gespalten wird. Dabei wird ein chimärer Transkriptionsfaktor (ProteinA-LexA-VP16) freigesetzt, der im Kern die Transkription der Reporter-Gene initiiert. Dieses System erlaubt das Studium von Proteininteraktionen, die im Zytoplasma bzw. an Endomembranen stattfinden. Ein Nachteil des SUS-Verfahrens besteht aber wiederum darin, dass die potentiellen Proteinpartner jeweils einzeln in die entsprechenden Vektoren Moniert und dann nacheinander in die Zielzelle eingeschleust werden müssen. Die

Verwendung des Y2H-Verfahrens ist somit auf die Untersuchung weniger, bereits bekannter Proteinpaare auf ihre Interaktionsfähigkeit beschränkt.

Zwei aus dem Stand der Technik bekannte Weiterentwicklungen haben die SUS- Technik deutlich erweitert. 2004 erlaubte zum ersten Mal der sog. Mating Based Approach ein Hochdurchsatz-Screening von Proteinpaaren (3). Dieses Verfahren nützt ein bei Hefen natürlicherweise vorkommendes Paarungsverhalten: zwei haploide Hefezellen, die zu unterschiedlichen Paarungstypen gehören (MATa und MATalpha), können zu einer diploiden Zelle verschmelzen. Bei dem Mating Based Approach werden die an Nub-Sequenzen gekoppelten ßa/ ^' f-Proteine in die MATa- Zellen, die zu testenden Prey-Proteine, z.B. in Form einer cDNA Bank in die MATalpha-Zellen kloniert (Fig. 1). Auf diese Weise ist es zum ersten Mal gelungen, viele potentielle Protein-Protein-Interaktionspartner vergleichsweise schnell zu screenen. Der Nachteil auch dieses Verfahrens besteht darin, dass es auf die Untersuchung von ausschließlich nur zwei Protein partnern beschränkt ist. Die Wechselwirkung von gerade mal zwei Proteinen ist allerdings nur ein Ausschnitt aus einem viel größeren Spektrum an Interaktionen in einer Zelle.

Eine andere Weiterentwicklung des SUS-Verfahrens erlaubt das Studium der Interaktion von drei Proteinen. Es ist die sog. Split-Ubiquitin-Bridge-Methode aus dem Jahr 2009 (4), nachfolgend auch SUS-Bridge Assay genannt.

Kennzeichen des ursprünglichen SUS-Verfahrens ist, dass die DNA des Prey- Proteins an die DNA der Nub-Sequenz und die DNA des Ba/f-Proteins an die DNA der Cub-Sequenz des Ubiquitins gekoppelt ist, so dass nach Transkription zwei Fusionsproteine entstehen. Unterhalb der Cub-Sequenz ist zusätzlich die DNA- Sequenz eines Chimären Transkriptionsfaktors gekoppelt. Nach einer

Wiederherstellung des Ubiquitin-Moleküls durch die räumliche Annäherung von Nub- und Cub-Teilproteinen wird der entstandene Protein-Komplex von spezifischen Ubiquitin-Proteasen erkannt und der Transkriptionsfaktor unterhalb des

rekonstituierten Ubiquitin freigesetzt, der im Kern die Transkription der Reporter- Gene initiiert.

Beim SUS-Bridge Assay werden Bait und Prey allerdings so ausgewählt, dass diese für sich genommen nicht miteinander interagieren, sondern nur in Gegenwart eines mit Bait und Prey zusätzlich interagierenden dritten Proteins. Nur in diesem Fall können die Nub- und Cub-Teilproteine wieder in räumliche Nähe gebracht werden und das Wachstum auf Mangelmedium ermöglichen. Bei diesem Verfahren erfolgt die Aktivierung des Reportergens nur, wenn sich zwischen den zwei

