技术领域

本发明涉及一种中药活性成分组合物， 其包含京尼平苷或栀子苷、黄连素、人 参总皂苷或人参皂苷单体或人参皂苷单体组合 物。 本发明还涉及该组合物在制备 治疗或预防脑和神经损伤、 神经退行性脑病、 细菌性或病毒性脑炎、 或抑郁症的 药物中的用途。 背景技术

中医理论重视整体观念和辨证论治， 传统中医理论认为， 气虚血瘀是中风重 要病机， 气虚是本病之本， 血瘀是本病基本病机， 乃本病发生发展的核心， 活血 化瘀为治疗本病的基本大法。 气虚血瘀症在传统的认识中只见于中风后遗症 期， 益气活血法亦仅用于后遗症患者， 清代名医王清任补阳还五汤是代表方剂 （张梅 奎， 尹岭， 张学文 补阳还五汤治疗缺血性中风的研究进展， 中国中医基础医学杂 志， 2002，8(9):74-78 )。 而采用益气、 解毒治法及相关的中药治疗脑及神经损伤性 疾病尚未见报道。

老年性痴呆 （senile dementia, SD) ， 亦称阿尔茨海默病 （Alzheimer disease,

AD) 是一种以进行性认知障碍和记忆能力损害为主 的中枢神经系统退行性疾病， 并伴有不同程度的运动、 认知、 语言和人格等多方面的异常。 AD的临床表现为痴 呆综合症， 以记忆力减退、人格变性为特征。 AD的主要病理改变是大脑皮质萎縮、 神经细胞和突触大量丢失、 神经元纤维缠结、 细胞外老年斑和脑血管淀粉样变。 目前对老年痴呆症尚无根本治疗方法。 目前治疗老年性痴呆分子机制和相关的植 物药有： 1) 乙酰胆碱酯酶抑制剂石衫碱甲； 2) 兴奋性氨基酸和肽类递质调节剂， 如叶秋碱； 3) 干扰 β-淀粉样蛋白 （Αβ) 纤维形成和沉积， 如银杏黄酮， 丹酚酸， 大黄素、 知母皂苷元等。 4) 抗氧化及清除自由基药物， 丹参水提物丹酚酸、 茶叶 的提取物茶多酚、 银杏叶提取物、 人参皂苷、 银杏内酯等； 5) 改善微循环， 如丹 参酮和丹参素； 6) 钙拮抗剂， 如芹菜素。

血管性痴呆 (Vascular Demenia,简称 VD)是由于一系列脑血管因素导致脑组织 损害所引起的痴呆综合征的总称， 是发生在脑血管病基础上的以记忆、 认知功能 障碍为主， 或伴有语言、 空间技能及情感或人格障碍的获得性智能持续 性损害的 一种疾病。 临床以记忆力减退， 计算、 判断、 定向等能力及精神、 行为的进行性 障碍为特征， 是中老年人群的常见病， 多发病。 VD的确切病理机制目前尚不完全 清楚， 一般认为， 脑血管疾病导致局部脑组织炎症、 代谢紊乱和氧化应激损失， 损伤了足够容量的脑组织， 严重损害记忆及认知等高级神经功能， 特别是病灶涉 及额叶、 颞叶及边缘系统时更加容易出现痴呆症状。 治疗 VD 的中药复方有： 黄 连解毒汤、 当归芍药散、 地黄饮子、 天智颗粒、 聪圣胶囊、 参麻益智胶囊、 六味 地黄汤、 加味归脾汤、 补阳还五汤等。 而采用益气、 解毒治法及相关的中药尚未 见报道。

帕金森病 (Parkinson disease, PD)又名震颤麻痹， 是中、 老年人常见的中枢系 统疾病， 临床表现为静止性震颤、 运动迟缓、 肌强直和姿势步态异常等。 发病机 制是中枢黑质纹状体通路中多巴胺（ DA)能神经系统病变， 导致纹状体 DA缺失， 引起躯体运动功能紊乱。 多巴胺含量减少， 乙酰胆碱就会兴奋过度， 两种递质失 去平衡， 导致神经与肌肉组织不由自主产生强直、 震颤等症状。 目前， 帕金森病 尚无根治药物， 西药左旋多巴 （美多巴） 、 溴隐停、 麦角卡林等是临床常用药， 但效果不稳定， 毒副作用较大， 远期疗效也不肯定。 中药临床常用治疗方法及常 用药物如下： 1)补肝虚， 镇肝息风： 采用天麻、 鹿角胶、 天冬、 麦冬、 鳖甲、 龟 板、 生白芍、 甘草等入药； 2)补肾虚， 填精补气： 萸肉、 五味子； 3) 补精血， 还 精补脑： 采用大云、 当归、 桂圆肉、 大枣等； 4) 活血化瘀： 三七、 穿山甲、 丹参、 全蝎。 陈建宗等发现枸杞、 肉苁蓉、 何首乌等组成的培补肝肾的中药可以提高 PD 大鼠脑部纹状体 DA， 3、 4-二羟基苯乙酸 (DOPAC), NE， 5-HT等含量， 且对黑质、 蓝斑、 中缝背核等神经核团有一定的保护作用 （陈建宗、 郭建英、 孙静等， 培补 肝肾熄风通络法治疗血管性帕金森综合征 40例，中医杂志， 2002， 43(7)： 528-529)。 何建成等研究发现由枸杞、 桑寄生、 天麻、 钩藤、 僵蚕等组成的具有滋阴补肾、 通络解毒作用的中药方剂能明显降低 PD大鼠脑部释放活性氧 (ROS)、丙二醛 (MDA) 含量，使谷胱甘肽（GSH)、谷胱甘肽过氧化酶 (GSH-PX)、超氧化物歧化酶 (SOD) 等 自由基清除系统含量上升， 具有提高机体抗氧化能力、 减轻自由基对机体损伤的 作用 (何建成、 袁灿兴、 李亚明等， 滋补肝肾通络解毒中药对帕金森病大鼠模型氧 化应激反应的影响， 中国新药与临床杂志， 2003， 22(3)： 160-163)。 徐立等观察息 风止痉胶囊 (当归、 白芍、 蜈蚣、 全蝎等滋阴养血、 息风通络中药组成)治疗气血不 足型实验性 PD小鼠，发现其可显著增加 PD小鼠脑内 DA、DOPAC、高香草酸 (HVA) 的含量， 并可降低小鼠肢体震颤强度， 縮短震颤持续时间， 故认为息风止痉胶囊 对 PD有防治作用 (徐立、 魏翠娥、 刘建勋等， 熄风止痉胶囊对小鼠实验性帕金森 病的防治作用， 中药新药与临床药理， 2005， 2： 87-90) 而采用益气、 解毒治法 及相关的中药尚未见报道。

抑郁症通常指的是一种情绪障碍， 主要是以心境低落、 思维迟钝、 语言行动 减少为主要特征的综合征， 主要表现为情绪低落、 兴趣减低、 悲观、 思维迟缓、 缺乏主动性、 自责自罪、 饮食、 睡眠差、 担心自己患有各种疾病、 感到全身多处 不适、 严重者可出现自杀念头和行为。 抑郁症具有发病率高、 患病率高、 复发率 高、 自杀率高、 而知晓率低、 治疗率低等特点。 抑郁症病因复杂， 目前已有研究 的病理机制假说有如下几种： 1)单胺类神经递质代谢异常，抑郁症是由于脑� ��某些 部位单胺递质不足所引起的； 2) 受体功能改变， 抗抑郁药抑制突触前单胺类递质 摄取是即时效应， 而突触后受体敏感性降低则是一种慢性适应性 变化； 3)神经内分 泌紊乱， 研究发现抑郁的发生与下丘脑一垂体一肾上腺 轴 (HPA)、 下丘脑-垂体-甲 状腺轴 (HPT)、 下丘脑 -垂体 -生长激素轴 (HPGH) 等的功能紊乱以及血清胆固醇水 平降低， 血清雌激素水平下降有关。 目前抗抑郁药在不同程度上主要有 3种特性， 即对精神运动有激发作用、 增强内驱力、 活跃情绪和对抗焦虑作用。 其主要分为 五大类别： 单胺氧化酶抑制剂、 三环类抗抑郁药 （TCAs， 如达体朗） 、 四环类抗 抑郁药、 新型抗抑郁药如选择性 5 -经色胺再摄取抑制剂 （SSRIs, 如氟西汀） 、 选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂、 5 -羟色胺和去甲肾上腺素再摄取双重抑制剂 ( SNRIs,如文法拉辛）、去甲肾上腺素和特定的 5-经色胺再摄取抑制剂（NaSSAs, 如米氮平） 、 去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制剂、 植物药提取物等。 但大多存 在抗抑郁谱窄、 副作用大、 药价高和易复发等特点。

