ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASA Y TRATAR LA MUCOPOLISACARIDOSIS TIPO IVA

CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación se desarrolla en el campo médico del tratamiento de la mucopoiisacaridosis tipo IVA. Particularmente, la presente divulgación se enfoca en el desarrollo de chapetonas farmacológicas que se unen a la enzima GAI.NS y composiciones de las mismas para el tratamiento de mucopoiisacaridosis tipo IVA. Adicionalmente, la presente divulgación se desarrolla en el campo de la producción de la enzima GALNS recombinante humana.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La mucopoiisacaridosis tipo IVA (MPS IVA), también llamada síndrome de Morquío A, es una enfermedad de almacenamiento lisosomal (LSD) causada por mutaciones en el gen que codifica Ia enzima N-3cetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS, EC 3.1.6.4). Dicha deficiencia de GALNS conduce a la acumulación lisosomal de los glucosaminogiicanos (GAG) queratán sulfato (QS) y condroitin-6- sulfato (C6S), causando un impacto en el desarrollo del cartílago y los huesos. Las tasas mundiales de incidencia de la MPS IVA varían de 0.14 a 0.009 (por cada 10,000 nacimientos). Las opciones de tratamiento para pacientes con MPS IVA actualmente incluyen medicamentos antiinflamatorios no esteroideos, antibióticos, oxigeno suplementación, procedimientos quirúrgicos para corregir deformidades ortopédicas y obstrucciones traqueales, terapia de reemplazo enzimático (TRE) y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT). Los pacientes bajo ERT con elosulfasa alfa han mostrado algunas mejoras en los síntomas clínicos de la enfermedad. Particularmente, una administración intravenosa semanal de 2.0 mg/kg durante 24 semanas produjo una ligera mejoría en la prueba de caminata de 6 minutos y la reducción del QS urinario en los estudios de fase III, así como una mejora en la ventilación voluntaria máxima, el rendimiento de actividades de la vida diaria y altura/tasa de crecimiento.

Sin embargo, la TRE tiene efectos limitados en la corrección de las anomalías esqueléticas, corneales y cardíacas, debido a la avascularidad de los tejidos y la corta vida media de la enzima. En un estudio reciente, pacientes MPS IVA tratados con TRE continuaron exhibiendo un crecimiento pobre a pesar de la intervención temprana de la TRE antes de los 5 años de edad. Estos hallazgos indican que la TRE intravenosa actual no es efectiva para corregir el crecimiento anormal en pacientes con MPS IVA. El tratamiento de pacientes con MPS IVA mediante el trasplante de médula ósea (HSCT) es relativamente nuevo, y estudios recientes han demostrado actividades enzimáticas a largo plazo y normales, aumento de la densidad mineral ósea lumbar, mejora en el movimiento ambulatorio y remisión de la vía aérea estrecha. Sin embargo, el HSCT es un procedimiento de alto riesgo con muchas posibles complicaciones y alta mortalidad. Las limitaciones de las terapias actuales indican una necesidad insatisfecha de nuevas estrategias terapéuticas para mejorar y ampliar las opciones de tratamiento para pacientes con MPS IVA.

La proteína GALNS es un hornodímero de 120 kDa con dos monómeros compuestos por poiipéptidos de 40 y 15 kDa conectados por enlaces disulfuro y modificados por dos N- glucosilaciones. Actualmente, se han reportado más de 217 mutaciones perjudiciales en el gen GALNS, incluyendo mutaciones de sentido erratio/sin sentido (73%), mutaciones por splicing (9%), pequeñas deleciones (10%), pequeñas inserciones (2%), pequeñas mutaciones de inserción-deleción (1%), grandes deleciones (2%), grandes inserciones/duplicaciones (1%) y reordenamientos complejos (1%). Las correlaciones genotipo-fenotipo de GALNS han predícho mutaciones que pueden afectar el núcleo hidrofóbico, los puentes salinos, la afinidad de ligando, la superficie accesible al solvente y los sitios de N-glicosilación.

Las chapetonas farmacológicas son moléculas pequeñas que se unen a la protelna objetivo en el retículo endoplásmico. Estas moléculas usualmente sirven como plantillas moleculares que estabilizan la conformación nativa de una proteína, o promueven el correcto plegamiento y tráfico de una proteína mulante. Las chapetonas farmacológicas generalmente se unen al sitio activo de una proteina a una concentración inferior a 10 μΜ y aumentar su estabilidad térmica. En comparación con la TRE, las chapetonas farmacológicas tienen ventajas de administración oral, perfil de distribución tisular amplío y menos problemas de inmunogenicidad. En el caso de las enfermedades de almacenamiento lisosomal, las chapetonas farmacológicas se han probado experimentalmente en la enfermedad de Fabry con 1-deoxygalactonojirimicina (migalastat), asi como en la enfermedad de Gaucher, enfermedad de Pompe y gangliosidosis (GM1 y GM2). Para la mucopciísacaridosís se han estudiado chapetonas farmacológicas para los tipos II, IIIC y IVB, pero aún no para MPS IVA.

En general, se ha observado que estas moléculas aumentan la actividad enzimátíca de las proteínas mutantes de una manera dependiente de la mutación, lo que puede ser suficiente para mejorar la mayoría de los síntomas de la enfermedad, lo que sugiere que las chaperonas podrían emplearse como monoterapia. Además, se ha observado que estos medicamentos pueden mejorar la estabilidad de las enzimas lisosomaies recombinantes, lo que sugiere que la administración conjunta de una chaperona farmacológica y la enzima puede aumentar la eficacia de la TRE.

Adicionalmente, el plegamiento de proteínas representa un importante cuello de botella en la producción de proteínas reccmhínantes. Las proteínas mal plegadas no solo reducen la actividad biológica de una proteína, sino que también desencadenan el estrés celular, lo que resulta en bajos rendimientos de producción. Se ha demostrado que la mejora del plegamiento de la proteina GALNS aumentó significativamente su actividad. En este sentido, las chapetonas farmacológicas que se unen a GALNS recombinante pueden mejorar eI plegamiento adecuado de la misma, su actividad y rendimiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación busca proporcionar soluciones a los anteriores problemas y dificultades mediante el desarrollo de composiciones que comprenden una proteína N -acetilgalactosamina· 6-suifatasa (GALNS) y una chaperona farmacológica que se une a GALNS útiles en el tratamiento de la mucopolisacaridosis tipo IVA. En el contexto del presente desarrollo, una proteína GALNS adecuada puede ser una proteína recombinante o silvestre con o sin mutaciones.

Particularmente, el presente desarrollo se refiere a una composición que comprende una proteina GALNS y una chaperona farmacológica que se une GALNS seleccionada del grupo que consiste de ezetimíbe, pranlukast, bromocriptina o derivados de los mismos, en donde la relación molar entre GALNS y la chaperona farmacológica es de 10:1 a 10:0,1.

En una modalidad adicional, se revela aquí un método para aumentar la producción de N- acetílgalactosamina-6-suIfatasa recombinante humana (rhGALNS) que comprende los pasos de: a) cultivar células huésped que expresan GALNS en condiciones en donde se sobre-expresa la enzima GALNS; b) adicionar aI medio de cultivo una chaperona farmacológica que se une a la enzima GALNS hasta obtener una concentración entre 0.001 μΜ y 10 μΜ; c) purificar la enzima GALNS recombinante del medio de cultivo. Por otra parte, se divulga un método para tratar la mucopolisacaridosis tipo IVA, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende una chaperona farmacológica que se une a N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra A) las estructuras de las chaperonas farmacológicas que unen a GALNS, ezetimibe, pranlukast y bromocriptina.

