Titre de 1’invention : COMPOSITION ET PROCÉDÉ D’AMPLIFICATION DE SÉQUENCES D’ACIDES NUCLÉIQUES [0001] L’invention se rapporte à une composition d’amplification de séquences d’acides nucléiques, ainsi qu’à un procédé d’amplification de séquences d’acides nucléiques qui utilise cette composition. L’invention vise aussi un dispositif spécialement conçu pour l’utilisation de la composition.

[0002] Plus généralement, le domaine de l’invention est celui de la détection de séquences d’acides nucléiques par réaction d’amplification, tel que la PCR ou tout autre procédé d’amplification in vitro, dans un milieu à diffusion maîtrisée compatible avec de tels procédés.

[0003] En biologie moléculaire, il est régulièrement nécessaire d’identifier avec un grand niveau de précision et de confiance la présence d’une ou de plusieurs séquences nucléiques d’intérêt (ou séquences nucléiques cibles) dans un échantillon. Il est ainsi possible de mesurer la concentration relative ou absolue de ces séquences d’intérêt.

[0004] À titre d’exemple, les séquences cibles peuvent être des séquences en ADN telles que des fragments de gènes présents de façon spécifique dans le génome d’agents pathogènes pour l’homme ou l’animal. Les séquences cibles permettent par conséquent d’identifier l’agent pathogène qui les porte, ou de caractériser leur pouvoir pathogène ou leur capacité de résistance à un ou plusieurs antibiotiques ou une ou plusieurs molécules antivirales. Les séquences cibles peuvent aussi bien être des séquences en ADN situées en dehors des gènes, telles que des télomères, des transposons ou rétro- transposons notamment. Certaines des séquences cibles peuvent se distinguer les unes des autres par une ou plusieurs mutations ponctuelles, c’est-à-dire un changement d’une base par une autre (« single nucleotide polymorphism » en anglais), ou encore l’ajout ou la délétion d’une base ou de plusieurs bases. Les séquences cibles peuvent aussi être en ARN, comme par exemple des transcrits de gènes, des micro- ARN, des ARN non traduits ou encore des ARN viraux provenant de virus à ARN et des transcrits de rétrotransposons. Dans certaines situations, les séquences cibles sont des séquences en ADN artificielles utilisées comme code-barres ou « tag ». C’est notamment le cas de séquences attachées de façon covalente à des anticorps utilisés dans des procédés appelés immuno-PCR, ou encore de séquences intégrées dans des sondes cadenas (« padlock probes » en anglais).

[0005] Les séquences nucléiques cibles peuvent se trouver dans des états différents au sein de l’échantillon. Ainsi, les séquences peuvent être libres dans l’échantillon, éventuellement après une étape de traitement de cet échantillon, ou incluses dans des particules biologiques telles que des virus, des cellules procaryotes ou eucaryotes, ou des organelles de ces dernières telles que des mitochondries. Dans ce cas, ces séquences nucléiques sont généralement choisies de sorte à ce qu’elles permettent d’identifier les particules biologiques, ou d’en caractériser un génotype ou une propriété particulière.

[0006] Indépendamment de l’état des séquences, lorsqu’elles sont présentes en une quantité trop faible pour être caractérisées directement, un procédé couramment utilisé pour les détecter consiste à réaliser une amplification in vitro de ces séquences afin d’en obtenir une quantité suffisante pour permettre leur caractérisation. Cette amplification est réalisée à l’aide d’un mélange d’amorces oligonucléotidiques localisées dans les séquences cibles. L’ajout d’une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques conjuguées à un fluorophore permet classiquement de caractériser la présence ou l'absence des séquences cibles ainsi que leur quantité.

[0007] Un procédé d’amplification bien connu est celui de la réaction en chaîne par polymérase dit PCR (« Polymerase Chain Reaction » en anglais). La PCR est un procédé d’amplification exponentielle in vitro. Il s’agit du procédé d’amplification le plus couramment utilisé actuellement. Outre la PCR, il existe d’autres procédés alternatifs tels que le procédé LCR (« Ligation Chain Reaction » en anglais), le procédé NASBA (« Nucleic Acid Sequence-Based Amplification » en anglais), le procédé TMA (« T ranscription Mediated Amplification »), la LAMP (« Loop-Mediated Isothermal A mplification » en anglais), la SDA (« Strand Displacement Amplification » en anglais) et l’amplification en cercle roulant dite RCA (« Rolling Circle Amplification » en anglais).

[0008] La PCR et les autres réactions d’amplification in vitro sont habituellement réalisées dans un milieu de réaction liquide contenant les différents réactifs. Il s’agit typiquement d’amorces, de sondes fluorescentes spécifiques des séquences cibles, des enzymes pour l'amplification des acides nucléiques, optionnellement des additifs, et du ou des échantillons à analyser comportant la ou les séquences cibles. Pendant la réaction d’amplification, les réactifs ainsi que les produits issus de la réaction, appelés amplicons, diffusent librement dans le volume liquide du milieu de réaction. Cette diffusion libre dans le milieu réactionnel liquide est à l’origine de plusieurs inconvénients qui sont rédhibitoires pour certaines applications.

[0009] En effet, dans certaines applications, les séquences cibles sont présentes en faible quantité dans les échantillons (1 à 10 molécules par exemple). Il faut donc prévoir un mode opératoire pour assurer une détection de très grande sensibilité. C’est notamment le cas du diagnostic in vitro de séquences nucléiques particulières dans une prise de sang d’une personne, qui peuvent par exemple indiquer la présence d’une septicémie, d’une tumeur, ou encore d’une maladie génétique dans un fœtus (détection dans une biopsie dite liquide). Même si les procédés d’amplification peuvent avoir la capacité théorique de détecter une seule molécule d’une séquence cible, dans la pratique, la diffusion des amplicons dans le mélange réactionnel a pour effet de retarder le moment de la réaction où l’intensité du signal émis par les amplicons et mesuré par le détecteur du dispositif employé dépasse localement le niveau du bruit de fond du détecteur. Ce retard peut être tel que les amplicons ne sont finalement pas détectés au cours de la réaction, conduisant à un résultat faux négatif.

[0010] La libre diffusion pose aussi un problème dans les applications nécessitant la détection d’une pluralité de séquences cibles dans un même mélange réactionnel. C’est notamment le cas dans les applications liées au diagnostic des maladies infectieuses pour lequel il est primordial d’identifier simultanément le ou les agents pathogènes impliqués, mais aussi leur génotype de résistance à des molécules antibiotiques ou antivirales. Alors qu’une solution pour répondre à cette exigence peut consister à réaliser la détection de chaque séquence d’intérêt dans un test monoplex, il apparaît que cette solution est contraignante et qu’il peut notamment être souhaitable de réaliser la détection de toutes les séquences d’intérêt dans une réaction unique. Les raisons peuvent être l’urgence, la petite taille de l’échantillon, la faible concentration des séquences cibles dans l’échantillon, ou encore le coût du test (réactifs, consommables, taux d’occupation de l’automate, etc.). Or, la libre diffusion des amplicons issus de la séquence cible majoritairement présente dans l’échantillon a pour effet d’interférer avec l’amplification des autres séquences cibles minoritaires dans cet échantillon. Ceci notamment en raison de la compétition pour les réactifs nécessaires à la réaction d’amplification. Il existe ainsi un risque permanent qu’une ou plusieurs séquences cibles minoritaires ne soient pas détectées dans l’échantillon.

[0011] Dans d’autres applications il est nécessaire de mesurer la quantité de séquence(s) cibles présentes dans un échantillon. Il existe ainsi un besoin de quantification précise ou de mesure d’une distribution. Plus particulièrement, il faut parfois assurer que la présence d’une séquence cible présente en grande quantité dans un échantillon n’interfère pas avec la mesure de la concentration d’autres séquences cibles présentes en moins grande quantité (par exemple 10, 100, ou 1000 fois moins abondantes). Une telle mesure est impossible lorsque les séquences cibles et leurs amplicons diffusent librement dans le mélange réactionnel.

[0012] Pour palier certains problèmes cités ci-dessus, l’état de la technique propose des approches différentes.

[0013] Notamment, il existe l’approche d’une amplification PCR in situ. Cette approche est utile lorsque les séquences cibles sont incluses dans une cellule. La PCR in situ comporte ainsi une étape d’amplification d’ADN ou d’ARN locale afin d’améliorer les performances de sensibilité et de spécificité de l’hybridation. Dans cette technique l’amplification peut être réalisée en solution. Pour cela il faut fixer la ou les cellules, et les rendre perméables de sorte à permettre aux réactifs de la PCR d’entrer dans la cellule. L’amplification peut aussi être réalisée sur des coupes histologiques fixées dans le formol (US5364790, US5538871 et US5804383). L’inconvénient principal est lié à la perméabilisation des cellules pour faire pénétrer les réactifs dans celles-ci. Cette perméabilisation permet aux amplicons de diffuser. Cela rend inapplicable les méthodes de caractérisation des produits amplifiés en phase liquide. Il faut donc manipuler l’échantillon après l’amplification pour réaliser l’étape de détection des amplicons fixés dans les cellules. Cela rallonge la durée et augmente la complexité de la réaction et de son analyse. En outre il s’agit d’une opération coûteuse dont les risques de contamination croisée sont accrus. Pour ces raisons, la PCR in situ n’a notamment pas permis de satisfaire les besoins de génotypage multiple (Uhlmann et al, 1998).

[0014] Une autre approche est un procédé appelé amplification digitale ou PCR digitale. Dans ce procédé, le mélange réactionnel est divisé en un grand nombre de compartiments distincts de petit volume (par exemple de l’ordre du picolitre). Les compartiments sont choisis de sorte que chaque compartiment ne contienne qu’au plus une molécule de la séquence cible. Cette compartimentation physique peut être obtenue par exemple par la production d’une émulsion de gouttelettes de mélange réactionnel dans un liquide huileux grâce à un système microfluidique. Elle peut aussi être obtenue par remplissage d’un dispositif microfluidique constitué d’un grand nombre d’alvéoles de petit volume. Quel que soit le moyen par lequel elle est obtenue, cette compartimentation permet la réalisation d’un grand nombre de réactions d’amplification complètement distinctes, sans passage de mélange réactionnel d’un compartiment à un autre. Les compartiments dans lequel une réaction d’amplification est obtenue sont détectés et dénombrés. Ce dénombrement permet de réaliser une quantification précise du nombre de molécules de séquences cibles présentes dans l’échantillon. La PCR digitale permet ainsi de quantifier la présence de quelques séquences cibles en une seule réaction [Sensors (Basel) 2018, 18(4), 1271; J. Med. Virol. 2021, 93(7), 4182-4197], Cependant, la réalisation d’une réaction de PCR digitale nécessite un équipement complexe et coûteux. En particulier la compartimentation du mélange réactionnel demande des manipulations complexes. De plus, la PCR digitale ne permet pas de conserver les avantages de la PCR dite en temps réel (avec la mesure d’un Ct notamment).

