COMPOSICIÓN QUE COMPRENDE MIRNAS PARA SU USO COMO MEDICAMENTO

SECTOR DE LA TÉCNICA [0001] La presente invención se refiere a miRNAs aislados de la saliva de la garrapata Ixodes ricinus y combinaciones de los mismos, que muestran un efecto significativo en vías de señalización relevantes en particular para el tratamiento de cánceres, enfermedades inflamatorias, trastornos relacionados con el ritmo circadiano, epilepsia y otros trastornos. ESTADO DE LA TÉCNICA

[0002] Un microRNA (abreviado como "miRNA") es una pequeña molécula de ARN no codificante que se encuentra tanto en plantas como en animales, y que, a veces, ejerce una función relacionada con la regulación post-transcripcional de la expresión génica degradando ciertas RNAm o impendiendo su traducción. Mientras que la mayoría de miRNAs se encuentran dentro de la célula, algunos miRNAs, comúnmente conocidos como miRNAs circulantes o extracelulares, también se han encontrado en el espacio extracelular, incluyendo diversos fluidos biológicos y medios de cultivo celular. [0003] Las garrapatas del genero Ixodes son importantes vectores de enfermedades que transmiten patógenos que causan varias enfermedades humanas incluyendo la enfermedad de Lyme y la encefalitis transmitida por garrapatas. Las glándulas salivales y la saliva son vitales para el éxito biológico de las garrapatas y son una importante vía de transmisión de patógenos. Las glándulas salivales de la garrapata experimentan un notable crecimiento y diferenciación durante el período de alimentación de sangre, y la composición de la saliva incluye muchos componentes diseñados para influir en el huésped. Aún no se han descrito miRNAs en las garrapatas de Ixodes ricinus.

[0004] Recientemente, los miRNAs han llamado la atención como potenciales dianas terapéuticas. Sus funciones reguladoras de la expresión génica los convierten en una diana ideal para el tratamiento de enfermedades genéticas caracterizadas por la desregulación de diferentes genes. Hasta la fecha, varios miRNAs (predominantemente miRNAs humanos) han sido identificados como dianas potenciales para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, diferentes tipos de cáncer, enfermedades metabólicas, hepatitis, aterosclerosis, insuficiencia cardíaca y diabetes. Sin embargo, estos miRNAs son miRNA humanos y sirven como objetivo para el tratamiento. Los paradigmas de tratamiento sugeridos hasta el momento implican la administración de sustancias que afectan la cantidad o función de los propios miRNAs del organismo, incluyendo la administración de secuencias que imitan los propios miRNAs del organismo en enfermedades causadas por la infraexpresión de estos miRNAs (Ajay Francis Christopher et al.: Perspect Clin Res. 2016 Apr-Jun; 7(2): 68-74; Eva van Rooij and Sakari Kauppinen, _.. EMBO Mol Med. 2014 Jul; 6(7): 851-864).

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Detalle de la secuencia de cada uno de los microRNAs empleados en nuestros experimentos. Figura 2: Esquema general de las distintas transfecciones realizadas sobre la línea celular A- 375. C- representa la transfeccion de un Mimic que no interacciona frente a ninguna 3'-UTR del genoma (control negativo de transfeccion). Lipo representa otro control que nos permite evaluar el efecto citotóxico de la Lipofectamina sobre las células (En ausencia de mimics). NT significa "Células no transfectadas". 8, 279a, 317 y Bantam representa el efecto de cada uno de los Mimics (30 pmol) por separado en la línea celular. Finalmente, Mix representa el efecto de los cuatro Mimics (30 pmol de cada uno) en conjunto, debido a que todos ellos presentan dianas asociadas a la 3'-UTR de BRAF.

Figura 3: Imágenes de los diferentes cultivos transcurridas 48 H tras la transfeccion. A. A-375 transfectada con miR-8-3p.; B. A-375 transfectada con miR-279a-3p.; C. A-375 transfectada con el control negativo.; D. A-375 transfectada con Lipofectamina.; E. A-375 no transfectada.

Figura 4: Western blot utilizando anti-B-Raf V600E a las 48 H en la línea celular A-375. Calle 1 representa la transfeccion del Mimic 8-3p. Calle 2 representa la transfeccion del Mimic 279a- 3p. Calle 3 representa la transfeccion del Mimic 317-3p. Calle 4 representa la transfeccion del mimic Bantam-3p. Calle 5 representa la transfeccion de la mezcla de Mimics. Calle 6 representa la transfeccion del control negativo. Calle 7 representa las células expuestas a la Lipofectamina en ausencia de Mimics. Calle 8 representa las células no transfectadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0005] La presente invención se basa en un descubrimiento reciente que demuestra que los miRNAs presentes en la saliva de Ixodes ricinus regulan genes codificantes en mamíferos biológicamente activos (en particular humanos) y por tanto mediante la regulación de la expresión de estas proteínas se regulan también las vías de señalización en las que dichas proteínas participan.

La desregulación de estas vías de señalización desempeña un papel clave en muchas enfermedades de mamíferos (en particular humanos). La presente invención abre así un nuevo paradigma para el tratamiento de enfermedades de mamíferos que implican desregulación de la expresión génica, incluyendo la administración terapéutica de miRNAs que ocurren naturalmente en organismos no mamíferos, tales como garrapatas. [0006] La presente invención proporciona así una composición que comprende al menos un oligonucleótido derivado de un miRNA obtenido de la saliva de la garrapata de Ixodes ricinus, seleccionado dicho oligonucleótido del grupo que comprende:

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p, SEQ ID NO: 1 ),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGAACACAGCTGGTGGTATATCAG (iri-miR-317-3p, SEQ ID NO. 2),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGACTAGATCCACACTCATCCA (iri-miR-279a-3p, SEQ

ID NO. 3),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGAGATCATTGTGAAAGCTGATT (iri-miR-bantam-3p, SEQ ID NO. 4),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p, SEQ ID NO. 5),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CCAACCCACTAACTGACGGAAC (iri-miR-X1 h-3p, SEQ ID NO. 6),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CCCCCTTCGTCCACGTTCTAG (iri-miR-X17-5p, SEQ ID NO. 7),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CGGCTCTGGCGCTGGCCCCAGC (iri-miR-X8-3p, SEQ ID

NO. 8),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAATCTCATTTGGTATCTCTGGG (iri-miR-5307-5p, SEQ ID NO. 9),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia AAAAATTGTGGTAGTGTCAAGC (iri-miR-96-3p, SEQ ID NO. 10), - Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAGGAACTTCATACCATGCTCG (iri-miR-276-3p, SEQ ID NO. 11),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TCTCACTACCTTGTCTTTGTTG (iri-miR-71-3p, SEQ ID

NO. 12),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GATGACTGTGCCTCTAGTCCATG (iri-miR-279a-5p, SEQ ID NO. 13),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CTGGTTTTCACAATGATCGTCCAGA (iri-miR-bantam-5p, SEQ ID NO. 14),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GCTGTCAGTTTGTGGGCTGGTGC (iri-miR-X26-5p, SEQ ID NO. 15),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia ACTCGACGTAGCGCCCGCACTC (iri-miR-X12-3p, SEQ ID NO. 16),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CATCTTACCAGACAGCATTAGA (iri-miR-8-5p, SEQ ID

NO. 17),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a-5p, SEQ I D NO. 18),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG (iri-miR-1-3p, SEQ ID NO. 19),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia AGATATGTTTGATATTCTTGGTT (iri-miR-190-5p, SEQ ID NO. 20),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TTGTGACCGTTACAATGGGCAT (iri-miR-2001-5p, SEQ ID NO. 21).

De forma preferente, la composición comprende un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p, SEQ ID NO: 1) o bien un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p, SEQ ID NO. 5).

[0007] Preferiblemente, la composición de la presente invención comprende al menos dos, o al menos tres, o al menos cuatro oligonucleótidos seleccionados del grupo de oligonucleótidos de la invención, derivados de los miRNAs obtenidos de la saliva de la garrapata Ixodes ricinus, según se enumera en el párrafo [0006].

