【발명의 명칭】

항염 및 살균력이 증진된 치주질환 예방 또는 개선용 조성물 【기술분야】

본 발명은 항염증 효과가 우수한 동시에 살균제의 치면부착력을 증가시켜 살균효과가 극대화된 치주질환 개선 및 예방용 구강 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

. 치주질환은 흔히 풍치라고도 하며， 그 정도에 따라 치은염 (gingivi t i s) 과 치주염 (per iodont i t i s )으로 나뉜다. 치주질환의 직접적인 원인은 구강 내 세 균에 의해 치아에 지속적으로 형성되는 플라크 (plaque)라는 세균막으로， 이 플라 크가 제거되지 않고 단단해지면 치석이 된다. 플라크와 치석이 쌓이면 잇몸이 치아로부터 떨어지고， 이로 인해 틈이 벌어지면서 치아와 잇몸 사이에 치주낭이 형성되며， 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어지게 된다. 치주낭이 깊어지 면서 치주인대에 염증이 생기게 되고 골소실이 일어나게 되는 것이 치주질환이다. 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 치주질환으로 치은 (잇몸) 즉ᅳ 연조직에만 국 한된 형태를 치은염이라고 하고， 이러한 염증이 치은과 치조골 (잇몸뼈) 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 한다.

이러한 치주염의 원인으로는 구강 내에 존재하는 유해 세균이 방출하는 염증유발물질인 리포폴리사카라이드 (Lipopolysacchar ide , LPS)를 들 수 있다. 상기 리포폴리사카라이드에 의해 잇몸이 붓고 출혈이 일어나는 등 염증이 생성되 며， 이러한 염증을 개선하기 위한 항염 물질 (주로 생약추출물)을 첨가하여 효과 를 확인하는 선행연구가 많이 진행되어있다. 더불어 국내 제품에서는 판테놀， 초 산토코페를 각각을， 해외 제품에서는 글리시리진산디칼륨을 사용한 제품의 예가 있으나, 치주질환 개선 및 예방을 목적으로 상기 성분들을 모두 특히 선택 및 조 합하여 제조된 제품은 없는 것으로 확인되었다.

또 다른 치주염의 원인으로 치태 및 치석을 들 수 있다. 치태와 치석을 예방 및 개선하기 위하여 직접적 원인인 구강 내 유해세균의 살균이 필요하며 이 를 위해 선행연구 및 시판제품에서 다양한 살균제를 사용하고 있다. 그러나， 이 의 함량을 증가시킬 경우 효과가 증진되나 구강 자극을 피할 수 없으며， 비용적 인 부분도 무시할 수 없으므로 함량을 계속해서 증량할 수만은 없는 실정이다.

따라서 이에 따라 점증 물질 등을 사용하여 동일 함량의 살균물질의 치 면부착율을 높여 살균력을 증진시키는 연구가 많이 진행되고 있다. 이와 관련하 여， 예를 들어， 특허 제 10-2006-0089890호에서는 트리클로산의 구강 내 잔류효과 를 증대시키는 방법， 등록특허공보 10-0659139에서는 특정의 비이온성 계면활성 제를 최적의 배합농도로 항균력을 증진시키는 조성， 특허 제 10-2012-0058713호에 서는 폴리감마글루탐산을 함유하여 구강내 양이은성 항균제 잔류를 증대시키는 조성 등을 개시하고 있다. 그러나 이러한 선행기술들에 의하는 경우, 항균 작용 을 이용한 치주염 원인균 살균을 통한 예방만이 가능할 뿐， 기 발생한 잇몸 염증 에 대한 개선 효과는 거의 기대할 수 없는 실정이다. 한편， 등록특허 10- 0167019는 Ν ^α -장쇄 아실 염기성 아미노산 저급 알킬 에스테르 또는 그의 염을 이 용하여 살균물질인 염화세틸피리디늄의 치면 흡착력을 증가시키는 것을 개시하고 있으나， 실제 적용시 기대만큼의 효과를 나타내지 못했다.