[0015] Une approche prometteuse est de réaliser une PCR dans une matrice de gel et de mesurer des produits de PCR générés à chaque cycle. La PCR peut être effectuée à l'intérieur d’un gel de polyacrylamide (PAM) (Anal. Biochem. 2006, 356, 300-302) ou d’un dérivé du PEG. Ainsi, la réaction génère des colonies moléculaires distinctes que l’on appelle parfois « polonies » (P. Blainey et al. US10487354 ; Huang et al. US2019/0202268 ; Huang et al. US2019/0202268; G. M. Church et al. US6485944 ; A. B. Chetverin et al. EP1999268 ; A. B. Chetverin et al. US6001568). Les principaux avantages de ces matrices sont les suivants : i) avec une taille de maille appropriée, elles retardent la diffusion des molécules linéaires de sorte que les molécules cibles et leurs produits d'amplification restent localisés à proximité immédiate ; ii) le nombre de polonies formées est proportionnel au nombre de molécules cibles initialement présentes dans l’échantillon, ce qui facilite la quantification de manière similaire à la PCR digitale ; et iii) il est possible de fixer au moins une des amorces au gel par liaison covalente. Toutefois, un inconvénient important des gels de l'état de la technique est leur incompatibilité avec des applications en dehors du laboratoire. Par exemple, les techniques de l’état de l’art sont inadaptées pour les applications de diagnostic rapide. Ceci notamment en raison du processus de gélification qui n’est contrôlable ni spatialement ni temporellement. De plus, dans le cas des gels de PAM, les molécules cibles et les réactifs d'amplification doivent être incorporés dans le gel déjà formé après avoir été rincé avec un tampon pour en extraire les monomères d'acrylamide non polymérisés en raison de leur effet inhibiteur élevé sur la réaction d'amplification par PCR.

[0016] La présente invention vient améliorer la situation.

[0017] Ainsi, l’invention vise une composition de mélange maître pour l’amplification de séquences d’acides nucléiques, destinée à être mélangée à un échantillon biologique contenant une ou plusieurs séquences d’acides nucléiques cibles et à des amorces spécifiques de la ou des séquences d’acides nucléiques cibles, ainsi que des sondes fluorescentes pour révéler une amplification de la ou des séquences d’acides nucléiques cibles, la composition comprenant des réactifs et des enzymes d’amplification d’acides nucléiques, caractérisé en ce que la composition comprend en outre un réactif poly- mérisable, lequel polymérise sous l’influence d’une stimulation choisie parmi une stimulation thermique et une stimulation lumineuse, de sorte à former un hydrogel encapsulant localement chaque séquence d’acides nucléiques cible lorsque ladite composition est exposée à ladite stimulation.

[0018] L’invention permet ainsi de réaliser des réactions d’amplification de séquences d’acides nucléiques dans un milieu dont la diffusion des constituants est maîtrisée. Ainsi, l’invention permet d’encapsuler localement la ou les séquences cibles d’acides nucléiques. Il s’ensuit un grand nombre d’avantages liés notamment à la détection des acides nucléiques et/ou au contrôle localisé des réactions d’amplification.

[0019] Dans un mode de réalisation, le réactif polymérisable est un réactif photosensible qui polymérise lorsqu’il est exposé à une lumière, de préférence ultraviolette. Cela permet de contrôler avec précision l’initiation de la polymérisation contrôlée de la corn- position de 1’invention.

[0020] Le réactif polymérisable peut également être un réactif thermosensible qui po- lymérise lorsqu’il est exposé à une température au-delà d’une température seuil. Un avantage de ce mode de réalisation est que l’on peut directement utiliser les domaines de températures utilisés dans les procédés d’amplification d’acides nucléiques, isothermes ou non.

[0021] De préférence, le réactif polymérisable comporte des chaines déjà polymérisées, avantageusement, dont uniquement la fonction terminale est réactive pour contrôler plus facilement la taille des pores du gel. Ces chaines déjà polymérisées peuvent être choisies parmi les polymères hydrosolubles non ou faiblement inhibiteurs de la PCR (par exemple PEG, PAM, biopolymères, etc...).

[0022] De manière générale, le réactif polymérisable peut être un poly(éthylene glycol) à bras multiples (ou PEG à bras multiples, ou multi-arm PEG en langue anglaise).

[0023] Plus généralement encore, le réactif polymérisable est avantageusement prépo- lymérisé et/ou hydrosoluble et inerte biologiquement (de sorte à ne pas interférer avec la réaction d’amplification) et/ou apte à polymériser (avec une fonction activable ou de par sa nature radicalaire par exemple).

[0024] Ainsi dans un mode de réalisation particulier, le réactif polymérisable est choisi parmi la classe des PEG à bras multiples (multi-arm PEG) et leurs dérivés.

[0025] Le réactif polymérisable peut être choisi parmi le 4-Arm-PEG-SH, le 4-Arm-PEG-norbomene, le 2-Arm-PEG-SH, le 8-Arm-PEG-norbornene (tripentaerythritol), le nitrocinnamate-based 8-Arm-PEG ou un mélange de ceux-ci. Il s’agit de réactifs photosensibles polymérisable par lumière de longueur d’onde choisie et contribuent ainsi à la précision de la polymérisation contrôlée de la composition de l’invention.

[0026] Avantageusement, le réactif polymérisable photosensible est un mélange de 2 Arm- PEG-Thiol et de 8 Arm-PEG-norbornene ou de 4 Arm-PEG-Thiol et de 4 Arm- PEG-norbornene en présence du photoinitiateur lithium phenyl- 2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP).

[0027] Le réactif polymérisable peut être le 4 Arm-PEG-acrylate. Il s’agit d’un réactif qui polymérise en présence d’un thermoinitiateur lorsque celui-ci est exposé à une température donnée .

[0028] Avantageusement, le réactif polymérisable thermosensible est un mélange de 4 Arm- PEG- Acrylate en présence du thermoinitiateur 2,2’-azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride.

[0029] Plus généralement, le réactif polymérisable photosensible peut être choisi parmi les polymères hydrosolubles porteurs de fonctions insaturés (norbomene, nitro- cinnamate...) ou non (thiols) ou un mélange de ceux-ci. Il s’agit de réactifs capables de former des espèces intermédiaires réactives, de préférence des radicaux ou des ions- radicaux, en présence, le cas échéant, d’un activateur (le polymère lui-même ou un photoinitiateur), par application d’une lumière de longueur d’onde comprise entre 200 et 800nm, de préférence entre 300 et 450nm.

[0030] En outre, le réactif polymérisable thermosensible peut être choisi parmi les polymères hydrosolubles porteurs de fonctions alcène (acrylate, acrylamide...) ou un mélange de fonctions insaturées activées (anhydride maléique, maléimide...) avec des 1,3-diènes conjugués (furane, thiophène...). Il s’agit de réactifs capables de former des espèces intermédiaires réactives, de préférence des radicaux ou des ions-radicaux, ou participer dans des réactions de cycloaddition par application d’une température seuil comprise entre 30 et 95°C, de préférence entre 50 et 80°C.

[0031] Dans un mode de réalisation, le réactif polymérisable est présent en une teneur de 2% à 25%, de préférence de 5% à 15%, en poids par unité de volume (p/V%).

[0032] Dans un mode de réalisation, la composition comprend en outre un agent initiateur de polymérisation. Il peut s’agir d’un photoinitiateur ou d’un thermoinitiateur. L’agent initiateur est présent en une teneur de 0,02% à environ 0,1% en poids par unité de volume (p/V). De préférence le photoinitiateur est le lithium phenyl- 2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), et le thermoinitiateur est le 2,2’-azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride. L’agent permet de faciliter l’initiation de la polymérisation et contribue ainsi à la polymérisation contrôlée de la composition de l’invention.

[0033] En outre, la composition peut comporter ab inito un révélateur de la présence de séquences d’acides nucléiques, de préférence fluorescent. Le révélateur peut être un intercalant fluorescent de l’acide nucléique ou une sonde fluorescente spécifique d’une séquence combinée avec un quencher de fluorescence. Le révélateur offre une meilleure détection des acides nucléiques amplifiés au cours, ou en fin, de la réaction d’amplification.

[0034] La composition peut en outre comporter ab inito des amorces spécifiques à la ou aux séquences d'acides nucléiques cibles. Ceci permet notamment de préparer des mélanges maîtres spécialement conçus pour identifier un pathogène connu. Dans ce mode de réalisation il est en outre avantageux d’inclure directement dans la composition le ou les sondes spécifiques pour révéler la présence des séquences d’acides nucléiques cibles amplifiées.

[0035] Dans un mode préféré de l’invention, la composition de l’invention demeure liquide avant l’application de ladite stimulation pendant une durée comprise entre plusieurs heures et plusieurs mois, de préférence entre plusieurs jours et plusieurs mois, et ladite composition forme l’hydrogel après l’application de ladite stimulation dans un temps inférieur ou égal à 10 minutes, de préférence inférieur ou égal à 1 minute. [0036] Bien évidemment la composition est stable dans le temps, c’est-à-dire durant toute la durée dans laquelle la composition demeure liquide (ou très peu visqueux) et au-delà, de sorte à fonctionner en tant que composition d’amplification de séquences d’acides nucléiques. On entend par stable notamment le fait que les réactifs ne se dégradent pas (ou quasiment pas) dans des conditions de stockage normales (par exemple au réfrigérateur, à température ambiante, à l’abri de la lumière etc.).

[0037] L’invention vise également un procédé d’amplification de séquences d’acides nucléiques comprenant les étapes suivantes :(i) la mise à disposition de la composition de l’invention ; (ii) le mélange de ladite composition avec un échantillon biologique à analyser (iii) l’application d’une stimulation choisie parmi une stimulation thermique et une stimulation lumineuse de sorte à polymériser le mélange de l’étape (ii) pour obtenir un hydrogel ; (iv) exposer l’hydrogel à une réaction d’amplification de séquences d’acides.

[0038] L’étape (ii) peut comporter le mélange de la composition à des amorces spécifiques à la ou aux séquences d'acides nucléiques cibles et/ou à des sondes spécifiques pour révéler la présence des séquences d’acides nucléiques cibles amplifiées.

[0039] Dans un mode de réalisation l’étape (i) de mise à disposition est maintenue pendant une durée comprise entre plusieurs heures (par exemple 1 à 5 heures) et plusieurs mois (par exemple 1 à 18 mois), de préférence comprise entre plusieurs jours (1 à 15 jours) et plusieurs mois (2 à 6 mois).

[0040] Un point clé du procédé de l’invention est que la polymérisation à l’étape (ii) n’est engagée qu’ après l’application d’un stimulus lumineux ou thermique. Ainsi, le stimulus lumineux peut consister en l’application d’une lumière de longueur d’onde comprise entre 200 nm et 800 nm, de préférence entre 300 nm et 450 nm ; et le stimulus thermique peut consister en l’application d’une température seuil comprise entre 30°C et 95°C, de préférence entre 50°C et 80°C pendant une durée de moins de 10 min.

[0041] Avantageusement, le temps entre la mise à disposition de la composition et l’application du stimulus est supérieur à Ih, de préférence supérieure à 1 mois, ce qui évite de préparer la composition juste avant son utilisation.

[0042] En d’autres termes, la composition de l’invention est stockable pendant une période supérieure à 1 mois et qui peut atteindre jusqu’à six mois et au-delà.

[0043] Plus encore, chaque étape du procédé peut être caractérisée par une durée : (t ₀ ) de stockage de la composition contenant le(s) polymère(s) et les réactifs d’amplification, pouvant aller jusqu'à plusieurs mois en fonction de sa composition et des conditions de stockage; (ti) de manipulation de la même composition une fois déstockée, et mis en présence de la cible sans gélification dans les conditions ambiantes, pouvant aller jusqu’à plusieurs heures ; et (t ₂ ) de gélification après l’application d’un stimulus (lumière ou température), étant inférieur à 10 minutes.

