E1 medio de cultivo que nutre a las diferentes líneas celulares incorpora dosis elevadas de diferentes suplementos, con la finalidad de aumentar la cantidad de células obtenidas en el menor tiempo posible. Estos suple- mentos son, fundamentalmente : nucleósidos, hormonas, citosinas, aminoácidos y vitaminas, aún cuando se incorpo- ren también sales minerales, lípidos y otros.

Las plaquetas añadidas al medio de cultivo al que se incorporan estas dosis elevadas de suplementos, aportan los factores de crecimiento derivados de las plaquetas (PDGFs) necesarios para optimizar el establecimiento, mantenimiento y prolongar la proliferación, pudiéndose emplear el sobrenadante resultante de su activación tras suplementarle con glucobionato cálcico. Así mismo estas plaquetas, junto con el fibrinógeno que contienen, se pueden aplicar como soporte de las células procedentes de

los cultivos celulares previamente establecidos, o como constituyentes del implante biológico, cola biológica y/o material de relleno.

En la presente solicitud se denominará"implante biológico"al concentrado de plaquetas coagulado con la presencia de : fibrinógeno, fibronectina, el calcio del cultivo celular y el calcio ionizado de las plaquetas, el ATP y ADP, como activadores de dicha actividad, enriquecido por otros diversos suplementos biológicos y que será portador de los cultivos celulares.

La denominación de"cola biológica"se aplicará a los primeros minutos del implante biológico y puede o no llevar las líneas celulares establecidas. Esta cola biológica tiene la particularidad de favorecer la cicatri- zación por los factores de crecimiento en ella presentes y que pueden actuar sobre las células de la herida induciendo la multiplicación, diferenciación o el quimiotactismo celular. Las plaquetas son la única fuente de factores de crecimiento presentes en esta cola biológica.

Se denominará"material de relleno"al trombo recién formado en el medio de cultivo que posteriormente es congelado y/o liofilizado y/o pulverizado con el fin de rellenar defectos osteoarticulares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La composición según la invención, para la obtención del cultivo celular, parte del medio de cultivo celular utilizado de manera rutinaria en los procedimientos habituales de este tipo de cultivos; complementado con altas dosis de suplementos con el fin de mejorar el rendi- miento de los cultivos celulares y potenciar las propieda-

des biológicas de este medio de cultivo.

Estos cultivos celulares proceden de células autólogas o heterólogas. Incluyen condrocitos, fibroblas- tos, osteoblastos, epitelio pigmentario de retina, hepato- citos, células de la unidad pilosebácea, entre otros, así como células embrionarias.

Se emplean los factores de crecimiento provenien- tes de la degranulación plaquetaria y entre los que se encuentran : en los gránulos densos"serotonina, catecolami- nas, ATP y ADP, iones calcio"y en los gránulos alfa se encuentra"albúmina, beta-tromboglobulina, osteonectina, osteocalcina, factor 4 activador de las plaquetas, endote- lial factor de crecimiento endotelial derivado de las plaquetas, factor de crecimiento epidermico" (Hudson- Goodmafl et al 1990);"factor inhibidor de la alfa-plasmi- na, fibrinogeno, proacelerina, fibronectina, peptido III activador del tejido conectivo, factor-beta de crecimiento transformante, factor de crecimiento tipo insulina" (Martín et al 1992);"quininogeno de alto peso molecular, factor de von Willebrand, trombospondina, fosfolipido, inhibidor de la C1-esterasa, factor de crecimiento de hepatocitos, factores de crecimiento derivados de las plaquetas" (Miyazono y Takaku 1989., Miyazono y Takaku 1989), (H. L.

Wong and 5. M. Wahl, en"Peptide Growth Factors and their Receptors"Sporn and Roberts Eds., Springer-Verlag. Berlin, p. 5 10., Terkeltaub and M. H. Ginsberg, en"The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair", Clark & Henson Eds, Plenum Press, New York, p. 38.).

Los extractos plaquetarios presentan una activi- dad mitógena elevada, y su efecto cicatrizante es conocido; D. M. Carter y col., In"Growth factors and other aspects in Wound Healing", Barbul. Pines, Cadwell Hunt Eds, Alan R.

Liss Inc., New York 1998, páginas 303-317; patente US 4.760. 131 y solicitudes de patente PCI W086/03 122, WO 88/03409 y WO 89/05656.

No se añaden proteínas exógenas como trombina, ni inhibidores de plasmina como alfa 2-antiplasmina ni aprotinina, se puede aprovechar la presencia de protrombina y de otros factores de la coagulación en la cola biológica de la invención, y activar bien sea la vía extrínseca, o la vía intrínseca de la coagulación. La temperatura preferente de trabajo es de 37 °C. Además de estas proteínas coagula- bles, tampoco se añade fibrinógeno que, como ellas, actúa como material hemostático (véase la patente FR 2 448 900, de Immuno AG für Chemisch-Medizinische Produkte).

Antecedente remoto del estado de la técnica sería, además, es la patente NO W= 90/07931, de Curatech Inc., acerca de la recuperación de folículos pilosos mediante factores de crecimiento plaquetarios, que son inductores de la angiogénesis, de origen sanguíneo y de procedencia bien humana o bien de otros mamíferos, con incorporación de suplementos del tipo de la trombina, adenosin difosfato y colágeno.

DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere al medio de cultivo obtenido para el establecimiento, obtención, mantenimiento, propagación y congelación (con DMSO al 10%)' que se emplea en las líneas celulares tanto humanas como animales en los ejemplos realizados en la presente memoria, caracterizando a este medio de cultivo altas concentracio- nes de suplementos y factores de crecimiento procedentes del concentrado de plaquetas, de procedencia heteróloga o autóloga.

A. -Composición principal y su procedimiento : A. 1.- De la composición a). -Medio de cultivo celular utilizado de manera rutinaria en los procedimientos habituales de este tipo de cultivos, suplementado con concentrado de plaquetas al 10k (la variación preferente se estima entre el 1 y el 30%), estabilizado durante 24 horas en la estufa de cultivo. A este medio se le añadió factores de crecimiento como : IGF- I, IGF-II, TGF-b, si bien pueden incorporársele cualesquiera otros factores de crecimiento que demuestren facilitar la proliferación celular. b).-Al medio de cultivo celular se le añaden los siguientes suplementos, destinados al mantenimiento de las diversas líneas celulares : trifosfato de adenosina (entre 1 y 10 mg/1), bicarbonato sódico (entre 1,2 y 5 g/1), citicolina (histidina-5- difosfato de colina) (entre 10 y 100 mg/1), etanolamina (entre 10 y 50 mg/1), fosfoetanolamina (entre 5 y 25 mcg/1), glucagón (entre 1 y 5 mg/1), 1-glutamina (entre 2 y 10 mM), heparina sódica (entre 10.000 y 50.000 UI/1), hidrocortisona (entre 10 y 100 mg/1), insulina humana recombinante (entre 100 y 1.000 UI/1), levotiroxina (entre 50 y 200 mcg/1), ácido linoleico (entre 10 y 50 mcg/1), ácido oleico (entre 10 y 50 mcg/1), piruvato sódico (entre 50 y 150 mg/1), seleniato sódico (entre 10 y 50 mg/1), toxina colérica (entre 0.1 y 1 mg/1), Antibióticos (penicilina 100.000 UI/1, estreptomicina 100 mcg/1 y anfotericina B 2.5 mcg/1) ; colina {entre 1 y 30 mg/l} ; ácido fólico {entre 1 y 10 mg/l} ; mio-inositol {entre 1 y 40 mg/l} ; niacinamida {entre 1 y 10 mg/l} ; ácido p-amino benzoico {entre 1 y 10 mg/l} ; ácido D-pantoténico {entre 1 y 15 mg/l} ; piridoxina {entre 1 y 10 mg/l} ; riboflavina {entre 2 y 20 mg/l} ; tiamina {entre 1 y 5 mg/l} ; vitamina B-12 {entre 1 y 10 mcg/l}) y aminoácidos (1-histidina

{entre 2 y 20 mg/l}) ; L-isoleucina {entre 4 y 50 mg/1} ; 1- metionina {entre 1 y 25 mg/l} ; 1-fenilalanina {entre 2 y 20 mg/l} ; 1-triptophano {entre 1 y 5 mg/l} ; 1-tirosina {entre 2 y 10 mg/1} y, opcionalmente, albúmina humana (entre 100 y 1000 mg/1) y transferrina humana (entre 10 y 50 mg/1). c) Concentrado de plaquetas.

A. 2.- Procedimiento El medio de cultivo fue evaluado mediante la norma : Biological evaluation of medical devices. Part 5 : Test for cytotoxicity : in vitro methods. (ISO 10993- 5 : 1992). El ensayo se realizó sobre las células 3T3 A31, que es una línea celular procedente del ratón Swiss albino, (ATCC CRL 1658). El cultivo celular se realiza en frascos de cultivo, en un ambiente adecuado para la proliferación celular.

Las plaquetas empleadas en este procedimiento son obtenidas de la siguiente manera : A. 2. 1.- Mediante extracción por venopunción del paciente : Empleando tubos de 5 mililitros que contienen 10% de citrato trisódico como anticoagulante. Los tubos se centri- fugaron a 200 G durante 10 minutos. La sangre se separa en sus tres componentes : plasma en la parte superior, células blancas como una tenue línea en la parte media y los eritrocitos en la parte inferior. Se procede a retirar de la capa de plasma un 80% aproximadamente de dicho volumen y el restante 20% es el que destina por su alta concentra- ción en plaquetas a suplementar el medio de cultivo. Estas plaquetas son activadas por la presencia de calcio en el medio de cultivo, formándose un trombo que puede ser

retirado y que es el que se ha denominado material de relleno. Esta activación plaquetar es la responsable de la liberación de los factores de crecimiento plaquetario (PDGFs) al medio de cultivo.

A. 2. 2.-Del banco de sangre, mediante el siguiente protoco- lo : A. 2.2. 1.- Preparación del concentrado de plaquetas Los concentrados de plaquetas se preparan a partir de la sangre total por medio de grandes centrífugas refrigera- das. Las elevadas fuerzas gravitatorias generadas por estos aparatos dan lugar a que la sangre se separe en plasma líquido y sus diferentes elementos celulares.