이에 본 발명자들은 치주질환자의 구강 내 자극이 적으며 효능이 증진된 치주질환 개선 및 예방에 사용되는 구강용 조성물을 개발하고자 예의 연구하였고， 그 결과 항염증 효과가 우수한 동시에 살균제의 치면부착력을 증가시켜 살균효과 가 극대화된 우수한 조성을 확보한 후， 이러한 조성이 임상시험에서도 우수한 효 과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 하나의 목적은 항염증 및 살균 효과가 동시에 우수한 치주질환 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 항염증 및 살균 효과가 동시에 우수한 치주 질환 예방 또는 개선용 구강 조성물을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】 상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서， 본 발명은 글리시리진산 또 는 그의 염， 판테놀 및 초산토코페를을 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 의 약 조성물을 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 글리시리진산 또는 그의 염， 판테놀 및 초산토코페를을 포함하는 치주질환 예방 또는 개선용 구강 조성물을 제공한다. 상기 조성물들은 양이온성 살균제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 글리시리진산 또는 그의 염, 판테놀 및 초산토코페롤을 포함하 는 치주질환 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 글리시리진산 또는 그의 염， 판테놀 및 초산토코페롤을 포함하는 치주질환 예방 또는 개선용 구강 조성물을 제공한다.

【발명의 효과】

본 발명의 조성물은 항염 및 살균효과를 바탕으로 우수한 치태 생성 억제 및 치은염 예방 효과를 나타내는 바， 치주질환 예방， 개선 또는 치료 용도로 유 용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 항염시험 결과에 대한 그래프로 실시예 1-9， 비교예 1-5의 NO생성 량의 정도를 표현한 것이다.

도 2 및 도 3은 치은염 또는 경도의 치주질환 환자에 있어서 실시예 3-1 과 일반 치약 사용시， 치태지수의 변화값과 6주 경과 후 변화량에 대하여 표현한 것이다.

도 4 및 도 5는 치은염 또는 경도의 치주질환 환자에 있어서 실시예 3-1 과 일반 치약 사용시， 치은지수의 변화값과 6주 경과 후 변화량에 대하여 표현한 것이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

본 발명의 발명자들은 항염 효과 및 살균력이 동시에 우수한 치주질환 예 방 및 개선용 구강용 조성물을 개발하기 위해 연구하던 중， 글리시리진산 또는 그의 염， 판테놀 및 초산토코페를을 흔합하여 사용하면 우수한 항염증 효과가 도 출된다는 점올 확인하였고， 이를 일정 성분비로 사용하는 경우 양이온성 살균제 의 치아 접착력이 증가되어 살균력 또한 증대되는 것을 확인한 후 본 발명을 완 성하게 되었다.

따라서， 바람직한 양태에서， 본 발명에 따른 조성물은 항염증, 살균 또는 항플라크용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 글리시리진산은 감초에서 유래된 성분으로 염증 반 웅 과정 중 염증 반웅 매개물질의 생성을 감소시켜 염증을 억제하는 효과가 있으 며， 본 발명에서는 글리시리진산디칼륨, 글리시리진산암모늄과 같은 염 형태로도 사용될 수 있으나， 상기 예시된 염에 제한되는 것은 아니다.

글리시리진산 또는 그의 염은 양이온성 살균제의 치면 부착 효과에 영향 을 미칠 수 있으므로 그 조성 함량의 조정이 중요하다. 구체적인 일 양태로서， 본 발명에 따른 조성물에는 상기 글리시리진산 또는 그의 염이 전체 조성물 100 중량부 대비 0.001 내지 2 중량부， 0.01 내지 1 중량부 또는 0.05 내지 0.5 중량 부로 포함될 수 있다. 2 중량부 이상을 함유할 경우 제품의 향미가 떨어지고 함 께 포함되는 양이온성 살균제의 치면부착력이 감소하여 살균력에 영향을 주어 효 과가 감소할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 판테놀은 세포의 성장과 조직의 회복을 촉진하고 염증과 발적을 막아 구강내 상처를 보호하는 효과를 가진다. 초산토코페를 및 글 리시리진산 또는 그의 염 디칼륨과 병행하여 사용할 경우， 잇몸 염증 개선에 더 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서， 상기 판테놀은 전체 조성물 100 중량부 대비 0.005 내지 5 중량부， 0.01 내지 3 중량부 또는 0. 1 내 지 2중량부 포함될 수 있다. 0.005 중량부 미만의 경우 치주질환 개선에 대한 효과 및 상처 보호 효과가 미미할 수 있고， 5 중량부 초과의 경우 첨가량에 비해 효과의 상승 정도가 적어 비효율적일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 초산토코페롤은 비타민 E로서， 잇몸의 혈액순환을 촉진시키고 잇몸 상처 및 염증 치유에 영향을 주는 물질이며， 항산화 물질로도 널리 알려져 있다. 본 발명의 한 구체예에서， 상기 초산토코페를은 전체 조성물 100 중량부 대비 0.01 내지 1 중량부， 0.05 내지 0.5 중량부 또는 0. 1 내지 0.5 중량부 포함될 수 있다. 0.05 중량부 미만의 경우 효과가 미미할 수 있고 1 중 량부 초과시 제제의 안정성에 영향을 줄 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서， 상기 조성물은 양이온성 살균제를 추가로 포함 할 수 있다. 상기 양이온성 살균제는 양이온을 띠고 있으면서 치면 세균막 또는 타액 단백질과 결합함으로써 치석을 억제하고 타액 내 세균에 대한 살균작용을 나타내는 물질로 구체적으로는 염화세틸피리디늄， 염화핵살코늄, 염화벤잘코늄 및 클로르핵시딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으며， 바 람직하게는 염화세틸피리디늄을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구체예에서， 상기 양이온성 살균제는 전체 조성물 100 중 량부 대비 0.01 내지 1 중량부 또는 0.01 내지 0.1 중량부 포함될 수 있으나 이 에 제한되는 것은 아니다.