Interaktionspartnern Bait und Prey zusätzlich ein weiteres, drittes Protein (Bridge) anlagert und sie so zusammenbringt. Auf diese Weise war es zum ersten Mal möglich, die Interaktion zwischen drei potentiellen Protein-Partnern zu untersuchen. Bei dem Split-Ubiquitin-Bridge-Veffahren handelt es sich jedoch um einen Assay, mit dem nur wenige ausgewählte Proteine untersucht werden können, denn das Verfahren ist methodisch sehr aufwändig: die drei potentiellen Interaktionspartner müssten sequentiell, also hintereinander (als sequentielle Kotransformation) in die Hefezelle kloniert werden, was mit viel Arbeits- und Zeitaufwand verbunden ist. Ein Hochdurchsatz-Screening von vielen potentiellen Proteinpartnern, etwa das Studium einer kompletten cDNA-Bank ist damit nicht möglich.

Mit allen bislang aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren ist es somit nicht möglich, eine Interaktion von mehr als zwei Proteinpartnern in einem Hochdurchsatz- Maßstab zu untersuchen. Das ist ein entscheidender Nachteil des Stands der Technik: da eukaryotische Zellen komplexe Stoffwechselwege aufweisen, bei denen häufig mehr als zwei Proteine miteinander wechselwirken, sind die bekannten Verfahren für eine systematische Untersuchung von Proteininteraktionen für viele biologische Fragestellungen ungeeignet. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Klonierungssystem und ein Verfahren zur Untersuchung von Interaktionen zwischen drei Proteinpartnern bereitzustellen, mit denen zugleich ein schnelles Hochdurchsatz-Screening von cDNA-Banken möglich ist. Das erfindungsgemäße Klonierungssystem und Verfahren sollen erstmals ein Hochdurchsatz-Screening etwa einer kompletten cDNA-Bank auf das Vorhandensein mindestens eines Proteins erlauben, das mit zwei bereits bekannten und vom Experimentator jeweils vorgegebenen Proteinen interagiert, somit eine Dreifachinteraktion eingeht.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines neuartigen Klonierungssystems gelöst, das es erstmals erlaubt, sowohl Bait als auch Prey in einem einzigen

Arbeitsgang in Hefe einzutransformieren: zum einen wird ein erster Vektor, ein sogenannter ,2in1 ' Vektor hergestellt, der sowohl ,/?a/f-Cub-Fusion' als auch ,prey- Nub-Fusion' auf demselben Plasmid tragen kann (Fig. 2); zum anderen wird ein zweiter Vektor, enthaltend die DNA des dritten, unbekannten Proteins, z.B. in Form einer cDNA-Bank, hergestellt.

Erfindungsgemäß wird der erste Vektor, enthaltend die DNA des ersten bekannten Proteins (Bait) und die DNA des zweiten bekannten Proteins (Prey), die nicht direkt miteinander interagieren können, in Hefezellen des ersten Paarungstyps, und der zweite Vektor, enthaltend die DNA des dritten, unbekannten Proteins, in Hefezellen des zweiten Paarungstyps übertragen, und die Hefezellen der beiden Paarungstypen werden anschließend zur Verschmelzung gebracht. Dabei ist die DNA des Prey- Proteins an die DNA der Nub-Sequenz und die DNA des ßa/ ^' f-Proteins an die DNA der Cub-Sequenz des Ubiquitins gekoppelt, so dass nach Transkription zwei

Fusionsproteine entstehen. Unterhalb der Cub-Sequenz ist zusätzlich die DNA- Sequenz eines Chimären Transkriptionsfaktors gekoppelt. Nach einer

Wiederherstellung des Ubiquitin-Moleküls durch die räumliche Annährung von Nub- und Cub-Teilproteinen wird der entstandene Protein-Komplex von spezifischen Ubiquitin-Proteasen erkannt und der Transkriptionsfaktor unterhalb des

rekonstituierten Ubiquitin freigesetzt, der im Kern die Transkription der Reporter- Gene initiiert. Der erste Vektor enthält im Einzelnen mindestens folgende Elemente (Fig. 2): einen ersten Promotor; die DNA eines ersten bekannten Proteins, gekoppelt an eine Chimäre aus C-terminaler Sequenz (Cub) des Ubiquitins und an die DNA eines Transkriptionsfaktors; einen zweiten Promotor; die DNA eines zweiten bekannten Proteins, gekoppelt an die N-terminale Sequenz (Nub) des Ubiquitins; ein erstes Auxotrophie-Marker-Gen; einen ersten Replikationsursprung aus E. coli; einen ersten Replikationsursprung aus S. cerevisiae; ein erstes Antibiotikaresistanz-Gen.