Para preparar los concentrados de plaquetas, la centrifugación se realiza a temperatura ambiente; en cambio, para los demás componentes sanguíneos se lleva a cabo a temperaturas entre 1 y 6 °C. Es importante equili- brar el material en los lados opuestos de la cabeza de la centrífuga, lo que se realiza fácilmente mediante discos de goma de diferentes pesos. Es muy útil disponer un bolsa protectora de plástico en torno al recipiente con la sangre, a causa de la posibilidad de roturas. Los portillos y los tubos unidos a la bolsa deben protegerse también contra roturas. No debe frenarse manualmente la centrífuga ya que ello altera el contenido de la bolsa de sangre. Hay que seguir escrupulosamente todas las instrucciones de seguridad.

El protocolo que'se describe es el que se sigue con mas frecuencia en los bancos de sangre para separar los componentes sanguíneos. Con el centrifugado a baja veloci- dad de la unidad de sangre se obtiene plasma rico en

plaquetas (PRP) en la parte superior y eritrocitos en la inferior. El PRP se exprime hacia una bolsa satélite adjunta, lo que deja los eritrocitos en la bolsa principal.

Las dos bolsas unidas se centrifugan de nuevo, esta vez a alta velocidad, con lo que se obtiene un botón de plaquetas agregadas a partir del PRP. Se eliminan aproxima- damente 200 ml de plasma pobre en plaquetas y se dejan 50 ml del mismo con el botón plaquetario.

Esos 200 ml de plasma pueden emplearse para elaborar bien plasma recuperado, bien plasma fresco congelado (PFC), o bien se añaden a los eritrocitos para conseguir sangre total modificada. Al mismo tiempo, la bolsa que contiene el botón plaquetario y los 50 ml de plasma se separa de la bolsa primaria eritrocitaria, y se deja en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente, con el fin de favorecer la desagregación plaquetaria.

Las plaquetas se colocan luego en un rotor mecánico, para resuspender suavemente el botón plaquetario. La mayoría de las plaquetas de la unidad de sangre total se hallan presentes en el concentrado plaquetario. Para conservar las plaquetas en estado funcional óptimo es necesario mantenerlas en agitación constante a temperatura ambiente.

A. 2.2. 2.- Preparación del concentrado de plaquetas de donantes múltiples.

Las plaquetas de donantes múltiples se obtienen a partir de sangre total, 6 u 8 horas después de la recogida (según el fabricante de la bolsa y el tipo de anticoagulan- te usado), mediante centrifugación a baja velocidad para obtener un plasma rico en plaquetas.

Este plasma se transfiere a una bolsa satélite, tras lo cual se somete a centrifugación intensa para formar un botón de agregado plaquetario y un plasma pobre en plaque- tas. Se elimina el plasma, a excepción de 50 ml, para lograr un concentrado de plaquetas. Los 200 ml restantes de plasma pobre en plaquetas pueden añadirse luego a los hematíes para formar así sangre total modificada, o bien pueden congelarse para obtener PFC o usarse como plasma recuperado, para posterior elaboración.

Este concentrado de plaquetas se deja en reposo durante 1 hora para permitir que se desintegre suavemente el botón plaquetario. A continuación se someten las plaquetas a un proceso de agitación suave y constante a temperatura ambiente (20-24 °C) durante un plazo de conservación hasta de 5 días. Es importante cerciorarse de que las plaquetas mantengan su pH a 6 o más para que no pierdan su funcionalismo, y que exista una dosis mínima de 5, 5 x 10l°plaquetas en el 75% de las unidades investigadas.

A. 2. 3.- Preparación de suero con alta concentración de PDGFs.

Las plaquetas obtenidas, ya sea por venopunción del propio paciente y las procedentes del banco de sangre pueden ser activadas mediante el siguiente protocolo : Por ejemplo, se recogen 9 mililitros de los concentrados de plaquetas cualesquiera que sea su procedencia, se añaden entre uno o dos mililitros de glucobionato cálcico (1 mililitro aporta 4.5 miligramos de calcio elemento) esta solución se lleva a 37 °C, obteniéndose un suero rico en Factores de Crecimiento Derivados de las Plaquetas {Plate- let-Derived Growth Factors (PDGFs)} y un trombo que puede ser empleado como el material de relleno. Este suero rico en PDGFs puede ser empleado como aporte a los medios de

cultivo celular o como solución sobre los defectos cutá- neos, osteoarticulares o de otra etiología con el fin de acelerar la curación de las lesiones. El suero también puede congelarse y/o liofilizarse para prolongar su conservación hasta el momento de su utilización.