脑膜炎可分为细菌性和无菌性两类。 细菌性脑膜炎是由于细菌感染软脑膜而 引发的炎症， 是一种颅内严重的感染性疾病， 常可伴发脑炎和脑脓肿。 从病原学 角度讲包括两大类， 一类是各种化脓性细菌感染的脑膜炎 （简称： 化脑） ， 如： 脑膜炎双球菌、 肺炎双球菌、 流感、 嗜血杆菌等感染的脑膜炎； 另一类是结核杆 菌感染的脑膜炎。 临床用药主要是抗菌药物联合激素治疗。 无菌性脑膜炎是指脑 脊液涂片和细菌培养为隐性的脑膜炎。 一般无菌性脑膜炎多为病毒感染所致。 病 毒性脑炎是指病毒感染所引起的脑实质炎症， 常表现为发热、 头痛、 抽搐、 意识 障碍和脑膜刺激症状等， 可致中枢神经系统局灶性损害。 病毒性脑炎预后不佳， 死亡率高， 常留有严重后遗症。 临床常用药物为 1)激素类， 如肾上腺皮质激素地 塞米松； 2) 抗病毒嘌呤类， 如无环鸟苷或阿糖腺苷； 3) 抗病毒细胞因子类， 干扰 素； 4) 营养类， 如胞二磷胆碱、 维生素 B6、 维生素 E、 脑复康、 泛酸等改善脑代 谢， 对有癫痫发作的患者还应结合抗癫痫药， 对精神运动兴奋的患者可合用精神 安定性药物等。

现有对于脑或神经损伤性疾病的治疗药物， 仍存在副作用大、 疗效差、 无法 根治等缺陷。 由于脑部疾病是一个涉及多环节、 多因素、 多途径的复杂的病理生 理过程， 而中药复方制剂可具有多方面的神经保护作用 ， 具有多靶点、 多向调节、 防治结合的临床意义， 应有望成为一种较为有效的脑及神经保护药物 。

各种人参为补虚调神之良药， 经常被用于中医药方中， 《神农本草经》 记载 人参"主补五脏， 安精神， 定魂魄， 止惊悸， 除邪气， ......， 开心益智"， 被认为是 一种具有多种药效的中草药， 其主要药效活性成分用于脑和神经损伤已见多 篇报 道， 如防治老年痴呆症、 帕金森、 抑郁症、 脑梗塞、 脑缺血及脑缺血引起的其他 疾病等 （江山， 姜正林， 曾因明， 九种人参皂甙单体抗脑缺血损伤作用研究， 中 药药理与临床 2007; 23(2)： 19-21； 徐诽诽， 刘纯青， 马涛等， 人参皂苷 Re对 MPTP 致帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元的保护作 用， 沈阳药科大学学报， 2005， 22

( 1 ) ： 36-44； 人参皂苷组合物及制备方法， 发明专利， 申请号 200610046083.3; 化合物 20S-人参皂苷 R 2在制备抗抑郁药物中，发明专利，申请号 200810043537.0)。 黄连性苦寒， 具泻火， 燥湿， 解毒， 杀虫之功效， 现代药理学研究表明， 其 除了具有强的抗菌活性外， 还具有抗炎、 降血脂、 降血糖、 抗肿瘤、 抗溃疡、 神 经系统保护等多种药理学作用。 有报道黄连通过抗炎作用在脑缺血和再灌注损 伤 中发挥保护作用 （Ki-Yeon Yool , In Koo Hwang2, Jong Dai Kim3 等， Antiinflammatory Effect of the Ethanol Extract of Berberis koreana in a Gerbil Model of Cerebral Ischemia/Reperfusion Phytother. Res. 2008， 22, 1527-1532 ) 。

栀子是茜草科植物山栀 (Gardeniaj匪 inoides Ellis. ) 的果实，性苦寒，无毒。 入心、 肝、 肺、 胃经。 具有泻火除烦、 清热利尿、 凉血解毒的功效。 主治热病虚 烦不眠、 黄疸、 淋病、 消渴、 目赤、 咽痛、 吐血、 衄血、 血痢、 尿血、 热毒疮疡、 扭伤肿痛。 临床用于急性黄疸型肝炎、 止血、 扭挫伤等疾病。 现代药理学研究表 明， 栀子除具有解热、 抗菌、 镇静、 镇痛、 利胆、 抗炎、 止血、 保肝、 软组织损 伤修复等传统药理作用外， 还具有抗氧化、 抗哮喘、 降血脂、 降压、 抗过敏、 抗 动脉粥样硬化、 抗病毒、 抗抑郁忧虑、 神经系统保护等作用 （栀子的化学成分和 药理作用研究， 北方药学， 2008， 5 ( 3 ) ： 44-45， 51； 黄仕孙， 吴曙粤， 栀子的 现代药理研究及临床应用概述， 内科， 2010， 5 ( 5 ) ： 534-536； 刘国敏， 郭素华， 程维明， 栀子的药理作用及其机制研究新进展， 海峡药学， 2008， 20 ( 1 1 )： 8-10； 栀子提取物在制备预防和 /或治疗抑郁忧虑药中的用途， 中国发明专利， 申请号 200810016679.8 ) 。

黄连和栀子共用的经典复方黄连解毒汤原载于 《外台秘要》 ， 由黄连、 黄柏、 黄芩、 栀子组成， 被视为清热解毒的代表方， 具有泻火解毒之功效， 主治一切实 热火毒、 三焦热盛之证。 有报道黄连解毒汤用于脑病治疗， 可减少脑缺血和再灌 注的脑损伤以及炎性侵润 （Young Sun Hwang a, Chan Young Shin b， Youngbuhm Huh等， Hwangryun-Hae-Dok-tang (Huanglian-Jie-Du-Tang) extract and its constituents reduce ischemia-reperfusion brain injury and neutrophil infiltration in rats. Life Sciences2002, 71 :2105-21 17)。

本发明人注意到仍缺少能用于益气解毒以治疗 脑及神经损伤性疾病的药物制 剂。 发明内容

本发明组合物来源于临床治疗脑中风的有效中 药复方益气解毒方。益气解毒方 是针对 "毒损脑络"的关键病机， 采用辨证施治、 扶正祛邪治疗中医脑病而提出的。 益气解毒方是以前未见报道的新的中药复方制 剂， 其活性成分用于中医脑及神经 损伤性疾病的预防和治疗也未见报道。 益气解毒方剂由人参、 黄连、 栀子三味组 成。 其中， 人参为君药， 大补元气， 安神益智， 可以补五脏气， 对于正气虚损的 治疗十分恰当； 黄连为臣药， 乃泻火解毒之良品， 与人参配伍， 一补一泻， 相得 益彰； 栀子为佐使药， 该药功善清心除烦， 凉血解毒， 辅助黄连的泻火解毒， 同 时其性屈曲下行， 驱诸火邪从小便中出， 使热毒之邪有所出路。 此三味配伍， 可 以在扶正的基础上， 有效化解毒邪， 起到很好的协同治疗作用。

兴奋性氨基酸大量释放和神经递质异常、 氧化应激、 自由基、 炎性级联、 线 粒体功能障碍等是脑损伤发病的普遍病理机制 ， 人参长于益气、 神经保护， 黄连 和栀子长于解毒， 将其三种配伍可以做到合理配伍、 互促互补。

因此， 本发明要解决的技术问题是提供一种能够预防 或治疗脑及神经损伤疾 病的中药活性成分组合物。

本发明涉及一种中药活性成分组合物， 所述中药活性成分包含京尼平苷或栀 子苷、 黄连素、 人参总皂苷或人参皂苷单体或人参皂苷单体组 合物。

如上所述的根据本发明的组合物， 其中所述中药活性成分按照总重量为 100 份计算包括以下重量份数配比： 人参总皂苷或人参皂苷单体或人参皂苷单体组 合 物， 1-99份， 黄连素， 1-99份， 京尼平苷或栀子苷， 1-99份； 优选人参总皂苷或 人参皂苷单体或人参皂苷单体组合物， 2-75份， 黄连素， 2-75份， 京尼平苷或栀 子苷， 2-75 份； 更优选人参总皂苷或人参皂苷单体或人参皂苷 单体组合物， 3-50 份， 黄连素， 3-50份， 京尼平苷或栀子苷， 3-50份。

如上所述的根据本发明的组合物， 其中人参总皂苷或人参皂苷单体或人参皂 苷单体组合物、黄连素、京尼平苷或栀子苷的 重量比为 3: 2： 2-0.1， 优选 3:2: 2-1， 更优选 3:2:2。

如上所述的根据本发明的组合物， 其包括中药活性成分以及任意一种或多种 药学上可接受的载体， 例如抗氧剂、 络合剂、 填充剂、 骨架材料等。

如上所述的根据本发明的组合物，其可以根据 具体需要与药学上可接受的载体 制成任何一种药学上可接受的剂型， 例如片剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 注射剂如粉针、 冻干粉针、 输液等。

本发明进一步涉及如上所述的组合物在制备治 疗或预防脑和神经损伤，例如脑 血管痴呆或缺血性脑血管病 (例如短暂性局部脑缺血发作、脑梗塞或脑卒� �)、神经 退行性脑病， 例如老年痴呆症或帕金森症、 细菌性或病毒性脑炎、 或抑郁症的药 物中的用途。 附图说明

图 1 :本发明组合物对行 MCAO手术 24h后脑缺血大鼠脑片脑缺血面积 TTC染色 结果， A: 假手术组； B: 模型组； C: 阳性对照组 （银杏叶提取物 Egb761片组) (4mg/kg ); D-F: 给药组 3、 2、 l(62.5mg/kg)。

图 2： 实施例 1中本发明组合物对行 MCAO手术后 12h和 24h的大鼠脑梗塞体积 的影响 （n=10)。 具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。 但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。 本 领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明 技术 方案的细节和形式进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围 内。