[0008] Preferiblemente, la composición de la presente invención comprende al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que comprende:

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TGAACACAGCTGGTGGTATATCAG (iri-miR-317- 3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TGACTAGATCCACACTCATCCA (iri-miR-279a- 3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TGAGATCATTGTGAAAGCTGATT (iri-miR- bantam-3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h- 5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia CCAACCCACTAACTGACGGAAC (iri-miR-X1 h- 3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia CCCCCTTCGTCCACGTTCTAG (iri-miR-X17-5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia CGGCTCTGGCGCTGGCCCCAGC (iri-miR-X8- 3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TAATCTCATTTGGTATCTCTGGG (iri-miR-5307- 5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia AAAAATTGTGGTAGTGTCAAGC (iri-miR-96-3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TAGGAACTTCATACCATGCTCG (iri-miR-276- 3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TCTCACTACCTTGTCTTTGTTG (iri-miR-71-3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia GATGACTGTGCCTCTAGTCCATG (iri-miR-279a- 5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia CTGGTTTTCACAATGATCGTCCAGA (iri-miR- bantam-5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia GCTGTCAGTTTGTGGGCTGGTGC (iri-miR-X26- - un oligonucleotido que tiene la secuencia ACTCGACGTAGCGCCCGCACTC (iri-miR-X12- 3p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia CATCTTACCAGACAGCATTAGA (iri-miR-8-5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a-5p), - un oligonucleotido que tiene la secuencia TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG (iri-miR-1-3p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia AGATATGTTTGATATTCTTGGTT (iri-miR-190- 5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TTGTGACCGTTACAATGGGCAT (iri-miR-2001- 5p).

De forma preferente, la composición comprende un oligonucleotido con secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p, SEQ ID NO: 1) o bien un oligonucleotido con secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p, SEQ ID NO. 5).

[0009] Preferiblemente, la composición de la presente invención comprende al menos dos, o al menos tres, o al menos cuatro oligonucleótidos seleccionados del grupo de oligonucleótidos que corresponden a miRNAs obtenidos de la saliva de la garrapata Ixodes ricinus, según se enumera en el párrafo [0008]. De forma preferente, uno de esos al menos dos, al menos tres o al menos cuatro oligonucleótidos es el oligonucleotido con secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p, SEQ ID NO: 1) o bien el oligonucleotido con secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p, SEQ ID NO. 5).

[0010] En una realización preferida, la composición de la presente invención comprende al menos dos o al menos tres oligonucleótidos seleccionados del grupo que consiste en:

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGAACACAGCTGGTGGTATATCAG (iri-miR-317-3p),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGACTAGATCCACACTCATCCA (iri-miR-279a-3p), - Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGAGATCATTGTGAAAGCTGATT (iri-miR-bantam-3p);

O seleccionados del grupo compuesto por:

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p),

- Un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CCAACCCACTAACTGACGGAAC (iri-miR-X1 h-3p), - Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CCCCCTTCGTCCACGTTCTAG (iri-miR-X17-5p),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CGGCTCTGGCGCTGGCCCCAGC (iri-miR-X8-3p);

O seleccionados del grupo compuesto por:

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAATCTCATTTGGTATCTCTGGG (iri-miR-5307-5p),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia AAAAATTGTGGTAGTGTCAAGC (iri-miR-96-3p),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAGGAACTTCATACCATGCTCG (iri-miR-276-3p),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TCTCACTACCTTGTCTTTGTTG (iri-miR-71-3p);

O seleccionados del grupo compuesto por:

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GATGACTGTGCCTCTAGTCCATG (iri-miR-279a-5p),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CTGGTTTTCACAATGATCGTCCAGA (iri-miR-bantam-5p),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GCTGTCAGTTTGTGGGCTGGTGC (iri-miR-X26-5p),

- Un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia ACTCGACGTAGCGCCCGCACTC (iri-miR-X12-3p);

O seleccionados del grupo compuesto por:

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CATCTTACCAGACAGCATTAGA (iri-miR-8-5p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a-5p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p);

O seleccionados del grupo compuesto por: - un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a-5p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG (iri-miR-1-3p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia AGATATGTTTGATATTCTTGGTT (iri-miR-190-5p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TTGTGACCGTTACAATGGGCAT (iri-miR-2001-5p); Y opcionalmente al menos una secuencia adicional seleccionada del grupo definido anteriormente en el párrafo [0006]. De forma preferente, la secuencia adicional será una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p, SEQ ID NO: 1) o bien una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p, SEQ ID NO. 5).

[001 1] Más preferiblemente, la composición de la presente invención comprende al menos dos o al menos tres oligonucleótidos seleccionados del grupo compuesto por:

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8- 3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TGAACACAGCTGGTGGTATATCAG (iri-miR- 317-3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TGACTAGATCCACACTCATCCA (iri-miR- 279a-3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TGAGATCATTGTGAAAGCTGATT (iri-miR- bantam-3p);

O seleccionados del grupo compuesto por:

- un oligonucleótido que tiene la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h- 5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia CCAACCCACTAACTGACGGAAC (iri-miR- X1 h-3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia CCCCCTTCGTCCACGTTCTAG (iri-miR-X17- 5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia CGGCTCTGGCGCTGGCCCCAGC (iri-miR- X8-3p);

O seleccionados del grupo compuesto por: - un oligonucleotido que tiene la secuencia TAATCTCATTTGGTATCTCTGGG (iri-miR- 5307-5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia AAAAATTGTGGTAGTGTCAAGC (iri-miR-96- 3p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TAGGAACTTCATACCATGCTCG (iri-miR-276- 3p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TCTCACTACCTTGTCTTTGTTG (iri-miR-71- 3p);

O seleccionados del grupo compuesto por:

- un oligonucleotido que tiene la secuencia GATGACTGTGCCTCTAGTCCATG (iri-miR- 279a-5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia CTGGTTTTCACAATGATCGTCCAGA (iri-miR- bantam-5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia GCTGTCAGTTTGTGGGCTGGTGC (iri-miR- X26-5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia ACTCGACGTAGCGCCCGCACTC (iri-miR- X12-3p);

O seleccionados del grupo compuesto por:

- un oligonucleotido que tiene la secuencia CATCTTACCAGACAGCATTAGA (iri-miR-8- 5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8- 3p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a- 5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h- 5p);

O seleccionados del grupo compuesto por:

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a- 5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG (iri-miR-1 - 3p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia AGATATGTTTGATATTCTTGGTT (iri-miR- 190-5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TTGTGACCGTTACAATGGGCAT (iri-miR- 2001-5p);

Y opcionalmente al menos una secuencia adicional seleccionada del grupo definido anteriormente en el párrafo [0008]. De forma preferente, la secuencia adicional será la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p, SEQ ID NO: 1) o bien la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p, SEQ ID NO. 5).

[0012] En una representación más preferida, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p),

- un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGAACACAGCTGGTGGTATATCAG (iri-miR-317-3p), - un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGACTAGATCCACACTCATCCA (iri-miR-279a-3p),

- un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGAGATCATTGTGAAAGCTGATT (iri-miR-bantam-3p). [0013] Más preferiblemente, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TGAACACAGCTGGTGGTATATCAG (iri-miR-317- 3p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TGACTAGATCCACACTCATCCA (iri-miR-279a- 3p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TGAGATCATTGTGAAAGCTGATT (iri-miR- bantam-3p).

Esta composición es especialmente útil para el tratamiento de cáncer.

[0014] En otra realización preferida, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p), - un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CCAACCCACTAACTGACGGAAC (iri-miR-X1 h-3p),

- un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CCCCCTTCGTCCACGTTCTAG (iri-miR-X17-5p),

- un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CGGCTCTGGCGCTGGCCCCAGC (iri-miR-X8-3p). [0015] Más preferiblemente, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleótido que tiene la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h- 5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia CCAACCCACTAACTGACGGAAC (iri-miR-X1 h- 3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia CCCCCTTCGTCCACGTTCTAG (iri-miR-X17-5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia CGGCTCTGGCGCTGGCCCCAGC (iri-miR-X8- 3p).

[0016] En otra realización aún más preferida, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAATCTCATTTGGTATCTCTGGG (iri-miR-5307-5p), - un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia AAAAATTGTGGTAGTGTCAAGC (iri-miR-96-3p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAGGAACTTCATACCATGCTCG (iri-miR-276-3p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TCTCACTACCTTGTCTTTGTTG (iri-miR-71-3p).

[0017] Más preferiblemente, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TAATCTCATTTGGTATCTCTGGG (iri-miR-5307- 5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia AAAAATTGTGGTAGTGTCAAGC (iri-miR-96-3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TAGGAACTTCATACCATGCTCG (iri-miR-276- 3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TCTCACTACCTTGTCTTTGTTG (iri-miR-71-3p).