[0044] Autrement dit, la composition comportant l’agent polymérisable est stable pendant une période très longue allant jusqu’ à plusieurs mois. Ceci est très avantageux pour des conditions de stockage. La composition peut ensuite être mélangée à la séquence cible, et ce sans que le processus de polymérisation transforme la solution en gel directement. En pratique, la gélification avance très lentement et la formation d’un gel ne s’observe qu’après plusieurs heures. Il s’ensuit un autre grand avantage qui est qu’il n'y a pas besoin de précipiter les manipulations en laboratoire. En particulier, cela permet notamment de préparer plusieurs échantillons en parallèle. On peut ainsi lancer la polymérisation de plusieurs échantillons en parallèle dans une même opération de stimulus. La gélification de l’ensemble des échantillons ne dure que quelques minutes. Il s’ensuit que le processus d’amplification des séquences cibles peut alors être débuté pour l’ensemble des échantillons en parallèle. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l’hydrogel est obtenu en un temps inférieur ou égal à 10 minutes, de préférence inférieur ou égal à 1 minute après l’application de la stimulation du procédé de l’invention.

[0045] L’hydrogel formé par la composition de l’invention encapsule les réactifs d’amplification ainsi que la ou les séquences cibles d’acides nucléiques. Il s’ensuit que des réactions d’amplification de séquences d’acides nucléiques sont conduites localement à des endroits distincts du gel. Les produits de l’amplification restent encapsulés dans l’hydrogel. En d’autres termes, aussi bien la diffusion des constituants de la composition, ainsi que la diffusion des produits de la réaction d’amplification sont maîtrisées. Il s’ensuit un grand nombre d’avantages liés notamment à l’analyse et la détection des acides nucléiques.

[0046] Dans un mode de réalisation, la réaction d’amplification est une réaction en chaine par polymérase.

[0047] Dans un mode de réalisation de l’invention, la polymérisation est initiée par une exposition de la composition à une lumière ultraviolette (lorsque l’agent polymérisable est photosensible) ou une température seuil (lorsque l’agent polymérisable est thermosensible). Cette polymérisation peut être liée à une réaction choisie parmi le groupe constitué d’une réaction bio-orthogonale thiol-ène et une réaction de dimérisation.

[0048] D’autres avantages et caractéristiques de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après et sur les dessins annexés sur lesquels :

[0049] [Fig.1] montre une figure de principe de l’invention ;

[0050] [Fig.2] montre des photographies d’hydrogels formés par la composition de l’invention avec un agent photosensible ayant des concentrations initiales de séquences cibles différentes, ainsi qu’un graphique correspondant aux données PCR d’un premier exemple de réalisation de l’invention ; [0051] [Fig.3] montre deux photographies d’un hydrogel formé par la composition de l’invention du premier exemple de réalisation ; et

[0052] [Fig.4] montre des photographies d’hydrogels formés par des modes de réalisations différents de la composition selon l’invention ayant une concentration initiale de séquences cibles identique (10 ³ copies).

[0053] Les figures, tableaux et la description ci-après contiennent, pour l’essentiel, des éléments de caractère certain. Les figures et tableaux font partie intégrante de la description, et pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.

[0054] D’une manière générale, la présente invention concerne des compositions comportant un agent polymérisable. Les compositions sont biocompatibles et présentent une faible viscosité à une température ambiante. Ainsi, les compositions de l’invention permettent de mélanger à température ambiante des molécules cibles ou des cellules cibles à des réactifs d'amplification de séquences nucléotidiques. Ceci présente l’avantage que les manipulations par les opérateurs de laboratoires sont réalisables de manière habituelle. Les compositions de l’invention ont la particularité d’être apte à former rapidement un hydrogel à réseau homogène au moyen de l’agent polymérisable. L’agent polymérisable déclenche une polymérisation de la composition lorsqu’il est exposé à un facteur déclencheur, tel qu’un stimulus lumineux ou une température seuil. La composition de l’invention assure une sensibilité suffisante de la PCR, en particulier grâce à l’analyse d’images du gel. Lorsque la composition de l’invention se trouve dans un état de gel, elle peut alors être soumise à une réaction d’amplification d’acides nucléiques.

[0055] La composition de l'invention à l’état de gel présente une matrice capable de résister aux changements rapides de température généralement requis lors des réactions d’amplifications. En outre, la composition sous forme de gel conserve son l’intégrité structurelle sous l’effet des différentes contraintes physiques et/ou chimiques qui lui sont appliquées pendant les procédés d'amplification d’acides nucléiques.

[0056] Un objectif de l'invention est de réaliser des matrices de gel à structure homogène. Le gel présente des mailles appropriées qui limitent drastiquement, voire prohibent, la diffusion des molécules cibles et des produits d'amplification, tout en permettant une diffusion des réactifs d'amplifications pour réaliser la ou les réactions d’amplification d’acides nucléiques. Cet objectif est atteint par la revendication principale annexée à la présente description de l’invention.

[0057] Classiquement, les hydrogels sont des réseaux de polymères réticulés tridimensionnels (3D), capables d'absorber et de retenir de grandes quantités d'eau. En raison de leurs propriétés ajustables et de leurs méthodes de fabrication polyvalentes, les hydrogels sont utilisés dans une large gamme d'applications biomédicales et techniques. À titre d’exemple on peut citer l'ingénierie tissulaire et la médecine régé- nérative ou encore le traitement des eaux usées ou la robotique. Les hydrogels sont généralement formés à partir de monomères ou de chaînes de pré-polymères par des liaisons covalentes et/ou non-covalentes telles que les liaisons hydrogène, les interactions électrostatiques, les complexations dites hôte-invité (« host-guest » en anglais) et leurs combinaisons (W. Wang, R. Narain, H. Zeng. Polymer Science and Nanotechnology, Fundamentals and Applications, 2020, Pages 203-244).

[0058] L’état de la technique décrit des matrices de gel utilisées pour l'amplification des acides nucléiques. Ces matrices de gel sont formées dans des réactions de polymérisation selon deux mécanismes de base : la polymérisation en chaîne et la polymérisation par étapes.

[0059] La polymérisation en chaîne (« chain groth polymerization » en anglais) consiste à former un polymère à partir de molécules monomères insaturées (notamment acrylamide, méthacrylamide, acide acrylique, acide méthacrylique, bis-acrylamide, styrène, etc). Ce type de réaction nécessite une activation initiale de la ou des liaisons insaturées. En d’autres termes, il est nécessaire au préalable de former une espèce réactive (radical, cation). Par exemple, des particules radicalaires réactives peuvent être formées après activation de composés particuliers appelés initiateurs. L’activation des initiateurs peut être réalisée à partir de photons, d’un chauffage, d’un potentiel d'oxydoréduction ou d’une activité enzymatique. Le ou les initiateurs possèdent un centre radicalaire et ainsi la capacité de transférer facilement les radicaux aux molécules réactives. Les radicaux sont ainsi formés en cascade. En résumé, une fois l'initiateur ajouté et le stimulus appliqué le cas échéant, les radicaux commencent à être générés et la polymérisation est initiée. Au cours du processus de croissance du polymère il se forme une chaîne comportant des motifs de monomères. Des monomères sont ajoutés au fur et à mesure aux extrémités des chaînes des polymères. Le processus de polymérisation peut être interrompu, notamment en raison de l'atteinte d'un taux de conversion élevé, d'une recombinaison brutale de plusieurs chaînes différentes entre elles ou de la présence de composés inhibiteurs de radicaux libres dans le milieu réactionnel. L’oxygène est typiquement utilisé en tant qu'inhibiteur de radicaux. Par conséquent, il est préférable de procéder à un dégazage avant la polymérisation et/ ou d'appliquer des conditions inertes pendant celle-ci. Cela nécessite des manipulations complexes et fait intervenir un équipement de laboratoire conséquent, tels que des des- siccateurs, des réservoirs de gaz inerte ou une ligne de gaz inerte, des pompes, etc. En outre, la polymérisation en chaîne génère la formation de chaînes de différentes longueurs, ce qui engendre des irrégularités dans la matrice de gel. Les matrices de gel contiennent de plus des liaisons transversales hétérogènes et de poids moléculaire élevé, ce qui se traduit par un hydrogel constitué de mailles de tailles variables. La structure du gel est ainsi souvent incompatible avec des réactions d’amplifications d’acides nucléiques. D'autre part, les polymérisations radicalaires sont généralement rapides et de ce fait peu, voire pas, contrôlables.

[0060] La polymérisation par étapes implique différents types de réactions de monomères bifonctionnels ou multifonctionnels (pré-polymères). En particulier, la réaction de conjugaison de type Michael à base de thiol impliquant des dérivés du PEG est régulièrement utilisée dans ce type de polymérisation. Les groupes fonctionnels des monomères ou prépolymères sont par définition des sites réactifs et peuvent ainsi réagir directement les uns avec les autres. Contrairement à la polymérisation en chaîne, des dimères, trimères et tétramères sont formés au début de la polymérisation. Ensuite, ces oligomères se combinent entre eux pour former de longues chaînes de polymère. Les polymères formés par ce type de polymérisation ne possèdent généralement pas de liaisons transversales hétérogènes [Biomacromolecules 2012, 13(8), 2410-2417 ; J. Appl. Polym. Sci. 2015, 132, 8]. Cela garantit une certaine homogénéité des mailles. Pour cela les matrices de gels de ce type sont préférées pour des applications de PCR, comme la formation de polonies. La structure des gels est néanmoins très compacte ce qui est souvent incompatible avec des réactions d’amplifications d’acides nucléiques. De plus, la réaction de polymérisation par étapes peut se produire rapidement après mélange des réactifs. Il s’ensuit que certaines de ces réactions sont également très peu, voire pas, contrôlables.

[0061] Au-delà des propriétés incontrôlables des réactions de polymérisation et de la structure inadaptée des gels, il existe d’autres inconvénients dont certains sont abordés ci-dessous.

[0062] Les temps de réactions des processus de gélification connus de type décrits plus haut (copolymères d'acrylamide-bis-acrylamide et copolymères de PEG-acrylate/PEG-SH multi-bras) nécessitent souvent entre 10 et 30 minutes à température ambiante ou à des températures comprises entre 20 à 40°C pour former une structure polymère quasi complète [P. Blainey et al. (US 10487354) ; Huang et al. (US2019/0202268) ; G. M. Church et al. (US 6,485,944) ; A. B. Chetverin et al. (EP1999268) ; A. B. Chetverin et al. (US6001568)]. Cette durée diminue l'efficacité des réactifs d'amplification qui sont généralement sensibles à la température (enzymes, fluorophores, etc.). En outre, cette durée est inadaptée à toutes les applications où la rapidité du test est importante, comme, par exemple, les applications dites au chevet du patient (« Point-of-Care Testing » en anglais). Pour de telles applications, une durée de gélification de l'ordre d'une minute serait souhaitable.

[0063] Le début d’une réaction de polymérisation est incontrôlable dans les techniques de l’Art. En effet, dans le cas d'hydrogels PEG-acrylate-PEG-SH à croissance par étapes la réaction est engagée dès le mélange des composants, et dans le cas d'hydrogels acrylamide-bis-acrylamide à croissance en chaîne la réaction est engagée lors du mélange des composants avec des initiateurs de polymérisation (par exemple APS- TEMED). Cela complique les manipulations de l'utilisateur (il existe un besoin de rapidité notamment) et affecte la reproductibilité d'un protocole en raison de la forte probabilité de formation de défauts de la matrice du gel lors du processus de mélange puis d’injection dans la chambre réactionnelle.