Der zweite Vektor enthält im Einzelnen mindestens folgende Elemente (Fig. 2): einen dritten Promotor; die DNA des dritten, unbekannten Proteins; ein zweites

Auxotrophie-Marker-Gen; einen zweiten Replikationsursprung aus E. coli; einen zweiten Replikationsursprung aus S. cerevisiae; ein zweites Antibiotikaresistanz- Gen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung von Interaktionen zwischen drei Proteinpartnern besteht aus folgenden Schritten:

Übertragung des ersten Vektors in Hefezellen des ersten Paarungstyps; Übertragung des zweiten Vektors in Hefezellen des zweiten Paarungstyps;

Paarung der Hefezellen des ersten und des zweiten Paarungstyps; Übertragung der Hefezellen auf ein Mangel/nedium, welches auf Vorhandensein beider Vektoren sowie Reportergen-Aktivität (welche eine Interaktion der drei zu untersuchenden Proteine bedeutet) selektiert.

Nach einer Übertragung des ersten Vektors in Hefezellen des ersten Paarungstyps, einer Übertragung des zweiten Vektors in Hefezellen des zweiten Paarungstyps, und einer anschließenden Verschmelzung der Hefezellen beider Paarungstypen überleben nur solche Zellen auf einem Mangel-Medium für den ersten und den zweiten Auxotrophie-Marker und können somit selektioniert werden, die das erste und das zweite Protein auf dem ersten Vektor, sowie das dritte Protein auf dem zweiten Vektor exprimieren, und diese drei Proteine untereinander interagieren.

Dadurch, dass die beiden bekannten Proteine erfindungsgemäß auf nur einem Vektor kodiert sind, wird nur ein Auxotrophie-Marker bzw. nur einer der beiden Hefestämme (z.B. THY.AP4, Fig. 1) für die Expression beider Fusionsproteine (,bait- Cub-Fusion' und ,prey-Nub-Fusion') benötigt. Der zweite Marker kann somit für das Einklonieren der cDNA-Bank für den zu untersuchenden unbekannten dritten Proteinpartner verwendet werden.

Für den ersten Vektor, der die DNA des ersten und des zweiten bekannten Proteins enthält, wird bevorzugt ein low-copy Hefe-Replikationsursprung verwendet, wie beispielsweise CEN4/ARS1.

Als erster Promotor wird ein regulierbarer, insbesondere ein reprimierbarer Promotor verwendet. Besonders bevorzugt wird der Methionin-reprimierbare met25 Promotor verwendet.

Als zweiter Promotor wird insbesondere ein konstitutiv exprimierender und / oder ein regulierbarer Promotor verwendet. Insbesondere kommen dafür starke Promotoren in Frage, wie beispielsweise der TDH3- (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3) oder PMA ί-Promotor (Plasma Membrane ATPase).

Für den zweiten Vektor, der die DNA des dritten, unbekannten Proteins enthält, wird bevorzugt ein high-copy Hefe-Replikationsursprung verwendet, wie beispielsweise 2μ-Οη, der eine hohe Kopienzahl des Plasmids zur Folge hat und damit indirekt auch die Expression verstärkt.

Als Promotor für den zweiten Vektor wird bevorzugt ein starker, konstitutiv

exprimierender Promotor verwendet, wie beispielsweise der PMA1-, TDH3- oder /ADH-Promotor.

Die beiden im Verfahren verwendeten Vektoren enthalten Gene, die jeweils unterschiedliche Antibiotika-Resistenzen (z.B. Ampicillin und Spectinomycin) vermitteln, was eine einfache Trennung der Transformanten ermöglicht.

