CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con terapias para el tratamiento y prevención de enfermedades infecciosas y/o neoplásicas y, más en concreto, con terapias basadas en el uso de interferones y de combinaciones de los mismos con agentes capaces de estimular la actividad de dichos interferones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El interferón (IFN) fue la primera citoquina identificada en 1957 por Isaacs and Lindenmann a partir de estudios de interferencia viral (Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 1957, 147:258-267). También fue la primera citoquina que pudo ser purificada, clonada, secuenciada completamente y producida de forma recombinante. La identificación de varias isoformas ha llevado a la clasificación de los interferones en base a su secuencia de aminoácidos y en base a la capacidad de unirse específicamente a distintos receptores. En mamíferos, los interferones se han clasificado en tres familias conocidas como interferones de tipo I, de tipo II y de tipo III.

Los interferones de tipo I constituyen una familia multigénica con actividad citoquina que fueron originalmente descubiertos en virtud de su actividad inhibidora sobre la infección viral de líneas celulares in vitro (Pestka, S., Krause, C.D. and Walter, M.R. 2004. Immunol Rev. Vol. 202:8-32). En función de la homología de sus secuencias, los interferones de tipo I se agrupan en al menos 8 subclases de interferones, incluyendo IFN-a, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, IFN-CO, IFN-τ, and IFN-δ and IFN-ζ (limitin). IFN-α y IFN-β comparten un único receptor dimérico que se expresa en la superficie de la mayor parte de las células nucleadas. Tanto el genoma humano como el de ratón contienen un único gen que codifica IFN-β, mientras que contienen 12 ó 13 genes funcionales que codifican IFN-α. La función de estas citoquinas es de gran importancia en la respuesta inmune frente a múltiples tipos de infecciones virales, puesto que ponen en marcha mecanismos que promueven la muerte por apoptosis de las células infectadas y la inhibición de la replicación viral al tiempo que favorece la presentación antigénica. Recientemente se ha documentado experimentalmente que también ejerce sus funciones activando directamente las actividades de linfocitos T, B y NK así como de células dendríticas en la respuesta inmunitaria (Le Bon A. et al., 2003. Nat. Immunol. Vol: 4: 1009-15; Le Bon A. et al, 2006. J. Immunol. Vol: 176:4682-4689 ; Le Bon A. et al, 2006. J Immunol. 176:2074-8).

El interferón de tipo II consiste en un único interferón, IFN-γ.

Recientemente se ha identificado una nueva familia de IFNs formada por IFN-λΙ, IFN- λ2 and IFN- λ3 a los que se les denomina de forma colectiva como interferones de tipo III. La estructura de estos interferones es similar a la de la familia de IL-10, por lo que estas tres moléculas fueron descritas independientemente como IL-29 (IFN-λΙ), IL-28A (IFN- 2) e IL-28B (IFN- 3). Sin embargo, los IFN-λ están más relacionados estructural y funcionalmente con los IFNs de tipo I que con las citoquinas de la familia IL-10 dado que son capaces de activar ISRE y de inducir actividad antiviral.

Los IFNs de tipo I son capaces de generar una respuesta antiviral gracias a su capacidad de inducir la expresión de los antígenos de histocompatibilidad de clase I y la inducción de protección antiviral, así como la inducción de una serie de genes, denominados genéricamente como ISG {interferon-stimulated genes) en distintas líneas celulares, muchos de los cuales codifican proteínas con actividad antiviral, tales como la proteína treonina/serina quinasa activada por dsRNA, la proteína 2 ',5 '-OAS y la proteína MxA.

Recientemente se ha puesto de manifiesto que IFN-α es capaz de aumentar la antigenicidad de células epiteliales infectadas o tumorales mediante el incremento del procesamiento y la presentación de antígenos en estas células, haciendo que estas células sean más visibles y reactivas a las respuestas inmunes en un mecanismo de tipo suicida que da lugar a una destrucción selectiva de las mismas células. Esta actividad de IFN-α se ve aumentada por la co-administración de oncostatina M. Así, Larrea et al. (J.Virol., 2009, 83 :3298-3311) han demostrado que OSM es capaz de aumentar el efecto antiviral de IFN-α en células de hepatoma Huh7 infectadas con el virus de la hepatitis A o de la hepatitis C.

Por otro lado, WO2006/134195 describe por primera vez el uso de un interferón alfa en una composición farmacéutica para administración combinada con una citoquina de la familia IL-6, en particular cardiotrofina 1 (CT-1) u oncostatina M (OSM) y que dicha composición proporciona un efecto antiviral sinérgico fuerte. La administración combinada de ambas citoquinas es útil para el tratamiento de enfermedades virales, particularmente frente al virus de la hepatitis C (HCV).

Asimismo, Ikeda y cois. [Ikeda et al. FEBS Lett., 2009; 583: 1434-1438] han descrito que la oncostatina M en combinación con interferón alfa inhibe sinérgicamente la replicación del RNA del HCV. Aunque todas estas combinaciones permiten la administración de menores dosis de IFN-α, su uso se acompaña habitualmente de una serie de efectos adversos como consecuencia de la administración de interferón. Así, existe una necesidad en la técnica de composiciones y métodos que permiten aumentar la capacidad antiviral y antineoplásica de los interferones y que no presenten las desventajas asociadas con las composiciones conocidas hasta la fecha.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con una composición o kit que comprende, juntos o separados,

(i) un primer componente seleccionado del grupo de

(a) un agonista de OSMR y

(b) un polinucleótido que codifica un agonista de OSMR y

(ii) un segundo componente seleccionado del grupo de

(a) al menos un interferón de tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo y (b) al menos un polinucleótido que codifica un interferón tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una composición o kit de la invención y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una composición, un kit o una composición farmacéutica según la invención para su uso en medicina.