[0064] Il est de plus, impossible d'automatiser les processus de polymérisation connus, car la manipulation avec des répliques de 100-1000 réactions et plus nécessite la préparation séparée de lots de 2-5 réactions maximum. Cela complique également l'utilisation de chambres d'amplification de différentes formes (cassettes, chambres de réaction étroites ou allongées, c'est-à-dire de type tige ou capillaire, spécialement pliées ou enroulées dans une cassette plane pour pouvoir être placées dans un cycleur PCR standard), ce qui limite leur nombre à celles qui peuvent être remplies rapidement. Plus particulièrement, dans les procédés d’amplification en gel connus, la viscosité des mélanges réactionnels augmente dès l’introduction des polymères dans le mélange. Il s’ensuit que le mélange réactionnel gélifie rapidement et il faut l’introduire rapidement dans la chambre réactionnelle d’amplification. À défaut, le mélange gélifié peut boucher l’entrée de la chambre. Le mélange devient alors inutilisable et l’amplification échoue.

[0065] La réaction radicalaire en chaîne, par exemple dans le cas des gels d'acrylamide-bis-acrylamide, est une réaction sensible à la présence d'oxygène dans l'air. L’oxygène inhibe la polymérisation et contribue à la formation de réseaux contenant des réticulations hétérogènes et à haut poids moléculaire. Cela résulte en des hydrogels constitués de mailles de tailles variables. Par conséquent, il est préférable d'effectuer un processus de dégazage avant la réaction de polymérisation et/ou d'appliquer des conditions inertes pendant celle-ci. Cela nécessite des manipulations complexes et l'utilisation de plusieurs équipements de laboratoire, tels que des des- siccateurs, des réservoirs de gaz inerte ou des conduites de gaz inerte, des pompes, etc. [0066] De plus, un inconvénient majeur de ces gels est que les monomères d'acrylate n'ayant pas réagi sont néfastes pour la réaction d'amplification. Il a été tenté de palier ce problème par des étapes supplémentaires de lavage (A. B. Chetverin et al. dans EP1999268 et US6001568). Mais cela augmente la complexité des procédés en y ajoutant des étapes longues, souvent associées à des pertes de rendement. En effet, le procédé de préparation des gels comprend: a) le traitement de la surface du verre avec un mélange de liant-silane-eau-éthanol-acide acétique pour la fixation du gel (environ 2h) ; b) le dégazage de la solution de pré-polymère (environ minimum 15 min) ; c) l’incubation à 4 °C pendant Ih, puis l'addition rapide d'agents initiateurs et la gélification à température ambiante pendant environ 40min ; d) le lavage du gel pendant environ 60min, suivi du séchage pendant une nuit à température ambiante ; e) la diffusion du mélange réactionnel d'amplification dans les gels. L'ensemble du processus dure ainsi environ 13h ou plus. Outre la contrainte de temps, un autre inconvénient majeur de ce type de procédé est qu’il rend quasi impossible d’utiliser ces gels pour des molécules cibles de tailles diverses (ADN, ARN, bactéries, virus). Ceci est notamment dû à une problématique de diffusion au sein du gel qui entraîne une distribution inégale des produits d'amplification.

[0067] Dans le cadre des réactions d’amplification d’acides nucléiques, la préparation de gels doit tenir compte d’un grand nombre de facteurs. On peut notamment citer la stabilité physique du gel, son inertie, la toxicité des composants, la compatibilité du gel avec les réactifs réactionnels d’amplification, ainsi que la compatibilité du gel avec les conditions d'amplification (c’est-à-dire d’une part l’influence des composants du gel sur les réactifs d'amplification et d’autre part l’influence des réactifs d'amplification sur la gélification).

[0068] Il a été tenté de réaliser des gels à base de PEG, en particulier un copolymère d'acrylate de PEG 4- Arm et de thiol de PEG 2- Arm, et d’y appliquer une réaction d’amplification d’acide nucléiques (P. Blainey et al. dans US10487354 ou Huang et al. dans US2019/0202268). Toutefois, le déclenchement trop rapide de la polymérisation et son caractère incontrôlable entraîne des difficultés qui rendent impossible l'industrialisation.

[0069] En définitive, les problèmes rencontrés dans l’art sont divers et variés, et on pourra citer en résumé: un long processus de préparation ; une polymérisation initiale trop rapide et non-contrôlable ; un temps trop long pour la formation du gel ; des problèmes de reproductibilité ; la formation de gels non-homogènes ; des manipulations complexes ; le dégazage ou des manipulations sous atmosphère inerte ; des protocoles en un grand nombre d’étapes ; la nécessité de laver les gels pour éliminer des potentiel inhibiteurs de l'amplification des acides nucléiques ; et la nécessité de plusieurs équipements de laboratoire (dessiccateurs, réservoirs de gaz inerte ou ligne de gaz inerte, pompes, bains de lavage, etc.).

[0070] Tout cela fait qu’aucune solution de technique d’amplification d’acides nucléiques (PCR notamment) ne peut être réalisée en gel de manière satisfaisante. Il n’existe d’ailleurs actuellement aucune technique d’amplification en gel commercialisée et/ou industrialisée à ce jour.

[0071] La Demanderesse a mis au point une composition et un procédé d’amplification d’acides nucléiques en hydrogel qui résout les problèmes de l’art. Ainsi, l’invention ne nécessite pas de manipulations complexes, utilise des réactifs non toxiques et compatibles aussi bien avec les acides nucléiques qu’avec l'amplification enzymatique de ceux-ci. La polymérisation avec la composition de l’invention est contrôlable au moyen d’un agent de polymérisation qui est sensible à la lumière et/ou à la température. L’agent de polymérisation de l’invention est photosensible et/ou thermosensible.

[0072] En particulier, l’invention offre une (i) simplicité de manipulation, une (ii) rapidité, une (iii) contrôlabilité, et un (iv) stockage drastiquement accrus par rapport à l’état de l’art. En effet, l’invention permet de (i.l) préparer la réaction d’amplification en une seule étape, et ce sans manipulations complexes. De plus, (i.2) aucune étape de dégazage n’est requise (souvent liée à une sensibilité à l’oxygène). La (ii.1) préparation est rapide, c’est-à-dire notamment sans lavage. Il n’y a par exemple pas besoin de laver les gels pour éliminer des potentiels inhibiteurs d’enzymes d’amplifications. La (ii.2) gélification est très rapide, et ce seulement après l’application d’un stimulus (lumineux ou thermique). Le (iii.l) stimulus est contrôlable spatialement et temporellement, et est en outre parfaitement (iii.2) reproductible. La (iii.3) taille des polonies est homogène, ce qui permet notamment de contrôler davantage le processus d’amplification. Les ingrédients de la composition de l’invention rendent possible leur (iv.l) mélange sans risque de gélification avant l’application du stimulus. Le (iv.2) stockage à long terme, ainsi que la réalisation d’un grand nombre de (iv.3) manipulations en parallèles deviennent possible avec l’invention.

[0073] L’invention vise notamment une polymérisation induite par la lumière ou par une température seuil d'un ou plusieurs monomères ou pré-polymères avec ou sans agent de photo- ou thermo-initiation. La polymérisation de l’invention combine les avantages des deux mécanismes de polymérisation décrits ci-dessus (croissance en chaîne et par étapes).

[0074] La photo-polymérisation et la thermo-polymérisation font partie des méthodes chimiques de formation des hydrogels. Elle se produit en exposant un système photosensible ou thermosensible composé de composants insaturés avec/sans photo- ou thermo-initiateur (avec/sans autres composants portant des groupes fonctionnels photo/ thermosensibles) à la lumière ultraviolette (-200-400 nm) ou visible (-400-800 nm) ou à une température élevée (supérieure à la température ambiante).

[0075] Dans la présente description, et pour la définition de l’invention, on désigne par « stimulus » ou « stimuli » ou « stimulation » tout élément ou facteur chimique ou physique déclenchant une polymérisation.

[0076] Le principal avantage d’une polymérisation activée par photons (photoactivation) ou par de la chaleur (thermoactivation) est que les hydrogels sont formés in situ à partir de solutions aqueuses de manière peu invasive et avec un contrôle du déclenchement du processus de gélification. Ceci est possible grâce à l'utilisation d'un stimulus externe appliqué aux réactifs. Les stimulus utilisés dans l’invention sont respectivement l'irradiation ciblée des pré-polymères avec une lumière de longueur d'onde choisie ou l’exposition des monomères (qui sont également des pré-polymères) a une température seuil. La possibilité d'ajuster l'intensité et la durée d’exposition à la lumière ou la température par le biais du dispositif PCR apporte un contrôle supplémentaire sur la gélification et ainsi sur les propriétés du gel généré (contrôle de la vitesse de gonflement, de la résistance mécanique, de la dégradabilité, etc.).

[0077] En ce qui concerne la photoactivation : la lumière peut être dirigée vers un endroit précis et à un moment défini. Cela permet de réaliser différentes conceptions techniques des chambres d'amplification. L'utilisation de l'énergie lumineuse permet la polymérisation à de faibles doses de radicaux initiateurs dans des conditions de réaction simples. Typiquement, la photopolymérisation se définit par des taux de polymérisation rapides (environ quelques minutes) et une production de chaleur minimale. Cela est particulièrement important pour la stabilité des systèmes d'amplification (Biomaterials 2002, 23, 4307-4314). Ces avantages rendent cette méthode de formation d'hydrogels particulièrement bien adaptée à des applications in vivo, à l'encapsulation de cellules viables pour des stratégies d'ingénierie tissulaire et de médecine régénérative, ainsi qu'à des applications de libération contrôlée de médicaments (B. Amsden. Chapitre 8 : Méthodes de photoréticulation pour concevoir des hydrogels. Gels Handbook, pp. 201-218 (2016)).

[0078] En ce qui concerne la thermoactivation : la plage de température utilisée lors de la PCR peut être suffisante pour initier la polymérisation. Ainsi, la gélification peut se produire en même temps que le début de la réaction de l'amplification des acides nucléiques. Contrairement aux hydrogels formés par photopolymérisation, ce système peut ne nécessiter aucun temps supplémentaire liée à l’irradiation par de la lumière. Cela rend ce mode de réalisation particulièrement adapté aux applications PCR rapides. De plus, il ne nécessite aucun équipement supplémentaire tel qu'une lampe UV intégré au dispositif d’amplification (tel qu’un thermocycleur PCR par exemple), puisque le stimulus de la formation de l'hydrogel est le même que celui de l'amplification de l'acide nucléique, à savoir la température.

[0079] L’invention prévoit de sélectionner un ou plusieurs monomères ou pré-polymères pour la construction d’un hydrogel. La concentration en monomères ou pré-polymères dans la composition de l’invention est généralement comprise entre 2% et 25%. Plus généralement, l’invention prévoit un réactif polymérisable qui polymérise sous l’effet d’un facteur extérieur. Selon l’invention, ce facteur est une lumière ou une température. Ainsi, lorsque le réactif polymérisable (c’est-à-dire les monomères ou les prépolymères), est exposé à de la lumière (lorsqu’il est photosensible) ou à de la température (lorsqu’il est thermosensible), celui-ci polymérise. Il se forme alors un hydrogel.

[0080] Optionnellement, la composition de l’invention peut comprendre un photoinitiateur ou un thermoinitiateur. Lorsqu’un photoinitiateur ou un thermoinitiateur est utilisé, sa quantité est généralement choisie entre 0,02% et 1%.