中药活性成分制备例

黄连素提取工艺：

取黄连药材， 粉碎， 置索氏提取器中， 加入 95%乙醇加热回流至提取液无色， 减压浓縮 95%乙醇提取液至膏状， 再加入 1%醋酸， 加热溶解， 抽滤除去不溶物， 向溶液中滴加浓盐酸， 至溶液混浊为止， 放置冷却， 即有黄色针状黄连素盐酸盐 析出， 抽滤， 将晶体用冰水洗涤两次， 再用丙酮洗涤一次， 加速干燥， 得到粗品。 将粗品用水溶解， 用石灰乳调节 pH为 8.5〜9.8， 冷却， 滤除杂质， 继续冷却至室 温以下即有晶体析出， 抽滤， 再精制即得。

人参茎叶总皂苷提取工艺：

取人参茎叶， 切成 l〜2cm段， 加水煎煮 2次， 第一次 2小时， 第二次 1.5小 时， 合并滤液， 通过 D101型大孔树脂， 水洗脱至无色， 再用 60%乙醇洗脱， 收集 60%乙醇洗脱液， 将洗脱液浓縮至相对密度为 1.06〜1.08 ( 80°C ) 的清膏， 干燥粉 碎， 即得。

京尼平苷或栀子苷提取工艺：

取栀子药材， 粉碎， 加水煎煮 3次， 每次 1.5小时， 煎液滤过， 合并滤液， 通 过 AB-8型大孔树脂， 分别用水、 5%乙醇洗脱至无色， 再用 10%乙醇液洗脱， 收 集 10%乙醇洗脱液， 将洗脱液浓縮至相对密度为 1.06〜1.08 ( 80°C ) 的清膏， 干燥 粉碎， 即得。

本发明所述之人参皂苷单体可为人参皂苷 Rgl， Rbl， Re, Rfl， Rd， R (R l 和 R 2) 。

本专利中人参皂苷单体包括但不限于由下述方 法得到：

(I)人参皂苷单体 Rfl的制备参照专利方法进行制备（人参皂苷 F1的医药用 途， 申请号 200610008477.X) ；

(II)人参皂苷单体 Re的制备参照专利方法进行制备（人参皂苷 Re医药新用 途和制备方法， 申请号 2004110021133.6) ；

(III) 人参皂苷单体 Rgl的制备参照专利方法进行制备 （人参皂苷 Rgl的用 途， 申请号 200810227643.4) ；

(IV) 人参皂苷单体 Rbl 的制备参照专利方法进行制备 （一种人参皂苷 Rbl 的制备方法， 申请号 200710178212.9) ； (V) 人参皂苷单体 Rh (R l和 Rh2) 的制备参照专利方法进行制备 （人参 皂苷 R 提取物及制备方法， 申请号 200810043537.0) ；

(VI)人参皂苷单体 Rd的制备参照文献方法进行制备（刘德育， 曹飒。 从三 七药材中快速批量分离提取人参皂苷 Rd的方法，中药材， 2006， 29 (3 )： 247-249)。

以上所述人参总皂苷和人参单体均为已知的具 有药物活性的物质， 由人参总 皂苷或上述各种人参皂苷单体或两种以上的人 参皂苷单体混合可作为药物制剂的 原料药后与黄连素、 栀子苷按如下一定比例再混合， 按常规制剂方法， 将其制备 成临床适用的任何一种药剂， 例如片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 滴丸等口服固体制剂， 口服液体制剂， 注射剂等。 在制备上述制剂的过程当中， 可以将上述制备的混合 物与任何一种用于制备临床药剂的适合的赋形 剂混合使用， 制备成药物制剂。

药物组合物配比方法

(1) 按照重量份数配比计算， 分别取按照上述方法制备的人参总皂苷 30份、 黄 连素 20份和栀子苷 5-20份混合后作为药物制剂的原料药；

(2) 按照重量份数配比计算， 分别取按照上述方法制备的任意一种人参皂苷 单 体 30份、 黄连素 20份和栀子苷 5-20份混合后作为药物制剂的原料药；

(3) 按照重量份数配比计算， 分别取按照上述方法制备的两种或两种以上人 参 皂苷单体混合物 30份、 黄连素 20份和栀子苷 5-20份混合后作为药物制剂的原料药。

本发明药物组合物按照如上 （1 ) - (3 ) 配比方法组成组合物与黄连素及栀子 苷合用和药学上可接受的赋形剂或载体组成。

将本发明的上述（I) - (VI)所示的任意一种化合物中加入制备不同剂� �时所 需的各种辅料或药学上可接受的赋形剂或载体 后， 以常规的药物制剂方法可制备 成任何一种适宜的临床制剂， 例如可以是注射剂 （粉针、 冻干粉针、 水针、 输液 等） 、 片剂、 口服液、 颗粒剂、 胶囊剂、 软胶囊、 滴丸等。 其中， 所述的辅料可 以是抗氧络合剂、 填充剂、 骨架材料等； 所述的药学上可接受的载体是木糖醇、 甘露醇、 乳糖、 果糖、 葡聚糖、 葡萄糖、 聚乙烯吡咯烷酮、 低分子右旋糖酐、 氯 化钠、 葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种， 优选为甘露醇或乳糖。 实施例 1 本发明组合物对急性局灶性脑缺血动物保护作 用研究实验

急性局灶性脑缺血动物模型建立 (行大脑中动脉栓塞 （MCAO) 手术） 采用体重在 250-270g雄性 SD大鼠， 参照 Zea Longa等 (Longa EZ， Weinstein PR, Carlson S, Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 1989; 20: 84-91)建立的大鼠大脑中动脉内栓线阻断方法。 10%水合氯醛溶液 400mg/kg， 腹腔注射麻醉动物。大鼠仰卧位固定， 颈部正中切开 皮肤， 钝性分离各层组织， 暴露右侧颈总动脉 (CCA)。 分离至颈内动脉 （internal carotid artery, ICA)、 颈外动脉 （external carotid artery, ECA) 分叉后一段， 仔细 分离避免损伤迷走神经和气管，置线备用。分 离同侧颈外动脉，在 ECA发出约 0.8cm 处结扎。 于 CCA近心端夹一动脉夹， 在 ECA结扎处与分叉处之间做一直径约 2mm 的" V"形切口， 将尼龙线自切口处轻轻插入 CCA， 松开动脉夹， 经颈内、 颈外动脉 分叉部进入颈内动脉， 将尼龙线缓慢地向 ICA入颅内的方向推进， 插入深度约 18.5±0.5mm至微感阻力，使尼龙线头端通过 MCA起始处， 到达较细的大脑前动脉， 此时即实现左侧大脑中动脉的血流阻塞， 结扎 ICA以固定尼龙线和防止出血， 逐层 缝合， 尼龙线残端留 l cm长于皮外。

假手术组只进行术前麻醉和血管分离术， 不结扎及导入线栓。 手术过程中室 温保持在 24-25°C， 生物机能实验系统进行动物呼吸及心电监测。

动物分组和给药

将 SD大鼠随机分为六组：假手术组、模型组、银� ��叶提取物片阳性对照组 (金 纳多银杏叶提取物片， Egb761， 德国威玛舒培博士药厂)、 本发明组合物给药组 1、 2、 3。 阳性对照组给药方法： 取银杏叶提取物片 1片 （40mg)溶于 40ml生理盐水 中， 配制成 lmg/mL， 灌胃给予 SD大鼠 lmL， 给药量为 4 mg/kg。 给药组给药方 法： 分别取人参总皂苷： 黄连素： 栀子苷按照重量比 3:2:2(给药组 1)、 3:2:0.1 (给 药组 2)、 3:2:0.5(给药组 3),分别用生理盐水配制成 31.25 mg/mL,灌胃给药 0.5mL， 剂量为 62.5 mg/kg。 给药组及阳性对照组于手术麻醉前 10 min灌胃给药， 分别于 术后 4、 12、 24 h处死动物， 进行如下各项指标检测。

神经行为学 Bederson's法功能评价

动物于处死前进行神经行为学观察， 参照 Bederson 等的方法 (参考文献 Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M， et al., Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke 1986; 17:472-476), 提鼠尾离开地面约 1 尺， 观察两前肢状况； 将大鼠置于水平地面， 推动其双肩， 观察两侧抵抗力有无差异； 大鼠置于地面，观察其行走情况。采用五级评 分法（0-4 分）， 分数越高， 说明其神经行为损伤越严重。 Bederson's 功能评分统计结果见表 1， 各组间数据比较采用秩和检验， Ρ<0.05认为具有统计学意义。

表 IBederson's 功能评分统计结果（ ±sd， n=10)