En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con el uso de una composición, de un kit o de una composición farmacéutica según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad infecciosa y/o una enfermedad neoplásica.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Análisis cuantitativo mediante RT-PCR de ARN mensajero de HCV presente en dos clones distintos de células Huh7 que contienen el replicón genómico completo del HCV, tras 3 días de tratamiento con una de las siguientes sustancias a ensayar: Control, en que no se añadieron los compuestos; IFN-λΙ (50 UI/mL); OSM (10 ng/mL); combinación de IFN-λΙ (50 UI/mL) con OSM (10 ó 20 ng/mL); IFN- 2 (50 IU/mL); y combinación de IFN- 2 (50 UI/mL) con OSM (10 ó 20 ng/mL) (Figs. 1A y IB). La leyenda "+" junto a un compuesto (OSM, IFN-λΙ o IFN-X2) indica que la sustancia a ensayar comprende dicho compuesto. Como se aprecia en la figura, el tratamiento combinado con un IFN-λ (1 ó 2) más OSM produce una inhibición de la replicación viral del HCV mayor que la inducida por las citoquinas administradas individualmente. * P <0,012 vs Control, IFN-λΙ y OSM 20 ng/mL; ¥ P<0,004 vs. Control, IFN-λΙ y

OSM 10 ng/mL; P<0,008 vs. Control, IFN- 2 y OSM 10 ng/mL y OSM 20 ng/mL; γ P<0,004 vs. Control, IFN-λΙ y OSM 10 ng/mL; ¥ P<0,008 vs. Control, IFN- 2 y OSM 10 ng/mL. Figura 2. Análisis por Western-Blot de la proteína viral estructural Core en células Huh7 que expresan el replicón de HCV de longitud completa. Las células fueron tratadas durante tres días con una de las siguientes sustancias a ensayar: Control, en que no se añadieron los compuestos; IFN-λΙ (50 UI/mL); OSM (10 ng/mL); y combinación de IFN-λΙ (50 UI/mL) con OSM (10 ng/mL). La leyenda "+" junto a un compuesto (OSM o IFN-λΙ) indica que la sustancia a ensayar comprende dicho compuesto. La figura refleja que la detección de Core es sensiblemente menor en el tratamiento combinado IFN-λΙ con OSM. La imagen es representativa de varios experimentos llevados a cabo en distintos replicones genómicos.

Figura 3. Análisis cuantitativo mediante RT-PCR del ARNm de genes implicados en la inmunomodulación. OSM presenta sinergia con IFN-λΙ y IFN- 2 en la inducción de genes implicados en el procesamiento y presentación de antígenos, en células Huh7 portadoras del replicón genómico de HCV. La figura refleja la determinación mediante RT-PCR cuantitativa de los niveles de ARNm de transportadores asociados con el pro cesamiento de antígeno TAP 1 (A) y TAP2 (B) y de la subunidad de inmunoproteasoma PSMB9 (C) en células tratadas durante 24 y 48 horas (h) con una de las siguientes sustancias a ensayar: Control, en que no se añadieron compuestos; OSM (10 ng/mL); IFN-λΙ (50 UI/mL); IFN- 2 (50 UI/mL); combinación de IFN-λΙ (50 UI/mL) con OSM (10 ng/mL); y combinación de IFN- 2 (50 UI/mL) con OSM (10 ng/mL). La leyenda "+" junto a un compuesto (OSM, IFN-λΙ o IFN- 2) indica que la sustancia a ensayar comprende dicho compuesto, γ P<0,010 vs. Control, IFN-λΙ y OSM

24 h; * P <0,016 vs Control, IFN- 2 y OSM 24 h; ΦΡ<0,004 vs. Control, IFN-λΙ, IFN- 2 y OSM 48 h; ¥ P<0,002 vs. IFN-λΙ, IFN- 2, 24 h; Ψ P <0,030 vs. Control, IFN-λΙ y OSM 48 h; Φ P<0,004 vs. Control, IFN- 2 y OSM 48 h.

Figura 4: Activación de la vía de señalización de las Jak-STATs tras el tratamiento durante 3, 12, 24 o 48 horas con IFN-λΙ (5000 UI/mL), OSM (10 ng/mL) o ambas administradas simultáneamente en células Huh7 o en células Huh7-Core 3 ' portadoras del replicón genómico de HCV. La leyenda "+" junto a un compuesto (OSM o IFN-λΙ) indica que la sustancia a ensayar comprende dicho compuesto. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han puesto de manifiesto la capacidad de la oncostatina M de aumentar de forma sinérgica la actividad de los interferones de tipo III. En concreto, según se observa en los ejemplos de la presente invención, la OSM potencia de forma sinérgica la capacidad de IFN-λΙ e IFN- λ2 de inhibir la replicación de HCV en células de hepatoma (véanse ejemplos 1 y 2) así como la capacidad de dichos interferones de promover la activación de genes implicados en la presentación antigénica en dichas células (véase ejemplo 3).

COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con una composición o kit que comprende, juntos o separados,

(i) un primer componente seleccionado del grupo de

(a) un agonista de OSMR y

(b) un polinucleótido que codifica un agonista de OSMR.

(ii) un segundo componente seleccionado del grupo de

(a) al menos un interferón de tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo y

(b) al menos un polinucleótido que codifica un interferón tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo. El término "composición", según se usa en la presente invención, se refiere a una composición de materia que comprende los componentes indicados, es decir, un agonista de OSMR y al menos el interferón de tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo o los polinucleótidos que codifican dichas moléculas así como cualquier producto resultante, directa o indirectamente, de la combinación de los distintos componentes en cualquier cantidad de los mismos. El experto en la materia apreciará que la composición puede venir formulada como una única formulación o puede presentarse como formulaciones de cada uno de los componentes por separado que pueden combinarse para su uso conjunto como una preparación combinada. La composición puede ser un kit de partes en donde cada uno de los componentes se formula y empaqueta de forma separada. El término "proteína", usado aquí indistintamente con polipéptido, se refiere a una cadena de aminoácidos de cualquier longitud en donde los distintos aminoácidos se encuentran unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o por puentes disulfuro.