상기 구강용 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있으며， 예를 들어， 불소화 합물， 연마제， 습윤제， 감미제， 착향제， 기포제， 결합제， 방부제, pH 조절제， 등 과 같은 첨가제 등을 포함할 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 불소화합물은 치아의 내산성을 증대시켜 충치를 예방하는 작용을 하 는 것으로， 예를 들어， 불화나트륨， 일불소인산나트륨， 불화 주석으로 이루어진 군에서 선택된 단일 또는 이들의 흔합물일 수 있으며， 바람직하게는 일불소인산 나트륨일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 불소 화합물은 상기 전체 구강용 조성물 100 중량부에 대해 0.01 내지 2 중량부， 0.1 내지 1.5 중량부 또 는 0.5 내지 1 중량부 포함될 수 있다.

상기 연마제는 이산화규소， 탄산칼슘， 함수 알루미나， 인산일수소칼슘 및 중조로 이루어진 군에서 단일 또는 이들의 흔합물일 수 있고， 상기 전체 구강용 조성물 100 중량부에 대해 10 내지 60 중량부로 포함될 수 있다.

상기 습윤제는 비결정성 소르비를액， 글리세린， 프로필렌 글리콜 및 폴리 에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 단일 또는 이들의 흔합물일 수 있고， 상기 전체 구강용 조성물 100 중량부에 대해 3 내지 60 중량부로 포함될 수 있다. 상기 감미제는 사카린나트륨， 자일리를， 에리스리를， 스테비아， 수크랄로 오스，아세설팜칼륨 및 아스파탐으로 이루어진 군에서 선택된 단일 또는 이들의 흔합물일 수 있으며， 상기 전체 구강용 조성물 100 중량부에 대해 0.01 내지 2 중량부로 포함될 수 있다.

상기 착향제는 페퍼민트 오일， 스페아민트 오일 및 멘를로 이루어진 군에 서 선택된 단일 또는 이들의 흔합물일 수 있고, 상기 향미제의 함량은 구강용 조 성물에서 통상적으로 사용되는 함량일 수 있으며， 특별히 제한하지 않는다.

상기 기포제는 라우릴 황산 나트륨， 라우릴 사르코신산나트륨, 코카마이 도프로필 «1ᅵ타인， 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로 필렌계 축합 고분자로 이루어진 군에서 선택된 단일 또는 이들의 흔합물일 수 있 고， 상기 전체 구강용 조성물 100 중량부에 대해 0.5 내지 5 중량부로 포함될 수 있다.

상기 결합제는 카라기난， 잔탄검， 카르복시메틸셀를로오스나트륨， 및 폴 리비닐피를리돈으로 이루어진 군에서 선택된 단일 또는 이들의 흔합물일 수 있고， 상기 전체 구강용 조성물 100 중량부에 대해 0. 1 내지 5 중량부로 포함될 수 있 다.

상기 방부제는 메틸파라벤 또는 프로필파라벤일 수 있다.