假手术 模型 阳性对

项目 等级 给药组 1 给药组 2 给药组 3 组 组 照组

0 6

1 1 4

2 1 3 2

12h-l 3 5 2

4

Rank

P值 # #

0 7 4 4 5

1 2 0 4 2 1

2 1 2 2

12h-2 3 4 1 1 1

4

Rank

P值 ## # ## ##

0 10 0 5 5 1 0

1 0 4 4 3 6 7

2 0 0 0 1 3 2

24h-l 3 0 1 0 0 0 0

4 0 3 0 0 0 0

Rank

P值 ## ## ## #

0 8 0 3 5 5 3

1 2 4 3 2 2

2 4 0 0 0 1

24h-2 3 0 0 0 0 0

4 2 0 0 0 0

Rank

P值 # ## ## ## 心

积 P值 ## ## ## 分

注： 非参数秩和检验， 检验， 与对照组比较: ： "P<0.01; 与模型组比较： #P

<0.05， ##P<0.01

结论： 由表 1可知，模型组较假手术组有统计学差异，说� �造模成功（Ρ<0.01)， 阳性对照组（3 mg/kg)和给药组 1、 2、 3能显著改善动物局灶性脑缺血后 12h和 24 h 的神经损伤症状 (P<0.05, P<0.01 )o

对脑缺血后脑梗死体积的改善作用评价

功能评分后大鼠断头处死， 迅速将取出的脑组织置于 -20°C冰箱， lOmin后置 室温环境， 切除嗅球、 小脑和低位脑干后并按大脑定位图谱所示间隔 2mm冠状切 成 6个大脑连续冠状粗切片。然后迅速将脑片置� � 5ml含 2%TTC (氯化三苯基四氮 唑)及 0.1ml的溶液中， 37°C恒温、避光孵育 30 min，期间每隔 5min 将脑片翻动一次。 经 TTC染色后， 正常组织呈玫瑰红色， 梗死组织未被染色而呈 白色。 将每组脑片排列整齐， 拍照保存， 应用图像分析系统软件处理并作统计， 计算每张脑片的梗塞面积， 乘以每片脑片的厚度 2mm， 每只动物所有脑片梗塞面 积乘以厚度相加， 即为脑梗塞体积。

结论： 如图 1和 2所示， 大鼠脑组织缺血损伤后， 假手术组无脑梗塞出现， 模 型组出现明显梗死区而呈现 TTC染色灰白色。 给药组 1、 2、 3可显著降低脑梗灰白 区， 縮小脑梗塞体积， 对脑梗死具有显著改善作用。 对大脑中动脉栓塞 （MCAO) 大鼠脑缺血后局部脑血流的改善作用评价 MCAO手术方法如上所述， 药物于水合氯醛手术麻醉前 15 min给予。

动物分组和给药方法

将 SD大鼠随机分为以下几组： 假手术组、模型组、 银杏叶提取物片阳性对照 组 (金纳多银杏叶提取物片， Egb761， 德国威玛舒培博士药厂)、本发明组合物给药 组（人参总皂苷： 黄连素： 栀子苷按照重量比 3:2:2)。 阳性对照组给药方法： 取银 杏叶提取物片 1片（40mg)溶于 40ml生理盐水中， 配制成 lmg/mL， 灌胃给予 SD 大鼠 lmL， 给药量为 4 mg/kg。 给药组给药方法： 给药组按照配伍比例分别用生理 盐水配制成 0.25mg/mL、 1.25 mg/mL禾 B 6.25 mg/mL, 灌胃给药 lmL， 三个剂量从 高到低分别为 l mg/kg、 5mg/kg和 25mg/kg。动物仰卧位于手术台上， 麻醉但未进 行 MCAO 手术前， 稳定血流灌注量读数后， 使用激光散斑血流监测视频系统 (PariCam PSI)记录 15min内血流值， 以其平均值作为脑血流的基础值 （baseline value) 。 完成 MCAO 手术， 把线插入颅内， 模型组当血流值突然下降至基础值的 40%-60% 时， 提示中脑动脉血流已被阻断， 给药各组同模型组， 行 MCAO 手术 前的血流值为本组的基础值（100% )， 手术后血流值均以此基础值的百分率表示。 手术后 30 min在同一位置测定 LDF值， 监测 SD大鼠行 MCAO手术前后血流变 化， 此系统不但可以掌握血流灌注的空间分布， 而且能够清楚的看清血流实时动 态变化的情况。 本发明组合物对 SD大鼠行 MCAO手术后脑血流作用结果见表 2。

平均血流灌注量 （PU) 的计算方法为：

平均血流灌注量 （PU) =血细胞移动速度 （V) X血细胞浓度 （C)

利用下述公式计算局部脑血流变化率： 百分比变化 = ^TQItteated _ ^TQI∞ntto1 x 100%

TOIcontrol

其中， TOI _∞ntol 为给药前耳廓平均血流灌注量（手术前） ， TOIt^w为给药后耳 表 2本发明组合物对 SD大鼠行 MCAO手术后脑血流作用 （n=5 )

组别 剂灑 L (mg-kg ^-1 ) 平均血流降低变化率 （％) 假手术组 - 0

模型组 - 51.95±4.71

阳性对照组 4 22.09±7.8**

给药组 1 32.96±5.17

5 21.71±2.16

25 14.93±3.13

注： 非参数秩和检验， 检验， 与对照组比较： "P < 0.01 ; 与模型组比较： ^## P < 0.01

结论：通过监控缺血后半小时内的局部脑血流 灌注量（rCBF)变化，行 MCAO 手术后缺血半小时内阳性药物组 （4mg/kg) 和给药组高、 中、 低剂量 （l mg/kg、 5mg/kg、 25mg/kg) 能明显改善局灶性脑缺血后降低的局部脑血流 ， 且本发明组合 物给药组低剂量组 （l mg/kg， 32.96±5.17") 仍表现较好的改善局部血流灌注量作 用， 与模型组相比， 具统计学差异 （P<0.01 )， 并且呈现很好地浓度依赖关系。 这 表明本发明组合物能快速透过血脑屏障并可能 通过扩张血管， 增加局部血流灌注 量来发挥较好的血管保护作用。

由以上实验可知本发明组合物具有良好的急性 脑缺血损伤保护作用。 实施例 2本发明组合物对局灶性脑缺血动物缺血后再� �注保护作用研究实验 大脑中动脉栓塞 （MCAO) 缺血后再灌注模型的制备

采用体重在 250-270g雄性 SD大鼠， 参照 Zea Longa等（Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 1989; 20: 84-91 )建立的大鼠大脑中动脉内栓线阻断方法， 作适当改进。

10%水合氯醛溶液 400mg/kg， 腹腔注射麻醉动物。大鼠仰卧位固定， 颈部正中 切开皮肤，钝性分离各层组织，暴露右侧颈总 动脉 (CCA；)。分离至颈内动脉（internal carotid artery, ICA) 、 颈外动脉（external carotid artery, ECA)分叉后一段， 仔细 分离避免损伤迷走神经和气管，置线备用。分 离同侧颈外动脉，在 ECA发出约 0.8cm 处结扎。 于 CCA近心端夹一动脉夹， 在 ECA结扎处与分叉处之间做一直径约 2mm 的" V"形切口， 将尼龙线自切口处轻轻插入 CCA， 松开动脉夹， 经颈内、 颈外动脉 分叉部进入颈内动脉， 将尼龙线缓慢地向 ICA入颅内的方向推进， 插入深度约 18.5±0.5mm至微感阻力，使尼龙线头端通过 MCA起始处， 到达较细的大脑前动脉， 此时即实现左侧大脑中动脉的血流阻塞， 结扎 ICA以固定尼龙线和防止出血， 逐层 缝合， 尼龙线残端留 l cm长于皮外。

假手术组只进行术前麻醉和血管分离术， 不结扎及导入线栓。 手术过程中室 温保持在 24-25°C， 生物机能实验系统进行动物呼吸及心电监测。

动物分组和给药

将 SD大鼠随机分为以下几组： 假手术组、 模型组、 银杏叶提取物片阳性对照 组 (金纳多银杏叶提取物片， Egb761， 德国威玛舒培博士药厂） （4mg/kg)、 本发明 组合物给药组 （人参总皂苷： 黄连素： 栀子苷按照重量比 3:2:2)。 阳性对照组给药 方法： 取银杏叶提取物片 1片 （40mg) 溶于 40ml生理盐水中， 配制成 lmg/mL， 于 手术后 3h灌胃给予 SD大鼠 lmL， 给药量为 4 mg/kg。 给药组给药方法： 给药组按照 配伍比例分别用生理盐水配制成 0.25mg/mL、 1.25 mg/mL和 6.25 mg/mL, 于手术 后 3h灌胃给药 lmL， 三个剂量从高到低分别为 1 mg/kg、 5mg/kg和 25mg/kg。 除假 手术组外， 其余各组于缺血后 2h将残留鱼线拔出至颈内和颈外动脉分叉处， 造成 再灌注损伤， 于 12h和 24h后处死动物进行相关指标检测。

神经行为学 Bederson's法功能评价

动物于处死前进行神经行为学观察，参照 Bederson等的方法 (参考文献 Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al., Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke 1986; 17:472-476)，提鼠尾 离开地面约 1 尺， 观察两前肢状况； 将大鼠置于水平地面， 推动其双肩， 观察两 侧抵抗力有无差异； 大鼠置于地面， 观察其行走情况。 采用五级评分法 （0-4分）， 分数越高， 说明其神经行为损伤越严重。