El término "polinucleótido", según se usa en la presente invención, se refiere a un polímero formado por un número variable de monómeros en donde los monómeros son nucleótidos, incluyendo tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. Lo s polinucleótidos incluyen monómeros modificados mediante metilación o así como formas no modificadas. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente en la presente invención e incluyen mRNA, cDNA y polinucleótidos recombinantes. Según se usa en la presente invención, los polinucleótidos no están limitados a polinucleótidos tal y como aparecen en la naturaleza, sino que incluye po linucleótidos en los que ap arecen análogos de nucleótidos y enlaces internucleotídicos no naturales. Primer componente de las composiciones de la invención

El primer componente de las composiciones de la invención se selecciona del grupo de

(a) un agonista de OSMR y

(b) un polinucleótido que codifica un agonista de OSMR.

El término "agonista de OSMR", según se usa en la presente invención, se refiere a cualquier ligando, tanto natural como no natural, que se une al polipéptido conocido como OSMR y que es capaz de activar la señalización mediada por al menos uno de los receptores heterodiméricos en los que participa OSMR. Así, los agonistas de la invención son capaces de activar la señalización mediada por el receptor formado por OSMR y gpl30, por el receptor formado por OSMR y IL31RA y por el receptor formado por gpl30 y LIFR, resultando dicha unión en un aumento de al menos una de las actividades biológicas de OSM, incluyendo la capacidad inhibir el crecimiento de c élulas de me lanoma A375 tal y como s e de scrib e p or Z arling et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1986, 83:9739-9743) y/o la capacidad de inhibir la replicación de HCV en células de hepatoma (HepG2 o Huh7) tal y como ha sido descrito por Larrea et al. (J. Viral, 2009, 83 :3298-3311), Ikeda et al. (FEBS Letters, 2009, 583: 1434-1438) o en los ejemplos 1 y 2 de la presente invención.

Ejemplos de agonistas de OSMR adecuados para su uso en la presente invención incluyen tanto la oncostatina M como cualquier variante funcionalmente equivalente de la misma, incluyendo las variantes descritas en W09109057.

El término "oncostatina M" u "OSM", según se usa en la presente invención, se refiere a una citoquina pleiotrópica del tipo IL-6 que es una glicoproteína con un peso molecular aproximado de 28.000 producida principalmente por células T, monocitos/macrófagos y células dendrítica y que fue aislada originalmente de un medio acondicionado por células U-937 de leucemia histiocítica humana tratadas con PMA y que era capaz de inhibir el crecimiento de células de melanoma A375 (Zarling, et al.; 1986, Proc. Nati. Acad. Sci.USA, 83 :9739-9743 y Brown, et al, 1987, J. Immunol, 139:2977-83). La OSM muestra también capacidad de inhibir el crecimiento en la línea celular célular MI de leucemia mieloide de ratón, así como en otras células de tumores sólidos (Grant et al. , 1999; Mol. Med. Today. , 5:406-12 y Gibbs et al, 1998, Melanoma Res. , 8 : 221-226) así como actividad estimulador del crecimiento de fibroblastos normales, células de sarcoma de kaposi-SIDA y en una línea celular de eritroleucemia humana, TF-1 (Nair, et al., 1992, Science, 255 : 1430-1432 y Miles et al., 1992, Science. 255 : 1432-1434). El documento WO2006084092 describe el uso de anticuerpos de unión a la subunidad beta del receptor de OSM (OSMR ) para inhibir el crecimiento de células cancerígenas.

El ADNc de la OSM humana codifica el pre-pro-OSM de 252 aminoácidos que comprende un péptido señal hidrofóbico de 25 residuos y un dominio C-terminal hidrofílico de 31 aminoácidos que son eliminados durante la maduración de OSM para generar así la forma madura de OSM de 196 residuos. El número de acceso indexado en la base de datos NCBI de pre-pro-OSM de origen humano es P13725 (SEQ.ID.NO.: 1). La forma madura de OSM (SEQ ID NO:2) corresponde a la región comprendida entre el resto de alanina en posición 26 y el resto de arginina en posición 221 , ambos incluidos.

La invención contempla el uso de variantes de OSM, que pueden ser tanto naturales como artificiales. La expresión "variante natural" se refiere a todas aquellas variantes de la OSM humana mencionada anteriormente que aparecen de forma nativa en otras especies, es decir, los ortólogos de OSM e incluyen, sin limitación, la OSM de origen bovino, cuya forma precursora corresponde a la secuencia con número de acceso P53346 en la base de datos NCBI y cuya forma activa corresponde a los aminoácidos 21 a 194 de dicha secuencia, así como la OSM de ratón, cuya forma precursora corresponde a la secuencia con número de acceso P53347 en la base de datos NCBI y cuya forma activa corresponde a los aminoácidos 21 a 194 de dicha secuencia.

En una forma preferida de realización, el primer componente de la invención corresponde a la forma madura de OSM de origen humano que comprende la secuencia de SEQ.ID.NO.: 2, opcionalmente incluyendo las modificaciones post-traduccionales que aparecen cuando la secuencia anterior se expresan en células de origen humano tales como el puente disulfuro entre los aminoácidos 31 y 152, el puente disulfuro entre los aminoácidos 74 y 192 así como glicosilaciones en las posiciones 100 y/o 217.