La Figura 2 corresponde a los efectos de las chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS, ezetimíbe y pranlukast, sobre la actividad enzimátíca y la estabilidad térmica de hrGALNS. A) los resultados muestran el porcentaje de actividad en relación con los resultados observados sin ezetimibe o pranlukast. Adicionalmente, se muestra en B) los resultados del ensayo de desplazamiento térmico, en donde la hrGALNS se incubó con o sin ezetimibe o pranlukast.

La Figura 3 corresponde a los efectos de la chaperona farmacológica que se une a GALNS, bromocriptina, sobre la actividad enzimática de hrGALNS.

La Figura 4 muestra A) el efecto de las chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS, ezetimibe y pranlukast, en la producción de hrGALNS en E. cotí; y B) el efecto de estas (0.001 μΜ) en la producción de hrGALNS en la levadura Pichia pastoris.

La Figura 5 muestra la producción de GALNS recombínante en P, pastoris a escala de biorreactor (1.7 L). En particular, la enzima GALNS humana recombinante fue producida con o sin supiementación de 0.001 μΜ de la chaperona farmacológica que se une a GALNS, ezetimibe. La actividad de GALNS fue medida en la fracción extracelular.

La Figura 6 muestra el efecto de las chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS, ezetimibe y pranlukast, en la producción de GALNS recombinantes en células HEK293. Particularmente, se midieron las actividades enzimátícas en los Usados celulares (intracelulares) y los medios de cultivo (extracelulares) después de los tratamientos con las chaperonas farmacológicas. La Figura 7 muestra el efecto del tratamiento con la chaperona farmacológica que se une a GALNS, bromocriptina, en la producción de GALNS recombinantes en células HEK293.

La Figura 8 muestra los efectos tie las chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS sobre la actividad enzimátíca GALNS mutatia. En particular, A) muestra el efecto del ezetímibe y pranlukast sobre la actividad GALNS en fibroblastos de pacientes con IVA MPS. Los fibroblastos se trataron con diferentes concentraciones de ezetímibe y pranlukast durante 48 h, después de lo cual se midió la actividad de GALNS en el Usado celular. La linea de puntos corresponde a los niveles de actividad nativa; y B) muestra el efecto de ezetímibe (Eze) y pranlukast (Pran) sobre los niveles de proteína GALNS según lo determinado por el análisis de Western blot. Los fibroblastos se trataron con diferentes concentraciones de ezetímibe y pranlukast durante 48 horas, después de lo cual se analizaron los lisados proteicos de los fibroblastos. Los niveles de proteina GALNS se normalizaron contra la densidad de β-actina y se informaron como veces de cambio con respecto a los niveles de proteina nativa {linea de puntos).

La Figura 9 muestra el tratamiento de fibroblastos MPS IVA GM00958 (A), GM00593 (B), y GM01361 (C) con la chaperona farmacológica que se une a GALNS, bromocriptina.

La Figura 10 muestra el efecto de las chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS, ezetímibe (A) o pranlukast (B) en la reducción de la masa de lisosomas en fibroblastos de pacientes con MPS IVA. Las células se trataron con ezetimíba o pranlukast durante 48 h, después de lo cual las células se tiñeron con el colorante LysoTracker Red DND-99. Los resultados se presentan como intensidad celular normalizada al nivel de fluorescencia de células no afectadas (lineas punteadas).

La Figura 11 muestra la evaluación de los marcadores de autofagia p62 y LC3B-II en fibroblastos MPS IVA tratados con las chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS, ezetímibe (A) o pranlukast (B). Los fibroblastos se trataron con diferentes concentraciones de las chaperonas farmacológicas durante 48 h, después de lo cual se analizó la proteina en los lisados celulares. Los resultados se normalizaron frente a la densidad de β-actina y se informaron como diferencias de pliegue con respecto a los niveles de densidad de células no afectadas (línea punteadas). La Figura 12 muestra los efectos del tratamiento combinado de hrGALNS con las chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS, ezetimibe o pranlukast, en la reducción del tamaño del lisosoma en fibroblastos de pacientes con MPS IVA. La administración conjunta de hrGALNS producida en la levadura P. pastoris y las chaperonas farmacológicas ezetimibe y pranlukast disminuyó el tamaño de los lisosomas a los niveles nativos. Las células fueron tratadas durante 72 h con hrGALNS en presencia o ausencia de ezetímiba o pranlukast. Las células se tiñeron con el colorante LysoTracker Red DND-99 y los resultados se presentan como intensidad celular normalizada al nivel de fluorescencia de fluorescencia de células no afectadas (lineas punteadas).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación se refiere a métodos y composiciones útiles para tratar la mucopolisacarídosis tipo IVA (MPS IVA), también conocida como la enfermedad de Morquio A. i. Definiciones

En el contexto de Ia presente descripción, las formas singulares "un/una", "e!/ía" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente Indique lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye una pluralidad de excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo mezclas de los mismos.

Una “composición farmacéutica" se refiere a la combinación de un agente activo con un vehículo inerte o activo que hace a la composición adecuada para el diagnóstico o uso terapéutico in vitro, in vivo o ex vivo.

Una "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de activo suficiente para inducir resultado biológico y/o terapéutico deseado. Dicho resultado puede ser aliviar los signos, síntomas, o causas de una enfermedad o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. La cantidad efectiva de las composiciones divulgadas en la presente divulgación variaran dependiendo de factores como la chaperona farmacológica que se una a GALNS usada, opcionalmente de la proteina especifica recombinante de GALNS usada, el régimen de dosificación, el momento de la administración, el peso y la edad del sujeto a ser tratado, la severidad de la enfermedad a ser tratada, el modo de administración, etc, todos los cuales puede ser determinados por una persona medianamente versada en la materia.

En el contexto de la invención, los términos “tratar", " tratamiento" y similares se refieren a obtener el efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completamente o parcialmente la enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de cura parcial o completa de una enfermedad y/o el efecto adverso que produce una enfermedad.

Adicionalmente, el término " tratar " puede cubrir cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero e incluye prevenir una enfermedad e Incluye prevenir un trastorno en un sujeto que puede estar predispuesto a un trastorno, pero que puede no haber sido diagnosticado aún, por ejemplo, prevenir los síntomas de la MPS IVA en un paciente con las características genéticas de la MPS IVA.

En el contexto del presente desarrollo " tratar " además incluye la disminución sistemática de los síntomas asociados con la patología y/o un retraso en el establecimiento de los síntomas. Evidencia clínica y subclínica del " tratamiento " puede variar con la patología, el individuo y el tratamiento.

La "administración" puede ser efectuada en una dosis, de manera continua o intermitente a lo largo del curso del tratamiento. Los métodos para determinar los medios más efectivos y las dosis para la administración son conocidos para la persona versada en la materia y pueden variar con la composición usada para la terapia, el propósito de la terapia, la célula objetivo que esta siento tratada y el sujeto a ser tratado. Administraciones únicas o múltiples pueden ser llevadas a cabo con el nivel de dosis y patrón seleccionado por el médico traíante. Las formulaciones de dosis adecuadas y los métodos de administración los agentes son conocidos en el campo técnico de la invención. El "sujeto" de diagnosis o tratamiento es una célula o un mamífero, incluyendo un humano.

Los agentes, composiciones y kits del presente desarrollo pueden ser usados en la fabricación de medicamentos y para el tratamiento de humanos mediante la administración de acuerdo con los procedimientos convencionales, tales como un agente activo en composiciones farmacéuticas o una combinación de agentes activos en kits de partes. Un agente de acuerdo con la presente divulgación puede ser administrado para terapia mediante cualquier ruta adecuada, específicamente mediante administración oral o intravenosa.