神经功能学评分结果见表 3， 各组间数据比较采用秩和检验， Ρ<0.05认为具有 统计学意义。

表 3 本发明组合物对脑缺血再灌后大鼠神经功能学 评分的影响 分组 齐 U量 (mg-kg ^-1 ) 神经功能学评分

12h 24h

假手术组 - 0 0

模型组 - 2.62±0.53 2.83±0.65 ^## 阳性对照组 1.30±0.52 1.57±0.46

给药组 1 1.86±0.67 2.07±0.75*

5 1.52±0.37 1.58±0.59

25 1.24±0.49 1.44±0.65

数据以平均值±标准偏差表示并通过 one-way ANOVA分析。 相对于假手术组： P<0.01， #P<0.05; 相对于模型组： *P<0.05， **P<0.01。 结论： 模型组较假手术组有统计学差异， 说明造模成功（Ρ<0.01 ) ， 阳性对照 银杏叶提取物组 （4 mg/kg， ig) 和本发明组合物大、 中、 小剂量组 （1、 5mg/kg、 25mg/kg)能显著改善动物局灶性脑缺血再灌后 12h和 24 h的神经损伤症状（Ρ<0.05, P<0.01 ) ， 且呈现出一定的剂量依赖关系。

对脑缺血后脑梗死体积的改善作用评价

功能评分后大鼠断头处死， 迅速将取出的脑组织置于 -20°C冰箱， lOmin后置 室温环境， 切除嗅球、 小脑和低位脑干后并按大脑定位图谱所示间隔 2mm冠状切 成 6个大脑连续冠状粗切片。然后迅速将脑片置� � 5ml含 2%TTC (氯化三苯基四氮 唑；)及 0.1ml的溶液中， 37°C恒温、避光孵育 30 min，期间每隔 5min 将脑片翻动一次。 经 TTC染色后， 正常组织呈玫瑰红色， 梗死组织未被染色而呈 白色。 将每组脑片排列整齐， 拍照保存， 应用图像分析系统软件处理并作统计， 计算每张脑片的梗塞面积， 乘以每片脑片的厚度 2mm， 每只动物所有脑片梗塞面 积乘以厚度相加， 即为脑梗塞体积。 本发明组合物对于脑缺血再灌后脑梗死体积 的作用见表 4。

表 4 本发明组合物对脑缺血再灌后脑梗死体积的作 用 分组 齐 U量 (mg-kg ^-1 ) 脑梗死体积 （mm ³ )

12h 24h

假手术组 - 0 0

模型组 - 229.35±43.2 248.76±50.23

阳性对照组 114.36±54.39** 126.47±38.12**

给药组 1 168.22±37.20** 179.43±46.73**

5 117.25±42.19** 135.46±42.19**

25 102.38±52.08** 109.53±48.55**

数据以平均值±标准偏差表示并通过 one-way ANOVA分析。 对于假手术组 ^## P <0.01,#P<0.05 ； 对于模型组 *P<0.05, **P<0.01。

结论： 如表所示， 大鼠脑组织缺血再灌注损伤后， 假手术组无脑梗塞出现， 模型组出现明显梗死区。 给药组 （1、 5mg/kg和 25 mg/kg) 可显著縮小脑梗塞体 积。

脑水肿改善作用评价

脑水肿是伴随脑缺血发生早期重要的病理过程 ， 评价药物对脑水肿的改善作 用是评价药物防治作用的重要指标， 采用脑组织含水量和脑水肿率进行评价。

具体检测指标：

脑组织含水量 （％)

取脑后立即称取缺血侧即左侧大脑半球的湿重 。然后将左侧大脑半球置 100°C 的烤箱中烘烤 24h后称取干重， 计算脑组织含水量。 脑组织含水量 （％) = (脑湿 重-脑干重） 湿重 x 100 % 。

本发明组合物对脑缺血再灌后大鼠脑组织含水 量的影响见表 5。

表 5本发明组合物对脑缺血再灌后大鼠脑组织含� �量的影响 （ ± ， _n =7) 分组 齐 U量 (mg-kg ^-1 ) 脑组织含水灑 L ( 100%)

12h 24h

假手术组 - 78.34±1.15 78.54±0.86

模型组 - 81.12±0.98 ^# 81.50±0.74

阳性对照组 79.02±0.77** 79.44±0.78** 给药组 1 80.18±0.83* 80.73±0.93

5 79.47±0.73** 79.82±0.73**

25 78.86±0.9广 78.86±0.9广

数据以平均值±标准偏差表示并通过 one-way ANOVA分析。 对于假手术组 ^## P <0.01,#P<0.05 ； 对于模型组 *P<0.05, **P<0.01。

结论： 脑缺血再灌 12h和 24h， 模型组与对照组相比， 脑水肿率均有统计学差 异（P < 0.05)，阳性对照组和本发明组合物各剂量组与� ��型组相比有统计学差异（P < 0.05， P < 0.01 )， 说明本发明组合物可明显改善脑缺血 12和 24h大鼠的脑水肿。

综上所述， 从神经功能学评分和脑水肿的改善， 脑梗死体积的减少， 表明本 发明组合物大、 中、 小剂量组 （1、 5mg/kg和 25 mg/kg) 具有明显的保护大鼠脑 缺血再灌后损伤的作用。 实施例 3 本发明组合物对老年痴呆 （AD) 动物保护作用研究实验

β-淀粉样蛋白 （Αβ _1-40 ) 的孵育

用无菌生理盐水将 Αβ^ο稀释成 2ug/ul， 37°C孵育 1 周， 使之成为凝聚态的 Αβι_ ₄₀ °

Αβ^ο致大鼠痴呆模型建立

取 250-270g健康雄性 AD大鼠麻醉后固定于大鼠立体定位仪上， 常规备皮消 毒， 切开皮肤，暴露前囟， 用微量注射器向大鼠左侧海马区 （以 Bregma点为 0点， AP-3.0mm、 ML2.0mm、 DV-2.9mm) 缓慢注入凝聚态 Αβ^ 5μ1，留针 5min以使 Αβ 充分弥散， 然后缓慢撤针， 缝合切口。 假手术组只进行术前麻醉， 切开皮肤， 暴 露前囟， 不进行注射 Αβ^^

实验分组和给药

将 250-270g健康雄性 SD大鼠 30只随机分成假手术组、 Αβ模型组、 银杏叶 提取物阳性对照组、 本发明组合物给药组 1、 2、 3， 每组 5只。 阳性对照组给药方 法： 取银杏叶提取物片 1片 （40mg) 溶于 4ml生理盐水中， 配制成 lmg/mL， 灌 胃给予 SD大鼠 lmL， 给药量为 4 mg/kg。 给药组给药方法： 分别取人参总皂苷： 黄连素： 栀子苷按照重量比 3:2:0.5， 用生理盐水配制成 62.5 mg/mL， 给药组 1、 2、 3分别灌胃给予 2mL， lmL和 0.5mL， 即给药剂量为 500 mg/kg、 250 mg/kg和 125 mg/kg。 在模型造完后， Αβ模型组灌入等体积生理盐水， 其他组灌入相应的药物。

Morris水迷宫测试

术后 30d开始水迷宫检测。水迷宫为直径 90cm，高 40cm的水池，水深 30cm， 在水池壁上标明 4个入水点， 将其分成四个象限， 于其中一象限中心置一有机玻 璃圆形平台， 平台低于水面 2cm， 水温 （24±2)°C， 用不透明厚薄均匀的白色塑料 泡沫覆盖， 水池周围参照物保持不变。 测试包括：

1)定位航行试验： 用于测量大鼠对水迷官学习和记忆的获取能力 。 历时 5d， 每天上下午两个时间段， 每个时间段 4 次， 分别从四个不同的标记点， 将大鼠面 向池壁放入水中， 记录 2min 内寻找平台所需时间 （逃避潜伏期)。 若大鼠入水后 2min内未能找到平台， 则将其置于平台上并停留 10s， 逃避潜伏期记录 2min。 每 次训练间隔 60s。

2)空间探索试验： 用于测量大鼠学会寻找平台后， 对平台空间位置记忆的保 持能力。 定位航行试验结束后， 于第六天将平台移走， 任选一个入水点将大鼠面 向池壁放入水中， 记录 2min内跨越原平台位置的次数。

采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA) ， P<0.05 认为具有统计学意义。 Morris水迷宫测试结果见表 6。

表 6 定位航行试验中的平均逃避潜伏期 （s, ±sd， n=5)

第 1天 第 2天 第 3天 第 4天 天 假手术组 74.89±21.30 38.10±14.80 22.60±9.20 21.02±8.73 17.80±7.71 Αβ模型组 77.80±22.40 59.88±15.50 47.2±11.80" 48.11±11.52' 46.15±15.00

## ## 阳性对照组 75.30±22.31 40.10±15.20 23.01±9.30 、# ^ff # ^ff 21.04±8.75 17.90±7.80

## ## ## 给药组 1 75.10±22.10 39.40±15.0 22.8±9.32 21.30±8.80 17.90±7.80

## ## ## 给药组 2 75.20±23.00 39.43±15.30 23.10±9.35 21.50±8.90 17.95±7.85

## ## ## 给药组 3 76.30±23.50 39.90±15.50 23.70±9.45 22.10±9.03 18.30±8.05 注： P < 0.01、 # P < 0.05、 ## P < 0.01

表 7、 Morris水迷宫大鼠空间探索实验结果 （^± ^， n=5 ) 组别 齐 LI量 (mg/kg) 潜伏期 （S ) 经过原平台位置次数 假手术组 10.02±5.38 3.68±1.58