A. 3.- Otros suplementos específicos De forma complementaria a la composición principal y para líneas celulares distintas a las del tipo de epitelio pigmentario de retina, fibroblastos, hepatocitos, líneas tumorales y sus equivalentes, se establecen las siguientes adiciones de alguno, algunos o la totalidad de los siguien- tes suplementos extra : Biotina (entre 1 mg/1 y 10 mg/l, dexametasona (entre 1 y 10 mg/1), Factor básico de creci- miento de fibroblastos (bFGF) (entre 10 y 1. 000 mcg/1), teofilina (entre 1 y 100 mg/l), ácido l-ascorbico (entre 20 y 100 mg/1), calcitonina humana recombinante (entre 100 y 10.000 UI/1), calcitriol (entre 0.1 y 10 mcg/1), dexameta- sona (entre 1 y 10 mg/1), sales inorganicas, tales como el fosfato potásico monobásico anhidro (entre 100 y 500 mg/1) y el fosfato sódico dibásico anhidro (entre 1.000 y 2.500 mg/1) u otras sales equivalentes, factor inhibidor de la leucemia humano recombinante (100-10.000 UI/ml), timidina (entre 5 y 10 mg/1), guanosina (entre 10 y 50 mg/1), citidina (entre 10 y 50) mg/1), uridina (entre 10 y 50 mg/1), 2-b-mercaptoetanol (entre 10 y 100 mcg/1), forscoli- na (entre 0.1 y 10 mg/1), 2-b-mercaptoetanol (entre 10 y 100 mcg/1), trifosfato de adenosina (entre 1 y 10 mg/1) y factor inhibidor de la leucemia humano recombinante (100- 10. 000 UI/ml). <BR> <BR> <P>B. -Otras composiciones específicas y su procedimiento : Estos suplementos específicos se incorporan de la

siguiente manera : B. 1.- De la composición - A los adipocitos : Biotina (entre 1 mg/1 y 10 mg/l, dexametasona (entre 1 y 10 mg/1).

- A los melanocitos : Factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) (entre 10 y 1.000 mcg/1), teofilina (entre 1 y 100 mg/1).

- A los condrocitos y osteoblastos : ácido 1-ascorbico (entre 20 y 100 mg/1), calcitonina humana recombinante (entre 100 y 10.000 UI/1), calcitriol (entre 0.1 y 10 mcg/1), dexametasona (entre 1 y 10 mg/1), sales inorgani- cas, tales como el fosfato potásico monobásico anhidro (entre 100 y 500 mg/1) y el fosfato sódico dibásico anhidro (entre 1.000 y 2.500 mg/1) o equivalentes.

- A las células madre : factor inhibidor de la leucemia humano recombinante (100-10.000 UI/ml), nucleósidos ; trifosfato de adenosina (entre 1 y 10 mg/1), timidina (entre 5 y 10 mg/1), guanosina (entre 10 y 50 mg/1), citidina (entre 10 y 50) mg/1), uridina (entre 10 y 50 mg/1), 2-b-mercaptoetanol (entre 10 y 100 mcg/1), forscoli- na (entre 0.1 y 10 mg/1).

B. 2.- Cultivo y mantenimiento de estas líneas celulares.

El medio de cultivo fue preparado con los componentes anteriormente especificados. Los antibioticos se emplearon en solución con las siguientes dosis finales : penicilina 100.000 UI/l, estreptomicina 100 mcg/1 y anfotericina B 2.5 mcg/1 : El pH fue ajustado a 7.40 y la osmolaridad para las células humanas del cultivo fue de 290 mOsm/Kg, asumida como la ideal para el mantenimiento in vitro, en tanto que para otras especies como el ratón la osmolaridad de los cultivos iniciales fue de 310 mOsm/kg.

Las células se mantuvieron en frascos de cultivo de 25 cm2 ó 75 cm2 en medio de cultivo rutinario con todos los suplementos y los productos de la degranulación plaquetar, en estufa a 37 °C con atmósfera de COz al 5%.

Cuando las células contenidas en un frasco de cultivo se encuentran adheridas a la superficie del mismo formando una monocapa (fase de crecimiento exponencial), se procede a la obtención de las células mediante el siguiente procedimiento : Decantado del medio de cultivo del frasco.

Lavado con tampón salino fosfato (pH : 7,3 a 4 °C), y posterior decantación.

Adición de EDTA-PBS (entre 1 y 10 mM) y agitar enérgicamen- te con el fin de soltar las células adheridas al fondo del frasco.

Adición de 3 ml de tampón salino fosfato para llegar a 10 ml finales y resuspender. Seguidamente centrifugación (Minifuge T Heraeus Christ) en tubo cónico de 50 ml. A 200 g durante 5 minutos a 37 °C.

Decantado del sobrenadante, mientras que el pellet se resuspende en un volumen conocido de PBS, procediéndose al estudio de viabilidad celular por el método de exclusión con Azul tripán al 0, 1k en cámara cuentaglóbulos tipo Burker. Si el número de células viables es mayor del 95% se resuspenden nuevamente en el volumen necesario para obtener la concentración celular adecuada. La concentración celular empleada en este trabajo ha sido de 5 x 105 células en 0,1 ml de PBS.

Todos los pasos reseñados se llevaron a cabo en condiciones de estricta esterilidad, utilizando para ello cámaras de flujo laminar estéril Gelaire BSB4.

Con el fin de detectar posibles contaminaciones de micoplasmas se sometieron periódicamente los cultivos a un test de detección de micoplasmas por fluorescencia siguien- do el siguiente protocolo : Las células que están siendo mantenidas en cultivo se fijan en Metanol-Acético (3 : 1) y se sumergen en una solución Tampón-Hoechst 33258 (bisbenzimidazol) preparada a partir de una solución stock estéril constituida por 100 ml de PBS y 15 mg. de Hoechst 33258 y posterior dilución 1 : 500 en PBS durante 30 min en oscuridad y a temperatura ambiente. Se observan las células al microscopio de fluorescencia. En caso de contaminación por micoplasmas, estos se observan como pequeños cuerpos fluorescentes en el espacio extranu- clear e intercelular.