Alternativamente, el primer componente de la invención puede ser una variante funcionalmente equivalente de oncostatina M de origen artificial. El término "variante funcionalmente equivalente de oncostatina M", según se usa en la presente invención, se refiere a polipéptidos cuya secuencia deriva de las secuencias mencionadas anteriormente mediante la adición, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos y que conserva sustancialmente las propiedades funcionales de OSM, incluyendo la capacidad inhibir el crecimiento de células de me laño ma A375 tal y como se describe por Zarling et al. (Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1986, 83 :9739-9743) y/o la capacidad de inhibir la replicación de HCV en células de hepatoma (HepG2 o Huh7) tal y como ha sido descrito por Larrea et al. (Journal of Virology, 2009, 83:3298-331 1), Ikeda et al. (FEBS Letters, 2009, 583: 1434-1438) o en los ejemplos 1 y 2 de la presente invención.

Variantes de oncostatina M contempladas en el contexto de la presente invención incluyen polipéptidos que muestran al menos 60%, 65%, 70%>, 72%>, 74%>, 76%>, 78%>, 80%), 90%o , ó 95%o de similitud o identidad con las distintas variantes naturales oncostatina M mencionadas anteriormente. El grado de identidad entre dos polipéptidos se determina usando algoritmos implementados en ordenador y métodos que son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410).

El primer componente de la invención también puede corresponder a un ácido nucleico que codifica oncostatina M o la variante funcionalmente equivalente de la misma. Así, en el caso de que el ácido nucleico codifique OSM, este puede ser de origen humano correspondiente a la secuencia con número de acceso NM 020530 en NCBI, de origen bovino correspondiente a la secuencia con número de acceso NM 175713 en NCBI, de ratón correspondiente a la secuencia con número de acceso NM 001013365 en NCBI. No obstante, la invención contempla el uso de todos aquellos polinucleótidos que codifican las variantes de OSM mencionadas anteriormente.

El experto en la materia apreciará que el ácido nucleico que forma el primer componente de la invención debe de ser expresado en el interior de una célula y eventualmente secretado al medio, para lo cual, la secuencia que codifica oncostatina M o la variante funcionalmente equivalente de la misma puede presentar en un extremo 5 ' una secuencia que codifica una señal secretora. La expresión "secuencia señal secretora", según se usa en la presente invención, se refiere a una secuencia de amino ácidos que es capaz de promover el acceso a la vía secretora celular de todas aquellas proteínas que presentan dicha secuencia en su extremo N-terminal. Secuencias señal adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, entre otras, la secuencia señal de activador de plasminógeno tisular (tPA), de la hormona del crecimiento, GM-CSF y de las inmunoglobulina y, en particular, de IgK o de IgVx. Preferiblemente, la secuencia señal que forma parte del primer componente de la invención es la propia secuencia señal de OSM correspondiente a los aminoácidos 1 a 21 de la secuencia identificada en SEQ.ID.NO.: 1.

Alternativamente, el primer componente de la invención puede ser un ácido nucleico que muestra una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%), al menos 85%, al menos 90%>, al menos 91%>, al menos 92%, al menos 93%>, la menos 94%>, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%o de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente en donde el porcentaje de identidad se determina mediante el uso de un algoritmo del tipo GAP, BESTFIT o FASTA cuya implementación informática aparece en el Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7 (Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) y en el que se usan los algoritmos locales de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. , 1981 , 2 :482), de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 1970, 48: 443) o de Pearson y Lipman (Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.), 1988, 85:2444) usando los valores por defecto para los distintos parámetros. Alternativamente, el primer componente de la composición de la invención es un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con cualquiera de las secuencias que codifican oncostatina M o las variantes de la misma. Por "polinucleótidos capaces de hibridar específicamente con un polinucleótido diana" se entiende, en el contexto de la presente invención, aquellos polinucleótidos que son capaces de hibridar en condiciones estrictas, entendiéndose por condiciones estrictas, las condiciones que permiten la hibridación específica de dos ácidos nucleicos a temperaturas de en torno a 65°C por ejemplo, en una solución de 6 X SSC, SDS al 0,5%), solución de Denhardt al 5% y ADN no específico desnaturalizado a una concentración de 100 μ /ιη1 cualquier otra solución con una fuerza iónica equivalente y tras una etapa de lavado a 65°C en presencia de una solución de, por ejemplo SSC al 0,2%) y SDS al 0,1% y cualquier otra solución con una fuerza iónica equivalente. No obstante, las condiciones estrictas pueden ser adaptadas por el experto en la materia en función del tamaño de la secuencia a ser hibridada, en función del contenido en GC y en función de otros parámetros. Métodos adecuados para la selección de las condiciones de hibridación adecuadas se han descrito por Sambrook y cois., 2001 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 ^rd Edition, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Segundo componente de las composiciones de la invención

El segundo componente de las composiciones de la invención se selecciona del grupo de

(a) al menos un interferón de tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo y

(b) al menos un polinucleótido que codifica un interferón tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo. En el contexto de la invención, "un interferón de tipo III" se refiere a cualquier miembro de la familia de los interferones que es capaz de unirse a y activar la señalización mediada por el receptor heterodimérico específico que comprende una primera cadena denominada IFNL-Rl, IL-28Ra o CRF2-12 y que es específica del interferón de tipo III y una segunda cadena denominada IL10R2, IL-10RP or CRF2-4, que actúa como subunidad compartida para otras citoquinas como la IL-10, IL-22 o IL- 26. La unión y activación de dicho receptor resulta en la inducción del complejo ISGF3, la sobreexpresión de moléculas de MHC de clase I y la activación por fosforilación de diferentes miembros de las STATs, en concreto STAT 1 , STAT2, STAT y STAT5. Asimismo, la activación de la señalización mediada por IFN de tipo III resulta en una inhibición de la proliferación de distintas líneas celulares.