Los términos "pclinucleótidc" y "oligonucleótido" se usan indistintamente y se refieren a una forma poiimérica de nucieótídos de cualquier longitud, ya sea desoxírribonudeótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Un polinucieótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Se pueden impartir modificaciones a la estructura de nucleótidos antes o después del ensamblaje del polínucleótido. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes que no son nucleótidos. Un polínucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente marcador. El término también se refiere a las moléculas de doble cadena y de una cadena. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier modalidad de esta descripción que sea un polínucleótido abarca tanto la forma de doble cadena como cada una de las dos formas complementarías de una cadena conocidas o previstas para formar la forma de doble cadena.

Un polinucleótido está compuesto por una secuencia especifica de cuatro bases de nucleótidos: atienina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); y uracilo (U) por timina cuando el polinucleótido es ARN. Por lo tanto, el término "secuencia polinucleótida " es la representación alfabética de una molécula polinucleótida. Esta representación alfabética puede ingresarse en bases de datos en un computador que tiene una unidad central de procesamiento y usarse para aplicaciones bioinfcrmáticas como la genómica funcional y la búsqueda de homología.

La "identidad ^' o "similitud' se refiere a la similitud de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos polinucleótidos. La similitud e identidad se pueden determinar comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear para fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base o aminoácido, las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de identidad o similitud entre secuencias es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por las secuencias. Una secuencia "no relacionada " o “no homologa " comparte menos del 40% de identidad, o alternativamente menos del 25% de identidad, con una de las secuencias del presente desarrollo.

Para cada polinucleótido o polipéptido divulgado en la presente divulgación, también se contemplan sus equivalentes biológicos lo cuales tienen un porcentaje de identidad de secuencia específico (por ejemplo, al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%) y que tienen la misma actividad biológica o similar del polipéptido de referencia o que codifica un polipéptido que tiene la misma actividad biológica o similar que el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. En algunas modalidades, un equivalente biológico tiene una, dos, tres, cuatro o cinco adiciones, delecíones o sustituciones de residuos de aminoácidos o nucleótidos en comparación con el polipéptido o polinucleótido de referencia.

Un polinucleótido o una región de polinucleótidos (o un polipéptido o región polipeptídica) tiene un cierto porcentaje (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%) de "identidad de secuencia " con otra secuencia cuando ese porcentaje de bases (o aminoácidos) son los mismos al comparar las dos secuencias alineadas. Esta alineación y eI porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar utilizando programas de software conocidos en la técnica.

II, Métodos para tratar MPS IVA

La presente divulgación proporciona, en una modalidad, un método de tratamiento de la MPS IVA mediante la administración de una cantidad efectiva de una chaperona farmacológica que se une a GALNS. Adicionalmente, el presente desarrollo también proporciona combinaciones de terapia de reemplazo de enzimas junto con la administración de chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS.

En el contexto del presente desarrollo, una chaperona farmacológica se refiere a una molécula pequeña que se une a la proteína GALNS, la cual aumenta la actividad enzimátíca y estabiliza dicha enzima.

De acuerdo con una modalidad de la presente divulgación, se proporciona un método para tratar la mucopolisacaridosis tipo IVA (MPS IVA) en un paciente humano en necesidad del mismo. En un aspecto, el método comprende administrar oralmente una cantidad efectiva de una composición que comprende una chaperona farmacológica que se une a GALNS.

En un aspecto, la chaperona farmacológica que se une a GALNS se selecciona del grupo que consiste de anilinopirimidina 1, 1,13-metil-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahldro- 1h-ciciopenta[a]fenantren-17-il, ezetimibe, pranlukast, nifursol, zosuquidar, fulvestrant, travoprcst, diosmina, baicaiina, panobinostat, zucapsaicína, preconaril, fenleuton, nilotiníb, merimepodib, (2E)-N-hidroxi-3-[l-metil-4-(fenilacetii}-lh-pirrol-2-ii]pro p-2-enamitia, bromocriptina, tarazepida, tainiflumato, dexametasona-21-sulfobenzoato,

(8S,9S,13R,14S,16S,17R)-13-metiI-6,7,8,9,ll,12,14,15,16,1 7-decahidrocicIopenta[a]fenantren- 3,16,17-triol, devazepída, dihidroergotoxina, acetofénido de algestona, (6S ,12ar)-tadalafil, nimorazol, plevitrexed, picrotin, lumacaftor, bisoctrizol, palosuran, dihidroergotamina, ergocristina y penfluridol.

En una modalidad, la chaperona farmacológica que se une a GALNS se selecciona del grupo que consiste de ezetimibe, pranlukast, bromocriptina o un derivado de los mismos. En una modalidad, la chaperona farmacológica que se une a GALNS es ezetimibe. En otra modalidad, la chaperona farmacológica que se una a GALNS es pranlukast. En otra modalidad, la chaperona farmacológica que se una a GALNS es bromocriptina. Las moléculas divulgadas en este estudio son consideradas como las primeras chapetonas farmacológicas descritas para la enzima lisosomal GALNS.

En algunas modalidades, la chaperona farmacológica que se une a GALNS puede administrarse de manera diaria, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez por semana o una vez cada dos semanas. En algunas modalidades, la chaperona farmacológica que se une a GALNS se administra durante una ventana de tiempo de no más de 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 10 años, 15 años, 20 años o 25 años. En una modalidad de la invención, la chaperona farmacológica que se una a GALNS se administra durante toda la vida del paciente.

En algunas modalidades, por cada administración, la cantidad de la chaperona farmacológica que se une a GALNS es de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. En algunas modalidades, para cada administración, la cantidad de chaperona farmacológica que se une a GALNS es de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.25 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 0.15 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 0.20 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 0.25 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 0.9 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 0.8 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg kg a aproximadamente 0.7 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 0.6 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0.2. mg/kg a aproximadamente 0.9 mg/kg, de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 0.8 mg/kg, de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 0.7 mg/kg, de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 0.6 mg/kg, de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 0.4 mg/kg. En algunas modalidades, para cada administración, la cantidad de chaperona farmacoiógica que se une a GALNS es de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.05 mg/kg. En algunas modalidades, para cada administración, la cantidad de la chaperona farmacológica que se une a GALNS es de aproximadamente 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.11 mg/kg, 0.12 mg/kg, 0.13 mg/kg, 0.14 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.16 mg/kg, 0.17 mg/kg, 0.18 mg/kg, 0.19 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.21 mg/kg, 0.22 mg/kg, 0.23 mg/kg, 0.24 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.26 mg/kg, 0.27 mg/kg, 0.28 mg/kg, 0.29 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,85 mg/kg, 0,9 mg/kg, 0,95 mg/kg, 1 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg o 2 mg/kg.

En algunas modalidades, por cada administración, la cantidad de la chaperona farmacológica que se une a GALNS es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg por paciente humano. En algunas modalidades, para cada administración, la cantidad de la chaperona farmacológica que se une a GALNS es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 95 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 90 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 85 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 80 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 75 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 65 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 55 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 95 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 90 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 85 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 80 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 75 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 65 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 55 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 45 mg, para m aproximadamente 5 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 95 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 90 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 85 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 80 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 75 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 65 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 55 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 95 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 90 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 85 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 80 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 75 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 65 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 55 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 25 mg, o de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 20 mg.

En algunas modalidades, por cada administración, ia cantidad de ia chaperona farmacológica que se une a GALNS es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 35 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 45 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 35 mg a aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 70 mg a aproximadamente 80, o de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 90 mg.