B. 3.- Mantenimiento a bajas temperaturas de las líneas celulares.

El mantenimiento de un stock de células a largo plazo se realizó mediante congelación en nitrógeno líquido de las células en cultivo. El procedimiento utilizado para la congelación fue el siguiente : Cuando las células en cultivo comienzan su fase de creci- miento exponencial, se calcula la viabilidad celular mediante tinción con Azul tripán.

Si es mayor del 95%, se resuspenden de nuevo en una solución del medio de cultivo completo y DMSO (dimetilsul- fóxido) al 10%.

Se ajusta a una concentración de 2x106 cel/ml. Esta suspen- sión se introduce en ampollas de congelación y se sumergen en nitrógeno líquido. Posteriormente, se almacenan en cámara de congelación a-180 °C. La descongelación de las células se realiza calentando las ampollas, sumergiéndolas en un baño a 37 °C y centrifugando después, con el fin de

eliminar el DMSO. El pellet se resuspende en medio de cultivo completo, y se siembra en un frasco de cultivo introduciéndose de esta manera en estufa de incubación a 37 °C.

B. 4.- Mantenimiento de las células madre.

Una vez realizada la selección de las células madre de origen embrionario, fetal o de adulto, mediante procesado enzimático, o por cultivo celular de tejido o por ovocitos, para el mantenimiento de estas células madre o Stem Cell, el medio de cultivo se condiciona o no por células STO, STO SNL 76/7 o VERO durante 48 horas y se utiliza hasta un 40k de este medio condicionado para cultivos celulares. Es conocido que, en ocasiones, se emplean células STO SNL 76/7 (McMahon and Bradley, 1990) o VERO, en forma de monocapas mitóticamente inactivadas (Evans and Kaufmann., 1981), utilizadas de manera rutinaria en los procedimientos habituales de este tipo de cultivos (Nagy et al., 1993).

Estas monocapas pueden secretar sustancias embriotróficas como el TGF-a (Factor de crecimiento transformante-a), TGF- b (Factor de crecimiento transformante-b), PDGT-a (Factores de crecimiento derivado de las plaquetas) e IGF-I y II (Factores de crecimiento tipo insulina) y de esta forma soportar el desarrollo tanto embrionario como el manteni- miento de las células madre. Tambien puede aportarse LIF humano recombinante (Factor inhibitorio de la leucemia humano recombinante) a una dosis por ejemplo de entre 100 y 10.000 units/ml (Kitamura et al. 1989) para el manteni- miento del fenotipo pluripotente de las células madre. Con el fin de conseguir niveles que permitan la formación de nichos de células madre que se mantienen indiferenciados (Rathjen et al., 1990), este factor puede por si solo mantener y servir en el aislamiento de células madre (Ernst et al., 1994; Nagy et al., 1993). Las células madre de la

unidad pilosebacea mantenidas in vitro presentan actividad fosfatasa alcalina demostrable directamente al igual que en los blastocistos (Johnson et al. 1977). Esta característica permite utilizar un marcaje histoquímico para detectar las células madre, así como poner de manifiesto el estado indiferenciado de las mismas (Piquet-Pellorce et al., 1994). (W090/08188 : PCT/AU89/00330, mediante marcado positivo para fosfatasa alcalina de los cuerpos embrioides y de las células madre.

Las células utilizadas pueden ser pluripotentes o totipotentes de diversa procedencia, como es el caso de la médula ósea, pero también se pueden emplear células embrionaria o las diferenciadas procedentes del propio paciente. Estas últimas al igual que las obtenidas de la médula ósea por tener un origen autólogo no presentan la capacidad de generar respuesta autoinmune.

A tales fines, las células se aíslan mediante procesa- do enzimático con tripsina, y/o dispasa/colagenasa según el tipo celular. Las líneas celulares se llevan a un frasco de 25 cm2 de superficie, realizándose los subcultivos al observarse la presencia de cuerpos embrioides o la desapa- rición de las células de la monocapa, manteniéndose en la estufa de cultivo sometidas a pase rutinario cada 48 horas.

Posteriormente se pueden introducir en la cola biológica que, con posterioridad, se convierte en el implante biológico.

Dicho implante biológico se puede mantener en la estufa durante un tiempo superior a 90 días, siendo sus células viables, y de las cuales se puede reestablecer un nuevo pase celular, siempre que se mantengan las condicio- nes de cultivo de cada línea celular.

Las células que se emplean tanto en la cola biológica como en los implantes biológicos se obtienen, por ejemplo, de la siguiente manera : se procede al tripsinizado de la línea celular, se inactiva la tripsina mediante inactivador se centrífuga a 200 g. Se retira el sobrenadante y el pellet es resuspendido en 1 ml de medio de cultivo. Se prepara una alícuota que contenga 10 x 106 células para un volumen final de 10 ml teniendo en cuenta que 1 ml es de concentrado de plaquetas. Todo este procedimiento se realiza a 37 °C.

Si se emplea como cola biológica presenta una excelen- te adhesión a los tejidos o materiales protésicos; si se desea mantener como implante biológico se lleva a la estufa donde obtendremos dos variantes : tras la retracción de los 10 ml de cola biológica en un tubo de ensayo, con una luz interior de 10 milímetros, a las 24 horas se presenta un cilindro de 10 x 1 milímetro, en experiencia realizada por triplicado.