상기 pH 조절제는 인산이수소나트륨， 인산일수소나트륨， 구연산， 구연산 나트륨， 인산， 주석산， 주석산 나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 단일 또는 이 들의 흔합물일 수 있고， 본 발명에 따른 구강용 조성물은 상기 pH 조절제를 이용 하여 적절한 pH , 예를 들어， pH 5 내지 8로 조절될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 구체적으로는 치약， 구강청정제， 구강세정게， 구강 맛사지 크림 등의 제형을 가질 수 있다. 또한， 본 발명에서 제공하는 구강용 조성물의 배합성분은 위에서 설명한 성분 외 에도 조성물의 용도와 종류에 따라 다양하게 배합하여 사용할 수 있다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하， 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범 위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균 적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이 다. <제조예 1>실시예 1 내지 9, 비교예 1 내지 5의 조성물 제조

잇몸 염증 개선 성분의 다양한 농도의 조성물을 다음 표 1과 같이 제조하 였고， 제제에 첨가되어 있는 기타 원료의 영향을 배제하기 위해 하기 표의 조성 으로만 조성물을 제조하였다.

비교예로 사용되는 조성물의 성분을 표 2 내지 표 3에 기재하였다.

비교예 4는 치주질환용으로 시판 중인 파로돈탁스 (GSK) 및 잇치 (동화약품) 의 약효성분 조성과 본 발명과의 조성의 비교를 위해 상기 시판품들과 동일한 조 성을 가지는 것으로 제조하였고， 비교예 5는 조성물에 대한 용매의 영향을 확인 하기 위하여 제조하였다.

【표 11

【표 2】

【표 3] 함량 (%) 카모밀레 틴크 라타니아 틴크 몰약 틴크 에탄을 정제수 비교예 4 0. 125 0. 125 0.062 5 to 100 비교예 5 - ᅳ ᅳ 5 to 100

<제조예 2> 실시예 1-1 내지 9-1 및 비교예 1-1 내지 1-3의 액체 치약 제 조

상기 염증 개선 조성물을 추가하여 만든 양이온성 살균제 베이스인 액체 치약의 살균력을 확인하기 위해 액체 치약을 제조하였다.

실시예 1-1 내지 9-1 및 비교예 1-1 내지 1-3의 치약으로서， 글리시리진 산디칼륨， 판테놀， 및 초산토코페를을 아래 표 4에 기재된 조성과 같이 사용하고 일불소인산나트륨 0.76 중량 ¾> , 염화세틸피리디늄 0.05 증량 %， 폴리옥실수소화피 마자유 0.5 중량 %， 에탄올 5 중량 %， 착향제 적량으로 사용하며， 전체 함량이 100 중량 %가 되도록 정제수를 첨가하여 액체 치약을 제조하였다. 초산토코페를， 착향 제， 폴리옥실수소화피마자유를 에탄을에 용해시키고， 나머지 성분은 정제수에 용 해시킨다. 먼저 조제한 에탄올조의 용액을 정제수조에 넣고 용해시킨 후 정용하 여 제조하였다.

【표 4】

함량 (%) 글리시리진산디칼륨 판테놀 초산토코페를 실시예 1-1 0.005 1 0.2 실시예 2-1 0.01 1 0.2 실시예 3-1 0.1 1 0.2 실시예 4-1 1 1 0.2 실시예 5-1 0. 1 0.01 0.2 실시예 6-1 0. 1 0.1 0.2 실시예 7-1 0.1 3 0.2 실시예 8-1 0. 1 1 0.05

실시예 9-1 0. 1 1 0.5

비교예 1-1 0. 1 0 _, 0

비교예 2-1 0 1 0

비교예 3-1 0 0 0.2 <시험예 1>산화질소 (NO) 생성억제능 평가

항염증 성분인 글리시리진산디칼륨의 농도별 항염증 효과를 확인하기 위 하여 치주질환원인균인 P. gingival is 유래 LPS를 처리하여 염증을 유발하고， LPS 처리 후 발생되는 염증매개물질인 NO의 양이 평가물질에 의해 감소되는 정도를 평가하였다. 구체적인 방법은 아래와 같다.