[0081] In faut noter que la présente invention vise une composition de mélange maître destinée à être mélangée à un échantillon biologique. Cet échantillon peut, ou pas, comporter une ou plusieurs séquences cibles que l’on cherche à identifier par amplification, notamment pour identifier la présence ou non d’un pathogène dans l’échantillon.

[0082] La composition de mélange maître comporte donc des ingrédients nécessaires pour l’amplification des séquences cibles. Ainsi, la composition comporte en particulier des réactifs d’amplification (par exemples des bases nucléiques dNTP’s, MgCl ₂ , tampon de réaction) et des enzymes d’amplification (par exemple de la Taq polymérase, transcriptase inverse ou rétrotransciptase).

[0083] La composition ne comporte donc pas ab initio la ou les séquences cibles que l’on cherche à amplifier. La composition ne comporte pas forcément non plus les amorces spécifiques à la ou aux séquences cibles, ni les sondes fluorescentes pour révéler une amplification de la ou des séquences d’acides nucléiques cibles, puisque ces deux éléments sont dépendants de la ou des séquences cibles que l’on recherche. Logiquement, lorsqu’on connaît la séquence cible recherchée (par exemple une séquence spécifique au coronavirus), la composition peut contenir les amorces et sondes spécifiques à. cette séquence.

[0084] Toutefois, dans la présente description il est généralement fait référence à la composition de l’invention dans son état déjà mélangé à la séquence cible (y compris les amorces et sondes). L’effet technique lié à la polymérisation du réactif polymérisable de l’invention s’observe dans les condition d’utilisation d’un procédé d’amplification d’acides nucléiques.

[0085] En effet, classiquement la composition comporte en outre des enzymes pour l'amplification des acides nucléiques, des amorces plus ou moins spécifiques de la ou des séquences cibles, une ou plusieurs molécules fluorescentes rapporteuses plus ou moins spécifiques de la ou des cibles d'intérêt, un tampon de réaction et d'autres additifs, si nécessaire.

[0086] La composition de l’invention comporte en outre, en état d’utilisation, un échantillon à analyser (ADN, ARN, plasmide, bactéries, virus, phages, champignons, etc.) comportant des séquences d’acides nucléiques cibles. On notera que l’échantillon peut initialement se trouver dans un second mélange, et/ou subir une purification préalable notamment. Dans ce cas, l’échantillon est mélangé avec les constituants du gel et les réactifs PCR. Le mélange résultant est une composition selon l’invention.

[0087] La composition peut-être injectée dans une chambre de réaction compatible avec un instrument d'amplification des acides nucléiques. Le mélange se trouve ainsi dans un état liquide (plus ou moins visqueux) à l'intérieur de la chambre de réaction et peut ainsi s'adapter à différentes formes de chambres de réaction.

[0088] Selon l’invention, l’hydrogel formé par la polymérisation du réactif polymérisable a pour effet d’encapsuler localement chaque séquence d’acides nucléiques cible, tout en conservant une diffusion des autres constituants de la composition pour permettre une amplification efficace de la ou des séquences d’acides nucléiques cibles.

[0089] Lorsque la composition de l’invention se trouve en état de gel dans la ou les chambres de réaction, le processus d'amplification de l’acide ou des acides nucléiques cibles peut être réalisé. Le processus d’amplification peut être notamment choisi parmi l’un cité plus haut dans la description, en particulier une PCR classique ou de type qPCR, PCR en temps réel, PCR asymétrique, RT PCR, ou autre ; une NASBA; une 3SR (réplication de séquence auto-entretenue, « Self-Sustained Sequence Replication » en anglais) ; une SDA ; une TMA ; une RCA ; une LAMP, ou une MDA (amplification par déplacement multiple, « multiple displacement amplification » en anglais).

[0090] La [Fig.1] montre un schéma de principe du procédé de l’invention. Le mélange réactionnel d’amplification (Mix PCR) et un réactif polymérisable (polymères + ac- tivateur(s)) sont mélangés pour former le mélange maître de l’invention (MasterMix Polonies). Le mélange maître est ainsi prêt à l’emploi et est mélangé à l’échantillon biologique (cible) contenant la ou les séquences cibles.

[0091] La composition de l’invention comportant les séquences cibles et les amorces notamment, peut ainsi être répartie dans des chambres réactionnelles d’un dispositif d’amplification d’acides nucléiques (Chambre(s) d’amplification). Ensuite, on applique un facteur choisi parmi une lumière ou une température de sorte à initier la polymérisation du réactif polymérisable. Un hydrogel selon l’invention est ainsi formé. Selon l’invention, l’hydrogel encapsule localement chaque séquence d’acides nucléiques cible tout en autorisant la diffusion des réactifs d’amplification. Le processus d’amplification peut alors être réalisée (Amplification).

[0092] La Demanderesse a découvert non sans surprise que la sélection des polymères, et des activateurs le cas échéant, conditionne l’état des hydrogels formés. Les hydrogels formés à partir de la composition de l’invention présentent des caractéristiques qui comblent les problèmes de l’état de la technique cités ci-avant dans la description.

[0093] Pour sélectionner les polymères et activateurs de l’invention et ainsi former un hydrogel à partir de la composition de l’invention, il convient de procéder comme suit.

[0094] La première étape comporte la conception de la matrice d'hydrogel en fonction des besoins finaux. Les principales considérations à prendre en compte sont : a) l'origine chimique des composants de l’hydrogel, leur compatibilité avec le protocole ; b) l'utilisation de monomères ou de pré-polymères fonctionnalisés ; c) le type de réaction de photoréticulation ou de thermoréticulation ; d) optionnellement le type de photoi- nitiateur ou de thermoinitiateur, ainsi que la source à appliquer, c’est-à-dire respectivement la source de lumière ou la source de chaleur; e) la structure et la densité du réseau souhaitées (pourcentage de gel, rapport des réactifs).

[0095] Divers matériaux naturels et/ou synthétiques peuvent être utilisés pour former des hydrogels photo- ou thermo-réticulables. Des substances naturelles, telles que l'alginate, l'acide hyaluronique, le chitosane, le collagène, la fibroïne de soie et la gélatine, peuvent être appliquées. Cependant, on notera que la variation d'un lot à l'autre des hydrogels d'origine naturelle ne reproduit pas toujours leurs propriétés mécaniques et biochimiques et, par conséquent, peut limiter la possibilité d'obtenir des matrices aux propriétés bien définies. Les propriétés matérielles des hydrogels synthétiques peuvent être réglées avec précision. Dans la mesure où ces matériaux sont dépourvus de fonctionnalités biologiquement pertinentes, certaines applications nécessitent l'introduction de caractéristiques spécifiques présentes dans les matrices extracellulaires (MEC) naturelles d'une manière hautement contrôlée. Les matériaux synthétiques peuvent inclure, sans s'y limiter, des dérivés de Pluronics, des poly(alcools vinyliques) (PVA), des poly(acides acryliques), des polyéthylèneglycols (PEG) et des polypeptides (Chinese Chem. Lett. 2020 ; ACS Macro Lett. 2013, 2, 5-9).

[0096] L'utilisation de monomères dans la polymérisation est limitée par le fait que la plupart d'entre eux sont cytotoxiques et/ou cancérigènes, et ont des effets inhibiteurs sur le processus d'amplification. De plus, cette approche donne souvent lieu à des réseaux inhomogènes. Une solution alternative consiste à utiliser des précurseurs macromoléculaires d'hydrogel (pré-polymères) qui sont fonctionnalisés avec des groupes photo- ou thermo-réactifs pour la formation d'hydrogels photo- ou thermo-po- lymérisables respectivement. Deux avantages des pré-polymères sont leur faible toxicité d’une part et leur faible taux d'inhibition d’autre part, en comparaison avec le système acrylamide/bis-acrylamide par exemple. De plus, les pré-polymères sont stables et solubles dans l'eau. Comme discuté plus haut, ces molécules possèdent au moins un, voire plusieurs groupes fonctionnels réactifs. A titre d’exemple, on peut notamment utiliser les dérivés d'acrylate et de méthacrylate de PEG (configurations linéaires et multi-bras), les dérivés de norbornène de PEG (configurations linéaires et multi-bras), les dérivés de thiol de PEG (configurations linéaires et multi-bras), les dérivés d'acrylamide et de méthacrylamide de PEG (configurations linéaires et multi- bras), les dérivés d'alcool polyvinylique (PVA), les polysaccharides modifiés tels que les dérivés d'acide hyaluronique, le méthacrylate de dextran. Les peptides peuvent être incorporés dans les hydrogels de PEG-acrylate par fonctionnalisation des groupes amino terminaux du peptide avec une partie acrylate (Biomaterials 2002, 23, 4307-4314).

[0097] Il existe plusieurs types de réactions de photoréticulation ou de thermoréticulation. Le choix de la réaction appropriée est fait en fonction de la réaction d'amplification et des cibles appliquées, et de la gamme de températures notamment. De préférence, dans le cadre de la présente invention on utilise une réaction bio-orthogonale thiol-ène et une réaction de dimérisation.

[0098] Concernant la polymérisation photosensible, parmi les réactions bio-orthogonales la polymérisation par photoclic de thiol-norbornène (thiol-ène) est l'une des options préférentielle ici. Cette polymérisation procède par un mécanisme de croissance par étapes, permettant la fabrication d'hydrogels structurellement uniformes avec quasiment aucun défaut de réseau. Elle implique des réactions orthogonales médiées par la lumière entre des macromères multifonctionnels contenant des fonctions norbornène et thiol aux extrémités. Activée par la lumière UV ou visible, la réaction thiol-ène se traduit par l'addition rapide, étape par étape, des thiols aux doubles liaisons des fragments de norbornène, avec la formation de liaisons thioéther, et à médiation ra- dicalaire (on note qu’un mécanisme ionique cationique est également possible). Ce type de réactions bio-orthogonales est insensible à l'eau et à l'oxygène, ne nécessite pas l'ajout d’un co-initiateur ou d’un co-monomère, et peut se dérouler dans des conditions de réaction douces, sélectives, et efficaces. Il s’ensuit une formation d’un réseau homogène et une cinétique rapide par rapport à la polymérisation en chaîne. Le mécanisme de la polymérisation par étapes permet d'obtenir un réseau homogène avec les mailles appropriées qui limitent drastiquement la diffusion des molécules/cellules cibles et des produits d'amplification, mais permettent la diffusion des réactifs d'amplification.

[0099] Une autre approche dans le cadre de la polymérisation photosensible est l'application des réactions de cycloaddition, par exemple, la photodimérisation. La photodimérisation se produit entre deux mêmes molécules insaturées (après activation par la lumière) et résulte en la formation d'un dimère. Différentes structures, contenant des doubles liaisons telles que les coumarines, les cinnamates, la thymine, les anthracènes, le stilbène, les chalcones et le diméthylmaléimide (DMMI) peuvent être utilisées. Ils peuvent être intégrés dans les polymères naturels ou synthétiques, tels que : les conjugués de cinnamate, coumarine et thymine avec l'acide hyaluronique ou le sulfate de chondroïtine ; les conjugués de cinnamate avec le poly(N,N-diméthylacrylamide), les PEG contenant des groupes cinnamate terminaux et des groupes nitrocinnamate (Adv. Eunct. Mater. 2001, 11, 1) ; gélatine modifiée avec du nitrocinnamate ; PVA avec des groupes coumarine ; poly(acrylamide) portant des DMMI. (Chapitre 8 : Photo-Crosslinking Methods to Design Hydrogels. Gels Handbook. Gels Handbook, pp. 201-218 (2016)). La photoréactivité de ces composés pourrait être ajustée en faisant varier les substituants du centre réactif photosensible. Parmi les avantages supplémentaires de cette stratégie de réticulation, on note qu'aucun initiateur ou catalyseur n'est nécessaire. En revanche, un apport énergétique élevé doit être appliqué pour obtenir une réticulation efficace. L'intensité des UV et le temps de gélification peuvent être réduits de plusieurs façons. La première consiste à incorporer un plus grand nombre de groupes photodimerisables sur le noyau du prépolymère, ce qui augmentera également la réticulation (par exemple, en incorporant des fragments photodimerisables sur toute la longueur du squelette du prépolymère, en utilisant des prépolymères à plusieurs chaînes). La seconde suppose l'utilisation de sensibilisateurs hydrosolubles, tels que le disulfate de thioxanthone, pour réduire l'apport énergétique (Polymer 2007, 48, 5599-5611).