En cualquiera de los métodos descritos en este documento, debe entenderse, incluso si no siempre se establece explícitamente, que se administra una cantidad efectiva de la chaperona farmacológica que se une a GALNS del presente desarrollo al sujeto. La cantidad puede ser determinada empíricamente por el médico tratante y variará con la edad, el sexo, el peso y la salud del sujeto. Considerando las anteriores variables, un experto administrará una cantidad terapéuticamente efectiva ai sujeto a tratar. Se contempla que una cantidad terapéuticamente efectiva de la chaperona farmacológica que se une a GALNS descrita en el presente documento puede contener desde aproximadamente 0.01 miligramos de la chaperona farmacológica que se une a GALNS por kilogramo de peso corporal de un sujeto hasta 2 gramos de la chaperona farmacológica que se une a GALNS por kilogramo de peso corporal de un sujeto. En algunos aspectos, una cantidad terapéuticamente efectiva de la chaperona farmacológica que se une a GALNS es de 50 mg a 2000 mg, o de 100 mg a 1000 mg, sin limitación.

Adicionalmente, la presente divulgación proporciona métodos para tratar la MPS IVA que comprenden la administración de una chaperona farmacológica que se une a GAI.NS junto con terapia de reemplazo de enzimas (TRE). En una modalidad particular, la TRE comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de GALNS recombinante humana (hrGALNS). En un aspecto, la hrGALNS comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEQ ID NO 1:

MAAWAATRWWQLLLVLSAAGMGASGAPQPPNILLLLMDDMGWGDLGVYGEPSRETPN LDRMAAEGLL

FPNFYSANPLCSPSRAALLTGRLPIRNGFYTTNAHARNAYTPQEIVGGIPDSEQLLP ELLKKAGYVSKIVGKWH

LGHRPQFHPLKHGFDEWFGSPNCHFGPYDNKARPNIPVYRDWEMVGRYYEEFPINLK TGEANLTQIYLQEA

LDFIKRQARHHPFFLYWAVDATHAPVYASKPFLGTSQRGRYGDAVREIDDSIGKILE LLQDLHVADNTFVFFTS

DNGAALISAPEQGGSNGPFLCGKQTTFEGGMREPALAWWPGHVTAGQVSHQLGSIMD LFTTSLALAGLTP

PSDRAIDGLNLLPTLLQGRLMDRPIFYYRGDTLMAATLGQHKAHFWTWTNSWENFRQ GIDFCPGQNVSGV

TTHNLEDHTKLPLIFHLGRDPGERFPLSFASAEYQEALSRITSWQQHQEALVPAQPQ LNVCNWAVMNWAP

PGCEKLGKCLTPPESIPKKCLWSH

En una modalidad de la invención, la hrGALNS comprende la SEQ ID NO:1 o una secuencia de o una secuencia de aminoácidos que tiene (a) una identidad de secuencia (por ejemplo, de al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO: .1. y (b) que tienen la actividad enzimáTica de la proteína GALNS humana. La terapia de reemplazo de enzimas para tratar la MSPS IVA es conocida por la persona versada en el campo del presente desarrollo y se encuentra divulgado en documentos como US20190224283, el cual se incorpora por referencia a la presente divulgación.

MI. Métodos para preparar la proteina humana recombinante GALNS

La presente divulgación proporciona ademas métodos para preparar la hrGALNS usada en la terapia de reemplazo de enzimas mencionada anteriormente. En general, la hrGALNS puede ser preparada mediante la expresión de polinucleótidos que codifican las secuencias de polipéptidos de GALNS en una célula huésped apropiada. Esto se puede lograr por métodos de ADN recombinante, lo cual corresponde a tecnología conocida por los expertos en la materia.

La presente divulgación proporciona un método para aumentar la producción de hrGALNS que comprenden adicionar al medio de cultivo una chaperona farmacológica que se une a GALNS. Los inventores del presente desarrollo encontraron que la adición de una chaperona farmacológica que se une a GALNS, aumentó la producción de hrGALNS en diferentes sistemas de expresión de la misma.

En una modalidad, el presente desarrollo proporciona un método para aumentar la producción de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa recombinante humana (hrGALNS) que comprende los pasos de: a) cultivar células huésped que expresan GALNS en condiciones en donde se sobre-expresa la enzima GALNS; b) adicionar al medio de cultivo una chaperona farmacológica que se une a la enzima GALNS; c) purificar la enzima GALNS recombinante del medio de cultivo.

La chaperona farmacológica que se une a GALNS se selecciona del grupo que consiste de anilinopirimidina 1, 1,13-metil-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahidro- 1H- cicIopenta[a]fenantren-17-il, ezetimibe, pranlukast, nifursol, zosuquidar, fulvestrant, travoprost, diosmína, baicalina, panobinostat, zucapsaicina, preconariI, fenleuton, nilotiníb, merimepodib, (2E)-N-hidroxi-3-[l-metil-4-(fenilacetilj-lH-pirrol-2-iI]pro p-2-enamida, bromocriptina, tarazepida, talniflumato, dexametasona-21-sulfobenzoato,

(8S,9S,13R,14S,16S,17R)-13-metil-6,7,8,9,11,12,14,15,16,1 7-decahidrocícIopenta[a]fenantren- 3,16,17-triol, devazepida, dihitiroergotoxina, acetofénido de algestona, (6S ,12ar) tadalafil, nimorazol, plevitrexed, picrotin, lumacaftor, bisoctrizol, palosuran, dihidroergotamina, ergocristina y penfiuritiol.

En una modalidad, la chaperona farmacológica que se une a GALNS se selecciona del grupo que consiste de ezetimibe, pranlukast, bromocriptina o un derivado de los mismos. En una modalidad, la chaperona farmacológica que se une a GALNS es ezetimibe. En otra modalidad, la chaperona farmacológica que se una a GALNS es pranlukast. En otra modalidad, la chaperona farmacológica que se una a GALNS es bromocriptina.

En algunas modalidades, la chaperona farmacológica que se une a GALNS se adiciona al medio de cultivo de hrGALNS depende de la identidad de la chaperona usada y se encuentra en una cantidad entre 0,00.1. μΜ a 10 μΜ, En una modalidad, la cantidad de chaperona farmacológica es de 0.0015 μΜ a 50 μΜ, de 0,0020 μΜ a 50 μΜ, de 0.0030 μΜ a 50 μΜ, de 0.0040 μΜ a 50 μΜ, de 0.0050 μΜ a 50 μΜ, de de 0,00.1. μΜ a 40 μΜ, de 0,00.1. μΜ a 30 μΜ, de de 0.001 μΜ a 20 μΜ, de 0.001 μΜ a 15 μΜ, de 0.001 μΜ a 12 μΜ, de 0.001 μΜ a 10 μΜ, de 0.001 μΜ a 8 μΜ, de 0,001 μΜ a 6 μΜ, de 0.001 μΜ a 5 μΜ, de 0.001 μΜ a 3 μΜ, de 0.001 μΜ a 1 μΜ, de 0.001 μΜ a 0.8 μΜ, de 0.001 μΜ a 0.6 μΜ, de 0.001 μΜ a 0.4 μΜ, de 0.001 μΜ a 0.2 μΜ, de 0.001 μΜ a 0.1 μΜ, de 0.001 μΜ a 0.08 μΜ, de 0.001 μΜ a 0.06 μΜ, de 0.001 μΜ a 0.04 μΜ, de 0.001 μΜ a 0.02 μΜ, de 0.001 μΜ a 0.01 μΜ, de 0.002 μΜ a 0.009 μΜ, de 0.003 μΜ a 0.007 μΜ, de 0.004 μΜ a 0.006 μΜ.