Außerdem enthalten die beiden erfindungsgemäßen Vektoren Gene, die jeweils für unterschiedliche Auxotrophie-Marker kodieren, z.B. für Leucin- oder für Tryptophan- Auxotrophie (Fig. 2).

Die DNA des dritten, unbekannten Proteins, kann z.B. als ein gezielt ausgewähltes Gen oder in Form einer cDNA Bank in den Expressionsvektor kloniert werden. Die Expression der Reporter-Gene bei einer Wiederherstellung des Ubiquitin-Moleküls führt dann dazu, dass nur Klone auf einem Selektionsmedium, z.B. Mangelmedium, wachsen, welche alle drei miteinander interagierenden Proteine exprimieren. Diese Klone können dann isoliert und die in ihnen exprimierten Gene identifiziert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht gegenüber dem Stand der Technik die entscheidende Prozessbeschleunigung für ein Hochdurchsatz-Screening, bei dem erstmals eine komplette cDNA Bank auf die Anwesenheit eines potentiellen dritten Interaktionspartners untersucht werden kann, der mit zwei bereits bekannten, für sich genommen wechselwirkenden Proteinen, interagiert. Da das Screening über den Einsatz der Mating öased-Prozedur im Hochdurchsatz durchgeführt werden kann, weist das erfindungsgemäße Verfahren eine zehn bis hundertfach höhere Effizienz auf, im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren. Auf einen etwaigen industriellen Maßstab bezogen ist ebenfalls ein großer Vorteil, dass jede cDNA-Bank, einmal im entsprechenden Expressionsvektor und in Hefe kloniert, bei - 80°C einige Jahre lang aufbewahrt und für jedes beliebige Screening

wiederverwendet werden kann. Lediglich Bait und Frey müssten im ersten Vektor ausgetauscht werden.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der unten beschriebenen Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Figuren beschrieben.

Fig. 1 : Schematische Darstellung der Hefestämme, die als Beispiel für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. (A) THY.AP4, vom mating Typ .alpha' wird auch als ,bait-strain' bezeichnet und trägt die Reportergene (ADE2, HIS3 und lacZ) unter der Kontrolle des lexA Promotors. Der Stamm ist auxotroph gegenüber Tryptophan, Leucin, Uracil, Histidin und Adenin. (B) Der Hefestamm THY.AP5, auch als ,prey-strain' bekannt, wird im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, um die cDNA Bank zu tragen. Dieser Stamm trägt die gleichen

Auxotrophien wie THY.AP4 mit einer Ausnahme: er ist prototroph gegenüber Uracil, was eine Gegenselektion gegenüber THY.AP4 ermöglicht.

Fig. 2: Vektorkarten der Plasmide, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Einmal vorgestellt sind zwei ,2in1 ' Vektoren. Die beiden ,2in1 ' Vektoren tragen das Ampicillin-Resistenzgen und den pMB1 Replikationsursprung für Selektion und Wachstum in E. coli sowie die Leucin-Expressionskassette und eine sogenannte Centromer/Autosomale Replikations-Sequenz (Cen4/ARS1) für die Anzucht in Saccharomyces cerevisiae. Die beiden Expressionskassetten stehen entweder unter der Kontrolle des Methionin-reprimierbaren met25 Promotors (im Falle der C-terminalen Cub-PLV Fusionen) oder unter der des starken und

konstitutiven tdh3 Promotors (im Falle der N-terminalen NubG-HA Fusionen [(A), pSUSr-2in1] bzw. der C-terminalen NubA-HA Fusionen [(B), pSUSr2-2in1]).

Weiterhin, vorgestellt ist ein Expressionsvektor, welcher die cDNA Bank für potentielle Interaktionspartner trägt. Dieser wird mittels Spectinomycin in Bakterien bzw.