[0100] Un autre groupe de polymérisations photo-induites comprend les réactions avec la formation de radicaux nitrènes réactifs intermédiaires à partir d'azides activés par la lumière UV. Le radical nitrène peut rapidement subir des réactions d'addition avec des liaisons insaturées, des réactions d'insertion dans des liaisons carbone-hydrogène ou azote-hydrogène. Des hydrogels peuvent également être formés lorsque le radical nitrène réagit avec des amines primaires, par exemple le chitosan modifié (B. Amsden. Chapitre 8 : Photo-Crosslinking Methods to Design Hydrogels. Gels Handbook. Gels Handbook, p. 201-218 (2016)).

[0101] Le choix du photo-initiateur approprié (si nécessaire) est une tâche cruciale dans la conception de matrices photoréticulables pour l'amplification des acides nucléiques. Une série de caractéristiques importantes doivent être prises en compte : un photoinitiateur doit avoir un spectre d'absorption qui présente un bon chevauchement avec le spectre d'émission de la source lumineuse souhaitée ; une valeur plutôt élevée du coefficient d'extinction molaire ; une bonne solubilité dans l'eau ; une stabilité ; une capacité à produire des radicaux libres (ou d'autres particules réactives) ; une biocompatibilité, une compatibilité avec le processus d'amplification, etc. (Biomaterials 2002, 23, 4307-4314 ; BioTechniques 2019, 66, 40-53).

[0102] Concernant la polymérisation thermosensible, parmi les réactions bio-orthogonales la réaction de Diels-Alder est l'une des options préférentielle ici. Elle procède par un mécanisme de croissance par étapes, permettant la construction d'hydrogels structurellement uniformes avec quasi pas de défauts. Elle implique des réactions orthogonales médiées par la température entre des macromères multifonctionnels contenant des fonctionnalités diéniques et diénophiles. Différentes structures peuvent être utilisées pour le diène conjugué (furane, tétrazine, etc.) et pour l'alcène substitué (maléimide, norbornène, etc.). Ces structures peuvent être intégrées dans un polymère naturel ou synthétique tel que les poly (acrylates) (European Polymer Journal, 2013, 12, 3998-4007), les poly(étheramines) (Polymers, 2019, 11, 930), l'acide hyaluronique (Polymer Chemistry, 2014, 5, 5116-5123), l'alginate (Biomaterials, 2015, 50, 30-37). Activée par la température, la réaction de Diels-Alder est une réaction sans radical qui aboutit à un cycle à six chaînons. Ce type de réactions bio-orthogonales est insensible à l'eau et à l'oxygène, ne nécessite pas l'ajout d’un co-initiateur ou d’un co-monomère, et peut se dérouler dans des conditions de réaction douces, sélectives, et efficaces. Il s’ensuit une formation d’un réseau homogène et une cinétique rapide par rapport à la polymérisation en chaîne. Le mécanisme de la polymérisation par étapes permet d'obtenir un réseau homogène avec les mailles appropriées qui limitent drastiquement la diffusion des molécules/cellules cibles et des produits d'amplification, mais permettent la diffusion des réactifs d'amplification.

[0103] Une autre approche dans le cadre de la polymérisation thermosensible est la dimérisation d'un groupe polymérisable tel que l'acrylate. La dimérisation se produit entre deux des mêmes fonctionnalités polymérisables en présence d'un thermoinitiateur. Différentes structures contenant des doubles liaisons telles que les (méth)acrylates, les (méth)acrylamides ou les maléimides peuvent être utilisées et ces structures peuvent être intégrées dans les polymères naturels ou synthétiques, tels que les PEGs ou les polysaccharides (acide hyaluronique, gélatine etc.). La thermoréactivité de ces composés peut être ajustée en faisant varier les substituants du noyau thermosensible. La température et le temps de gélification peuvent être réduits de plusieurs manières. La première consiste à incorporer un plus grand nombre de groupes thermodimerisables sur le noyau du pré-polymère, ce qui augmentera également la réticulation (par exemple, en incorporant des parties thermodimerisables le long de tout le squelette du pré-polymère, en utilisant des pré-polymères à plusieurs bras). La seconde suppose l'utilisation de concentrations plus élevées de thermoinitiateur, tout en faisant attention à la compatibilité avec la PCR.

[0104] Le choix d'un thermoinitiateur approprié (si nécessaire) est une tâche cruciale dans la conception de matrices thermoréticulables pour l'amplification des acides nucléiques. Une série de caractéristiques importantes doivent être prises en compte : un thermoinitiateur doit avoir une température de décomposition qui présente un bon chevauchement avec la température utilisée pendant le processus de PCR ; une valeur plutôt élevée du coefficient d'extinction molaire ; une bonne solubilité dans l'eau ; la stabilité ; la capacité à produire des radicaux libres (ou d'autres particules réactives) ; la biocompatibilité, la compatibilité avec le processus d'amplification notamment. Différents types de thermo-initiateurs peuvent être utilisés pour initier une polymérisation thermique : - Les persulfates, neutralisés avec un contre ion (ammonium, potassium, sodium etc...), se décomposent en radicaux sulfates qui, en solution aqueuse, forment des ions HSO ⁴ et des radicaux hydroxyles, capables d'initier la polymérisation (Catalysis Today, 2015, 257,297-304) ; - Les peroxydes organiques (peroxyde de méthyl éthyl cétone, peroxyde de benzoyle, etc.) qui subissent une fission symétrique (homolyse), formant deux radicaux capables d'initier la polymérisation ; - Les composés azoïques (2,2'-azobis(isobutyronitrile), 2,2'-Azobis[dihydrochlorure de 2-(2-imidazolin-2-yl)propane], etc.) qui se décomposent avec la chaleur (ou la lumière) en formant de l'azote gazeux et des radicaux de carbone capables d'initier la polymérisation.

[0105] Le processus de polymérisation se déroule par la formation et la réaction de certaines espèces réactives, c'est-à-dire des radicaux ou des ions. Ils peuvent être formés à la suite d'une réactivité chimique élevée des composants participants eux-mêmes (par exemple, des cations dans une addition de type Michael) ; à la suite d'une activation spéciale par un ou plusieurs initiateurs (par exemple, des radicaux formés à la suite d’une réaction d’oxy do-réduction du système APS-TEMED dans une chaîne de polymérisation,), par l'application de la température avec ou sans initiateurs (par exemple, le persulfate d’ammonium ammonium persulfate, APS en anglais) qui peut être décomposé en radicaux par chauffage) ou par l'application de la lumière avec ou sans photoinitiateur.

[0106] Dans la présente invention, on utilise cette dernière approche, c'est-à-dire l'application de lumière ou de température respectivement avec ou sans photoinitiateur ou thermoinitiateur pour la génération d'espèces radicalaires réactives. En général, deux groupes principaux d’initiateurs sont utilisés dans la synthèse d'hydrogels pour des applications biomédicales : les photo-initiateurs ou thermo-initiateurs radicaux et cationiques (c'est-à-dire ceux qui induisent la formation de radicaux réactifs ou de cations dans le système, respectivement). L'utilisation de photo-initiateurs ou thermoinitiateurs cationiques est possible mais compliquée car ils conduisent à la formation d'acides protoniques, qui sont nocifs pour les cellules et les enzymes, ce qui peut inhiber le processus d'amplification.

[0107] Dans le cadre de la polymérisation photosensible les photo-initiateurs clivables (type I) ou biomoléculaires (type II) peuvent être prévus. Les photo-initiateurs de type I comprennent, sans s'y limiter, les dérivés de la benzoïne et de l'acétophénone, tels que le groupe des photo-initiateurs Irgacure (Irgacure-2959 ; Irgacure-184 ; Irgacure-651 ; Irgacure-369 ; Irgacure-907 ; etc.), le phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP), etc. Sous l'effet de la lumière, ces composés se décomposent en deux parties portant des centres radicaux, capables de favoriser la polymérisation ultérieure. Typiquement, ce type de composés a un maximum dans le spectre d'absorption autour de 300-400 nm et, par conséquent, peut être utilisé pour la polymérisation UV. Au contraire, les photo-initiateurs de type II, tels que la camphorquinone, la thioxanthone, la benzophénone, ont un maximum dans le spectre d'absorption dans le domaine visible et peuvent être utilisés pour la polymérisation médiée par la lumière visible. Le mécanisme de leur action est basé sur l'extraction de l'hydrogène présent dans le coinitiateur (par exemple, la thriéthanolamine) avec la génération de radicaux se- condaires. Souvent, pour induire une photogélification efficace, un accélérateur, tel que la N- vinylpyrrolidone, est nécessaire. Cependant, comparé aux photo-initiateurs de type I, le type II est moins cytotoxique et plus soluble dans l'eau. L'un des photoinitiateurs sensibles à la lumière UV les plus utilisés est l'Irgacure-2959, ce qui est dû à sa solubilité modérée dans l'eau, sa faible cytotoxicité et son immunogénicité minimale. Cependant, il est caractérisé par une efficacité d'initiation et un coefficient d'extinction molaire relativement faibles dans la gamme spectrale UV-A. Une bonne alternative consiste à utiliser le LAP, qui est plus efficace et biocompatible, et qui, étant un sel de lithium, est bien soluble dans l'eau. De plus, le LAP absorbe également dans la région de la lumière bleue (405 nm). On peut aussi mettre en œuvre le V-50 (dichlorhydrate de 2,2'-azobis(2-méthylpropionamidine)) et le V-086 (2,2'-azobis(N-(2-hydroxyéthyl)-2-méthylpropionamide)) (BioTechniques 2019, 66, 40-53 ; B. Amsden. Chapitre 8 : Photo-Crosslinking Methods to Design Hydrogels. Gels Handbook, p. 201-218 (2016)).

[0108] La concentration optimale de photoinitiateur ou de thermoinitiateur est un paramètre important pour la polymérisation des hydrogels utilisés dans le processus d'amplification. Des concentrations élevées d'initiateur permettent la génération de plus de radicaux libres, ce qui entraîne normalement une conversion plus élevée des monomères. Cependant, une concentration trop élevée de l'initiateur peut être néfaste pour l’amplification car les radicaux peuvent endommager les macromolécules cellulaires, telles que les membranes cellulaires, les protéines et les acides nucléiques, mais également les fluorophores. Il s’ensuit une inhibition de l'amplification. De préférence, on utilise une concentration de 0,02%- 1 % en fonction de l'initiateur appliqué, de l'intensité de la lumière ou de la température, des aspects mécano-cinétiques de la polymérisation.