模型组 28.36±11.54 1.69±1.05

阳性对照组 4 15.76±9.79 2.87±1 .12 ^#

给药组 1 500 13.34±9.48 3.01±1 .36*

给药组 2 250 15.98±10.02** 2.96±1 .09*

给药组 3 125 17.78±9.96* 2.78±1.12

注： P < 0.05， P < 0.01 由表 6可知， 大鼠给予本发明组合物后前 2天变化不明显， 从第 3天开始， 模型组与假手术组相比： "Ρ < 0.01， 说明建模成功； 给药组与 Αβ模型组比较： ^# Ρ < 0.05， Ρ < 0.01 , 这表明， 给药组 1、 2、 3可明显縮短后三天开始的平均逃避潜 伏期。 表 7表明， 给药组可明显縮短大鼠空间探索潜伏期， 增加跨越原平台位置 次数， 因此本发明组合物对 0 ₁ _ ₄₍₎ 所致大鼠 AD模型具有明显保护作用。 氧化铝致小鼠痴呆模型及给药方法

实验动物选用 22月龄的老龄昆明种小鼠， 雌雄各半， 随机分为 6组： 正常对 照组、 三氯化铝模型组、 氯化铝加阳性对照银杏叶提取物片组、 氯化铝加本发明 组合物给药组 1、 2、 3。阳性对照组给药配制方法：取银杏叶提取� �片 1片（40mg) 溶于 4ml生理盐水中，配制成 lmg/mL，灌胃给予 SD大鼠 lmL，给药量为 4 mg/kg。 给药组给药配制方法： 分别取人参总皂苷： 黄连素： 栀子苷按照重量比 3:2:0.5， 用生理盐水配制成 62.5 mg/mL,给药组 1、 2、 3分别灌胃给予 2mL， lmL和 0.5mL， 即给药剂量为 500 mg/kg, 250 mg/kg 和 125 mg/kg。 对三氯化铝模型组小鼠用 lOmg/ml的氯化铝蒸馏水溶液 （；上海金山化工厂生产，批号 100093) 200mg/kg体重 /天， 灌胃给药， 连续 90天。对阳性对照组和给药组在建立痴呆模型� ��同时给予银 杏叶提取物片和本发明组合物， 灌胃给药， 连续 90天。 正常对照组给予同剂量生 理盐水。

跳台实验

TT-2型小鼠跳台程序自动控制仪 (中国医学科学院药物研究所研制)。其跳台反 射箱为 90x 18x60cm ³ 有机玻璃箱， 由透明板分离成 5间， 箱底为铜栅， 加以 36V 电压，每间内置一高 3.5cm，直径为 3.5cm的橡皮垫，作为小鼠回避电击的安全区。 实验前 3天使小鼠熟悉实验室环境， 室内保持安静， 温度 25°C。 实验时将小鼠放 入反射箱内适应 5 min后， 然后通以 0.25 mA电流， 将小鼠置于跳台上， 小鼠有从 高处跳下的习性， 如果跳下则受到电击而产生记忆。 训练时跳台潜伏期大于 180 s 者弃去不用， 记录小鼠 5min 内从平台跳下的次数 （错误次数）， 以错误次数作为 基础成绩将小鼠分成 6组 (正常对照组、 模型组、 阳性对照银杏叶提取片组， 给药 组 1,2,3， 阳性对照和给药 1， 2， 3组)， 每组 10只， 使 6组小鼠智力水平接近。 实验时认真详细测定 5min内小鼠从台上跳下触地次数 (错误数)， 作为小鼠学习获 得和记忆巩固的观察指标。

采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA) 分析， 认为具有统计学意 义。 跳台实验结果见表 8。 表 8小鼠跳台实验学习记忆能力变化的比较 （ ±s， n=10)

组别 记忆获得实验错误次数 记忆巩固实验错误次数 正常对照组 1.26±0.73 1.80±0.40 模型组 6.78±2.40* 5.90±1.08 ^# 阳性对照组 3.60±2.00 4.78±0.63 ^# 给药组 1 2.87±1.90 ^## 3.50±0.88 给药组 2 3.48±2.05 4.10±0.95 给药组 3 4.00±2.10 4.88±1.02 ^#

P<0.05，， #P<0.05, ##P<0.01

由表 8可知， 模型组与给药组比较： ^# Ρ< 0.05， 说明建模成功； 给药组与模型 组比较： ^# P<0.05， P<0.01, 表明本发明组合物能够明显减少小鼠痴呆模型 的 错误次数， 因此对小鼠学习记忆能力有显著的改善作用。 实施例 4本发明组合物对帕金森动物模型保护作用研� �实验

帕金森动物模型建立及给药方法

用腹腔注射农药百草枯 （paraquat, PQ) 的方法造小鼠帕金森病模型。 取雄性 7周龄昆明种小鼠 120只， 适应一周后随机分为 6组， 每组 20只。 空白对照组： 每天一次灌胃蒸馏水 lOmL/kg体重， 每周一次腹腔注射生理盐水 10ml/kg体重； 其余 5组每周一次腹腔注射 PQ10mg/kg， 且每天灌胃一次秋水仙碱， 按成人给药 量的 4倍， 即 0.2 mg/ kg， 持续 7周造模给药。 造模成功后， 阳性对照组： 每天 灌胃一次美多巴， 按照成人给药量的 7.5倍， 即按 125 mg/ kg剂量给药， 持续给 药至造模后一周；给药组 1、2、3：分别小鼠灌胃本发明组合物 250 mg/kg、125mg/kg、 小剂量组 62.5 mg/kg (配制方法同实施例 3)， 持续给药至造模后一周。 相同条件 下伺养， 观察小鼠的行为学改变， 然后做小鼠黑质脑区单胺类神经递质的含量检 测多巴胺 (DA；)、 去甲肾上腺素 (NE)、 5-羟色胺 (5-HT)。

转棒实验

正常小鼠具有攀爬能力， 这需要适当的握力与运动协调性， 我们采用转棒实 验来检测小鼠的运动功能障碍。 将小鼠放于转棒测试仪 (北京吉安得尔科技有限公 司 YLS-4C型)上， 每次放 6只， 按每分钟 20转的速度转动， 记录小鼠 3min内掉 下来的次数。

自主活动测定

将小鼠放入自主活动测试仪的活动箱中， 每次同时测定 6只小鼠， 每个箱中 1只小鼠， 放入后让小鼠适应 3 min再开始测试， 当计算机进入测定程序后， 由计 算机自动记录小鼠 10 min内活动和站立的次数。

采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA) 分析， 认为具有统计学意 义。 行为学检测结果见表 9。 表 9 行为学检 W结果 ( x±s, n=20)

转棒 3min内掉 水平活动数 站立活动数 活动总数 （次） 组别

下数 （次） (次） (次） 空白对照组 2.4±0.6 8.4±0.8 76.3±14.5 88.6±15.8

PQ模型组 3.5±0.6** 26.8±12.1** 29.6±12.3** 阳性对照组 3.4±0.7 7.5±0.8 ^## 56.4±10.2 66.4±13.6 ^## 给药组 1 3.5±0.4 ^## 6.8±0.7 ^## 58.7±19.6 64.8±17.2 ^## 给药组 2 4.8±0.8# 5.5±0.9 ^# 63.6±14.3 54.2±11.8 给药组 3 5.5±0.7 ^# 4.0±0.8 65.5±10.3 ^# 40.3±15.4 ^# 注： P< 0.01， #Ρ< 0.05， Ρ< 0.01

由表 9可知， 给予本发明组合物后小鼠从转棒掉下的次数减 少， 活动次数明 显增加。 给药组与模型组比较： ^# P < 0.05， P < 0.01, 说明本发明组合物能够显 著改善帕金森小鼠的行为能力。

单胺类神经递质的含量检测结果见表 10。

表 10 DA、 NE、 5 - HT含量的测定结果 （； i±s， n=10) 组别 5-HT DA NE

(g/g 蛋白） (g/g 蛋白） (g/g 蛋白） 空白对照组 19.74±10.6 27.96±10.12 23.79±8.6

PQ模型组 53.4±7.8** 64.38±9.64* 44.86±10.5** 阳性对照组 36.53±8.4 ^## 42.28±10.4 ^## 33.24±7.8# 给药组 1 35.89±9.5 40.76±8.8 ^## 30.67±8.4 ^# 给药组 2 42.56±6.9 ^# 49.25±12.3 33.12±9.3# 给药组 3 46.88±7.2 50.62±11.2 ^# 39.88±5.4

0.05， P< 0.01， ^ff P<0.05， ^ffff P<0.01

由表 9、 10可知， 本发明组合物可显著减少 PQ致帕金森小鼠的运动障碍， 降 低单胺类神经递质的过度释放， 改善帕金森症状。 实施例 5 本发明组合物对血管性痴呆动物模型保护作用 研究实验

动物模型建立

采用永久性结扎双侧颈总动脉造血管性痴呆大 鼠模型。 SD大鼠腹腔注射 3.5% 水合氯醛 10ml/kg麻醉后， 仰卧位固定， 颈部正中切口， 分离双侧颈总动脉， 避免 损伤颈交感神经和迷走神经， 用 1 号线将其永久性结扎， 术后缝合伤口， 笼内伺 养。 假手术组为分离双侧颈总动脉， 但不结扎。