En algunas modalidades la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de células de mamíferos, bacterias y levaduras. En una modalidad, las células huésped se seleccionan del grupo que consiste de células HEK293, £ cali y P. pastarte.

En una modalidad de la invención, la hrGALNS producida comprende la SEQ ID NO:l o una secuencia de o una secuencia de aminoácidos que tiene (a) una identidad de secuencia (por ejemplo, de al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO: 1 y (b) que tienen la actividad enzimátíca de la protelna GALNS humana. La terapia de reemplazo de enzimas para tratar la MSPS IVA es conocida por la persona versada en el campo del presente desarrollo y se encuentra divulgado en documentos como US20190224283, el cual se incorpora por referencia a la presente divulgación.

IV. Composiciones

En una modalidad adicional, la presente divulgación se proporciona composiciones que comprenden una chaperona farmacológica que se une a GALNS y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la chaperona farmacológica que se une a GALNS se selecciona del grupo que consiste de anilinopirimidina 1, 1,13-metil-3-oxa-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahidro- lh-cicIopenta[a]fenantren-17-il, ezetimibe, pranlukast, nifursoi, zosuquidar, fulvestrant, travoprost, diosmina, baicalina, panobinostat, zucapsaicina, preconarii, fenieuton, nilotinib, merimepodíb, (2E)-N-hidroxi-3-[l-metii-4-(fenilacetíI)-1H-pirrol-2-iljpr op-2-enamida, bromocriptina, tarazepida, tainiflumato. dexametasona-21-sulfobenzoato,

(8S,9S,13R,14S,16S,17R)-13-metil-6,7,8,9,11,12,14,15,16,1 7-decahidrociclopenta[a]fenantren- 3,16,17-trioi, devazepida, dihidroergotoxina, acetofénido de algestona, (6S ,12ar)-tadalafil, nimorazol, plevítrexed, picrotin, lumacaftor, bisoctrizol, palosuran, dihidroergotarnina, ergocristina y penfiuridoi.

En una modalidad, la chaperona farmacológica que se une a GALNS se selecciona del grupo que consiste de ezetimibe, pranlukast, bromocriptina o un derivado de los mismos. En una modalidad, la chaperona farmacológica que se une a GALNS es ezetimibe. En otra modalidad, la chaperona farmacológica que se una a GALNS es pranlukast. En otra modalidad, la chaperona farmacológica que se una a GALNS es bromocriptina.

En una modalidad de la invención, la hrGALNS comprende la SEQ ID NO:l o una secuencia de o una secuencia de aminoácidos que tiene (a) una identidad de secuencia (por ejemplo, de al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO: 1 y (b) que tienen ia actividad enzimática de ia proteína GALNS humana. La terapia de reemplazo de enzimas para tratar la MBPS IVA es conocida por la persona versada en el campo del presente desarrollo y se encuentra divulgado en documentos como US20190224283, el cual se incorpora por referencia a ia presente tiivuigación.

En una modalidad adicional, la presente divulgación proporciona composiciones que comprenden hrGALNS, una chaperona farmacológica que se une a GALNS y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la relación molar entre hrGALNS y la chaperona farmacológica es de 10:1 a 100:1, de 10:1 a 80: 1, de 10:1 a 50:1, de 8:1 a 50:1 o de 5:1 a 50:1. En una modalidad, la relación molar entre GALNS y la chaperona farmacológica es de 5:1 a 50:1. La cantidad de hrGALNS en las composiciones de la presente divulgación depende de la identidad de la chaperona farmacológica que se une a GALNS incluida en la composición y una persona versada en la materia podría calcularla a partir de las proporciones antes dadas y la cantidad específica de la chaperona farmacológica que se une GALNS en la composición. En algunas modalidades, la composición de la presente divulgación comprende una cantidad de una chapetona farmacológica que se une a GALNS es de aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 0.01 mg, de aproximadamente 0.01. mg a aproximadamente 0.1 mg, de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente lmg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 2.5 mg, de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 35 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 45 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 35 mg a aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 70 mg a aproximadamente 80, o de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 90 mg.

En el contexto deI presente desarrollo, un " vehículo farmacéuticamente aceptable " se refiere a cualquier diluyente, excipiente o vehículo que pueda usarse en las composiciones o kits del presente desarrollo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, como albúmina sérica humana, sustancias tampón, como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de giicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno fosfato potásico, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polietilen- polioxipropileno-polímeros en bloque, polietilenglicol y grasa de lana. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en textos de referencia estándar en este campo. Se seleccionan preferiblemente con respecto a la forma de administración prevista, es decir, tabletas orales, cápsulas, elixires, jarabes y similares, y de acuerdo con las prácticas farmacéuticas convencionales.

Las composiciones farmacéuticas tiel presente desarrollo se pueden fabricar por métodos bien conocidos en la técnica, tales como procesos convencionales de granulación, mezcla, disolución, encapsulacíón, líofilización o emulsión, entre otros. Las composiciones pueden producirse en diversas formas, que incluyen gránuics, precipitados o partículas, polvos, incluidos polvos liofilizados, secados por rotación o secados por pulverización, polvos amorfos, inyecciones, emulsiones, elixires, suspensiones o soluciones. Las formulaciones pueden contener opcionalmente estabilizadores, modificadores de pH, tensioactivos, modificadores de biodisponibilitiad y combinaciones de estos.

Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas pueden prepararse como suspensiones o soluciones líquidas usando un liquido estéril, tal como aceite, agua, alcohol y combinaciones de los mismos. Se pueden añadir tensioactivos, agentes de suspensión o agentes emulsionantes farmacéuticamente adecuados para administración oral o parenteral. Las suspensiones pueden incluir aceites, como el aceite de maní, aceite de sésamo, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz y aceite de oliva. La preparación de la suspensión también puede contener ásteres de ácidos grasos, tales como oleato de etilo, miristato de isopropilo, glicéridos de ácidos grasos y glicéridos de ácidos grasos acetilados. Las formulaciones en suspensión pueden incluir alcoholes, tales como etanol, alcohol isopropílico, alcohol hexadecilico, glicerol y propilenglicol. Los éteres, como el poli (etilenglicol), los hidrocarburos de petróleo, como el aceite mineral y la vaselina, y el agua también se pueden usar en formulaciones en suspensión.

Además de las formas de dosificación descritas anteriormente, los excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables y las formas de dosificación son generalmente conocidas por los expertos en la técnica y se incluyen en la descripción. Debe entenderse que una dosis especifica y un régimen de tratamiento para un paciente en particular dependerán de una variedad de factores, incluida la actividad de las proteínas hrGALNS especificas, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta, la función renal y hepática del paciente, y el momento de la administración, la tasa de excreción, la combinación de medicamentos, el juicio tiel médico o veterinario tratante y la gravedad de la enfermedad particular que se está tratando.

V. Kits En una modalidad adicional, la presente divulgación se refiere a un kit útil en el tratamiento de la MPS IVA que comprende: i) una cantidad terapéuticamente efectiva de una chaperona farmacológica que se une a GALNS; y ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de GALNS humana recombinante.