Si se emplea sobre frascos de cultivo o se multiplica a partir de cultivo de 6 pocillos, no se produce retracción por lo que se presenta como el medio ideal para lograr formar lamina.

Se obtienen parches compuestos por fibroblastos y queratinocitos, superpuestos sobre los que recuerdan la dermoepidermis. La isoleucina es el aminoácido necesario para mantener el crecimiento de los queratinocitos, aunque el incremento de los otros aminoácidos tiene efectos beneficiosos en el potencial proliferativo de las diferen- tes líneas celulares.

En el caso de los osteoblastos se producen láminas variables en las cuales se puede inducir la calcificación

en grado variable con el fin de cubrir o rellenar defectos óseos. La matriz extracelular que es producida por los osteoblastos en los cultivos realizados in vitro, presenta un grado variable de mineralización, lo que permite su introducción en los defectos osteoarticulares con las propias células (autoinjerto) o tras la eliminación de estas (aloinjerto).

Como cola biológica se puede emplear en los casos de desprendimiento de retina llegando incluso a portar células de epitelio pigmentario de dicha retina.

Los factores plaquetarios liberados tanto al medio de cultivo como en el interior de la cola o implante biológi- co, logran un aumento en la proliferación celular fomentan- do el crecimiento, y evitando al mismo tiempo la degrada- ción del producto de adhesión a las superficies expuestas.

No se consideró necesario el empleo de inhibidores de proteasas como el ácido epsilonaminocaproico (200-400 mcg/ml de gel) y ácido tranexámico (200-400 mcg/ml de gel) y, se descartó la aportación de otros tipos de proteasas (yema de huevo de gallina, de Sigma Co., tipo III).

C. -Empleo de los bioimplantes Los bioimplantes se pueden emplear de los siguientes modos : a. -La cola biológica recién preparada puede servir de material para la adhesión directamente sobre el lugar de la lesión como en los casos de desprendimiento de retina con células procedentes directamente de los cultivos o de las conservadas en nitrógeno líquido. Con esta cola se puede proceder a rellenar el defecto osteoarticular, o al

menos servir de material de relleno de gran parte de dicho defecto. b. -Cuando se va a emplear el implante biológico, el lugar lesionado o defecto se puede empapar con la cola biológica, posteriormente se comprime el implante en el lugar lesionado. En 48 horas se observa proliferación celular, y en tres semanas se aprecian nódulos de calcif- cación si las células son osteoblastos.

Como cola biológica, dada la rapidez con que se produce el trombo, los condrocitos quedan adheridos a las superficies lesionadas al igual que otros tipos celulares como fibroblastos implantados en la región dérmica o hipodérmica o las células del epitelio pigmentario en la retina. Este ultimo caso requiere especial atención, puesto que el volumen final de la cola biológica al formarse el trombo es casi despreciable (1 milímetro cúbico por mililitro de medio) y, dado el poder regenerativo de dichas células (por su carácter pluripotente) sobre las células nerviosas retinianas. Se abriría el campo de la regenera- ción retiniana en casos como la retinitis pigmentaria y el desprendimiento retiniano.

Una de las principales ventajas de dicho procedi- miento es la ausencia de aporte exógeno de proteínas, la ausencia de sueros animales, lo cual reduce los riesgos de contaminación accidental. c. -Como material de relleno, resulta obvio que este producto congelado, desecado y/o liofilizado presenta una durabilidad superior a los tres años. Tanto los produc- tos desecados como el implante deben ser irrigados con la cola biológica, así mismo, se debe aplicar dicha solución sobre el lugar lesionado que va a ser reparado.

El procedimiento de la invención está por consiguiente particularmente adaptado a las necesidades actuales de utilización de productos autólogos.

Estos productos : medio de cultivo, cola biológi- ca, implante biológico y material de relleno pueden ser utilizados en los tratamientos de heridas traumáticas o quirúrgicas, en los implantes óseos o reconstrucciones osteoarticulares, mantenimiento de injertos (piel. huesos, entre otros) y mantenimiento a largo plazo de los implantes biológicos in vitro. La misma cola puede igualmente ser utilizada para fijar piezas de prótesis. comprendidas prótesis óseas, piezas de osteosíntesis y prótesis denta- les, y también para la fijación y para dar cohesión a materiales de relleno óseo, como carbonato de calcio, de hidroxiapatita o de polímeros biodegradables como el poli (ácido láctico).

Por lo que respecta a la industrialización del producto, la composición básica a añadir al cultivo celular específico está materializada en un complejo único de suplementos, preparado de antemano para facilitar y agilizar la operativa detallada en la presente memoria, así como usarlos en directo con líneas celulares que no requieren suplementos extra, dejando para cada caso concreto la incorporación de los dos suplementos opcionales : albúmina y transferrina humanas.

Igual ocurre con los suplementos extra, destina- dos a líneas celulares que requieren la adición de éstos : Para cada línea celular concreta se dispone ya de la mezcla previa correspondiente al conjunto adecuado de estos suplementos extra, a idénticos fines de facilitar la operativa concreta.

REALIZACION PREFERENTE DE LA INVENCION Composición básica.