[0018] En otra realización preferida adicional, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GATGACTGTGCCTCTAGTCCATG (iri-miR-279a-5p), - un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CTGGTTTTCACAATGATCGTCCAGA (iri-miR-bantam-5p), - un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GCTGTCAGTTTGTGGGCTGGTGC (iri-miR-X26-5p),

- un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia ACTCGACGTAGCGCCCGCACTC (iri-miR-X12-3p).

[0019] Más preferiblemente, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleotido que tiene la secuencia GATGACTGTGCCTCTAGTCCATG (iri-miR-279a- 5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia CTGGTTTTCACAATGATCGTCCAGA (iri-miR- bantam-5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia GCTGTCAGTTTGTGGGCTGGTGC (iri-miR-X26- 5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia ACTCGACGTAGCGCCCGCACTC (iri-miR-X12- 3p).

[0020] En otra realización aún más preferida, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia CATCTTACCAGACAGCATTAGA (iri-miR-8-5p),

- un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p),

- un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a-5p), - un oligonucleotido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p).

[0021] Más preferiblemente, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleotido que tiene la secuencia CATCTTACCAGACAGCATTAGA (iri-miR-8-5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a-5p),

- un oligonucleotido que tiene la secuencia GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h- 5p).

[0022] En aún otra realización preferida, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos: - un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a-5p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG (iri-miR-1-3p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia AGATATGTTTGATATTCTTGGTT (iri-miR-190-5p),

- un oligonucleótido con una secuencia que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia TTGTGACCGTTACAATGGGCAT (iri-miR-2001-5p). [0023] Más preferiblemente, la composición de la presente invención comprende los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a-5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG (iri-miR-1-3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia AGATATGTTTGATATTCTTGGTT (iri-miR-190- 5p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TTGTGACCGTTACAATGGGCAT (iri-miR-2001- 5p).

[0024] La diferencia del 10% (es decir, una similitud de secuencia del 90%) en la secuencia de los oligonucleótidos de la invención puede darse acortando o extendiendo la secuencia, o mediante mutaciones puntuales. Más preferiblemente, las secuencias de los oligonucleótidos de la invención tienen al menos el 91 %, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98%, o al menos 99% de similitud con las secuencias listadas. Las diferencias correspondientes en las secuencias oligonucleotídicas se pueden lograr acortando o extendiendo la secuencia, o mediante mutaciones puntuales.

[0025] Los oligonucleótidos de la presente invención pueden obtenerse por métodos estándar bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante métodos de síntesis en fase sólida o por métodos de bioproducción.

[0026] Debe entenderse que las composiciones definidas que comprenden al menos uno, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro oligonucleótidos", también pueden comprender adicionalmente otros oligonucleótidos seleccionados del grupo definido en el párrafo [0006] o en el párrafo [0008], o cualquier otro oligonucleótido o sustancia, preferiblemente sustancias farmacéuticamente aceptables. [0027] Las composiciones de la presente invención pueden comprender además sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables. Las composiciones líquidas comprenden preferiblemente agentes auxiliares farmacéuticamente aceptables seleccionados entre disolventes, conservantes, estabilizantes, emulsionantes, agentes solubilizantes, sustancias reguladoras de la viscosidad, sales y tampones. Las composiciones sólidas comprenden preferiblemente agentes auxiliares farmacéuticamente aceptables seleccionados de entre los vehículos, cargas, aglutinantes, desintegrantes, reguladores de flujo, lubricantes, auxiliares de granulación, conservantes y estabilizantes. Las composiciones se preparan por métodos conocidos en el estado de la técnica, tales como mezcla, liofilización, granulación, formación de comprimidos, etc.

[0028] En el marco de la presente invención, se observó que las garrapatas usan exosomas para administrar los miRNA presentes en la saliva al organismo huésped. Por lo tanto, en una realización preferida, la composición de la presente invención comprende también componentes que forman los liposomas. Dicha composición comprende entonces las secuencias de oligonucleótidos en forma de liposomas y es útil para administrar las secuencias de oligonucleótidos con una mejor biodisponibilidad.

[0029] Los liposomas son vesículas que tienen al menos una bicapa lipídica. Están típicamente compuestas por un núcleo que en la presente invención contiene las secuencias de oligonucleótidos y opcionalmente sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables y al menos una bicapa lipídica que comprende típicamente fosfolípidos u otras sustancias lipídicas anfipáticas, es decir, sustancias lipídicas que comprenden una cabeza hidrófila y una cola hidrófoba. Los liposomas se producen típicamente sonicando una dispersión que comprende los compuestos a encapsular y sustancias lipídicas anfipáticas, mediante extrusión o secado por pulverización.

[0030] En el marco de la presente invención, se exploró la interacción de los miRNA aislados de la saliva de la garrapata Ixodes ricinus con la regulación de la expresión génica de proteínas que participan en vías de señalización implicadas en la progresión o regulación de trastornos de salud de mamíferos (en particular humanos). Se encontró que los miRNAs obtenidos de la saliva de la garrapata Ixodes ricinus afectan a las vías de señalización, y en combinaciones de al menos dos, al menos tres o al menos cuatro miRNAs los oligonucleótidos interactúan sinérgicamente para regular las vías de señalización. Se encontró que las vías de señalización comprenden genes con zonas que actúan como diana para los miRNAs, Preferiblemente, las vías de señalización implican a genes que comprenden combinaciones de dianas para los miRNAs. La interacción puede producirse, por ejemplo, mediante el silenciamiento o regulación negativa de la expresión génica de las proteínas que participan en dichas vías de señalización.

[0031] Se ha demostrado que los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención y las combinaciones de los mismos regulan la expresión de proteínas que participa en vías de señalización implicadas en la progresión o regulación de trastornos de salud. Por lo tanto, los oligonucleótidos y sus combinaciones son útiles como medicamentos, por ejemplo en la regulación de la homeostasis de un organismo mamífero (en particular humano). [0032] En particular, los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención son útiles en el tratamiento de cánceres, enfermedades inflamatorias, alergias, dermatitis atópica, lupus, asma, dolor crónico, trastornos relacionados con el ritmo circadiano, enfermedades metabólicas, diabetes, glaucoma, hepatitis, tratamiento del dolor, tratamiento local del dolor, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de Parkinson, enfermedades neurológicas y neurodegenerativas y epilepsia. Los oligonucleótidos y / o combinaciones de los mismos, de acuerdo con la presente invención han mostrado una regulación negativa de la expresión génica de proteínas de vías de señalización implicadas en la regulación de estos trastornos, dichas vías de señalización incluyendo las vías siguientes (el número entre paréntesis es el número de identificador (ID) de la vía KEGG ID) que se discuten como ejemplos de vías de señalización que desempeñan papeles clave en diversas enfermedades. Otras vías con regulación negativa participan en la progresión y desarrollo de enfermedades, y el experto no tendría ninguna dificultad para encontrar la información relevante para cada vía en los libros y artículos científicos pertinentes, o utilizando las bases de datos pertinentes, como la base de datos KEGG. La presente invención proporciona además un método de tratamiento de un mamífero que sufre de una enfermedad como diferentes tipos de cánceres, enfermedades inflamatorias, alergias, dermatitis atópica, lupus, asma, dolor crónico, trastornos relacionados con el ritmo circadiano, enfermedades metabólicas, diabetes, glaucoma, hepatitis, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de Parkinson, enfermedades neurológicas y neurodegenerativas y epilepsia. Dicho método comprende una etapa de administración de la composición de la presente invención al mamífero.