En un aspecto, la chaperona farmacológica que se une a GALNS se selecciona del grupo que consiste de aniiinopirimidina 1, 1,13-metiI-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17 dodecahidro- 1h-ciclopenta[a]fenantren-17-il, ezetimibe, pranlukast, nifursol, zosuquidar, fulvestrant, travoprost, diosmina, baicalina, panobinostat, zucapsaicina, preconaril, fenleuton, nilotinib, merimepodíb, (2E)-N-hidroxi-3-(l-metil-4-(fenilacetil}-lH-pirrol-2-il¡pr op-2-enamida, bromocriptina, tarazepída, talniflumato, dexametasona-21-sulfobenzoato, (8S,9S,13R,14S,16S,17R)-13-metil-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-d ecahídrociclopenta[a]fenantren- 3,16,17-triol, devazepida, dihidroergotoxina, acetofénído de algestona, (6S ,12ar)-tadalafil, nimorazol, plevítrexed, picrotin, lumacaftor, bisoctrizol, palosuran, tiihidroergotamina, ergocristina y penfluridol.

En una modalidad, la chaperona farmacológica que se une a GALNS se selecciona del grupo que consiste de ezetimibe, pranlukast, bromocriptina o un derivado de los mismos. En una modalidad, la chaperona farmacológica que se une a GALNS es ezetimibe. En otra modalidad, la chaperona farmacológica que se una a GALNS es pranlukast. En otra modalidad, la chaperona farmacológica que se una a GALNS es bromocriptina.

En una modalidad de la invención, la hrGALNS comprende la SEQ ID NO:1 o una secuencia de o una secuencia de aminoácidos que tiene (a) una identidad de secuencia (por ejemplo, de al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO: 1 y (b) que tienen la actividad enzimática de la proteína GALNS humana. La terapia de reemplazo de enzimas para tratar la MSPS IVA es conocida por la persona versada en el campo del presente desarrollo y se encuentra divulgado en documentos como US20190224283, el cual se incorpora por referencia a la presente divulgación.

En una modalidad adicional, la presente divulgación proporciona kits que comprenden hrGALNS, y una chaperona farmacológica que se une a GALNS, en donde la relación molar entre hrGALNS y la chaperona farmacológica es de 10:1 a 100:1, de 10:1 a 80: 1, de 10:1 a 50:1, de 8:1 a 50:1 o de 5:1 a 50:1. En una modalidad, la relación molar entre GALNS y la chaperona farmacológica es de 5:1 a 50:1. La cantidad de hrGALNS en los kits de la presente divulgación depende de la identidad de la chaperona farmacológica que se une a GALNS incluida en la composición y una persona versada en la materia podría calcularla a partir de las proporciones antes dadas y la cantidad específica de la chaperona farmacológica que se une GALNS en la composición.

En algunas modalidades, la composición de la invención comprende una cantidad de una chaperona farmacológica que se une a GALNS es de aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 0.01 mg, de aproximadamente 0.01. mg a aproximadamente 0.1 mg, de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente lmg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 35 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 45 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 35 mg a aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 70 mg a aproximadamente 80, o de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 90 mg.

En una modalidad de la divulgación, los componentes del kit puede ser administrados para terapia mediante cualquier ruta adecuada conocida en la técnica. En una modalidad particular, la chaperona farmacológica que se une a GALNS se administra mediante vía oral y hrGLANS mediante vía intravenosa. El kit de acuerdo con la presente divulgación incluye cualquier kit en el que los reactivos están contenidos en recipientes separados. Dichos recipientes incluyen pequeños recipientes de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o de papel. Tales recipientes permiten la transferencia eficiente de los reactivos de un compartimiento a otro compartimento de tal manera que las muestras y los reactivos no presenten contaminación cruzada y los agentes o soluciones de cada recipiente puedan añadirse de manera cuantitativa de un compartimento a otro.

Los siguientes ejemplos corresponden a modalidades particulares del presente desarrollo y no pretenden ser limitativos del alcance de la protección.

EJEMPLOS

Los resultados incluidos en esta sección se muestran como la media i la desviación estándar (SO) y se analizaron medíante un ANOVA, seguido de la prueba de Holm-Sidák cuando fue apropiado. Las diferencias entre los grupos se consideraron significativas cuando p <0.05 en GraphPad PRISM 7.0.

Ejemplo 1. Identificación de moléculas pequeñas que se unen a hrGALNS.

Se identificaron 40 compuestos que interactúan con GALNS mediante métodos bioinformáticos (Tabla 1). Ezetimibe (ZINC3810860), pranlukast (ZINC22001688) y bromocriptina (ZINC53683151) fueron seleccionados para un análisis posteriores (Figura 1).

Tabla 1. Lista de chapetonas farmacológicas que se unen a GALNS

Ejemplo 2. Inhibición de la actividad de GALNS mediante las moléculas pequeñas seleccionadas que se unen a hrGALNS.

La actividad de GALNS se ensayó utilizando 4-metilumbeliferil^-d-galactopiranosidc-6-sulfato (Toronto Chemicals Research, North York, ON, Canadá) como sustrato. Una unidad (U) se definió como los nmoles de 4-metilumbeliferil liberados por hora. La actividad específica de GALNS se expresó como U/mg de protelna según lo determinado por el ensayo de Lowry. Para evaluar el efecto inhibidor de la molécula pequeña que se une a hrGALNS, esta enzima se incubó junto con el sustrato y diversas concentraciones de compuestos, seguido de la detección de la generación de productos fluorescentes.

La estabilidad térmica se evaluó mediante el ensayo de desplazamiento térmico como se reporta anteriormente ¹ . Para este propósito, se mezclaron 5 μΜ hrGALNS, en acetato de sodio 25 mM pH 5.0, con 1 μΜ de la molécula pequeña que se une a hrGALNS y 20X SYPRO orange (Molecular Probes, Thermo Fisher Scientífic, Eugene, OR, EE. UU.). La desnaturalización térmica se realizó en un equipo Applied Biosystems ViiA7 con el software VíiA7 RUO (Applied Bíosystems, Thermo Fisher Scientífic, Carisbati, CA, EE. UU.). La curva de fusión se realizó de la siguiente manera: 1) 2 min a 25 ° C, 2) incrementos de 1 °C/30 segundos hasta una temperatura final de 95 °C, y 3) 2 min a 95 °C, La Tm se calculó trazando la primera derivada de la emisión de fluorescencia en función de la temperatura (-df/dT). Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Para evaluar el efecto de la molécula pequeña que se une a hrGALNS sobre la actividad de GALNS en células, se sembraron IxlO ⁵ células/pozo en una placa de 6 pozos y se cultivaron durante un día. Las diluciones del compuesto se agregaron a las células y se incubaron durante 48 h seguido de lisis celular usando desoxicolato de sodio al 1% (Sigma-Aldrich). Las actividades enzimáticas de los lisados celulares se determinaron como se describe anteriormente, fibroblastos no afectados y con MPS IVA tratados con DMSO se utilizaron como controles. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

Tanto ezetimibe como praniukast inhibieron la actividad enzimática de hrGALNS en un 40% a 50% a una concentración de 10 μΜ (Figura 2A). Adicionalmente, tanto ezetimibe como praniukast aumentaron la estabilidad térmica de hrGALNS en aproximadamente 5 *C (Figura 2B), Adicionaimente, se encontró que la bromocriptina reduce la actividad de GALNS de una manera dependiente de la dosis, llegando a una reducción del 24.4% a una concentración de 10 μΜ (Figura 3).

Juntos, los resultados revelaron que ezetimibe, praniukast y bromocriptina son inhibidores débiles y se unen directamente a GALNS y, por lo tanto, pueden funcionar como chaperonas farmacológicas de GALNS.

Ejemplo 3. Aumento en la producción de hrGALNS mediante la adición de chaperonas farmacológicas que se unen a hrGALNS.