Tryptophanmangel [(C), pYOX2-Dest] in Hefe selektiert und über .high-copy ¹

Replikationsursprünge pMB1 (E.coli) bzw. 2μ (S. cerevisiae) vervielfältigt. Die

Gateway Kassette des Expressionsvektors steht unter Kontrolle des starken, konstitutiven Hefe pmal Promotors.

Fig. 3: Schematische Darstellung für eine beispielhafte Ausführung des

erfindungsgemäßen Verfahrens. Es wird nach einem Interaktionspartner der membranlokalisierten Rezeptorkinasen BRI1 und BAK1 gesucht. Dazu werden BRI1 und BAK1 jeweils C-terminal mit NubA bzw. Cub-PLV getaggt und in Vektor pSUSr2- 2in1 kloniert. Eine Interaktion der beiden Proteine in Hefe ist nur möglich durch Zusatz bestimmter Protein-Cofaktoren, die aus der cDNA Bank, die auf dem Vektor pYOX2-Dest kloniert ist, rekrutiert werden müssen. Die unbekannten Cofaktoren können extra- oder intrazellulärer Natur (Doppelpfeil mit Fragezeichen) sein. Sobald die Interaktion zwischen BAK1 und BRI1 überbrückt wird, re-assoziiert ein

funktionales Ubiquitin Molekül, welches von Proteasen erkannt wird, die dann wiederum den Transkriptionsfaktor PLV abspalten, welcher im Kern die

Reportergene aktiviert und die Hefe prototroph für Adenin und Histidin macht und so ihre Selektion auf dem entsprechenden Mangelmedium ermöglicht.

Ausführunqsbeispiele

Herstellung des ersten Vektors, enthaltend die DNA des ersten und des zweiten bekannten Proteins

Für die erfolgreiche Herstellung eines solchen ,2in1 ' Vektors musste lange Zeit mit unterschiedlichen Promotoren für die beiden Expressionskassetten bzw. dem

Replikationsursprung (,Ori') in Hefe experimentiert werden. Die Verwendung eines 2μ high copy Ori sorgte für eine zu hohe Kopienzahl des Plasmids und daraus resultierend, eine zu starke Expression der Cub-Fusion, was. den Verlust der

Regulierbarkeit des met25 (Methionin-repremierbaren) Promotors zur Folge hatte. Der so überexprimierte Cub-PLV Transkriptionsfaktor bzw. dessen partielle

Degradierung löste Hintergrundwachstum selbst in Abwesenheit der Nub-Fusion aus. Es konnte also nur ein low-copy ars/cen Ori zum Einsatz kommen in einem

möglichen ,2in1 ' Vektor. Auch hier traten Probleme auf, da nun, trotz Verwendung des klassischen Alkoholdehydrogenase (adh) Promotors, der konstitutiv angeschaltet ist, zu wenig Nub-Fusion exprimiert wurde und selbst bei Positivkontrollen keine Interaktion gezeigt werden konnte. Zahlreiche weitere Promotoren konnten das Problem nicht lösen. Erst der tdh3 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3) Promotor, der etwa zehn- bis hundertmal stärker konstitutiv exprimiert als der adh Promotor, löste das Problem, so dass jetzt zuverlässig zwei interagierende Proteine auf demselben Plasmid exprimiert und getestet werden können.

Herstellung des zweiten Vektors, enthaltend die DNA des dritten, unbekannten Proteins

Auch der weitere Vektor pYOX2-Dest (Fig. 2) wurde in der vorliegenden Erfindung neu und speziell für das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt. Dieser ist für die Klonierung der cDNA Bank oder eines möglichen weiteren Gens konzipiert.

Ein high-copy Ori ermöglicht eine starke Expression, zusammen mit dem

verwendeten pmal (Plasmamembran ATPase-) Promotor, der konstitutiv in Hefe angeschaltet ist, ermöglichen eine starke Expression. Ein anderes Resistenzgen, welches Resistenz gegenüber Spectinomycin anstelle von Ampicillin im ,2in1 ' Vektor überträgt, ermöglicht die einfache Trennung von ,2in1 ' Plasmid und cDNA Bank, falls DNA aus Hefekolonien nach einem Screen in E. coli amplifiziert werden sollen.