[0033] Unión gap (4540): Se refiere a un tipo de conexión entre células como las que se basan en la transmisión sináptica eléctrica entre las neuronas. Actúa en enfermedades neurológicas, epilepsia y glaucoma. Además, la capacidad de las proteínas de unión gap para regular las respuestas inmunes, la proliferación celular, la migración, la apoptosis y la carcinogénesis las convierten en dianas terapéuticas atractivas para tratar trastornos inflamatorios y neoplásicos en diferentes sistemas de órganos. Se observan alteraciones en el perfil de la unión gap y en los niveles de expresión en trastornos cutáneos hiperproliferativos, enfermedades vasculares linfáticas, enfermedades pulmonares inflamatorias, lesiones hepáticas y trastornos neoplásicos. [0034] Vía de señalización GnRH (4912): La secreción de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) del hipotálamo actúa sobre su receptor en la pituitaria anterior para regular la producción y liberación de las gonadotropinas, LH y FSH. El GnRHR se acopla a proteínas Gq / 11 para activar la fosfolipasa C que transmite su señal a diacilglicerol (DAG) e inositol 1 ,4,5-trisfosfatasa (IP3). DAG activa la vía intercelular de proteína quinasa C (PKC) e IP3 estimula la liberación intracelular de calcio. Además de la clásica Gq / 11 , el acoplamiento de Gs se observa de vez en cuando de una manera específica de la célula. La señalización aguas abajo de la proteína quinasa C (PKC) conduce a la transactivación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la activación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), incluyendo la quinasa regulada por una señal extracelular (ERK), quinasa N-terminal Jun (JNK) y p38 MAPK. Las MAPK activas se trasladan al núcleo, dando como resultado la activación de factores de transcripción y la inducción rápida de genes tempranos. Esta vía de señalización está relacionada con el cáncer de mama en las mujeres, la hipertrofia prostética benigna y el carcinoma prostético en los hombres, y la pubertad precoz central en los niños.

[0035] Vía de señalización ErbB (4012): La familia ErbB son receptores tirosina quinasa (RTK), que son el enlace entre la unión de ligandos de factores de crecimiento extracelulares y las vías de señalización intracelular que regulan diversas respuestas biológicas, incluyendo proliferación, diferenciación, motilidad celular y supervivencia. La unión del ligando a los cuatro miembros estrechamente relacionados de esta familia de receptores - factor de crecimiento epidérmico de la familia RTK (EGFR, también conocido como ErbB-1 o HER1), ErbB-2 (HER2), ErbB-3 (HER3) y ErbB-4 (HER4) - induce la formación de homo- y heterodímeros y la activación del dominio de quinasa intrínseca, dando como resultado la fosforilación de residuos de tirosina específicos (pY) dentro de la cola citoplásmica. La regulación negativa de la vía ErbB juega un papel clave en el tratamiento del cáncer de mama.

[0036] Vía de señalización Fe epsilon Rl (4664): Las vías de señalización mediadas por Fe epsilon Rl en mastocitos se inician por la interacción de un antígeno con IgE unido al dominio extracelular de la cadena alfa de Fe epsilon Rl. Los mastocitos que se activan así liberan gránulos preformados que contienen aminas biógenas (histaminas) y proteoglicanos (heparina). La activación de la fosfolipasa A2 provoca la liberación de lípidos de la membrana seguido del desarrollo de mediadores lipidíeos tales como leucotrienos (LTC4, LTD4 y LTE4) y prostaglandinas (especialmente PDG2). También hay secreción de citoquinas, las más importantes de las cuales son TNF-alfa, IL-4 e IL-5. Estos mediadores y citoquinas contribuyen a respuestas inflamatorias y alérgicas, dermatitis atópica y lupus. [0037] Vía de señalización de oxitocina (4921): guarda relación con diabetes, obesidad y enfermedades cardiovasculares. La oxitocina ejerce una amplia variedad de efectos centrales y periféricos. En el sistema cardiovascular, la OTR está asociada con las vías ANP-GMPc y NO-cGMP, que reducen la fuerza y la tasa de contracción y aumentan la vasodilatación. [0038] Contracción del músculo liso vascular (4270): La célula vascular del músculo liso (VSMC) es una célula altamente especializada cuya función principal es la contracción. Al contraerse, las CMLV se acortan, disminuyendo así el diámetro de un vaso sanguíneo para regular el flujo sanguíneo y la presión. La vía está indicada en enfermedades cardiovasculares, aneurisma cerebral o enfermedad vascular; Asma, enfermedad funcional gastrointestinal.

[0039] Potenciación a largo plazo (4720): La potenciación a largo plazo del hipocampo (LTP), un aumento duradero de la eficacia sináptica, es la base molecular para el aprendizaje y la memoria. También se ha implicado en el dolor crónico y la hipertensión.

[0040] La dopamina (DA) es un importante neurotransmisor prototípico que actúa en el cerebro de mamíferos, donde controla una variedad de funciones incluyendo la actividad locomotora, la motivación, la recompensa, el aprendizaje, la memoria, y la regulación endocrina. DA influye en la actividad neuronal, la plasticidad sináptica y el comportamiento. Los D2Rs presinápticamente localizados regulan la síntesis y liberación de DA como principal autoreceptor del sistema dopaminérgico. Esta vía está implicada en la enfermedad de Parkinson, enfermedades del SNC, y la esquizofrenia.

[0041] Sinapsis colinérgica (4725): Implica la señalización de acetilcolina que afecta muchas funciones, como el aprendizaje, la memoria, la atención y el control motor.

[0042] Vía del cáncer colorrectal (5210): Está implicada en el cáncer colorrectal. Se han identificado dos mecanismos principales de inestabilidad genómica en la progresión esporádica de la vía del CRC. La primera, conocida como inestabilidad cromosómica (CIN), resulta de una serie de cambios genéticos que implican la activación de oncogenes como K- ras e inactivación de TSG (supresores de tumores) como p53, DCC / Smad4 y APC. La segunda, conocida como inestabilidad de microsatélites (MSI), resulta de la inactivación de los genes de reparación de ADN MLH1 y / o MSH2 por hipermetilación de su promotor, y la mutación secundaria de genes con microsatélites codificantes, tales como el receptor II del factor de crecimiento transformante (TGF- Rll) y BAX. [0043] Ritmo circadiano (4710): Es una ruta que desempeña un papel clave en el reloj biológico interno, que permite mantener un ritmo de aproximadamente 24 horas en ausencia de señales ambientales. En los mamíferos, el mecanismo del reloj circadiano consiste en bucles de retroalimentación de transcripción-traducción autónoma de células que impulsan patrones de expresión rítmicos de 24 horas de los componentes del reloj de núcleo. El primer bucle de retroalimentación negativa es una transcripción rítmica de los genes del período (PER1 , PER2 y PER3) y los genes del criptocromo (CRY1 y CRY2). Las proteínas PER y CRY forman un heterodímero, que actúa sobre el heterodímero CLOCK / BMAL1 para reprimir su propia transcripción. Las proteínas PER y CRY son fosforiladas por la caseína quinasa épsilon (CKIepsilon), lo que conduce a la degradación y reinicio del ciclo. El segundo bucle es un bucle de retroalimentación positivo impulsado por el heterodímero CLOCK / BMAL1 , que inicia la transcripción de genes diana que contienen secuencias potenciadoras cis-reguladoras de E-box.

[0044] Arrastre circadiano (4713): Es una propiedad fundamental por la que el periodo del reloj biológico interno es arrastrado por señales exógenas recurrentes, de tal manera que el ritmo endocrino y el de comportamiento del organismo se sincronizan con señales ambientales.

[0045] Proteogl ¡canos en el cáncer (5205): Se ha demostrado que muchos proteogl ¡canos (PG) en el microambiente tumoral son macromoléculas clave que contribuyen a la biología de varios tipos de cáncer incluyendo proliferación, adhesión, angiogénesis y metástasis, afectando el progreso del tumor. Su infra-regulación (down-regulation) contribuye al tratamiento del cáncer.

[0046] Hepatitis C (5160): El virus de la hepatitis C (VHC) es la mayor causa de hepatitis crónica. El VHC emplea varias estrategias para perturbar la inmunidad de la célula huésped. Después de la invasión, el genoma de ARN del VHC funciona directamente como un ARN mensajero (ARNm o mRNA) en el citoplasma de la célula huésped y forma complejos de replicación asociados a la membrana junto con proteínas no estructurales. El ARN viral puede desencadenar la vía RIG-I y la producción de interferón durante este proceso. Las proteínas del HCV regulan la respuesta inmune para inhibir la acción del interferón. VHC proteínas y las proteínas NS5A parecen ser las moléculas más importantes con funciones reguladoras que modulan la transcripción, la proliferación celular y la apoptosis. [0047] La presente invención comprende además preparaciones que comprenden al menos una composición de la presente invención y al menos otra sustancia farmacéuticamente activa. Tales preparaciones son adecuadas para la administración simultánea o secuencial. Las preparaciones pueden estar en forma de un kit que comprende la composición de la presente invención en una forma de administración, y al menos otra sustancia farmacéuticamente activa en una forma de administración separada.