Por tanto, el término interferón de tipo III engloba polipéptidos tales como los conocidos como interferón (IFN-λΙ o IL-29), interferón λ2 (IFN-X2 o IL-28A) e interferón λ3 (IFN- 3 o IL-28B), cuyas secuencias se describen en la base de datos GenBank bajo los números de acceso NP_742152, NP_742150 y NP_742151 respectivamente. En una forma preferida de realización, el interferón de tipo III es IFN-λΙ, también conocido como IL29 o zcyto21 y que corresponde al polipéptido humano codificado por el gen cuyo GeneID es 282618 y que codifica un precursor de 200 aminoácidos (SEQ.ID.NO.: 3; NP 742152.1 ; UniprotKB: Q8IU54.1). La forma madura de dicho precursor corresponde a un polipéptido de 181 aminoácidos, correspondiente a los aminoácido s 20 a 200 de l precursor y cuya secuencia se identifica como SEQ.ID.NO.: 4.

La invención también contempla variantes funcionalmente equivalentes de IFN-λΙ, que corresponden a todas aquellos polipéptidos resultantes de la sustitución, adición o deleción de uno o varios aminoácidos a partir de la secuencia mencionada anteriormente y que conserva sustancialmente una o varias de las funcionalidades de IFN-λΙ tales como la capacidad de promover un aumento en la expresión de antígenos de histocompatibilidad de clase I, la capacidad de inducir distintos genes conocidos genéricamente como ISG que incluyen proteínas con actividad antiviral tales como la proteína serina/treonina quinasa activada por ARN de doble cadena, la proteína quinasas R (PKR), p2-microglobulina, la proteína 2',5'-OAS y la proteína MxA.

En el caso particular de las variantes funcionalmente equivalentes de IFN-λΙ, estas pueden ser caracterizadas por su capacidad de proteger células HT29 (adenocarcinoma colorectal), células A549 (carcinoma de pulmón) y HaCaT (queratinocitos) de infección mediada por VSV determinado esencialmente tal y como se describe en Kotenko et al. (Nat. Immunol., 2003, 4:69-77) así como de proteger células HepG2 de carcinoma hepatocelular de los efectos citopatogénicos mediados por EMCV, determinado esencialmente tal y como ha sido descrito por Sheppard et al. (Nat. Immunol., 2003, 4:63-68). No obstante, la expresión "variante funcionalmente equivalente de IFN-λΙ" excluye específicamente cualquier interferón de tipo I. La distinción entre un interferón de tipo I y una variante funcionalmente equivalente de IFN-λΙ se lleva a cabo usando los métodos descritos por Kotenko, SV. et al. (Nat. Immunology 2003, 1 :69-77) así como mediante la comparación del efecto sobre la replicación viral en ciertos virus que muestran mayor sensibilidad a IFN de tipo III que de tipo I (véase Ank, N. et al., J. Viral, 2006, 80:4501-4509). Variantes funcionalmente equivalentes de IFN-λΙ adecuados para su uso en la presente invención incluyen esencialmente las variantes descritas en WO2009/149377. Variantes concretas incluyen (en donde las posiciones que se encuentran modificadas se indican tomando la proteína madura de 181 aminoácidos como referencia):

- Variantes que comprenden un resto de metionina, un dipéptido de secuencia ML, MI o un tetrapéptido de secuencia MEAE en posición N-terminal;

- Variantes en la posición 10, en concreto, variantes con la sustitución T10P;

- Variantes en la posición 15, en concreto, las variantes C 15K, C 15N, C 15R, C15S, C15T, C15I, C15M, C15E, C15D, C15G, C15A, C15V, C15Y, C15W, C15L o C15F;

- Variantes en posición 18, en concreto la variante G18D y G18E;

- Variantes en posición 169 y, en concreto, la variante N169D;

- Variantes en posición 171 y, en concreto, las variantes C171K, C171N, C171R, C171S, C171T, C171I, C171M, C171E, C171D, C171G, C171A, C171V, C171Y, C171W, C171L o C171F;

- Variantes que contienen una deleción de 1 , 2, 3 , 4, 5 ó 6 aminoácidos en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal;

- La variante Al-6/C171S (SEQ.ID.NO.: 5) que, opcionalmente, puede presentar una metionina en posición N-terminal;

IFN-λΙ recombinante que presenta la secuencia indicada en SEQ.ID.NO.: 6; Conjugados de IFN-λΙ con la región constante de una inmunoglobulina similares a los descritos para IFN-β en WO06000448,

- Conjugados de IFN-λΙ con ApoA tal y como se describe en WO2009150284.

- Conjugados de IFN-λΙ con albúmina tal y como se describe para IFN de tipo I en Rustgi , V. (Curr. Med. Res. Opin., 2009, 25:991-1002), en WO05077042 y en WO200833413.

- Variantes de cualquiera de las anteriores obtenidas mediante conjugación del IFN-λ Ι con un p o límero hidrosoluble del tipo polyetilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-(Cl-C10)alcoxi-PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinil pirrolidona)PEG, tresil monometoxi PEG, monometoxi-PEG propionaldehido, PEG propionaldehido, bis-succinimidil carbonato PEG, homo lpo limeros de propileneglicol, un copolímero de un óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilato (p.ej. glicerol), monometoxi-PEG butiraldehido, PEG butiraldehido, monometoxi-PEG acetaldehido, PEG acetaldehido, metoxil PEG- succinimidil propionato, methoxil PEG-succinimidil butanoato, alcohol polivinílico, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos. PEG adecuados para su conjugación con las variantes de IFN-λΙ incluyen PEG con un peso molecular de en torno a 600 hasta en torno a 60,000, incluyendo, por ejemplo, 5,000 daltons, 12,000 daltons, 20,000 daltons, 30,000 daltons y 40,000 daltons, que pueden ser lineales o ramificados. Preferiblemente, el IFN-λΙ pegilado se obtiene mediante pegilación con un PEG-propionaldehido de 20000 daltons obtenido esencialmente tal y como se describe en WO2007041713.