Unterschiedliche Resistenzen ermöglichen einfache Trennung der Plasmide, da Bakterien normalerweise nur Plasmide amplifizieren, deren Behalten einen

Selektionsvorteil mit sich bringt - in diesem Fall also das Wachstum in Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum-Zusatz. Die Verwendung des

Phosphoribosylanthranilat isomerase Gens (TRP1 ) als Auxotrophie-Marker

(Tryptophan-Selektion) ermöglicht die Verwendung des THY.AP5 (Fig. 1)

Hefestammes, also den auf mating basierenden Ansatz.

Untersuchung von Interaktion zwischen Rezeptorkinasen BRI1 und BAK1 in A. thaliana mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens In Arabidopsis thaliana gibt es eine Klasse von membranständigen Rezeptorkinasen, welche eine Vielzahl von extrazellulären Stimuli in intrazelluläre Signale umwandeln. Zu dieser Klasse von Leucin-reichen Rezeptorkinasen zählen auch die

Hormon rezeptoren Brassinosteroid-insensitive 1 (BRI1) und deren

Interaktionspartner BRI1 associatqd inase 1 (BAK1). Brassinosteroide (BRs) sind als eigene Klasse von Phytohormonen an grundlegenden Entwicklungsprozessen wie der Blatt- und Wurzelentwicklung, der Xylem-Ausdifferenzierung und der

Blühinduktion beteiligt (7, 12). Ihre Perzeption findet im Apoplasten durch die

,Leucine-Rich-Repeat Receptor-like kinase' (LRR-RLK) BRI1 und deren

Interaktionspartner BAK1 statt.

Während Signaltransduktion und Transkriptregulierung im Zellinnern recht gut verstanden sind, gibt es widersprüchliche Ergebnisse zu den Vorgängen im

Apoplasten. Nach einer ursprünglichen Hypothese liegt BRI1 im inaktiven Zustand als Homodimer vor (10). Hierbei wird die intrazelluläre Domäne von BRM durch den negativen Regulator BKI1 gebunden, der die Kinaseaktivität von BRM inhibiert (1 1). BR Perzeption führt dann zu einer Konformationsänderung, die eine

Transphosphorylierung des Inhibitors sowie dessen Dissoziation zur Folge hat (9). Daran schließt sich die Rekrutierung von BAK1 an, was wiederum die

Signaltransduktionskaskade auslöst.

Eine kürzlich veröffentlichte Arbeit zeigte allerdings mittels FLIM-Studien in

Wurzelepidermiszelleri von Arabidopsis, dass trotz Zugabe von BR- Biosyntheseinhibitoren präformierte BRI1/-BAK1 Heterodimere in der

Plasmamembran vorkommen (8). In den Versuchen konnte auch gezeigt werden, dass trotz BR-Gabe nur ein geringer Anteil der BRM Population (ca. 10%) mit BAK1 heterodimerisiert, dies aber ausreicht, um alle BR-regulierten Prozesse auszuführen. Da in den Arbeiten unterschiedliche Methoden und Expressionssysteme zum Einsatz kamen, stellt sich die Frage, ob die Diskrepanz der Ergebnisse zur Rezeptor- Heterodimerisierung dadurch erklärt werden kann, dass dabei weitere, bislang unentdeckte Proteine eine entscheidende Rolle spielen. Wir haben festgestellt, dass im klassischen Split-Ubiquitin System die Interaktion der beiden Rezeptoren nur sehr schwach ist, bei Expressionsreduzierung durch

Methioningabe vollständig verschwindet. Daher vermuten wir, dass es noch andere Interaktionspartner in Pflanzenzellen geben muss, die in der Hefe fehlen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es nun erstmals überhaupt, solche bislang unbekannten Interaktionspartner zu identifizieren, welche die BRI1/BAK1 Interaktion in Hefe stabilisieren (Fig. 3). Dazu werden zunächst die neuen Vektoren mit den entsprechenden Konstrukten rekombiniert (5). Das ist einmal der ,2in1 ' Vektor ,pSUSr2-2in1 ' (Fig. 2) mit BAK1 und BRI1. Weiterhin ist es der Hefe-Expressionsvektor ,pYOX2-Dest' (Fig. 2) mit einer aus Arabidopsis Wurzeln gewonnenen cDNA Bank (die Rekombinierung der cDNA Bank erfolgt wie beschrieben im„CloneMiner Kit" der Firma Life Technologies).