动物给药方法

手术 1 月后， 分组给药， 大鼠随机分为六组： 假手术组、 模型组、 银杏叶提 取物片阳性对照组 C4mg/kg；)、本发明组合物给药组 1、 2、 3(250mg/kg, 125 mg/kg、 62.5mg/kg) (配制方法同实施例 3)。

Morris水迷宫学习记忆能力检测实验

水迷宫为直径 90cm， 高 40cm的水池， 水深 30cm， 在水池壁上标明 4个入水 点， 将其分成四个象限， 于其中一象限中心置一有机玻璃圆形平台， 平台低于水 面 2cm， 水温 （24±2)°C， 用不透明厚薄均匀的白色塑料泡沫覆盖， 水池周围参照 物保持不变。 测试包括：

1) 定位航向实验： 用于测量大鼠对水迷官学习和记忆的获取能力 。 将平台置 于迷宫某一象限的中间， 在其它三个象限中任选一入水点， 实验每天训练二次， 每次采用不同的入水点， 每次训练 1分钟的方案。 若动物在 2min之内尚未找到平 台， 则将动物拿到平台上并使它在上面站 15秒， 若大鼠在 2分钟之内找到平台， 也让其在平台上站 15秒， 方结束一次训练。 如此训练五天， 分别记录每只动物的 逃避潜伏期和游泳路径。

2)空间搜索实验：用于测量大鼠学会寻找平台� ��， 对平台空间位置记忆的保持 能力。 定位航行试验结束后， 于第六天将平台移走， 每只大鼠只游 2 分钟， 分别 用秒表记录每只大鼠第一次经过平台的时间， 即潜伏期， 并记录每只大鼠在 2 分 钟内经过平台的次数， 如果某只大鼠的潜伏期越短而经过原平台位置 次数越多， 则说明这只大鼠空间定位能力与学习记忆功能 良好。

给药 14天后开始 Morris水迷宫实验。 先是定位航向实验， 每只大鼠每天训练 2次， 训练时长为 120s， 连续训练 5天， 记录各项参数。 然后进行空间搜索实验， 第六天撤去平台， 记录大鼠的潜伏期及在 2分钟内通过平台位置的次数。

采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA) 分析， Ρ<0.05认为具有统计学意义。 水迷宫实验结果见表 11、 12、 13、 14。

表 11血管性痴呆大鼠定位航向实验逃避潜伏期 （ ± s ) 组别 剂量 动物 逃避潜伏期 （S )

(mg/kg) 数 (只） 第三天 第四天 第五天 假手术组 12 13.38±5.88 12.04±10.26 9.23±5.32 模型组 11 60.24±20.12 ^## 42.32±19.56 ^## 34.42±17.86 ^## 阳性对照

4 11 20.32±14.24** 17.63±10.25** 14.68±11.54"" 组

给药组 1 250 12 18.76±12.45** 15.56±8.24 13.96±8.71 给药组 2 125 11 24.22±15.68" 21.25±13.78* 21.21±11.37 ^# 给药组 3 62.5 11 35.79±23.12 ^# 26.38±12.39 24.42±9.76* 注： P < 0.05， P < 0.01， P < 0.01

由表 11可知， 模型组与假手术组比较， ^# P < 0.05， P < 0.01 , 说明建模成 功， 给药组与模型组比较， *P< 0.05， **P< 0.01， 说明本发明组合物可明显 的降低血管性痴呆大鼠的逃避潜伏期。 表 12血管性痴呆大鼠定位航向实验游程 （ ±

剂量 动物数 游程 （cm)

组别

(mg/kg) (只） 第三天 第四天 第五天 假 手 术

12 385.64±214.32 298.79±203.56 212.54±132.74 组

模型组 11 1647.76±688.43 ^## 1018.04±463.74 ^## 921.64±366.54 ^## 阳 性 对

4 11 543.22±216.87 356.28±144.84* 346.43±235.21* 照组

给药组 1 250 12 606.42±341.64** 394.29±243.66* 332.96±164.82** 给药组 2 125 11 787.21±463.50* 406.78±203.54* 给药组 3 62.5 11 899.54±532.04* 754.74±448.32 592.16±243.12* 注： P<0.05， P<0.01， P<0.01

有表 12可知， 模型组与假手术组比较， ^# P<0.05， P<0.01, 说明建模成 功， 给药组与模型组比较， *P<0.05， **P<0.01， 说明本发明组合物可明显 的减少血管性痴呆大鼠的在水迷宫实验中的游 程。

表 13血管性痴呆大鼠空间探索实验结果 （ ±

动物数

潜伏期 （s) 经过原平台位置次数

假手术组 12 11.37±5.29 3.68±1.65 模型组 12 28.06±13.57 1.35±1.23 阳性对照组 4 12 15.76±8.69 2.88±1.36* 给药组 1 250 12 14.98±9.θΓ ^# 3.00±1.24 ^# 给药组 2 125 12 17.04±7.32 2.76±1.38 ^# 给药组 3 62.5 12 17.58±10.62* 2.65±1.44 注： Ρ<0.05， Ρ<0.01

由表 13可知， 给药组与模型组比较， *Ρ<0.05， **Ρ<0.01， 说明大鼠 给予本发明组合物后空间探索实验的潜伏期较 模型组明显变短， 经过原平 台次数明显增加。

表 14不同给药天数本发明组合物对拟 VD大鼠寻找平台潜伏期实验的影响

( ±s， n=8)

寻找平台潜伏期 （s)

第 1天 第 2天 第 3天 第 4天 第 5天 正常组 35.90±24.36 25.90±25.76 23.54±20.12 15.9±9.86 10.8±6.87 假手术组 38.60±22.78 28.60±31.42 26.38±20.56 17.6±11.35 15.3±10.34 模型组 67.03±32.74* 62.6±39.88** 56.5±27.58** 42.6±23.08** 38.6±24.64** 鼎 、## 给药组 2 37.36±28.32 29.46±21.26 ^ffff 27.14±23.29 ^ffff 20.7±16.72 ^ffff 18.2±10.72 注： *P<0.05, **P<0.01, P<0.01

由表 14可知， 给药组与模型组比较， ^## P<0.01， 说明大鼠给予本发明组合物 后能够縮短寻找平台的时间。

由以上实验结果可知， 给予本发明组合物后， 可明显改善血管性痴呆大 鼠的学习记忆能力。

避暗实验

将大鼠放入明室中， 在箱内自由活动 3 min。 3 min内不进入暗室者剔除 （预 选时不通电)。 l h后正式进行学习训练，记录大鼠进入暗室遭� �电击所需时间为潜 伏期， 并记录 5 min内遭电击次数 （错误次数） 作为学习成绩； 24 h后重复上述过 程， 记录潜伏期和错误次数作为记忆成绩。 电压为 36 V， 潜伏期指标以秒 (S)为单 位。

采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA) 分析， Ρ<0.05认为具有统计学意义。 避暗实验结果见表 15。

表 15 血管性痴呆大鼠避暗实验结果 （ ±s， n=10) 组别 学习训练 记忆测试

潜伏期 （S ) 错误次数 潜伏期 （S ) 错误次数 假手术组 28.69±9.74 1.90±0.86 212.32±19.56 1.52±0.46 模型组 49.38±7.32** 7.62±1.78** 87.96±18.64** 7.20±2.18** 给药组 1 30.46±5.28 3.98±1.24 ^## 146.94±22.40 2.70±1.87 ^## 注： P < 0.01， P < 0.01

由表 15可知， 给药组 1与模型组比较 ^## P < 0.01， 说明本发明组合物能明显縮 短学习训练和记忆测试的潜伏期， 并减少错误次数， 可见本发明组合物能够改善 血管性痴呆大鼠的学习记忆能力。

结论： 本发明组合物能显著改善永久性结扎双侧颈总 动脉造血管性痴呆大鼠 的学习记忆能力， 因此对血管性痴呆大鼠具有保护作用。 实施例 6 本发明组合物对应激抑郁动物保护作用研究实 验

实验前先在安静、 温暖的环境内伺养动物 1周， 除对照组外均单笼伺养， 自然 光照， 通风良好， 自由进食水。

Wistar大鼠慢性轻度不可预见性的应激 （CUMS ) 抑郁模型制作方案： 将 2h 行为限制、 4°C冰水中游泳 5min、 停水 24h、 食 24h、 夹尾 lmin、 明暗颠倒 24h、 电击足底 5s ( 30V电压） 、 摇晃 5min ( 160Hz) 、 40°C环境 5min等九种刺激随机 安排到 18日内， 每日一种， 使动物不能预料刺激的发生。 将 Wistar大鼠随机分为 正常对照组、抑郁模型组、氟西汀阳性对照组 、给药组 1、2、3(250mg/kg组、 125mg/kg 组、 62.5mg/kg组） （配制方法同实施例 3)持续 21天， 各组动物于末次给药 24h后 断头处死。

实验指标测定

行为学测定—— Morris水迷宫测试

空间记忆的训练和测试参照 Morris water Maze法进行。 水温保持在 23 °C左右， 水被染成白色， 以隐蔽平台。 实验过程中周围环境条件保持安静、 稳定。