Otras variantes de IFN-λΙ contempladas en el contexto de la presente invención incluyen polipéptidos que muestran al menos 60%, 65%, 70%>, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%), 90%), ó 95%) de similitud o identidad con las distintas variantes naturales de IFN-λΙ mencionadas anteriormente. El grado de identidad entre dos polipéptidos se determina usando algoritmos tales como los descritos anteriormente en el contexto de oncostatina M. En una forma preferida de realización, el IFN-λΙ corresponde a la molécula conocida como PEG-rIL-29, que se encuentra en ensayos clínicos y que corresponde a Δ6-ΙΚΝ-λ1 modificado en su extremo N-terminal con un resto de metionina y modificado por pegilación con PEG-propionaldehido de 20000 daltons (SEQ.ID.NO.: 7).

El interferón de tipo III que forma el segundo componente de la invención también puede corresponder a un ácido nucleico que codifica IFN-λΙ o cualquiera de las variantes funcionalmente equivalentes de éste mencionadas anteriormente. Así, en el caso de que el ácido nucleico codifique IFN-λΙ, este puede ser de origen humano correspondiente a la secuencia con número de acceso AY129150 en NCBI, de origen felino (Felis catus) correspondiente a la secuencia con número de acceso AB241610 en NCBI, de cerdo {Sus scrofa) correspondiente a la secuencia con número de acceso FJ455508 en NCBI o de perro (Canis lupus) correspondiente a la secuencia con número de acceso AB241609 en NCBI.

Alternativamente, el segundo componente de la invención puede ser un ácido nucleico que muestra una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%o, al menos 85%, al menos 90%>, al menos 91%>, al menos 92%, al menos 93%>, la menos 94%>, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%) de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente en donde el porcentaje de identidad se determina esencialmente tal y como se describe anteriormente en el contexto del primer componente de la invención. Asimismo, el segundo componente de la composición de la invención es un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con cualquiera de las secuencias que codifican el IFN-λΙ o la variantes del mismo, en donde los "polinucleótidos capaces de hibridar específicamente con un polinucleótido diana" se definen de la misma forma que los mencionados anteriormente en el contexto del primer componente de la invención

En otra forma preferida de realización, el interferón de tipo III es ΙΚΝ-λ2, también conocido como IL28A o zcyto20 y que corresponde al polipéptido codificado por el gen humano cuya GeneID es 282616 y que produce un precursor de 200 aminoácidos (SEQ.ID.NO.: 8; NP 742150.1; UniprotKB: Q8IZJ0.1) que es procesado para dar lugar a la proteína madura de 175 aminoácidos, correspondiente a los aminoácidos 26 a 200 de SEQ.ID.NO.: 8 y que se representa por SEQ.ID.NO.: 9.

La invención también contempla variantes funcionalmente equivalentes de ΙΚΝ-λ2, que corresponden a todas aquellos polipéptidos resultantes de la sustitución, adición o deleción de uno o varios aminoácidos a partir de la secuencia mencionada anteriormente y que conserva sustancialmente la capacidad de IFN- 2 de promover un aumento en la expresión de antígenos de histocompatibilidad de clase I, así como la inducción de distintos genes conocidos genéricamente como ISG que incluyen proteínas con actividad antiviral tales como la proteína serina/treonina quinasa activada por ARN de doble cadena, la proteína quinasas R (PKR), p2-microglobulina, la proteína 2 ',5' -O AS y la proteína MxA. En el caso particular las variantes funcionalmente equivalentes de ΙΚΝ-λ2, estas pueden ser caracterizadas por su capacidad de proteger células HepG2 de carcinoma hepatocelular de los efectos citopatogénicos mediados por EMCV, determinado esencialmente tal y como ha sido descrito por Sheppard et al. (Nat. Immunol. , 2003, 4 :63-68) así como por su capacidad de reducir los efectos citopatogénicos causados por la infección con HBV o HCV en células Huh7, determinado tal y como se describe por Doyle et al. (Hepatology, 2006, 44:896-906). La distinción entre un interferón de tipo I y una variante funcionalmente equivalente de IFN- 2 se lleva a cabo usando los métodos descritos por Kotenko, SV. et al. (Nat. Immunology 2003, 1 :69-77) así como mediante la comparación del efecto sobre la replicación viral en ciertos virus que muestran mayor sensibilidad a IFN de tipo III que de tipo I (véase Ank, N. et al, J. Viral, 2006, 80:4501-4509).

Variantes funcionalmente equivalentes de ΙΚΝ-λ2 preferidas incluyen (la numeración de los restos se indica en relación con la posición en SEQ.ID.NO.: 9):

- Variantes que presentan un resto de metionina en posición N-terminal;

- Variantes que presentan una sustitución en el resto en posición 48, incluyendo C48K, C48N, C48R, C48S, C48T, C48I, C48M, C48E, C48D, C48G, C48A, C48V, C48Y, C48W, C48 L o C48 F;

- Variantes que presentan una sustitución en el resto en posición 50, incluyendo C50K, C50N, C50R, C50S, C50T, C50I, C50M, C50E, C50D, C50G, C50A,

C50V, C50Y, C50W, C50L, o C50F;

- Variantes que carecen del aminoácido en posición C-terminal (IFN- λ2-Δ175) Combinaciones de cualquiera de las anteriores, preferiblemente IFN- λ2 C48S o IFN- 2 C50S modificados en su extremo N-terminal por la presencia de un resto de metionina;

IFN- 2 recombinante cuya secuencia es (SEQ.ID.NO.: 10);

- Conjugados de IFN- 2 a otros polipéptidos tales como a la región Fe de las inmunoglobulinas, albúmina o ApoA o a polímeros hidrosolubles tales como los que se han descrito anteriormente en el contexto de IFN-λΙ, incluyendo variantes pegiladas de IFN-X2. Otras variantes de ΙΚΝ-λ2 contempladas en el contexto de la presente invención incluyen polipéptidos que muestran al menos 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%), 90%), ó 95%) de similitud o identidad con las distintas variantes naturales de IFN- 2 mencionadas anteriormente. El grado de identidad entre dos polipéptidos se determina usando algoritmos tales como los descritos anteriormente en el contexto de oncostatina M.