Incorpora los suplementos biológicos siguientes : trifosfato de adenosina 1 mg/1), aminoácidos (1-histidina 2 mg/1) ; L-isoleucina 4 mg/1 ; 1-metionina 1 mg/l ; 1- fenilalanina 2 mg/1 ; 1-triptofano 1 mg/l ; l-tirosina 2 mg/1), antibióticos (penicilina 100.000 UI/1, estreptomici- na 100 mcg/1 y anfotericina B 2.5 mcg/1), bicarbonato sódico 1.2 g/1), citicolina (histidina-5-difosfato de colina) 10 mg/l, etanolamina 10 mg/l, fosfoetanolamina 5 mg/l, glucagón 1 mg/l, ácido linoleico 10 mc/l, ácido oleico 10 mcg/1, 1-glutamina 2mM, heparina sódica 10.000 UI/l, hidrocortisona 10 mg/1, insulina humana recombinante 100 UI/l, levotiroxina 50 mg/l, piruvato sódico 50 mg/l, ácido selenioso 10 mcg/1, toxina colérica 0.1 mg/1 y vitaminas (d-biotina 1 mg/1 ; colina 1 mg/l ; ácido folico 1 mg/1 ; mio-inositol 1 mg/l ; niacinamida 1 mg/1 ; ácido p- amino benzoico 1 mg/l ; ácido D-pantotenico 1 mg/l ; pirido- xina 1 mg/l ; riboflavina 2 mg/1 ; tiamina 1 mg/l ; vitamina B-12 1 mcg/1).

Otros suplementos específicos.

En determinados casos se incorporan, además de las opcionales, albúmina humana 100 mg/1 y transferrina humana 10 mg/l, los siguientes suplementos : calcitonina humana recombinante (1.000 UI/1), Factor inhibidor de la leucemia humano recombinante (1.000 UI/ml), vitaminas (D- Biotina (1 mg/1), dexametasona (1 mg/1), factor básico de crecimiento de fibroblastos (b-FGF) (10 mcg/1), teofilina (1 mg/1), ácido 1-ascorbico (20 mg/1), calcitriol (0.5 mcg/1), sales inorganicas tales como el fosfato potásico monobásico anhidro 200 mg/1 y el fosfato sódico dibásico

anhidro 1.100 mg/1 o equivalentes, forscolina 0.1 mg/1, nucleósidos; adenosina 10 mg/l, timidina 5 mg/1, guanosina 10 mg/1, citidina 10 mg/1, uridina 10 mg/l, 2-b-mercaptoe- tanol 10 mcg/l.

En cuanto a los ejemplos que a continuación se describen, éstos se emplean para ilustrar de modo adicional la invención y constituyen el mejor modo de llevarla a la práctica. Estos ejemplos se prepararon y se ensayaron como a continuación se describe : Eiemplo 1.-Creación de sustituto dermocutáneo con capaci- dad de desarrollar folículos pilosos.

Se obtienen las líneas celulares de un punch cutáneo de diámetro variable o de la unidad folicular o pilosebacea. Se seccionan en tres partes según el espesor de cada una de ellas y, de la epidermis se obtienen queratinocítos y melanocitos, de la dermis los fibroblastos y de la hipodermis se obtienen los adipositos que se mantienen con los siguientes suplementos; vitaminas (D- Biotina (1 mg/1), dexametasona (1 mg/1), cultivándose cada grupo por separado. El medio de cultivo empleado en este ejemplo se corresponde en esencia con el utilizado en las células madre.

Posteriormente se van obteniendo mediante procesado enzimático con dispasa/colagenasa los adipocitos.

Se resuspenden 10 x 106 en 5 ml de medio de cultivo fresco con un 10% de concentrado de plaquetas añadiendo los siguientes suplementos específicos :; se siembra en un frasco de 75 cm2, se espera a que coagule en la estufa durante 1 hora. Se extraen los fibroblastos de igual manera, finalmente los queratinocitos que se han cultivado con su medio específico como es; factor inhibidor de la

leucemia humano recombinante 1.000 UI/ml, forscolina 0.1 mg/1, para mantener la especificidad de las células madre cutáneas : con el mismo procedimiento y, luego, se procede a cambios con el medio enriquecido durante 15 días para- aumentar el espesor de la capa de queratinocitos.

De este nodo se obtiene un sustituto cutáneo que, tras ser sometido a un proceso de queratinización por exposición al aire, puede ser empleado en la practica clínica diaria.

Ejemplo 2. -Implante biológico que contiene osteoblastos.

Se obtiene la línea celular de hueso trabecular o del procedente de cresta ósea o punción ósea. Se lava abundantemente para retirar restos de médula ósea o de periostio. Se obtienen las células de igual manera que en el ejemplo 1 respetando las particularidades de crecimiento de esta línea celular y resuspendiéndose en 10 ml finales de medio de cultivo y 10% concentrado de plaquetas además de los siguientes suplementos específicos : ácido 1-ascorbi- co (20 mg/1), calcitriol (0.5 mcg/1), calcitonina humana recombinante (1.000 UI/1), sales inorganicas tales como el fosfato potásico monobásico anhidro 200 mg/1 y el fosfato sódico dibásico anhidro 1.100 mg/1 o equivalentes. Se llevan a la estufa para que se produzca la retracción del trombo plaquetar en un tubo de 10 centímetros por 1 centímetro de diámetro interior, quedando un cilindro de 10 milímetros de longitud por 1 milímetro de diámetro.