Lista de secuencias:

SEQ ID NO. 1 : ir -miR-8-3p

SEQ ID NO. 2: ir -miR-317-3p

SEQ ID NO. 3: ir -miR-279a-3p

SEQ ID NO. 4: ir -miR-bantam-3p

SEQ ID NO. 5: ir -miR-X1 h-5p

SEQ ID NO. 6: ir -miR-X1 h-3p

SEQ ID NO. 7: ir -miR-X17-5p

SEQ ID NO. 8: ir -miR-X8-3p

SEQ ID NO. 9: ir -miR-5307-5p

SEQ ID NO. 10: ri-miR-96-3p

SEQ ID NO. 1 1 : ri-miR-276-3p

SEQ ID NO. 12: ri-miR-71-3p

SEQ ID NO. 13: ri-miR-279a-5p

SEQ ID NO. 14: ri-miR-bantam-5p

SEQ ID NO. 15: ri-miR-X26-5p

SEQ ID NO. 16: ri-miR-X12-3p

SEQ ID NO. 17: ri-miR-8-5p

SEQ ID NO. 18: ri-miR-9a-5p

SEQ ID NO. 19: ri-miR-1-3p

SEQ ID NO. 20: ri-miR-190-5p

SEQ ID NO. 21 : ri-miR-2001-5p

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

Disección de tejido de garrapata, extracción del ARN total y secuenciación

[0048] Se colocaron 1.080 ninfas y 420 adultos (hembras y machos) sobre animales de experimentación para su alimentación. El ARN total se extrajo del tejido combinado diseccionado de garrapatas adultas y garrapatas ninfales que se eliminaban en intervalos de 3 horas hasta un total de 24 horas (ninfas) o 36 horas (adultos) para producir diez muestras: cuatro muestras a 0-12h y 12-24h para ninfas Glándulas salivales (SG) e intestinos medios anteriores (MG, del inglés midgut. Parte del embrión a partir de la que se desarrollan el intestino medio), respectivamente, y seis muestras a 0-12h, 12-24h, y 24-36h para adultos SG y MG, respectivamente. La saliva de la garrapata fue obtenida como se describe en: (Horká.H., Cerná-Kycková.K., Skallová.A. and Kopecky.J. (2009) Tick saliva affects both proliferation and distribution of Borrelia burgdorferi spirochetes in mouse organs and increases transmission of spirochetes to ticks. Int J Med Microbio!, 299, 373-380). Las muestras se prepararon y se secuenciaron en un Genome Analyzer llx (lllumina, San Diego, CA) usando un protocolo de secuenciación estándar (longitud máxima de lecturas 36 nt) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas de secuenciación se prepararon de acuerdo con las instrucciones del TrueSeq Small RNA Sample preparation kit (lllumina). Los grupos o clusters se generaron utilizando la estación de agrupamiento de lllumina (lllumina cluster station). Las imágenes fluorescentes se convirtieron a secuencias utilizando el software de lllumina, Genome Analyzer Pipeline Analysis v1.8.

[0049] Dado que no se han reportado miRNAs en /. ricinus anteriormente, hemos utilizado sRNAbench y miRanalyzer para predecir miRNAs de /. ricinus utilizando las lecturas combinadas de todas las muestras. En el primer paso, el muestreo de lecturas se tomó de entre todas las muestras experimentales, y sólo se aceptaron predicciones / anotaciones de alta confianza. En una segunda ronda de anotación, se han utilizado sucesivamente las diez muestras para la predicción de miRNAs, eliminando en cada ronda los miRNAs previamente predichos para evitar que fuesen detectados de nuevo. [0050] También se obtuvieron predicciones de nuevos miRNAs usando como base el genoma de /. scapty/ar/s.Sin embargo, en algunos casos, la secuencia pre-miRNA de /. scapularis no era idéntica a la secuencia de /. ricinus dada la divergencia evolutiva entre las dos especies desde su último antecesor común. Sin embargo, se determinó la secuencia madura correcta de /. ricinus como una de las secuencias presentes en las lecturas de /. ricinus. Por lo tanto, en los casos de variación de secuencia (desemparejamientos) entre la secuencia madura de /. scapularis e /. ricinus, se ha "corregido" la secuencia de /. scapularis reemplazando la secuencia madura con la correcta de /. ricinus. En la práctica, esto significa que para algunos nuevos miRNAs predichos en el genoma de /. scapularis, la secuencia del pre-miRNA es un híbrido (la secuencia del miRNA maduro siempre es de /. ricinus pero la secuencia restante corresponde a /. scapularis). Las estructuras secundarias de los nuevos miRNAs fueron predichas utilizando RNAfoId y se representan mediante el servidor web 'forna', del paquete ViennaRNA ( Lorenz.R., Bernhart.S.H., Hóner Zu Siederdissen.C, Tafer.H., Flamm.C, Stadler.P.F. and Hofacker.l.L. (2011) ViennaRNA Package 2.0. Algorithms Mol Biol, 6, 26). miRNA familias y taxonomía

[0051] Se asignó cada miRNA al nodo taxonómico de su primera aparición (basado en el análisis filogenético). Primero se descargó la base de datos de la taxonomía de NCBI para generar el linaje completo para cada especie y luego asignamos todos los miRNAs a sus miRNAs putativamente homólogos en miRBase si: i) tienen la misma región semilla siendo definida la semilla como la secuencia comprendida entre los nucleótidos 2-8; ii) el alineamiento global tiene menos de cuatro desemparejamientos. Obsérvese que para todos los nuevos miRNAs, ambos brazos fueron apoyados por lecturas, de modo que definimos el brazo funcional (guía) como el que tiene un mayor número de miRNAs homólogos en miRBase (secuencia más conservada). También tenga en cuenta que para la mayoría de los miRNAs el número de posibles secuencias homologas es muy diferente para las secuencias guía y pasajero.

Expresión diferencial y normalización

[0052] Nuestro diseño experimental dio lugar a diferentes posibles comparaciones: i) SG (glándulas salivales) vs. MG (intestino medio anterior) en adultos, ii) SG vs. MG en ninfas, y iii) adultos vs. ninfas en SG. Usamos edgeR para determinar la expresión diferencial entre dos condiciones (Robinson.M.D., McCarthy.D.J. and Smyth.G.K. (2010) edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics, 26, 139-140).

Mediante el módulo de expresión diferencial del sRNAbench, se ha generado una matriz de expresión que contiene los recuentos de lecturas sin normalizar, formato obligatorio de entrada del edgeR para obtener los miRNAs diferencialmente expresados.

EdgeR normaliza los datos utilizando el método Trimmed Mean of M-values (TMM). También se generó una matriz de expresión con valores normalizados (Lecturas por millón o RPM.del inglés "Reads Per Million" ) utilizando el método de "asignación única" ('single assignment') de sRNAbench. Como resultado, se asigna las lecturas que mapean a varias secuencias de referencia solamente a la más expresada. Los valores RPM se obtuvieron dividiendo el recuento de lecturas de un miRNA por el número total de lecturas asignadas a la biblioteca de miRNA. Finalmente, los miRNAs posiblemente regulados en función del tiempo de alimentación se definieron como: a) al menos una diferencia de un factor dos entre los valores de expresión a las 12h y 36h; Y b) un valor de RPM a las 24 horas situado en medio. [0053] De los sesenta y siete miRNAs diferentes (secuencias únicas del miRNA guía) detectados, los 20 miRNAs más expresados en SG y saliva fueron seleccionados para la presentación de la estructura secundaria. Predicción de dianas de los miRNAs de la garrapata y análisis funcional "in silico"

[0054] Para predecir los genes del huésped regulados por los miRNAs de la garrapata, se utilizaba TargetSpy (Sturm.M., Hackenberg.M., Langenberger.D. and Frishman.D. (2010) TargetSpy: a supervised machine learning approach for microRNA target prediction. BMC Bioinformatics, 11 , 292), MIRANDA (John.B., Enright.A.J., Aravin.A., Tuschl.T., Sander.C. and Marks.D.S. (2004) Human MicroRNA targets. PLoS Biol, 2, e363), y PITA (Kertesz.M., lovino.N., Unnerstall.U., Gaul.U. and Segal, E. (2007) The role of site accessibility in microRNA target recognition. Nat Genet, 39, 1278-1284) implementados en el programa miRNAconsTarget de la colección sRNAtoolbox (Rueda.A., Barturen.G., Lebrón, R., Gómez- Martín, C, Alganza.Á. , Oliver.J.L. and Hackenberg.M. (2015) sRNAtoolbox: an integrated collection of small RNA research tools. Nucleic Acids Res, 43, W467-73).