El interferón de tipo III que forma el segundo componente de la invención también puede corresponder a un ácido nucleico que codifica ΙΚΝ-λ2 o cualquiera de las variantes funcionalmente equivalentes de éste mencionadas anteriormente. Así, en el caso de que el ácido nucleico codifique IFN- 2, este puede ser de origen humano correspondiente a la secuencia con número de acceso AY 129148 en NCBI, de ratón correspondiente a la secuencia con número de acceso AY869695 en NCBI. Alternativamente, el segundo componente de la invención puede ser un ácido nucleico que muestra una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%), al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, la menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%) de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente en donde el porcentaje de identidad se determina esencialmente tal y como se describe anteriormente en el contexto del primer componente de la invención. Asimismo, el segundo componente de la composición de la invención es un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con cualquiera de las secuencias que codifican el IFN- 2 o la variantes del mismo, en donde los "polinucleótidos capaces de hibridar específicamente con un polinucleótido diana" se definen de la misma forma que los mencionados anteriormente en el contexto del primer componente de la invención

En otra forma preferida de realización, el interferón de tipo III es IFN- 3, también conocido como IL28B o zcyto22 y que corresponde al polipéptido codificado por el gen humano cuya GeneID es 282617 y que produce un precursor de 200 aminoácidos (SEQ.ID.NO.: 11, NP 742151.2; UniprotKB: Q8IZI9-1) que es procesado para dar lugar a la proteína madura de 175 aminoácidos, correspondiente a los aminoácidos 26 a 200 de SEQ.ID.NO.: 11 y cuya secuencia viene indicada por SEQ.ID.NO.: 12).

La invención también contempla variantes funcionalmente equivalentes de ΙΚΝ-λ3, que corresponden a todas aquellos polipéptidos resultantes de la sustitución, adición o deleción de uno o varios aminoácidos a partir de la secuencia mencionada anteriormente y que conserva sustancialmente la capacidad de IFN- 3 de promover un aumento en la expresión de antígenos de histocompatibilidad de clase I, así como la inducción de distintos genes conocidos genéricamente como ISG que incluyen proteínas con actividad antiviral tales como la proteína serina/treonina quinasa activada por AR de doble cadena, la proteína quinasas R (PKR), p2-microglobulina, la proteína 2 ',5' -O AS y la proteína MxA. La distinción entre un interferón de tipo I y una variante funcionalmente equivalente de IFN- 3 se lleva a cabo usando los métodos descritos por Kotenko, SV. et al. (Nat. Immunology 2003 , 1 :69-77) así como mediante la comparación del efecto sobre la replicación viral en ciertos virus que muestran mayor sensibilidad a IFN de tipo III que de tipo I (véase Ank, N. et al., J. Viral, 2006, 80:4501-4509).

Variantes funcionalmente equivalentes de IFN- 3 preferidas incluyen (la numeración de los restos se indica en relación con la posición en SEQ.ID.NO.: 12):

- Variantes que presentan un resto de metionina en posición N-terminal;

- Variantes que presentan una sustitución en el resto en posición 48, incluyendo C48K, C48N, C48R, C48S, C48T, C48I, C48M, C48E, C48D, C48G, C48A, C48V, C48Y, C48W, C48 L o C48 F;

- Variantes que presentan una sustitución en el resto en posición 50, incluyendo C50K, C50N, C50R, C50S, C50T, C50I, C50M, C50E, C50D, C50G, C50A, C50V, C50Y, C50W, C50L, o C50F;

- Variantes que presentan una sustitución en el resto en posición 87 y, en particular, T87S;

- Variantes que presentan una sustitución en el resto en posición 135 y, en particular, H135Y;

- Variantes que carecen del aminoácido en posición C-terminal (IFN- 3-A175); - Combinaciones de cualquiera de las anteriores, modificados en su extremo N-terminal por la presencia de un resto de metionina;

- Conjugados de ΙΚΝ-λ3 a otros polipéptidos tales como a la región Fe de las inmunoglobulinas, albúmina o ApoA o a polímeros hidrosolubles tales como los que se han descrito anteriormente en el contexto de IFN-λΙ, incluyendo variantes pegiladas de IFN- 3.

Otras variantes de IFN- 3 contempladas en el contexto de la presente invención incluyen polipéptidos que muestran al menos 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%), 90%), ó 95%) de similitud o identidad con las distintas variantes naturales de IFN- 3 mencionadas anteriormente. El grado de identidad entre dos polipéptidos se determina usando algoritmos tales como los descritos anteriormente en el contexto de oncostatina M. El interferón de tipo III que forma el segundo componente de la invención también puede corresponder a un ácido nucleico que codifica IFN- 3 o cualquiera de las variantes funcionalmente equivalentes de éste mencionadas anteriormente. Así, en el caso de que el ácido nucleico codifique IFN- 3, este puede ser de origen humano correspondiente a la secuencia con número de acceso AY 129149 en NCBI, de ratón correspondiente a la secuencia con número de acceso AY184375 en NCBI, de cerdo, correspondiente a la secuencia con número de acceso GQ996936 en NCBI, o de perro correspondiente a la secuencia con número de acceso XM 850273.1 en NCBI.