Las producciones de hrGALNS en Escherichia coli BL21 (DE3) y Pichia pastoris GS115 se llevaron a cabo a una escala de matraz agitado (100 mi) como se describe anteriormente ^2,3,4 . La producción de hrGALNS en células de mamífero se realizó usando células HEK293 (ATCC CRL1573) transfectadas con el vector pCXN-GALNS. Las células HEK293 se cultivaron en medio modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco, Thermo Físher Scíentifíc, Granti IsIand, NY, EE. UU.) Suplementado con suero fetal bovino al 15% (Eurobio, Les Lilis, Francia), penicilina 100 U mL ^-1 , y estreptomicina .1.00 U ml. ^-1 (Walkersville, MD, EE, UU.), a 37 °C en una incubadora con CO ₂ al 5%. se utilizó Lípofectamine 2000 en la transfección según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Thermo Fisher Sdentific, San José, CA, EE. UU.). Las chaperonas farmacológicas se disolvieron en DMSO y se añadieron a diferentes concentraciones durante la producción de hrGALNS. La actividad de GALNS se midió en el iisado celular (células HEK293) o sobrenadante celular (E. coli y P. pastoris). La hrGALNS producida en P. pastoris se purificó del medio de cultivo siguiendo un protocolo descrito anteriormente ⁵ . Brevemente, el medio de cultivo (aproximadamente 1.7 L) se filtró secuencialmente a través de 0.45 y 0.22 μm usando membranas de poliéter sulfona (Pall Corp, Port Washington, NY, EUA). El filtrado se ultrafiltró a través de una membrana de corte de .30 kDa (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.), El producto retenido se dializó en tampón de acetato (25 mM, pH 5,0). Finalmente, la hrGALNS se purificó mediante cromatografía de intercambio catiónico seguida de cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones con la mayor actividad de GALNS se agruparon, diafiltraron contra acetato de sodio 25 mM, pH 5,0, y se iiofiiizaron.

Después tie la adición de ezetimibe o pranlukast a los cultivos de E. coli BL21 (DE3), la actividad GALNS en la fracción íntracelular no cambió. En la fracción extraceiular, la actividad GALNS se incrementó hasta 1.3 y 1.7 veces (p <0.001) con respecto a cultivos tratados con DMSO, en presencia de ezetimibe y pranlukast, respectivamente, como se ve en la Figura 4A.

En el sistema de expresión de P. pastoris, se detectó hrGALNS en la fracción extracelular debido a la presencia de un péptido señal de secreción. La adición de 0.001 μΜ de ezetimibe o pranlukast cada 24 h en el cultivo condujo a un aumento de hasta 5.0 veces la actividad de GALNS en comparación con los cultivos tratados con DMSO (Figura 4B). La actividad enzimática más alta en el cultivo se observó después de 48 h de incubación con ezetimibe (p <0,0001), en comparación con la actividad enzimática en el cultivo de control a las 72 h. Se observaron resultados similares durante la producción de hrGALNS en P. pastoris a escala de biorreactor (1,7 1.) (Figura 5).

En el sistema de expresión de mamíferos con el plásmido pCXN-GALNS, las células HEK293 transfectatias mostraron un aumento de 9,3 y 10 veces en la actividad de GALNS íntracelular y extracelular (Figura 6). El tratamiento con 0,01 μΜ de ezetimibe no aumentó la actividad GALNS íntracelular, pero indujo un ligero aumento en la actividad extracelular (1,16 veces); mientras que 0.001 μΜ de ezetimibe produjo un marcado aumento en la actividad de GALNS tanto intra (1.5 veces) como extracelularmente (1.6 veces). Por otro lado, el tratamiento con 0.01 μΜ y 0.001 μΜ de praniukast produjo un aumento de 1.4 y 1.3 veces en la actividad GALNS intracelular, respectivamente, y 1.7 y 1.8 veces extracelular, respectivamente (Figura 6). Adícionalmente, la Figura 7 muestra que el tratamiento de células HEK293 que sobreexpresan GALNS humana con bromocriptina 10 μΜ produjo un aumento del 54% en la actividad de GALNS en comparación con el tratamiento con DMSO

Juntos, los resultados indicaron que ezetimíbe, pranlukast y bromocriptina podrían aumentar la producción de hrGALNS al mejorar el plegamiento y el trafico adecuados de las proteínas GALNS recién sintetizadas.

Ejemplo 4. Ensayo en fibroblastos derivados de pacientes con MPS IVA Los fibroblastos de individuos no afectados y derivados de pacientes con MPS IVA se obtuvieron del Instituto Coriell. Las células se cultivaron en DMEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Grand ísland, NY, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal aI 10% (Eurobío, Les Ulis, Francia) a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ .

Las mutaciones en los fibroblastos MPS IVA se identificaron y confirmaron como p,R61W, p.R94C, p.F285del, p.A393S y p.W405_T406del. Los análisis Western blot contra GALNS, p62 y LC3B se realizaron en fibroblastos no afectados y con MPS IVA, tratados con una chaperona farmacológica usando DMSO como control. Las células se sembraron en placas de 6 pozos corno se describió anteriormente. Se cargaron cantidades equivalentes de Usados celulares (20 μg) en geles BisPís Tris al 10% de NuPAGE™ (Invitrogen, Thermo Fisher Scientifíc) y se transfirieron a membranas de PVDF usando iBIot™ Transfer Stack e ¡Slot 2 Dry Blotting System (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Las membranas se bloquearon con StartingSlock (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) a temperatura ambiente durante 1 h. Después del bloqueo, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios [anticuerpo monoclonaI de ratón anti-P62 (anticuerpo SQSTM1 (D-3) en el tampón de bloqueo (SC-28359, Santa Cruz Biotechnology), anticuerpo rncnoclonai de conejo anti-LC3B (# 3668S, Cell Signaiing Technology), el anticuerpo poiicional de conejo anti-GALNS (ab!87516, Abcam) o anticuerpo monoclonal de ratón anti-β -actina (#37005, Cell Signaiing Technology)). Las membranas se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario IgG de cabra anti-ratón (# 7076S) o IgG de cabra anti-conejo (# 7074P2, Cell Signaiing Technology, Danvers, MA, EE. UU.) conjugado con peroxidasa de rábano (HRP, dilución 1: 3000 en tampón de bloqueo). Las bandas de la protelna especifica se visualizaron usando un reactivo de quimíolumíníscencía (Luminata ™ Western HRP Chemiiuminescence Substrate, EMD Millipore, Burlington, MA, EUA) y posteriormente se analizaron usando el software NIH Image J.

Como se muestra en la Figura 8A, todos los fibroblastos de los pacientes evaluados tuvieron una actividad reducida de la enzima GALNS entre el 20% y el 64% comparados con la actividad del fibroblastos no afectados. Ademas, el análisis de Western blot mostró niveles de GALNS reducidos en todos los fibroblastos de los pacientes (Figura 8B). El tratamiento con ezetimibe aumentó significativamente la actividad de GALNS 1,6, 1.4, 2,5 y 2.5 veces en los fibroblastos GM01361, GM01259, GM00958 y GM00593 en comparación con las células tratadas con DMSO, respectivamente (Figura 8A). Con el tratamiento con 0,001 μΜ de ezetimibe, la actividad GALNS en fibroblastos de pacientes GM01259 fue igual a la de los fibroblastos nativos. El análisis de Western blot mostró que el tratamiento con ezetimibe 0,01 o 0,001 μΜ aumentó significativamente los niveles de proteína GALNS en todos los fibroblastos MPS IVA (Figura 88). El tratamiento con pranlukast produjo un aumento en la actividad de GALNS en fibroblastos de pacientes GM01361 (p.R61W / p.W405_T406del) y GM00958 (p.A393S), aunque con menos eficacia que ezetimibe (Figura 8A). Los resultados de Western blot mostraron que el tratamiento con pranlukast aumentó significativamente los niveles de proteína GALNS en todos los fibroblastos de los pacientes evaluados (Figura 8B).