Para los siguientes análisis sólo se emplearon interacciones entre ARNm y miRNA predichas por todos (los tres) programas. La predicción de las dianas produce un alto número de falsos positivos pero información filogenética y efectos combinatorias pueden reducir este número (Min.H. and Yoon.S. (2010) Got target? Computational methods for microRNA target prediction and their extensión. Exp Mol Med, 42, 233-244). No se puede suponer que las dianas de los miRNA de la garrapata se encuentran conservadas en el huésped (debido a procesos adaptativos entre la garrapata y el huésped o "tick-host adaptations'), por lo que se aplicaron solamente los efectos combinatorios para mejorar la calidad de la predicción. Como resultado, se analizó el efecto de conjuntos compuestos por cuatro miRNAs, teniendo en cuenta solamente los transcritos regulados por al menos 3 de los 4 miRNAs. Los conjuntos de genes que cumplen con los requisitos enumerados arriba, fueron analizados funcionalmente mediante el servidor web STRING (Franceschini.A., Szklarczyk.D., Frankild.S., Kuhn.M., Simonovic.M., Roth.A., Lin.J., Minguez.P., Bork.P., Mering.C. von, et al. (2013) STRING v9.1 : protein-protein interaction networks, with increased coverage and integration. Nucleic Acids Res, 41 , D808-15). Para cumplir con el formato de entrada los nombres de los transcritos fueron convertidos primero a los nombres de la proteínas mediante la herramienta 'Retrieve/ID mapping' (UniProt consortium (Apweiler.R., Bairoch.A., Wu.C.H., Barker.W.C, Boeckmann.B., Ferro, S., Gasteiger.E., Huang.H., López, R., Magrane.M., et al. (2004) UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res, 32, D115-9)). Las redes de interacción entre los genes regulados y las rutas KEGG estadísticamente significativas fueron extraídas de la salida de STRING. [0055] Las interacciones identificadas y resultados de los análisis funcionales se muestran en las tablas siguientes:

A) Un conjunto de cuatro miRNAs (Tabla 1):

GATGACTGTGCCTCTAGTCCATG (iri-miR-279a-5p),

CTGGTTTTCACAATGATCGTCCAGA (iri-miR-bantam-5p),

GCTGTCAGTTTGTGGGCTGGTGC (iri-miR-X26-5p),

ACTCGACGTAGCGCCCGCACTC (iri-miR-X12-3p).

Conteo

de tasa de

genes falso

ID de la Descripción de observa descubrí proteínas coincidentes en la red vía la vía dos miento (labels)

Vía de Camk2d, Camk4, Frs2, Mapk10, Ntrk2, señalización de Pdpkl , Pik3ca, Pik3r1 , Sortl , Sos1 ,

4722 neurotrofinas 12 5.94E-07 Traf6, Ywhae

Vía de

señalización de Abl2, Camk2d, Ereg, Mapk10, Nrg3,

4012 ErbB 9 2.18E-05 Pik3ca, Pik3r1 , Prkca, Sos1

Vía de

señalización de Homer2, Mapk10, Pdpkl , Pik3ca,

4068 FoxO 9 0,000707 Pik3r1 , Prkaa2, Setd7, Smad2, Sos1

Arhgef12, Camk2d, Fgf12, Frs2,

Proteoglicanos Pdpkl , Pik3ca, Pik3r1 , Prkca, Smad2,

5205 en cáncer 1 1 0,000909 Sos1 , Timp3

Vía de

señalización de Mapk10, Pdpkl , Pik3ca, Pik3r1 , Prkca,

4664 Fe epsilon Rl 6 0,00258 Sos1

Aldosterone- regulated

sodium

4960 reabsorption 5 0,00258 Atp1 b4, Pdpkl , Pik3ca, Pik3r1 , Prkca

Cldnl , Cldn19, Mapk10, Pdpkl , Pik3ca,

5160 Hepatitis C 8 0,00258 Pik3r1 , Sos1 , Traf6

Vía de Atp1 b4, Ncoa2, Pdpkl , Pik3ca, Pik3r1 ,

4919 señalización de 7 0,00619 Prkca, Thrb hormonas

Tiroideas

Células no

pequeñas de

cáncer de

5223 pulmón 5 0,00619 Pdpkl , Pik3ca, Pik3r1 , Prkca, Sos1

5214 Glioma 5 0,00847 Camk2d, Pik3ca, Pik3r1 , Prkca, Sos1

Vía de

señalización de Abl2, Fgf12, Gng4, Kitl, Mapk10,

4014 Ras 9 0,00901 Pik3ca, Pik3r1 , Prkca, Sos1

Vía de

señalización de

4150 mTOR 5 0,00901 Pdpkl , Pik3ca, Pik3r1 , Prkaa2, Prkca

Vía de

señalización de Mapk10, Pdpkl , Pik3ca, Pik3r1 ,

4910 Insulina 7 0,00933 Prkaa2, Rhoq, Sos1

Señalización

adrenérgica en Atp1 b4, Atp2b2, Camk2d, Pik3ca,

4261 cardiomiocitos 7 0,0108 Pik3r1 , Prkca, Slc8a1

Vía de

señalización de Fgf12, Gng4, Itga4, Kitl, Pdpkl , Pik3ca,

4151 PI3K-Akt 11 0,0124 Pik3r1 , Prkaa2, Prkca, Sos1 , Ywhae

Sinapsis Camk2d, Camk4, Gng4, Pik3ca, Pik3r1 ,

4725 colinérgica 6 0,0144 Prkca

Vía de

señalización de Camk2d, Camk4, Mylk4, Pik3ca,

4921 Oxitocina 7 0,0149 Pik3r1 , Prkaa2, Prkca

Itga4, MapkIO, Mylk4, Pdpkl , Pik3ca,

4510 Adhesión focal 8 0,0166 Pik3r1 , Prkca, Sos1

Absorción

4978 Mineral 4 0,0166 Atp1b4, Slc31a1 , Slc8a1 , Steap2

Vía de

señalización de Atp1b4, Atp2b2, Mylk4, Pde5a, Pik3ca,

4022 cGMP-PKG 7 0,0187 Pik3r1 , Slc8a1 Migración

transendotelial Cldnl , Cldn19, Itga4, Pik3ca, Pik3r1 ,

4670 de leucocitos 6 0,0187 Prkca

Vía de

señalización de Camk2d, Map3k2, MapklO, Prkca,

4912 GnRH 5 0,0202 Sos1

Cáncer de

5213 endometrior 4 0,0202 Pdpkl , Pik3ca, Pik3r1 , Sos1

4710 Ritmo circadiano 3 0,0345 Clock, Prkaa2, Rorb

Vía de

señalización del

receptores tipo

tipo Toll (o 7b//- like receptor,

4620 TLRs) 5 0,0367 Mapkl O, Pik3ca, Pik3r1 , Tirap, Traf6

Vía de

señalización de Fgf12, Map3k2, MapklO, Ntrk2, Prkca,

4010 MAPK 8 0,0368 Sos1 , Taokl , Traf6

Enfermedad de

Chagas

(Tripanosomiasi

5142 s Americana) 5 0,0368 Mapkl O, Pik3ca, Pik3r1 , Smad2, Traf6

Cáncer

5210 Colorrectal 4 0,0368 Mapkl O, Pik3ca, Pik3r1 , Smad2

Cáncer de

5212 Páncreas 4 0,0369 Mapkl O, Pik3ca, Pik3r1 , Smad2

Vías de

señalización en Fgf12, Kitl, MapklO, Pik3ca, Pik3r1 ,

5200 cáncer 9 0,045 Prkca, Smad2, Sos1 , Traf6

Secreción de

4971 ácido gástrico 4 0,0465 Atp1 b4, Camk2d, Mylk4, Prkca

5145 Toxoplasmosis 5 0,0465 Mapkl O, Pdpkl , Pik3ca, Pik3r1 , Traf6

Regulación de

citoesqueleto de

actina (actin Arhgef12, Fgf12, Itga4, Mylk4, Pik3ca,

4810 cytoskeleton) 7 0,0475 Pik3r1 , Sos1 Vía de

señalización de

receptor de

4662 células B 4 0,048 Ifitml , Pik3ca, Pik3r1 , Sos1

fabla 1. Interacciones y resull tados del análisis funcional. Conjunto A.