[0109] Enfin, la variation du pourcentage de gel et du rapport des composants permet d'obtenir la structure et la densité de réseau souhaitées. La matrice de gel doit posséder une structure homogène avec les mailles appropriées qui limitent la diffusion des molécules/cellules cibles et des produits d'amplification, tout en permettant la diffusion des réactifs d'amplification. Une taille moyenne des pores allant de 100 pm à 5 nm est capable d'empêcher la diffusion et ainsi l'intermixage des séquences cibles, tout en permettant la diffusion des réactifs d'amplification. Dans cette gamme, la concentration du gel peut être modifiée afin d'influencer deux paramètres : a) la taille de la colonie moléculaire ou polonie; b) la capacité de restriction de la matrice du gel envers différents types de cibles (ADN, ARN, plasmides, bactéries, virus, phages, etc.). Comme il a été constaté auparavant (G. M. Church et al. US6485944 ; A. B. Chetverin et al. EP1999268, A. B. Chetverin et al. US6001568), l'augmentation du pourcentage de gel entraîne la diminution de la taille des colonies moléculaires. La concentration du gel a également une influence considérable sur la capacité de la matrice à piéger différentes cibles.

[0110] Différentes chambres de réaction peuvent être utilisées. Elles peuvent inclure, sans s'y limiter, des puces plates, des cassettes, des chambres de réaction étroites ou allongées, c'est-à-dire de type tige ou capillaire, spécialement pliées ou enroulées dans une cassette plane pour permettre le placement dans un thermocycleur PCR standard. La chambre peut être de différents volumes appropriés confinés dans un espace fermé excluant les trous d'entrée/sortie pour couler le mélange. La chambre de réaction est constituée de différentes parties. Dans un mode particulier de l’invention, la partie inférieure de cette chambre est en contact direct avec un système de chauffage d'un côté, et avec le mélange (liquide ou gel) de l'autre côté. Elle est de préférence plane pour assurer la meilleure adhérence de la matrice de gel. La partie supérieure, la partie visible, est également de préférence plane, et est étroitement liée à la partie de base. La partie supérieure doit être transparente à la fois aux longueurs d'onde lumineuses pour pouvoir initier la polymérisation et aux longueurs d'onde lumineuses du processus de détection de la réaction d'amplification. La distance entre la base et le sommet peut être comprise entre 1 pm et 1 mm, de préférence celle-là, qui permettra l'arrangement d'une monocouche des produits d'amplification, c'est-à-dire des colonies moléculaires. Les deux autres dimensions (la longueur et la largeur) doivent être plus grandes (idéalement avec un facteur minimum de 10) afin de fournir une surface suffisante pour le placement de différentes cibles et de produits d'amplification de celles-ci. Pour éviter la déshydratation du gel, les trous d'entrée/sortie doivent être fermés de différentes manières : par exemple, mécaniquement, ce qui est intégré par la conception de la chambre ; avec l'utilisation de films adhésifs externes, et/ou avec l'utilisation de la pression.

[0111] Selon le premier mode de réalisation de l’invention, on expose la composition à une lumière de longueur d'onde et d'intensité choisies pendant une durée prédéfinie. Une lumière de différentes longueurs d'onde (UV avec 200-400nm ou lumière visible avec 400-800nm) et de différentes intensités peut être appliquée. L'intensité et la dose d'irradiation doivent nécessairement être prises en compte, car elles sont nécessaires à l'initiation de la polymérisation et à l'augmentation de la photoinitiation. On remarquera qu’il n’existe pas de proportionnalité linéaire entre l’intensité de lumière UV et la photoinitiation et que des valeurs d'intensité trop élevées peuvent entraîner une dégradation du polymère résultant en un gel inhomogène. De plus, une intensité trop forte peut provoquer la destruction de réactifs nécessaires à l'amplification. La gamme d'intensités UV entre 1 et 20 mW/cm ² est adaptée et permet de former un gel en 1-5 minutes.

[0112] Selon le deuxième mode de réalisation de l’invention, on expose la composition à une température seuil. Il peut notamment suffire de commencer la PCR pour initier la polymérisation de la composition de l’invention.

[0113] Lorsque le gel est formé la ou les séquences d’acides nucléiques sont immobilisées dans la matrice du gel. L'amplification peut alors être réalisée sur un dispositif d’amplification. On peut citer différentes machines, par exemple le thermocycleur plat MasterCycler Nexus de la société Eppendorf ; le système PCR ProFlex de la société Applied Biosystems ; QuantStudio 3D de la société Applied Biosystems ; SmartCycler de la société Cepheid, ou Chronos de la Demanderesse.

[0114] EXEMPLES DE RÉALISATIONS

[0115] Les exemples 1 à 5 concernent des hydrogels obtenus à partir de compositions comportant un réactif polymérisable photosensible selon l’invention, et les exemples 6 à 8 concernent des hydrogels obtenus à partir de compositions comportant un réactif polymérisable thermosensible selon l’invention. Sauf indication contraire, les PCR sont réalisés sur une machine Chronos de la Demanderesse disponible dans le commerce.

[0116] EXEMPLE 1 : ADN nu en PCR symétrique.

[0117] Une réaction bio-orthogonale thiol-ène est utilisée pour la formation de l’hydrogel. Les quantités équimolaires de 4 Arm-PEG-SH (MW de 10000 g/mol, Laysan Bio) et de 4 Arm-PEG-norbornene (MW de 10000 g/mol, Sigma) sont choisies pour la construction de gel avec des pourcentages (%) p/v dans la gamme de 5-7%. Le LAP (phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium, Sigma) est utilisé comme photoinitiateur à raison de 0,02% (p/V). Les réactifs d'amplification suivants sont utilisés : 1U de SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad), 8U d'ADN polymérase Platinum™ Taq (ThermoFisher SCIENTIFIC), 0,4pM d'amorces ciblant la région 16S des bactéries avec une longueur de matrice de 740 pb. Optionnellement, un colorant intercalant supplémentaire (colorant d'ADN fluorescent SybrGreen® (Jena Bioscience) ou colorant EvaGreen® (20X dans l'eau, Biotium) peut être ajouté à des concentrations dans une gamme de 0,5- 1,5 pM).

[0118] Le mélange contenant tous les composants avec l'ADN cible provenant de B. Subtilis est ajusté avec du ddH ₂ O à 25 pL et injecté dans la chambre de réaction. En fonction du thermocycleur utilisé, la chambre est caractérisée par les dimensions suivantes : SmartCycler de Cepheid (chambre plastique de 5x5x1 mm, 25 pL) ; thermocycleur plat MasterCycler Nexus d'Eppendorf (chambre de 9x9x0, 3 mm, 25 pL (lame de microscope en verre traitée au silane + chambre à joint d'étanchéité de cadre (Bio-Rad) + lamelle couvre-objet en plastique)) ; Chronos (chambre de 10x10x0,25 mm, 25 pL avec une base en Al et un couvercle en copolymère d'oléfine cyclique (COP)). Ici on utilise la machine SmartCycler de Cepheid.

[0119] Le gel résultant de la composition photosensible s'est formé à température ambiante après 1 minute dans une réaction de thiol-norbornène activée par l'application de lumière UV (365 nm, 3,4 mW/cm2) générée par une source de lumière.

[0120] La PCR est réalisée par 2 min à 95 °C pour la dénaturation initiale, puis 35 cycles de 5 s à 95 °C pour la dénaturation et 30 s à 60°C pour l'élongation.

[0121] Les colonies moléculaires d'ADN de B. Subtilis (10 ⁴ , 10 ³ , 10 ² copies et contrôle négatif) sont visualisées avec le microscope à fluorescence Axiovert 100 (ZEISS, Allemagne).

[0122] La [Fig.2] montre les photographies respectives de l’hydrogel des échantillons comportant 10 ⁴ , 10 ³ , 10 ² copies et contrôle négatif après PCR. La [Fig.2] montre aussi une courbe du signal de fluorescence en fonction des cycles PCR et les valeurs de Ct respectifs.

[0123] Ees photos sont réalisées avec un appareil photo Samsung Galaxy S 10. Ee contrôle négatif contenait 20-30 colonies moléculaires dues à l'amplification des impuretés d'E. Coli présentes dans le SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, amplifiables avec des amorces très sensibles ciblant la région 16S.

[0124] EXEMPEE 2 : ADN nu en PCR symétrique.

[0125] Dans cet exemple une réaction bio-orthogonale thiol-ène est utilisée pour la formation de la matrice polymère. Plus particulièrement, les quantités équimolaires de 2 Arm-PEG-SH (MW de 3400 g/mol, Laysan Bio) et de 8 Arm-PEG-norbomène (tripentaerythritol) (MW = 20000, Jenkem Technology) sont prises pour la construction des gels avec des pourcentages (%) p/V dans la gamme de 6-11%.

[0126] Le LAP (lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate, Sigma) est utilisé comme photoinitiateur en une quantité de 0,02% (p/V). Les mêmes réactifs d'amplification que ceux de l'exemple 1 sont utilisés.

[0127] La composition, y compris la séquence cible d'ADN provenant de B. subtilis (10 ³ copies), est ajustée avec du ddH ₂ O à 25 pL et injecté dans la chambre de réaction.

[0128] La polymérisation de la composition est initiée par l'application de lumière UV (365 nm, 3,4 mW/cm ² ) provenant d‘une torche UV. Le gel est formé (à température ambiante) après 1 minute par une réaction de polymérisation thiol-norbornène par étapes .

[0129] La [Fig.3] montre que le nombre et la taille des points (qui correspondent aux polonies) étaient différents en fonction du pourcentage de gel : 80-100 pm pour un gel à 10,8 % (photographie gauche), 100-120 pm pour un gel à 8,8 % (photographie milieu) et 150-160 pm pour un gel à 6 % (photographie droite). L'augmentation de la concentration du gel entraîne la formation de moins de points et avec une taille plus petite. Les signaux plus forts pour les gel à 6% et 8,8% peuvent s’expliquer par une plus grande efficacité de la PCR qui est due à la taille plus grande des mailles de la matrice de ces gels par rapport à la maille du gel à 10,8%. Une maille plus grande entraîne une diffusion plus libre des réactifs d’amplification et en particulier des molécules de relativement grandes tailles comme les enzymes. En revanche, une maille plus grande entraîne aussi une diffusion augmentée des produits de la PCR, ce qui est à l’origine de points plus larges. La PCR est conduite sur un dispositif Cepheid SmartCycler selon le protocole de l’exemple 1 et les photographies sont prises avec une caméra Samsung Galaxy S 10 sur un microscope à fluorescence Axiovert 100 (ZEISS, Germany).

[0130] La [Fig.3] montre aussi une courbe du signal de fluorescence en fonction des cycles PCR et les valeurs de Ct respectifs.

[0131] La [Fig.3] montre également une courbe de la dérivée du signal de fluorescence par rapport à la température, en fonction de la température. Le pic observé correspond à la température de fusion du produit formé par amplification. Ici, une valeur d’environ 88°C est obtenue, valeur attendue pour l’ADN amplifié.

[0132] EXEMPLE 3 : ADN nu en PCR symétrique.

[0133] Dans cet exemple une réaction de dimérisation est utilisée pour la formation de la matrice polymère : un 8 Arm- PEG à base de nitrocinnamate (MW de 21.400 g/mol) est utilisé pour la construction des gels avec un pourcentage (%) p/V de 10%. Les réactifs d'amplification suivants sont utilisés : 5U de SD Polymerase Hotstart (Bioron), un tampon (SD Polymerase Reaction Buffer incomplet (lOx), Bioron), un tampon MgCl ₂ 3 mM (Bioron), 0,4 pM d'amorces ciblant la région 16S de la bactérie avec une longueur de matrice de 740 pb. Un colorant intercalant de l’ADN EvaGreen® Dye, 20X in Water (Biotium) est ajouté à une concentration de 2X. La composition contenant tous les composants, y compris la cible d'ADN nu provenant de E. coli, est ajusté avec du ddH ₂ O à 25 pL et injectée dans la chambre de réaction de Chronos.