实验分为训练期和测试期， l-4d为训练期。 训练时将大鼠背对平台放入水中， 记录大鼠的逃避潜伏期， 即从大鼠入水到找到水下隐蔽的平台所需要的 时间， 若 大鼠 60s内未找到平台， 引导大鼠找到平台。逃避潜伏期以 60s计， 大鼠找到或被 引导到平台上后停留 20s， 然后擦干放回笼内。 每只大鼠入水位置按顺时针方向依 次变换， 每两次训练间隔 30s， 第二天的训练较第一天前进一个象限入水， 依此类 推。 第 5、 7d为测试期， 测试时撤去平台。 两次测试均记录大鼠的平台范围时间 比， 即大鼠 60s内游过原平台所在象限的时间占总时间 (60s)的比值。

采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA) 分析， Ρ<0.05认为具有统计学意义。 实验结果见表 16。

表 16 各组大鼠训练期平均逃避潜伏期 （ ±sd， n=12)

平均逃避潜伏期 （s)

正常对照组 22.1+±4.3

抑郁模型组 34.9±4.8

氟西汀阳性对照组 26.5±3.7 ^#

给药组 1 26.2±4.5 ^#

给药组 2 26.7±6.1

给药组 3 27.5±3.2 ^#

注： P < 0.01， ^# P < 0.05

由表 16可知， 给药组与模型组比较： ^# P < 0.05， 说明大鼠给予本发明组合物后， 其逃避潜伏期明显縮短， 即本发明组合物可以改善应激抑郁大鼠的学习 记忆能力。

生化指标测定一单胺氧化酶 （MAO) 、 谷胱甘肽硫转移酶 （GST) 、 γ谷胺 酰转移酶 （γ-GT) 的测定

Wistar大鼠动物进行末次处理后， 将大鼠断头处死， 于冰盘上迅速分离大鼠的 大脑皮质， 切除低位脑干。 称重后以 0.86%预冷的生理盐水 1 :9 在冰水浴中匀浆制 成 10%脑匀浆， 每个标本分装几份后， 低温冰箱冻存备用。取出制备好的匀浆化冻 后 3000r/min， 离心 15min得到匀浆上清液， 按照试剂盒说明书所示方法， 采用发色 底物法分别测定 MAO、 GST、 γ-GT的酶活性。 其结果见表 17。

表 17 各大鼠脑匀浆生化指标检测结果 （；^ ±sd， n=12)

MAO活性 GST活性 γ-GT活性 组别

μ/g 蛋白 μ/g 蛋白 μ/g 蛋白 正常对照组 20.35 ±9.23 18.79±4.78 87.66±20.45 抑郁模型组 35.24±7.45 33.76±6.33** 59.64±17.21 " 氟西汀阳性对照组 21. 87±9.64 ^M 20.04±8.34 鼎 76.13±22.75 浦 给药组 1 22.19±7.73 浦 22.15±5.82 浦 79.65±18.39 ^## 给药组 2 24.38±9.67 浦 25.83±5.46 浦 74.37±20.15 ^# 给药组 3 26.02±7.58 ^# 27.01±3.98 ^# 72.97±23.64 ^#

0.01， # P < 0.05, ## P < 0.01 由表 17可知， 给药组与模型组比较： ^# P < 0.05， P < 0.01 , 说明本发明组合 物能够显著提高单胺氧化酶（MAO ) 、 谷胱甘肽硫转移酶（GST) 、 γ谷胺酰转移 酶 （γ-GT) 的活性。

结论： 本发明组合物对慢性应激抑郁大鼠具有一定保 护作用。 实施例 7 本发明组合物对细菌性脑膜炎动物保护作用研 究实验

细菌性脑膜炎模型建立

实验动物

由于细菌性脑膜炎在婴幼儿中发病率较高， 是新生儿期严重的急性感染 性疾病， 所以细菌性脑膜炎实验动物采用 11 日龄 SD新生大鼠。

致病菌： GBSIII菌种购自中国药品生物制品检验鉴定所

干燥菌种在血清肉汤培养基中 37 °C培养 24h 后， 划线接种于血平皿， 18-24h后， 挑选单个菌落至血清肉汤培养基中， 至对数生长中期收菌。 采用 比浊法调整菌液浓度对应的 OD值与 0.5标准比浊管 （浓度 l x l0 ⁸ cfu/ml ) 相 同，得出菌液浓度为 10 ⁸ cfu/ml。用生理盐水将细菌稀释成所需浓度 10 ⁴ cfu/ml o 模型建立

1 ) 实验组 SD新生大鼠用 1.0%戊巴比妥钠 （15-25mg/kg ) 腹腔注射麻 醉。持 lOul穿刺针于新生大鼠两耳尖连线中点后 2-4mm凹陷处（小脑延髓池） 垂直进针， 有明显突破感后， 回抽见清亮脑脊液 （CSF ) 流出， 抽出 l OulCSF 弃去。 实验组缓慢注入 GSBIII菌悬液 10ul。 整个过程在 1、 2min内完成， 术 后平卧， 置室温 25 °C， 待复苏后， 放回鼠笼由母鼠继续喂养。 培养一定时间 后，将实验组 CSF抽出，经过处理，分为配制成 CSF原液、头孢氨噻肟 +CSF、 本发明组合物 500g/kg+CSF、 本发明组合物 250mg/kg+CSF、 本发明组合物 125mg/kg+CSF几个不同组的脑注入液。

2)取新生 SD大鼠随机分组为： 空白对照组、 模型组、 阳性对照组、 给 药组 1、 2、 3。 用 1.0%戊巴比妥钠 （15-25mg/kg) 腹腔注射麻醉。 持 lOul穿 刺针于新生大鼠两耳尖连线中点后 2-4mm凹陷处 （小脑延髓池） 垂直进针， 有明显突破感后， 回抽见清亮脑脊液 （CSF ) 流出， 抽出 lOulCSF 弃去， 向 各组分别注入相同量的 CSF 原液、 头孢氨噻肟 +CSF、 本发明组合物 500 mg/kg+CSF (给药组 1)、本发明组合物 250 mg/kg+CSF (给药组 2)、本发明组合 物 125 mg/kg+CSF (给药组 3)。 术后平卧， 置室温 25 °C， 待复苏后放回鼠笼 由母鼠继续喂养。

临床症状观察

接种细菌后， 即进行临床观察， 包括： 有无口唇及四肢皮肤发绀、 呼吸 困难、 反应迟钝、 运动减少和抽搐等， 以及最早出现症状的时间点。 在接种 细菌后 24h采用 Loeffler的神经行为学 5分制评分方法对新生大鼠进行评估。 5分： 当抓住背部时， 能正常运动， 在 5s 内翻身； 4分， 自主运动减少， 5s 内能翻身； 3分： 〉5s翻身； 2分： 不能翻身； 1分： 不能运动。 对于出现抽 搐动物， 根据 Racine制定的癫痫 SD大鼠抽搐分级标准进行抽搐程度评价。 该标准共分 6个等级， 0级： 无抽搐； I级： 面部阵挛； II级： 在 I级的基础 上， 有节律点头； III级： 在 II级的基础上有前肢阵挛； IV级： 在 III级的基础 上有后肢站力； V级： 在 IV级得基础上有跌倒。

实验结果见表 18、 19。

表 18 接种不同液体新生大鼠临床表现比较

发绀 呼吸困难 运动障碍

空白对照组 10 0 0 0 0 模型组 10 9 9 7 6 阳性对照组 10 2 1 2 1 给药组 1 10 2 2 2 2 给药组 2 10 3 4 2 3 给药组 3 10 3 5 3 3 由表 18可知， 大鼠给予本发明组合物后其各临床症状明显减 轻。

表 19接种不同液体 24h神经行为评分比较 组别 n 评分 （ ±s)

空白对照组 10 5±0

模型组 10 2.87±1.09

阳性对照组 10 3.99±0.87 ^##

给药组 1 10 4.27±1.12 ^##

给药组 2 10 3.79±1.04 ^##

给药组 3 10 3.43±1.36 ^#

注： P < 0.01， # P < 0.05， P < 0.01

由表 19可知， 单因素方差分析 （One-Way ANOVA) 分析， 模型组与空白对 照组比较： "Ρ < 0.01说明建模成功； 给药组与模型组比较： #Ρ<0.05， ^## Ρ<0.01， 说明给药组较模型组的神经行为明显提高， 可见本发明组合物能够明显改善脑膜 炎大鼠的神经行为。

接种 24h时后仍存活的大鼠， 处死前再经小脑延髓池穿刺取 lOul CSF作 WBC (白血球计算)计数， 计数结果如下表 20:

表 20 WBC计算结果

组别 n 平均值 （ ±s) 空白对照组 5 13.8±1.23

模型组 5 14780.0±5978** 阳性对照组 5 9920±1745 ^#

给药组 1 5 9054±2346

给药组 2 5 9847±3890

给药组 3 5 10976±4577 ^#

注： P < 0.01， ^# P < 0.05， P < 0.01 由表 20可知， 单因素方差分析 （ One-Way ANOVA) 分析， 模型组与空白对照 组比较： "P<0.01， 说明建模成功； 给药组与模型组比较： #P<0.05， ^## P<0.01， 说明本发明组合物能够明显降低大鼠白血球数 ， 降低脑膜炎大鼠的炎症。

结论： 本发明组合物具有好的抗菌作用， 对细菌性脑膜炎动物症状具有一定改 善作用。