B) Un conjunto de cuatro miRNAs (Tabla 2):

GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p),

CCAACCCACTAACTGACGGAAC (iri-miR-X1 h-3p),

CCCCCTTCGTCCACGTTCTAG (iri-miR-X17-5p),

CGGCTCTGGCGCTGGCCCCAGC (iri-miR-X8-3p)

C) Un conjunto de cuatro miRNAs (Tabla 3):

TAATCTCATTTGGTATCTCTGGG (iri-miR-5307-5p),

AAAAATTGTGGTAGTGTCAAGC (iri-miR-96-3p),

TAGGAACTTCATACCATGCTCG (iri-miR-276-3p),

TCTCACTACCTTGTCTTTGTTG (iri-miR-71-3p).

Conteo

de tasa de

genes falso

ID de la Descripción de observa descubr

vía la vía dos ¡miento proteínas coincidentes en la red (labels)

Potenciación a Adcyl , Braf, Cacnalc, Camk4, Grm5,

4720 largo plazo 7 0,0172 Itpr2, Prkcb Vía de Adcyl , Atp2b4, Cacnalc, Crebl , señalización de Gucy1a2, Irs1 , Itpr2, Pik3ca, Pik3r1 ,

4022 cGMP-PKG 10 0,0271 Slc8a1

Señalización de

endocannabinoi Adcyl , Cacnalc, Gabra4, Gabrb2, Grm5,

4723 des retrógrados 8 0,0271 Itpr2, Mapk10, Prkcb

Sinapsis Adcyl , Cacnalc, Camk4, Crebl , Itpr2,

4725 colinérgica 8 0,0271 Pik3ca, Pik3r1 , Prkcb

MicroARNs en Fzd3, Gis, Irs1 , Mdm4, Prkcb, Rdx,

5206 cáncer 9 0,0271 Slc7a1 , Tgfb2, Zeb2

Cáncer

5210 colorrectal 6 0,0271 Braf, Dcc, Mapk10, Pik3ca, Pik3r1 , Tgfb2

Vía de

señalización de Adcyl , Crebl , Esr1 , Itpr2, Pik3ca, Pik3r1 ,

4915 estrógenos 7 0,0322 Sp1

Vía de

señalización de Adcyl , Cacnalc, Camkld, Camk4,

4921 oxitocina 9 0,0322 Gucy1a2, Itpr2, Pik3ca, Pik3r1 , Prkcb

Proteoglicanos Braf, Cblb, Esr1 , Fzd3, Itpr2, Pik3ca,

5205 en cánver 11 0,0322 Pik3r1 , Prkcb, Rdx, Tgfb2, Wnt5a

Diabetes

4930 mellitus Tipo II 5 0,0343 Cacnalc, Irs1 , Mapk10, Pik3ca, Pik3r1

Vía de

señalización de Braf, Homer2, Irs1 , Mapk10, Pik3ca,

4068 FoxO 8 0,041 Pik3r1 , Rag1 , Tgfb2

fabla 3. Interacciones y resul tados del análisis funcional. Conjunto C.

D) Un conjunto de cuatro miRNAs (Tabla 4):

TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p),

TGAACACAGCTGGTGGTATATCAG (iri-miR-317-3p),

TGACTAGATCCACACTCATCCA (iri-miR-279a-3p),

TGAGATCATTGTGAAAGCTGATT (iri-miR-bantam-3p). tasa de

Conteo falso

ID de la Descripción de descubr proteínas coincidentes en la red vía de la vía genes ¡miento (labels) observa

dos

Adcyl , Gnaq, Gucy1a2, Map3k2, Prkacb, Prkca, Prkcb, Prkgl , Sos1 ,

4540 Unión Gap 10 0,00136 Tjp1

Vía de Adcyl , Gnaq, Map2k4, Map3k2, señalización de Mapk10, Mapk8, Prkacb, Prkca,

4912 GnRH 10 0,00136 Prkcb, Sos1

Vía de

señalización de

ErbB signaling Braf, Gsk3b, Map2k4, Mapk10,

4012 pathway 9 0,00435 Mapk8, Pik3ca, Prkca, Prkcb, Sos1

Vía de

señalización de

Fe epsilon Rl

signaling Map2k4, Mapk10, Mapk8, Pik3ca,

4664 pathway 8 0,00435 Prkca, Prkcb, Prkce, Sos1

Vía de Adcyl , Camkld, Camk4, Eef2k, señalización de Gnaq, Gucy1a2, Pik3ca, Prkacb,

4921 oxitocina 12 0,00435 Prkca, Prkcb, Rgs2, Rock2

Contracción del

músculo blando Adcyl , Braf, Gnaq, Gucy1a2, Prkacb,

4270 vacular 10 0,00808 Prkca, Prkcb, Prkce, Prkgl , Rock2

Potenciación a Adcyl , Braf, Camk4, Gnaq, Prkacb,

4720 largo plazo 7 0,00815 Prkca, Prkcb

Clock, Gnal, Gnaq, Gsk3b, Kif5c,

Sinapsis MapkIO, Mapk8, Prkacb, Prkca,

4728 dopaminérgica 10 0,00815 Prkcb

Cáncer Braf, Dcc, Gsk3b, MapkIO, Mapk8,

5210 colorrectal 7 0,00887 Pik3ca, Smad2

Regulación

mediada

mediante

inflamación de

los canales Adcyl , Gnaq, MapkIO, Mapk8,

4750 TRP 9 0,0155 Pik3ca, Prkacb, Prkca, Prkcb, Prkce Adcyl , Ednrb, Fzd3, Gnaq, Gsk3b,

4916 Melanogénesis 8 0,0155 Prkacb, Prkca, Prkcb

Secreción Adcyl , Gnaq, Gucy1a2, Prkacb,

4970 salivar 7 0,0155 Prkca, Prkcb, Prkgl

BCI2I11 , Dnmt3a, Fzd3, Igf2bp1 ,

MicroARNs en Mdm4, Prkca, Prkcb, Prkce, Pten,

5206 cáncer 10 0,0155 Sos1

Células no

pequeñas de Braf, Pik3ca, Prkca, Prkcb, Rxra,

5223 pulmón 6 0,0155 Sos1

Dcc, Gsk3b, Plxna2, Plxna4, Rock2,

4360 Guía axonal 9 0,0174 Sema3a, Sema5a, Unc5c, Unc5d

Braf, Cav2, Gsk3b, MapklO, Mapk8, Pik3ca, Prkca, Prkcb, Pten, Rock2,

4510 Adhesión focal 12 0,0174 Sos1 , Xiap

Señalización de

endocannabinoi Adcyl , Gabrb2, Gnaq, MapklO,

4723 des retrógrados 8 0,0174 Mapk8, Prkacb, Prkca, Prkcb

Depresión a Braf, Gnaq, Gucy1a2, Prkca, Prkcb,

4730 largo plazo 6 0,0174 Prkgl

Enfermedad de

Chagas

(Tripanosomias Adcyl , Gnal, Gnaq, Map2k4,

5142 is Americana) 8 0,0174 MapklO, Mapk8, Pik3ca, Smad2

Braf, Pik3ca, Prkca, Prkcb, Pten,

5214 Glioma 6 0,0174 Sos1

Vía de

señalización de Braf, Pik3ca, Prkca, Prkcb, Pten,

4150 mTOR 6 0,0198 Rictor

Vía de

señalización de BCI2I11 , Braf, Fbxo32, MapklO,

4068 FoxO 9 0,0207 Mapk8, Pik3ca, Pten, Smad2, Sos1

Maduración de

oocitos

mediada por Adcyl , Braf, MapklO, Mapk8, Pgr,

4914 progesterona 7 0,0211 Pik3ca, Prkacb Vía de Braf, Elk4, Map2k4, Map3k2, señalización de MapklO, Mapk8, Ntrk2, Prkacb,

4010 MAPK 13 0,0224 Prkca, Prkcb, Rasa2, Sos1 , Taokl

Vía de Adcyl , Ednrb, Gnaq, Gucy1a2, señalización de Pik3ca, Prkce, Prkgl , Rgs2, Rock2,