Raw 264.7 cell (한국세포주은행 (KCLB)， 한국)을 96 well plate에 seeding 하고 24시간 배양하였다. 배지 (DMEM 배지 + 1 FBS + penicillin + streptomycin)를 갈아주고 약 1시간 후에 약물 처리하고， 약물 처리 1시간 후에 LPS를 처리하여 24시간 후에 세포를 배양한 배지를 well당 50uL씩 취해 측정액 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid 와 0.1% napht hy 1 ethyl ened i amine in 5% phosphoric acid를 측정 직전에 1:1로 섞어서 사용)과 1:1로 섞어 540nm에서 흡 광도로 NO 생성값을 측정하였다. 결과를 아래 표 5 및 도 1에 나타내었다.

【표 5】

구분 NO 생성량 (ug/mL)

1.65

실시예 2 1.63

실시예 3 1.58

실시예 4 1.52

실시예 5 1.68

실시예 6 1.63

실시예 7 1.62

실시예 8 1.72

실시예 9 1.65

비교예 1 1.87

비교예 2 1.95

비교예 3 2.2

비교예 4 2.13

비교예 5 3

대조군 (LPS) 3.2 상기 표 5 및 도 1에 나타난 바와 같이, 비교예 1 내지 5와 비교했을 때 글리시리진산디칼륨， 판테놀， 초산토코페를을 모두 함유한 실시예의 조성물에서 염증반웅 매개물질인 NO 생성량이 감소하는 우수한 효과가 나타났다. 또한 실시 예 1 내지 9는 시판 중인 제품의 조성인 비교예 4보다도 우수한 항염 작용을 나 타내었다.

실시예에서 세 물질 조성물의 농도에 따른 NO 생성량 변화가 확인되었으 나， 판테놀과 초산토코페를은 일정 농도 이상에서 그 효과가 증가하지 않는 결과 를 나타내었다.

이러한 항염 물질이 제제 중에 투입되었을 때 미치는 영향을 확인하고자 추가적인 시험을 수행하였다ᅳ

<시험예 2> 양이온성 살균제의 치면부착력 평가

히드록시아파타이트 (HA) (Bio-Rad Laborator i es , Inc . , U. S) 250mg를 직경 13睡가 되도록 di sc를 성형한 후 600 ^° C에서 6시간 소결하여 HA di sc를 제조하였 다. 이를 채취한 타액 2mL에 넣고 18시간 방치하여 전처리한 후， 이를 다시 실시 예 1-1 내지 9-1 및 비교예 1-1 내지 3-1의 시험액이 각각 lmL이 들어있는 vial 로 옮겨 넣고, 37 ^° C lOOrpm 조건의 water bath에 넣고 30분간 반웅시켰다. 이후 di sc를 꺼내어 증류수 6mL로 표면에 묻은 시험액을 세척하고 추출용매 (50mM 소듐 라우릴 설페이트, 40mM 시트레이트 완층액 (ρΗ3 · 0) / 아세토니트릴 = 30/70) lOmL 이 담긴 vi al에 넣어 20분간 soni cat ion하였다. 추출한 액을 0.45um 필터로 여 과하여 염화세틸피리디늄 (Cetylpyr idinium chlor ide , CPC) 정량법에 따라 HPLC분 석하였고， 결과를 아래 표 6에 나타내었다.

【표 6】

구분 CPC (ug/mL)

실시예 1-1 19.9

실시예 2-1 19.8

실시예 3-1 19.9

실시예 4-1 15.8 실시예 5-1 17.6

실시예 6-1 18.6

실시예 7-1 20. 1

실시예 8-1 18.7

실시예 9-1 18.8

비교예 1-1 13.3

비교예 2-1 20.9

비교예 3-1 20.3 글리시리진산디칼륨과 판테놀을 첨가하여 제조한 실시예의 흡착력 평가를 진행한 결과 글리시리진산디칼륨은 살균제의 흡착력을 저하시키나， 반대로 판테 놀은 염화세틸피리디늄의 치면부착력을 높이는 것을 확인하였다.