BAK1/BRI1 im ,2in1 ' Vektor wird dann in den Hefestamm THY.AP4 und die cDNA Bank im Expressionsvektor in den Hefestamm THY.AP5 transformiert (3, Fig. 1 ). Die Transformation der Hefe wird im Fall des ,2in1 ' BAK1/BRI1 -Konstruktes im

Kleinmaßstab, die der cDNA Bank im Großmaßstab, beides wie in (6) beschrieben, durchgeführt.

Nach drei Tagen werden die auf Selektionsmedium angezogenen Hefen wie folgt behandelt. 5-10 Kolonien des ß/4 /ÖR/i-Konstruktes werden in 50ml

Selektionsmedium (Leucin-Selektion) überführt und über Nacht bei 30°C zu einer optischen Dichte von 10 ^Λ 8 angezogen (ca. 14h). Die Hefen werden dann in einem finalen Volumen von 1 ml Vollmedium (YPD) gesammelt. Bei der auf mehreren Selektionsplatten angezogenen cDNA Bank werden alle Kolonien mit

Selektionsmedium (Tryptophan-Selektion) heruntergewaschen und in 10ml

Finalvolumen gesammelt. Die OD sollte die gleiche Dichte haben, wie die OD des ,2in1 ' Konstruktes. Je 1 ml des ,2in ' bait Konstruktes und 1 ml der cDNA Bank werden in YPD bei pH 4,5 für 2 Stunden und bei 30° unter leichter Rotation (35rpm) inkubiert. Im Anschluss wird das gesamte Volumen auf mehreren YPD Platten pH 5,5 ausgestrichen und für 5 Stunden bei 30°C inkubiert. Danach wird mittels eines Gesamtvolumens von 15ml sterilem Wasser die gesamte Hefe von den YPD Platten heruntergespült und durch Zentrifugation und Resuspendierung in 5ml Volumen aufgenommen. Je 10ΟμΙ Hefe-Suspension werden auf Selektionsmedium (kein Tryptophan, Leucin, Uracil, Adenin und Histidin) ausplattiert und 3 Tage bei 30°C inkubiert. Einzelkolonien werden nach 3 Tagen auf neue Selektionsplatten überführt und im Falle ihres Wachstums per Colony PCR und Sequenzierung des PCR Produktes analysiert.

Auf diese Weise wurden in der vorliegenden Erfindung erstmals mehrere potentiell interessante Dreifach-Interaktionspartner gefunden. So wurde ein bislang

unbekanntes, als putatives MAP Kinase Substrat annotiertes Protein, identifiziert. Da BRI1 und BAK1 als Rezeptorkinasen in der Brassinosteroid Signaltransduktion involviert sind und diese wie oben beschrieben in einer MAP Kinase Kaskade im Cytosol weitergeleitet wird, könnte dieses bislang unbekannte Substrat interessante Hinweise auf mögliche Kreuzreaktionen zwischen funktionaler Dimerisierung der Rezeptoren einerseits und intrazellulärer Phosphprylierungskaskade anderseits Aufschluss geben. Normalerweise würde ein MAP Kinase Substrat als Teil einer Phosphorylierungskette in der Signalweiterleitung fungieren. So ist bekannt, dass zu den bisherigen Substraten der BR Signaltransduktion in erster Linie