[0134] Le gel résultant de la composition photosensible est formé à température ambiante après 1 min par une réaction de dimérisation activée par l'application d'une lumière UV (365 nm, 3,4 mW/cm ² ) générée par la torche UV. Le processus d'amplification PCR est réalisé d’après le protocole suivant : 2 min à 95 °C pour la dénaturation initiale, 35 cycles de 5 s à 98°C pour la dénaturation et 30 s à 60°C pour l'élongation. Les colonies moléculaires sont visualisées à l'aide du microscope à fluorescence Axiovert 100 (ZEISS, Allemagne).

[0135] La [Fig.4] montre neuf photographies d’hydrogels formés par des modes de réalisations différents de la composition selon l’invention ayant une concentration initiale de séquences cibles identique (10 ³ copies) ou nulle (voir les clichés de contrôle avec des échantillons négatifs), correspondant aux données PCR d’exemples de réalisation.

[0136] La première ligne de la [Fig.4] montre une première photo prise avec une caméra Hamamatsu (10 ³ copies) et une deuxième photo prise avec l'appareil photo de l'Apple iPhone 11 (négatif). Le contrôle négatif contient quelques colonies moléculaires du fait de la présence d’impuretés amplifiées par les amorces très sensibles ciblant la région 16S.

[0137] EXEMPLE 4 : ADN nu en PCR asymétrique.

[0138] Dans cet exemple une réaction bio-orthogonale thiol-ène est utilisée pour la formation de la matrice polymère : quantités équimolaires de 4 Arm-PEG-SH (MW de 10000 g/mol, Laysan Bio) et de 4 Arm-PEG-norbomene (MW de 10000 g/mol, Sigma) sont prises pour la construction des gels avec un pourcentage (%) p/V de 6,4%. Le LAP (phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium, Sigma) est utilisé comme photo-initiateur en une quantité de 0,02% (p/V). Les réactifs d'amplification suivants ont été utilisés : 5U de SD Polymerase Hotstart (Bioron), un tampon (SD Polymerase Reaction Buffer incomplet (lOx), Bioron), 3 mM MgC12 (Bioron), un couple d'amorces conçues sur mesure ciblant le gène FimH de E. coli avec une longueur de matrice de 400 pb. Un colorant d'intercalation EvaGreen® Dye, 20X dans l'eau (Biotium) a été ajouté à la concentration de IX.

[0139] La composition comprenant une séquence cible (10 ⁴ copies d'ADN nu) de E. coli est ajustée avec du ddH ₂ O à 25 pL et injecté dans la chambre de réaction de Chronos.

[0140] Le gel résultant de la composition photosensible s'est formé à température ambiante au bout d'une minute dans une réaction de clic thiol-norbornène à croissance par étapes activée par l'application de lumière UV (365nm, 3,4 mW/cm ² ) générée par la torche UV.

[0141] Le protocole d'amplification PCR est : 2 min à 92°C pour la dénaturation initiale, 40 cycles de 5s à 92°C pour la dénaturation et 30s à 64°C pour l'élongation. Les colonies moléculaires sont visualisées en temps réel avec la caméra Chronos.

[0142] EXEMPLE 5 : Virus en RT PCR

[0143] Le protocole expérimental est celui utilisé dans l'exemple 1, à la différence que la transcriptase inverse iScriptTM (Bio-Rad) est utilisée pour la transcription inverse. Le protocole d'amplification comprend en plus une étape de transcription inverse pendant 60s à 60°C. Un couple d'amorces conçues sur mesure ciblant MS2 avec une longueur de 200 pb est utilisé. Les réseaux de colonies moléculaires de MS2 (10 ³ copies) sont visualisés sur la machine Chronos.

[0144] La troisième ligne de la [Fig.4] montre une photo prise avec la caméra de la machine Chronos (10 ³ copies).

[0145] EXEMPLE 6 : ADN nu en PCR

[0146] Cet exemple met en œuvre une réaction de dimérisation d'acrylate pour la formation de la matrice polymère : 4 Arm-PEG-acrylate (MW de 20000 g/mol, Laysan Bio) est pris pour la construction des gels à 10% p/V. Le VA-044 (2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride, TCI Chemicals) est utilisé en tant que thermoinitiateur en une quantité de 0,07% (p/V). Les réactifs d'amplification suivants sont utilisés : 6U SD Polymerase HotStart (Bioron), un tampon 10X contenant 250mM d'acétate de potassium (KOAc), 83mM de sulfate d'ammonium ((NH ₄ )2SO ₄ ), 30mM de chlorure de magnésium (MgCl ₂ ), 1,5M de Tris- HC1 et 1 V% de Tween-20, 0,2pM de dNTP's mix (Sigma) et 0,4pM d'amorces ciblant la région 16S des bactéries avec une longueur de matrice de 740pb. Optionnellement, un colorant intercalaire supplémentaire (colorant d'ADN fluorescent SybrGreen® (Jena Bioscience) ou colorant EvaGreen® (20X dans l'eau, Biotium) peut être ajouté à des concentrations dans une gamme de 0,5- 1,5 pM).

[0147] Le mélange contenant tous les composants avec l'ADN cible provenant de B. Subtilis est ajusté avec du ddH ₂ O à 25 pL et injecté dans la chambre de réaction. En fonction du thermocycleur utilisé, la chambre est caractérisée par les dimensions suivantes : SmartCycler de Cepheid (chambre plastique de 5x5x1 mm, 25 pL) ; thermocycleur plat MasterCycler Nexus d'Eppendorf (chambre de 9x9x0, 3 mm, 25 pL (lame de microscope en verre traitée au silane + chambre à joint d'étanchéité de cadre (Bio-Rad) + lamelle couvre-objet en plastique)) ; Chronos (chambre de 10x10x0,25 mm, 25 pL avec une base en Al et un couvercle en copolymère d'oléfine cyclique (COP)). Ici on utilise la machine Chronos.

[0148] Le gel formé par la composition thermosensible se forme pendant la PCR, grâce aux cycles entre la température de dénaturation et celle d'élongation. En effet, la température seuil permet au thermo-initiateur de polymériser via les fonctionnalités acryliques du 4 arm-PEG.

[0149] La PCR est réalisée par 2 min à 95°C pour la dénaturation initiale, puis 35 cycles de 5s à 95 °C pour la dénaturation et 30s à 60°C pour l'élongation.

[0150] Les colonies moléculaires d'ADN de B. Subtilis sont visualisées avec le microscope à fluorescence Axiovert 100 (ZEISS, Allemagne) et les photos prises avec l’appareil photo de l’Apple iPhone 11.

[0151] La quatrième ligne de la [Fig.4] montre deux photos prises avec l’Apple iPhone 11 (10 ³ copies et négatif). Le contrôle négatif contient quelques colonies moléculaires du fait de la présence d’impuretés amplifiées par les amorces très sensibles ciblant la région 16S.

[0152] EXEMPLE 7 : ARN nu en RT PCR

[0153] Le protocole expérimental est celui utilisé dans l'exemple 6, à la différence que la transcriptase inverse WarmStart® LAMP (New England Biolabs) est utilisée pour la transcription inverse, et que le protocole d'amplification comprenait en plus l'étape de transcription inverse pendant 60s à 60°C. Un couple d'amorces conçues sur mesure ciblant MS2 avec une longueur de matrice de 200 pb au lieu de celle utilisée précédemment pour cibler le gène 16S de B. subtilis. Les colonies moléculaires de l'ARN nu MS2 sont visualisées avec la caméra de la machine Chronos. La cinquième ligne de la [Fig.4] montre deux photos prises avec la caméra de la machine Chronos(10 ³ copies et négatif). Le contrôle négatif contient quelques colonies moléculaires du fait de la présence d’impuretés amplifiées par les amorces très sensibles ciblant la région 16S.

[0154] EXEMPLE 8 : Virus en RT-PCR

[0155] Le protocole est celui utilisé dans l'exemple 6, à la différence que la transcriptase inverse WarmStart® LAMP (New England Biolabs) est utilisée pour la transcription inverse, et que le protocole d'amplification comprend en plus l'étape de transcription inverse pendant 60s à 60°C. Un couple d’amorces sur mesure ciblant MS2 avec une longueur de matrice de 200 pb est utilisé. Les colonies moléculaires du bactériophage MS2 sont visualisées avec la caméra de la machine Chronos.

[0156] La sixième ligne de la [Fig.4] montre une photo prise avec la caméra de la machine Chronos (10 ³ copies).

[0157] Au vu des exemples de réalisation liés à la polymérisation photosensible, la Demanderesse a développé un dispositif spécialement adapté pour l’utilisation de la composition de l’invention. Ainsi, la présente description divulgue par ailleurs une invention concernant un dispositif d’amplification de séquences d’acides nucléiques. Ce dispositif peut-être défini comme suit :

[0158] Dispositif d’amplification de séquences d’acides nucléiques comprenant un ther- mocycleur agencé pour réaliser une série de cycles thermiques avec un mélange réactionnel d’amplification d’acides nucléiques comportant une ou plusieurs séquences d’acides nucléiques cibles, et des réactifs d’amplification comprenant des amorces spécifiques de la ou des séquences d’acides nucléiques cibles, des sondes fluorescentes pour révéler l’amplification desdites séquences cibles, et des enzymes d’amplification d’acides nucléiques, le mélange réactionnel comprenant en outre un réactif photosensible, polymérisable lorsqu’il est exposé à la lumière provenant de la source de lumière de sorte à former un gel ; le dispositif comprenant en outre une chambre réactionnelle disposée dans le thermocycleur et agencée pour recevoir le mélange réactionnel d’amplification d’acides nucléiques, une source de lumière dirigée vers ladite chambre réactionnelle, et une commande de la source de lumière de sorte à l’allumer ou l’éteindre et contrôler la longueur d’onde et l’intensité de la lumière.

[0159] Le dispositif est donc agencé pour générer un stimuli au réactif photosensible de sorte à ce que ledit réactif polymérise lorsqu’il est exposé à la lumière provenant de la source de lumière. Il s’ensuit la formation du gel.

[0160] En d’autres termes, lorsque la source de lumière illumine le mélange réactionnel, il se forme un hydrogel encapsulant localement chaque séquence d’acides nucléiques cible et les réactifs d’amplification.

[0161] L’invention peut en outre être commercialisée sous forme de Kit comportant la corn- position telle que décrite ci-avant et un dispositif d’amplification de séquences d’acides nucléiques. Ainsi, l’invention vise aussi un : Kit pour amplification de séquences d’acides nucléiques comportant (i) la composition selon l’invention et (ii) un dispositif d’amplification de séquences d’acides nucléiques comprenant un ther- mocycleur agencé pour réaliser une série de cycles thermiques avec ladite composition, une chambre réactionnelle disposée dans le thermocycleur et agencée pour recevoir le mélange réactionnel d’amplification d’acides nucléiques, et comprenant en outre une source de lumière dirigée vers ladite chambre réactionnelle ainsi qu’une commande de ladite source de lumière de sorte à l’allumer ou l’éteindre et contrôler la longueur d’onde de la lumière.