먼저 동일제형， 유사 성분을 함유한 시판제품인 G .U.M Dental Rinse GNN

(Suns tar , Japan) 의 염화세틸피리디늄의 치면부착력을 확인한 결과， 그 값이 12.6ug/mL였다. 상기 표 7 에 나타낸 바와 같이， 실시예 1-1 내지 9-1의 치면부 착력은 지유엠 덴탈린스 지엔엔보다 우수하게 나타났다. 비교예의 결과와 비교 시， 실시예 1-1 내지 9-1 조성의 제제에서는 글리시리진산디칼륨의 양이 감소할 수록, 판테놀의 양이 증가할수록 치면부착력이 증가하는 것을 확인하였고， 두 성 분의 투입 함량이 중요한 것으로 나타났다. 상기에 언급한 실시예의 글리시리진 산디칼륨과 판테놀의 함유량에서는 염화세틸피리디늄의 치면부착력이 개선되는 결과를 나타내었다. - 상기 진행한 두 가지 시험-항염증 효과， 염화세틸피리디늄의 치면부착력 을 종합해볼 때 실시예 3ᅳ 1이 가장 우수한 것으로 나타났다.

또한 치면부착력 향상을 통해 살균효과가 증진될 것으로 기대되어 두 시 험 결과 가장 우수한 결과를 나타낸 실시예 3-1과 치면 흡착력이 낮게 나타난 비 교예 1-1 두 제제로 치주질환 원인균에 대한 살균력 평가를 진행하였다. <시험예 3>치주질환원인균에 대한살균력 시험

치주질환 원인균으로 알려진 두 가지 균주인 Porphyro nas gingival is^ Aggregatibacter actinc ycetemcomitans ⁶ ^ 대하여 부착 및 부유 항균력 시험을 진행하였다. 살균물질의 흡착력이 높은 제제와 낮은 제제를 비교하여 부착력 개 선으로 살균력이 개선되었는지를 확인하였다.

[Porphyromonas gingival is배양]

Sheep blood와 hem in menadione이 첨가된 TSA 배지에 균을 획선 접종하고 혐기성 컨테이너 안에 넣어 37 ^° C 인큐베이터에서 세균 집락이 관찰될 때까지 배 양하였다..집락이 관찰되면 5% Horse serum과 Hemine menadione이 첨가된 TSB에 접종하고 A ₅₆₀ =0.7(약 lxi0 ^9' cells/ )까지 배양하였다. 계대배양 후 75cuf cell culture flask에 horse serum, hem in menadione이 첨가된 TSB 배지와 배양균 0.1% 를 접종하고 24시간마다 배지를 교체해주며 8일간 배양하였다.

[Aggregatibacter act inomycetemcomi tans배양]

BHI agar에 균을 획선 접종하고 37 ^° C， 5% C0 ₂ 로 조정한 인큐베이터에서 세 균 집락이 관찰될 때까지 배양하였다. 집락이 관찰되면 BHI broth에 접종하고 A ₅₆₀ =0.7(약 1 10 ⁹ cells/ )까지 배양하였다. 75cui ² Cell culture flask에 BHI broth와 배양균 0.1%를 접종하고 24시간마다 배지를 교체해주며 3일간 배양하였 다.

[부착시험 (Biofilm Method)]

해당 균을 배양 후. flask에 담긴 배양균을 버렸다. PBS로 flask 내부를 3 회 세척한 후 3 의 시험용액을 첨가하고 18초 동안 흔들어 주었다. PBS로 flask 내부를 3회 세척한 후， 1 m의 PBS를 첨가해 Cell Scraper로 바이오필름을 긁어내었다. 긁어낸 바이오필름을 15초 동안 Vortexing 하였다. 현탁액을 PBS로 10배씩 희석하여 준비해 둔 BHI Agar와 TSA Plate에 도말하고 A . ac t i nomycet emcom i t ans는 3일후， P. gingival is는 7일 배양 후 집락을 관찰하였 다. 음성대조군으로는 시험용액대신 PBS를 처리하였다. [부유시험 (Planktonic Method)]

Broth에 배양된 1 의 균을 취하여 13,500 rpm에서 원심분리하고 상층액 을 제거하였다. 침전물에 시험용액을 가하고 15초 동안 분쇄한 다음 13,500rpm 에서 30초간 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 후에 PBS로 3회 세척하고 1 의 PBS로 현탁하였다. 현탁액을 PBS로 10배씩 희석하여 준비해둔 BHI, TSA Plate에 도말하고 A . ac t i nomyce t emcom ί t ans는 3일， P. gingival is는 7일 배양 후 집락을 관찰하였다. 음성대조군으로는 시험용액대신 PBS를 처리하였다.