Transkriptionsfaktoren zählen. Diese lösen BR-spezifische Antworten aus. Unser Fund ist spektakulär, da es sich hier nicht um ein kernlokalisiertes MAP Kinase Substrat, sondern um wahrscheinlich ein Plasmamembran-assoziiertes Protein handelt. Eine Dimerisierung der Rezeptoren, die zunächst Voraussetzung für deren Aktivierung ist, würde durch eine Signalkaskade nicht nur zu direkter

Transkriptregulierung einerseits sondern über das neu entdeckte Protein zu einer verstärkten Interaktion der Rezeptoren führen, was auf eine mögliche feedback- Regulierung des BR Signals hindeutet. Eine solche Signal-Amplifizierung in der BR Signaltransduktion wurde bislang noch nicht beschrieben. Literaturstellen

(1) S. Fields, 0. Song: A novel genetic System to detect protein-protein

interactions. In: Nature. 340, Nr. 6230, 1989, S. 245-6

(2) N. Johnsson and A. Varshavsky: Split ubiquitin as a sensor of protein

interactions in vivo. In: Proc Natl Acad Sei U S A. Oct 25, 1994; 91(22):

10340-10344 (3) P. Obrdlik, M. El-Bakkoury, T. Hamacher, C. Cappellaro, C. Vilarino, C.

Fleischer, H. Ellerbrok, R. Kamuzinzi, V. Ledent, D. Blaudez, D. Sanders, J.L. Revueita, E. Boles, B. Andre, W.B. Frommer: K ⁺ Channel interactions detected by a genetic System optimized for systematic studies of membrane protein interactions. In: Proc Natl Acad Sei U S A. 2004 Aug 17; 101 (33): 12242-7

(4) A. Honsbein, S. Sokolovski, C. Grefen, P. Campanoni, R. Pratelli, M.

Paneque, Z. Chen, I. Johansson, M.R. Blatt. A Tripartite SNARE-K ⁺ Channel Complex Mediates in Channel-Dependent K ⁺ Nutrition in Arabidopsis. (2009) In: Plant Cell 21 (9):2859-77

(5) C. Grefen, M.R. Blatt. A 2in1 cloning System enables ratiometric bimolecular fluorescence complementation (rBiFC). In: Biotechniques 2012 Vol. 53, No. 5, pp. 311-314 (6) C. Grefen, P. Obrdlik, K. Harter. The determination of protein-protein

interactions by the mating-based split-ubiquitin System (mbSUS). (2009) Methods Mol Biol. 479:217-33

(7) Bishop, G.J., and Koncz, C. (2002). Brassinosteroids and plant Steroid

hormone signaling. The Plant Cell 14 Suppl, S97-110.

(8) Bücherl, CA., van Esse, G.W., Kruis, A., Luchtenberg, J., Westphal, A.H., Aker, J., van Hoek, A., Albrecht, C, Borst, J.W., and de Vries, S.C. (2013). Visualization of BRI1 and BAK1(SERK3) membrane receptor heterooligomers during brassinosteroid signaling. Plant Physiology 162, 1911-1925.

(9) Jaillais, Y., Hothorn, M., Belkhadir, Y., Dabi, T., Nimchuk, Z.L., Meyerowitz, E.M., and Chory, J. (2011). Tyrosine phosphorylation controls brassinosteroid receptor activation by triggering membrane release of its kinase inhibitor. Genes & development 25, 232-237.

(10) Russinova, E., Borst, J.W., Kwaaitaal, M., Cano-Delgado, A., Yin, Y., Chory, J., and de Vries, S.C. (2004). Heterodimerization and endocytosis of Arabidopsis brassinosteroid receptors BRI1 and AtSERK3 (BAK1). The Plant Cell 16, 3216-3229.

(11) Wang, X., and Chory, J. (2006). Brassinosteroids regulate dissociation of BKI1 , a negative regulator of BRI1 signaling, from the plasma membrane. Science 313, 1118-1122.

(12) Zhu, J.Y., Sae-Seaw, J., and Wang, Z.Y. (2013). Brassinosteroid

signalling. Development 140, 1615-1620.