4022 cGMP-PKG 10 0,0227 Slc8a1

Sinapsis Adcyl , Gnaq, Prkacb, Prkca, Prkcb,

4724 Glutamatérgica 8 0,0227 Slc1a2, Slc38a1 , Slc38a2

Sinápsis Adcyl , Gabrb2, Prkacb, Prkca,

4727 GABAérgica 7 0,0227 Prkcb, Slc38a1 , Slc38a2

Vía de

señalización de Fzd3, Gsk3b, MapklO, Mapk8,

4310 Wnt 9 0,0231 Prkacb, Prkca, Prkcb, Rock2, Tbl1xr1

Vías de Braf, Dcc, Fzd3, Gsk3b, MapklO, señalización en Mapk8, Pik3ca, Prkca, Prkcb, Pten,

5200 cáncer 15 0,0231 Runxl , Rxra, Smad2, Sos1 , Xiap

Vía de

señalización de Braf, Camk4, Gsk3b, MapklO,

4722 neurotrofinas 8 0,0254 Mapk8, Ntrk2, Pik3ca, Sos1

Arrastre Adcyl , Gnaq, Gucy1a2, Prkacb,

4713 Circadiano 7 0,0262 Prkca, Prkcb, Prkgl

Adcyl , Elk4, Fzd3, Gsk3b, N2ra,

Infección por Map2k4, Mapk8, Myb, Pik3ca,

5166 HTLV-I 13 0,0279 Prkacb, Smad2, Trp53inp1 , Xiap

Vía de

señalización del Adcyl , Camk4, Ednrb, Gnal, Gnaq,

4020 Calcio 10 0,0294 Pdelc, Prkacb, Prkca, Prkcb, Slc8a1

Cáncer de

5213 endometrio 5 0,0307 Braf, Gsk3b, Pik3ca, Pten, Sos1

Vía de

señalización de Gsk3b, MapklO, Mapk8, Pik3ca, Prlr,

4917 prolactina 6 0,0318 Sos1

Reabsorción de

calicó regulada

por factores

endocrinos y

4961 otros factores 5 0,0402 Gnaq, Prkacb, Prkca, Prkcb, Slc8a1 Tabla 4. Interacciones y resultados del análisis funcional. Conjunto D.

E) Un conjunto de cuatro miRNAs (Tabla 5):

CATCTTACCAGACAGCATTAGA (iri-miR-8-5p),

TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p),

TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a-5p),

GCTGTTAGTTTGTAGGGTGGTG (iri-miR-X1 h-5p)

Conteo

de tasa de

genes falso

ID de la Descripción observa descubrí proteínas coincidentes en la red vía de la vía dos miento (labels)

Cxcl12, Pak3, Plxna4, Rgs3, Robo2, Sema3a, Sema3d, Sema5a, Srgap3,

4360 Guía axonal 1 1 0,0125 Unc5c, Unc5d

Sistema de

señalización

de Impadl , Inpp4b, Pik3ca, Pikfyve, Prkca,

4070 fosfatidilinositol 8 0,0129 Prkcb, Pten, Synjl

Potenciación a Adcyl , Braf, Camk4, Gnaq, Grm5,

4720 largo plazo 7 0,0129 Prkca, Prkcb

Depresión a Braf, Gna13, Gnaq, Gucy1a2, Prkca,

4730 largo plazo 7 0,0129 Prkcb, Prkgl

Adcyl , Gnaq, Grm5, Gucy1a2,

4540 Unión Gap 8 0,0148 Map3k2, Prkca, Prkcb, Prkgl

Sinapsis Adcyl , Bcl2, Camk4, Gnaq, Kcnj2,

4725 colinérgica 9 0,0148 Kcnj3, Pik3ca, Prkca, Prkcb

Arrastre Adcyl , Gnaq, Gria4, Gucy1 a2, Kcnj3,

4713 Circadiano 8 0,0194 Prkca, Prkcb, Prkgl

Sñalización de

endocannabini

odes Adcyl , Gabrb2, Gnaq, Gria4, Grm5,

4723 retrógrados 8 0,0313 Kcnj3, Prkca, Prkcb

Metabolismo

del Inositol Impadl , Inpp4b, Pik3ca, Pikfyve, Pten,

562 fosfato 6 0,0366 Synjl Vía de

señalización Abl2, Braf, Crk, Pak3, Pik3ca, Prkca,

4012 de ErbB 7 0,0366 Prkcb

Sinapsis Adcyl , Gnaq, Gria4, Grm5, Kcnj3,

4724 glutamatérgica 8 0,0442 Prkca, Prkcb, Slc38a1

Vía de

señalización Bcl2, Cxcl12, Ikbkg, Map3k7, Prkcb,

4064 de NF-kappa B 7 0,0456 Tab3, Xiap

fabla 5. Interacciones y resultados de análisis funcional. Conjunto E.

F) Un conjunto de cuatro miRNAs (Tabla 6):

TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA (iri-miR-9a-5p),

TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG (iri-miR-1-3p),

AGATATGTTTGATATTCTTGGTT (iri-miR-190-5p),

TTGTGACCGTTACAATGGGCAT (iri-mi R-2001 -5p) .

Ensayos con Mimics

Como la función de los microRNAs es el silenciamiento génico, se ha propuesto como hipótesis que los miRNAs presentes en la saliva de Ixodes ricinus podrían ser buenos candidatos para frenar la proliferación celular en cáncer, al ser utilizados frente a oncogenes. Se han empleado una combinación de los siguientes oligonucleótidos:

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC (iri-miR-8-3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TGAACACAGCTGGTGGTATATCAG (iri-miR-317- 3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TGACTAGATCCACACTCATCCA (iri-miR-279a- 3p),

- un oligonucleótido que tiene la secuencia TGAGATCATTGTGAAAGCTGATT (iri-miR- bantam-3p). BRAF es un proto-oncogen cuya expresión está relacionada con procesos de proliferación celular. Mutaciones en este gen están relacionados con distintos tipos de cáncer como melanoma, cáncer colorrectal, entre otros. Como los 4 miRNAs seleccionados (Figura 1) presentan dianas frente a la 3'-UTR de BRAF, hemos considerado que este gen podría ser un excelente candidato para probar la efectividad de estos microRNAs exógenos, comprobando si son capaces de reducir la expresión génica de BRAF y, por tanto, reducir la proliferación celular generada por la mutación que origina al oncogen.

Para lograrlo, hemos empleado miRNA Mimics (Creative Biogene), novedosas moléculas sintetizadas in vitro que son capaces de imitar el comportamiento de microRNAs maduros. Cuando son transfectados en el interior de las células, éstos pueden unirse específicamente a la región 3'-UTR del gen diana inhibiendo su traducción.

Para comprobar su eficacia hemos empleado una línea celular de melanoma, A-375, caracterizada por una mutación en BRAF (V600E). Para introducir nuestros microRNA mimics hemos utilizado Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent (ThermoFisher Scientific) siguiendo las indicaciones del fabricante empleando el esquema ilustrado en la figura 2.

Transcurridas 48 H tras la transfeccion, hemos analizado el fenotipo celular y el posible efecto citotóxico por microscopía óptica (Figura 3)

Como se muestra en la Figura 3, el miR-8-3p y el miR-279a-3p generan un efecto notable en la población celular (Figura 3 A y B, respectivamente), ejerciendo una reducción de la proliferación en comparación con los controles (C-E).

A continuación, las células fueron lisadas y se realizó una extracción de la proteína para realizar un Western Blot. Nuestro objetivo principal era comprobar si los Mimics habían sido capaces de modificar los niveles de expresión de B-Raf.

En los ensayos realizados (Figura 4) miR-8-3p y miR-279a-3p muestran (Figura 4) el efecto más interesante, siendo excelentes candidatos para ser empleados frente a la 3'-UTR de BRAF y poder reducir así su expresión. Por tanto, el empleo de estos miRNAs exógenos podría ser una novedosa aproximación para tratar estos tipos de cáncer generados por mutaciones en BRAF. Sin embargo, miR-bantam-3p parece mostrar un efecto antagónico al incrementar los niveles proteicos de B-Raf (quizás porque presente dianas sobre genes inhibidores de B-Raf), además, esta podría ser la razón por la cual la mezcla de Mimics presente mayores niveles proteicos de B-Raf que las células no transfectadas. Estos datos han sido cuantificados por densitometría de bandas empleando el software informático libre ImageJ.