Elemplo 3.-Implante y/o cola biolócrica que contiene condrocitos.

Obtención del cultivo de condrocitos del cartíla- go articular mediante procesado con dispasa/colagenasa.

Mantenimiento de la linea celular con los siguientes suplementos específicos; ácido 1-ascorbico (20 mg/1), calcitriol (0.5 mcg/1), sales inorganicas tales como el fosfato potásico monobásico anhidro 200 mg/1 y el fosfato sódico dibásico anhidro 1.100 mg/1 o equivalentes, y posterior recuperación con igual procesado enzimático. Se resuspende 10 x 106 célula/ml de medio de cultivo como en los casos anteriores. Por cirugía artroscópica se llega al cartílago dañado, preparando el lecho de la intervención y se procede a rellenar dicho defecto en el instante que se prepara la suspensión celular y la cola biológica. Coagula con rapidez. <BR> <BR> <P>Elemplo 4. -Cola biológica para la reparación del despren- dimiento de retina y/o reqeneración en caso de retinitis pigmentaria.

Se cultivan las células del epitelio pigmentario de retina, con demostrada capacidad de regeneración de la retina. El medio de cultivo empleado es el medio estandar.

Se resuspende de igual manera que en el ejemplo 3 y se rellene la zona desprendida. Debe recordarse que 1 mililitro de este medio ocupa finalmente 1 milímetro cúbico en las experiencias llevadas a cabo en el laboratorio.

Estos procedimientos que se realizan a pié de quirófano presentan la ventaja de aportar grandes cantida- des de factores de crecimiento plaquetario en la zona de la lesión al activarse la plaquetas tras su puesta en contacto con el medio de cultivo.

Procedimiento general El desarrollo del medio de cultivo es suplemen-

tado con factores de crecimiento obtenido del concentrado de plaquetas, de procedencia autóloga o heteróloga. De manera rutinaria puede tener una concentración del 1%.

Otros factores de crecimiento (IGF-I, IGF-II y TGF-b, entre otros) y suplementos, se añaden según el tipo celular a mantener in vitro. Para el mantenimiento de las células madre se precisa de Factor inhibidor de la leucemia humano recombinante.

El implante biológico proviene de la activación del concentrado de plaquetas, su coagulación y retracción, inducido por el calcio presente en el medio de cultivo celular. La cola biológica se origina en los primeros minutos de activación plaquetar y se emplea como relleno de cualquier tipo de lesiones. El material de relleno se obtiene del trombo originado por la retracción plaquetar con el fin de rellenar defectos osteoarticulares.

Procedimiento especifico 1. - La unidad pilosebacea tiene como base el manteni- miento rutinario en cultivo de las células madre, partiendo de las obtenidas en general, de 12 unidades pilosebaceas para un frasco de cultivo de 25 cm2 de superficie, los subcultivos se realizan cuando llegamos a la subconfluencia celular y siempre se emplea el medio de cultivo específico. Si no empleamos este último, las células pierden capacidades y desarrollaremos una piel que se puede emplear como sustituto cutáneo.

Procedimiento específico 2. - Se procede a la obtención de osteoblastos mediante cultivo celular. Los defectos osteoarticulares de cualesquiera de las etiologías conocidas se limpian y se

les da una configuración geométrica (cilindrica, cuboidal u otra) acorde con el material de implante a utilizar; dichos implantes biológicos, llevan incorporados los osteoblastos cultivados; pueden adherirse mucho mejor mediante la cola biológica recién preparada. Se puede rellenar con el material congelado, liofilizado y/o pulverizado. Los pequeños defectos osteoarticulares pueden ser rellenados con la cola biológica recién preparada conteniendo o no las líneas celulares previamente estable- cidas. En cualquier caso la cola biológica puede o no contener células en el momento de su aplicación. Cualquier tipo de implante y/o apósito, se puede sumergir y/o empapar en la denominada cola biológica, al igual que el lugar de implantación o cobertura.

Procedimiento específico 3. - En el caso de desprendimiento de retina o en la retinitis pigmentaria se procede al cultivo de las línea celular preferente como puede ser el caso del epitelio pigmentario de retina. Se obtienen las células del cultivo, se resuspenden y se añade el concentrado de plaquetas creandose la cola biológica con la que rellenar los defectos retinianos.

Procedimiento específico 4. - En los desgarros osteotendinosos se puede introducir directamente la cola biológica con o sin células, mientras que en el caso de los grandes defectos se pueden utilizar implantes que sustituyan el hueso con la forma apropiada, revistiéndolo con la cola biológica o el material pulverizado.

Procedimiento específico 5.-

En el caso de los melanocitos, el procedimiento se inicia por el procesado enzimático con tripsina de 12 unidades pilosebáceas, obteniéndose células de la unión dermoepidérmica, constituidas en su mayoría por melanocitos, entre otros, siendo estas células las que se incorporan a un frasco de 25 cm2 de superficie, realizándose los subcultivos al alcanzar la subconfluencia celular y empleándose siempre el medio de cultivo específico, para evitar que las células pierdan capacidades y se desarrollen, hasta el momento de ser reintroducidas en las zonas lesionadas.

Las diversas alternativas y modificaciones que se propongan, quedan sujetas a las formas y variaciones que estén comprendidas en lo descrito.