[수학식 1]

생균수 계산: N=CXD

N: 생균수， C: 집락수 (각 집락 수 평균치)， D: 희석배수 (희석액의 희석배 수)

[수학식 2]

감소율:

D: 생균수 감소율， A: 대조군의 생균수, B: 시료처리군의 생균수 부착시험결과를 표 7에 나타내고， 부유시험 결과를 표 8에 나타냈다. 【표 7】

** % i 11 compared to PBS control .

【표 8】

* Mean(SD) Log ₁₀ _trans formed counts to test solution.

** % Kill compared to PBS control . 상기 표 8 및 표 9에 나타난 바와 같이 양이온살균제의 치면부착력이 높 아진 조성인 실시예 3-1이 치주질환 원인균에 대해 우수한 살균력을 나타내었다. 또한， 치면부착력이 증가함에 따라 살균력이 증가되는 효과를 볼 수 있었다. 따라서 이 모든 시험 결과를 가지고 실시예 3-1의 치주 염증 개선 및 예 방 효과를 아래와 같이 임상시험을 통해 확인하였다.

<시험예 4>치태 및 치은 지수 측정

본 발명의 치태 및 치은지수 확인을 위하여 치과병원에서 피험자를 모집 하여 시험을 진행하였다. 치은염 및 경도의 치주염환자인 성인남녀 46명을 대상 으로 시판중인 액체치약 (가그린©333)과 본 발명의 실시예 3-1를 오픈라벨로 시 험 진행하였으며 시험기간은 총 6주로 진행하였다. 시험 전 baseline을 측정 및 스케일링을 하고 2， 4， 6 주에 치태지수 (Plaque Index, PI), 치은지수 (Gingival index, GI)를 측정하였다. 시험 기간 동안 치약을 하루 3회 식사 후 사용하도록 하였다. 치태지수는 상하악 대표치아인 #16， 21， 24, 36, 41， 44 치아에서 Loe- Silness plaque index(PI)를 사용하여 치은연상 치태축적상태를 치태 착색제 (GUM Red cote, Suns tar Butler, Chicago, IL, USA)를 이용하여 관찰한다. 치아당 6부 위 (순면， 원심순면， 근심순면， 설면， 원심설면， 근심설면)에서 점수화하여 피실 험자당 전체 PI점수는 각 치면 점수의 평균치로 구하였다.

치은지수는 #16， 21， 24， 36, 41， 44 치아에서 Loe-Silness gingival index(GI) 로서 치은 염증상태를 치아당 6부위 (순면， 원심순면， 근심순면， 설면， 원심설면， 근심설면)에서 점수화하여 피실험자당 전체 GI점수는 각 치면 점수의 평균치로 구하였다.

시험 결과는 아래 표 9 및 도 2 내지 도 5에 나타내었다.

【표 9】 Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD

0 1.82 0.22 1.71 0.32 1.36 0.23 1.34 0.34

2 0.87 0.41 0.59 0.48 ^* 0.88 0.7 0.54 0.59

4 0.93 0.45 0.34 0.25 ^* 0.89 0.48 0.33 0.42 ^*

6 0.88 0.47 0.39 0.30 ^* 1.01 0.58 0.36 0.43 ^*

(*p<0.05) 상기 표 9 및 도 2 및 도 4에 따르면, 치태지수 (PI )와 치은지수 (Gi )는 두 군 모두 시간이 경과함에 따라 감소하였으나 6주 경과 후 실시예 3-1의 PI , GI지 수가 더 감소하여 일반치약 대비 큰 개선율을 보여 우수한 치태 생성 (실시예 77.19% vs . 대조군 51.65%)억제 및 치은염 예방 (실시예 73.13% vs . 대조군 25.74%) 효과를 나타내었다 (도 3 및 도 5 참조) . 또한 시험 기간 중 이상반웅 및 부작용의 예는 보고되지 않았다.

위에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 염화세틸피리디늄， 일불소인산나트륨 초산토코페롤， 글리시리진산디칼륨 및 판테놀을 함유한 치주질환 예방 및 개선용 구강 조성물은 치은 지수, 치태 지수에서 우수한 효과를 나타내었다. 따라서 위 5가지 성분의 조합을 통해 항염작용， 판테놀 첨가로 치면부착력 증진이 증진되고 이를 통한 항균 작용 강화를 통해 치주 질환의 개선 효과가 더욱 증대함을 알 수 있다.