Adicionalmente, se observó una respuesta dependiente de la mutación al tratamiento con bromocriptina. Los fibroblastos MPS IVA GM00593 (p.R386C/p.F285del) mostraron un aumento del 60% en la actividad de GALNS; mientras que en los fibroblastos MPS IVA GM01361 (p.R61W / p.W405_T406dei) tuvieron un aumento del 14,2% en la actividad de GALNS. Por otro lado, no se observó mejoría en la actividad de los fibroblastos MPS IVA GM00958 (p. A393S) (Figura 9).

Ejemplo 5. Efecto en la masa lisosomal en fibroblastos derivados de pacientes con MPS IVA mediante chapetonas farmacológicas que se unen a GALNS

Las células HEK293 que sobreexpresan GALNS se trataron con las chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS durante 48 h seguido de un lavado celular e incubación con Lysotracker ^® Green DND-26 50 nM (Sondas Moleculares, Thermo Fisher Scientific, San José, CA, EE. UU.) en un medio DMEM completo a 37°C por 1 hora. Para la tinción de inmunofluorescencia, las células (después del tratamiento compuesto) se lavaron dos veces con PBS 1X, se fijaron con paraformaidehido al 4% y se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,1% seguido de bloqueo con albúmina de suero bovino al 2% en TBS 1X. Después del bloqueo, las células se incubaron durante la noche a 4°C con un anticuerpo policlonal de conejo anti-GALNS (abl87516, Abcam) en el tampón de bloqueo. Se adicionó IgG de cabra anti-conejo (H+L) conjugado con Alexa Fluor ^® 633 (A-21070, Thermo Físher Scientific, San José, CA, EE. UU.) a una dilución 1: 1,000 en el tampón de bloqueo. Los núcleos celulares se tiñeron con tiiclorhidrato de 4',6-diamidíno-2- fenílindol (DAPI, Thermo Fisher Scientific, San José, CA, EE. UU.). Las células se visualizaron utilizando un microscopio Axio Observer Z1 (ZEISS, Birkertód, Dinamarca) con un juego de filtros 109 HE LED (E), que contiene divisor de haz TBS 405+493+575 y filtro de emisión T BP 425/29+514/31+632/100; esta configuración recogió señales DAPI, Lysotracker ^® Green y anti- GANLS, respectivamente. Las imágenes se procesaron utilizando el software NIH Image J.

Para evaluar los efectos de las chaperonas farmacológicas en la reducción de la masa lisosómica las células se sembraron en placas de 96 pozos de fondo transparente (Greiner Bio-One, # 655090, Monroe, NC, EE. UU.) a 4000 células/pozo y se cultivaron durante toda la noche. El día del experimento, los fibroblastos no afectados y MPS IVA se trataron con diferentes concentraciones de ezetimlbe o pranlukast en medio DMEM durante 24 h. Luego, las células se tiñeron con 50 nM LysoTracker Red DND-99 en el medio de cultivo durante 1 hora, seguido de dos lavados de placa con DPBS, Las placas se fijaron y se tiñeron simultáneamente en solución de paraformaidehftio al 3,2% con colorante Hoechst a una dilución 1: 5,000 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces usando DPBS y se almacenaron con 100 μΙ/pοzο de DPBS a 4 °C hasta la obtención de imágenes. Las imágenes (9 imágenes/pozo) se adquirieron utilizando el sistema de imágenes INCell Analyzer 2200 (GE Healthcare Bio- Sciences, Pittsburgh, PA, EE. UU.). Se utilizó el software de análisis de imágenes INCell (GE Healthcare Bio-Sciences) para cuantifícar la intensidad de fluorescencia (tinción con LysoTracker). La intensidad de fluorescencia corresponde al promedio de todos los píxeles en una celda y se promedia en todas las celdas dentro de una imagen. Los conjuntos de filtros DAPI (excitación=350 ± 50 nm, emisión=455 ± 50 nm) y Texas Red (excitación=545 ± 20 nm, emisión=593 ± 20 nm) para visualizar la tinción nuclear de Hoechst y la tinción de LysoTracker Red DND-99, respectivamente.

La tinción de LysoTracker, un ensayo fenotipico que detecta lisosomas agrandados y organelos ácidos, exhibió aumentos de 1,2 a 2,4 veces en las células de pacientes con IVA MPS, lo que índica un aumento significativo en la masa lisosómica en comparación con los fibroblastos no afectados (Figura 10). La tinción de LyscTracker se redujo de forma dependiente de la dosis en todas las lineas de fibroblastos de la enfermedad después del tratamiento con ezetimlbe, lo que demuestra la reducción de la masa de lisosoma agrandado (Figura 10A). En este sentido, este estudio muestra, por primera vez, que este ensayo fenotipico se puede utilizar para el tamizaje de fármacos en células derivadas de pacientes con MPS IVA. Además, los datos de las Figuras 9 y 10 sugieren que el tratamiento con ezetimibe aumentó significativamente los niveles de proteina GALNS y la actividad en las células de pacientes con MPS IVA, lo que resultó en una reducción de la masa de lisosoma. Los resultados con pranlukast fueron ligeramente diferentes en los que la tinción de LysoTracker no cambió en los fibroblastos de pacientes tratados con pranlukast (Figura 10B). Junto con la información de la Figura 9, estos resultados sugieren que pranlukast podría aumentar la estabilidad de la enzima, pero no su plegamiento adecuado, lo que limita la recuperación de la función de las enzimas muladas.

Ejemplo 6. Efecto de las chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS en los marcadores de autofagia en los fibroblastos de pacientes con MPS IVA

Antes del presente desarrollo, no se han informado los marcadores de autofagia p62 y LC38-II en células MPS IVA. Encontramos una reducción significativa de los niveles de p62 en todas las células MPS IVA y una disminución en los niveles de LC38-II en los fibroblastos GM012.59, GM00958 y GM00593, como se muestra en la Figura 11. Los resultados sugirieron que los procesos autofágicos podrían verse interrumpidos en las células de los pacientes. Para evaluar aún más el potencial terapéutico de ezetimibe y pranlukast, medimos los cambios en los niveles de p62 y LC3B-II después del tratamiento con estas dos chaperonas farmacológicas. Los tratamientos de fibroblastos MPS IVA con ezetimibe y pranlukast a concentraciones de 0.01 μΜ y 0.001 μΜ, respectivamente, aumentaron significativamente los niveles de p62 y LC3B-II como se ve en la Figura 11.

Ejemplo 7. Terapia de combinación de ERT con chaperonas farmacológicas que se unen a GALNS.

Para evaluar el efecto de las dos chaperonas farmacológicas en la ERT, administramos conjuntamente la enzima hrGALNS con ezetimibe o pranlukast en los fibroblastos MPS IVA. Como se muestra en la Figura 12, el tratamiento combinado de las células del paciente con hrGALNS y una chapetona farmacológica (ezetimibe o pranlukast) disminuyó aún más la tinción de LysoTracker en comparación con las tratadas solo con hrGALNS, lo que indica un efecto aditivo con una mayor reducción de la masa lisosómica en las células del paciente. La terapia combinada con hrGALNS y pranlukast casi normalizó la tinción de LysoTracker en todos los fibroblastos MPS IVA a los niveles en las células de control nativas, aunque el pranlukast no redujo Ia masa lísosómíca cuando se usó por sí misma. Estos resultados sugirieron que ia terapia combinada de ERT con ezetimiba o pranlukast podría mejorar la eficacia clínica de ERT en pacientes con MPS IVA.