Alternativamente, el segundo componente de la invención puede ser un ácido nucleico que muestra una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%), al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, la menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%) de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente en donde el porcentaje de identidad se determina esencialmente tal y como se describe anteriormente en el contexto del primer componente de la invención. Asimismo, el segundo componente de la composición de la invención es un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con cualquiera de las secuencias que codifican el ΙΚΝ-λ3 o la variantes del mismo, en donde los "polinucleótidos capaces de hibridar específicamente con un polinucleótido diana" se definen de la misma forma que los mencionados anteriormente en el contexto del primer componente de la invención Alternativamente, el primer y segundo componente de la invención pueden encontrarse formando parte de una única molécula. Así, en el caso de que el primer y segundo componentes de la composición sean polipéptidos, dicha única molécula es una proteína de fusión que comprende (i) un agonista de OSMR y (ii) interferón de tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

El término "proteína de fusión", según se usa en la presente invención, se refiere a polipéptidos que comprenden dos o más regiones que proceden de proteínas distintas o heterólogas. Alternativamente, en el caso de que tanto el primer como el segundo componentes de la composición sean polinucleótidos, dicha única molécula es un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende (i) un agonista de OSMR, preferiblemente OSM o una variante funcionalmente equivalente de la misma y (ii) un interferón de tipo IIII o una variante funcionalmente equivalente del mismo o bien un polinucleótido que contiene regiones que codifican (i) un agonista de OSMR, preferiblemente OSM o una variante funcionalmente equivalente de la misma, y (ii) un interferón de tipo IIII o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

En este caso, cuando el primer y segundo componente son de naturaleza peptídica, la invención contempla composiciones en las que el primer componente se encuentra en posición N-terminal con respecto al segundo componente y composiciones en las que el primer componente se encuentra en posición C-terminal con respecto al segundo componente. En el caso de que el primer y segundo componente sean de naturaleza polinucleotídica, la invención contempla composiciones en las que el primer componente se encuentra en posición 5 ' con respecto al segundo componente y composiciones en las que el primer componente se encuentra en posición 3' con respecto al segundo componente.

En ambos casos, es posible que el primer y segundo componente estén asociados directamente, esto es, que el extremo C-terminal del primer componente se encuentre asociado al extremo N-terminal del segundo componente o que el extremo C-terminal del segundo componente se encuentre asociado al extremo N-terminal del primer componente o que el extremo 3 ' del primer componente se encuentra asociado al extremo 5 ' del segundo componente y composiciones en las que el extremo 3 ' del segundo componente se encuentra asociado al extremo 5' del primer componente.

Alternativamente, en otro aspecto, la invención contempla composiciones en las que la fusión del primer y del segundo componente se lleva a cabo a través de un enlazador peptídico (en el caso de que el primer y segundo componente son de naturaleza polipeptídica) o de una secuencia que codifica un enlazador peptídico (en el caso de que el primer y segundo componente sean de naturaleza polinucleotídica). Dicho péptido enlazador comprende al menos dos aminoácidos, al menos tres aminoácidos, al menos cinco aminoácidos, al menos diez aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos, al menos 40 aminoácidos, al menos 50 aminoácidos, al menos 60 aminoácidos, al menos 70 aminoácidos, al menos 80 aminoácidos, al menos 90 aminoácidos o aproximadamente 100 aminoácidos. Enlazadores adecuados para su uso en la presente invención son todos aquellos que han sido descritos con anterioridad como adecuados para unir dos polipéptidos y que permiten que cada uno de los polipéptidos conserve su estructura nativa, tales como los descritos en el documento WO2009150284.

En los casos en los que el primer o segundo componente de la invención es un polinucleótido o en donde ambos componentes forman parte de una única cadena polipeptídica que codifica una proteína de fusión o que contiene regiones codificantes para un agonista OSMR y para un interferón de tipo III, dicho polinucleótido puede encontrarse operativamente asociado a una región reguladora de la expresión dando lugar así a una construcción génica. En principio, cualquier región reguladora puede ser utilizada para las construcciones génicas de la presente invención siempre que dicha región reguladora sea compatible con las células en las que se desea expresar el polinucleótido. Así, promotores adecuados para la realización de la presente invención incluyen, sin estar necesariamente limitados, promotores constitutivos tales como los derivados de los genomas de virus eucariotas tales como el virus del polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, el promotor del gen de la metalotioneina, el promotor del gen de la timidina kinasa del virus del herpes simplex, regiones LTR de los retrovirus, el promotor del gen de la inmunoglobulina, el promotor del gen de la actina, el promotor del gen EF-lalpha así como promotores inducibles en los que la expresión de la proteína depende de la adición de una molécula o de una señal exógena, tales como el sistema tetraciclina, el sistema NFKB/IUZ UV, el sistema Cre/Lox y el promotor de los genes de choque térmico , los promotores regulables de la ARN polimerasa II descritos en WO/2006/135436 así como promotores específicos de tejido. Dado que la actividad de las composiciones de la invención se manifiesta fundamentalmente sobre células hepáticas, dicha región reguladora puede ser una región reguladora específica de hígado y, más concretamente, un promotor específico de hígado. Promotores específicos de hígado adecuados incluyen, sin limitación, un promotor de αΐ-anti-tripsina (AAT), un promotor de globulina de unión a hormona tiroidea, un promotor de alfa fetoproteína, un promotor de alcohol deshidrogenasa, un promotor de IGF-II, el promotor del factor VIII (FVIII), un promotor de núcleo básico (BCP) de HBV y promotor PreS2, un promotor de albúmina, un promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG), un promotor de híbrido región de control hepática (HCR)-ApoCII, un promotor híbrido HCR-hAAT, un promotor AAT combinado con el elemento potenciador del gen de la albúmina de ratón (Ealb), un promotor de apolipoproteína E, un promotor de lipoproteína de baja densidad, un promotor de piruvato quinasa, un promotor de fosfenol piruvato carboxiquinasa, un promotor de lecitina-colesterol acil transferasa (LCAT), un promotor de apolipoproteína H (ApoH), el promotor de la transferrina, un promotor de transtiretina, promotores de alfa-fibrinógeno y beta-fibrinógeno, un promotor de alfa 1-antiquimiotripsina, un promotor de glicoproteína alfa 2-HS, un promotor de haptoglobina, un promotor de ceruloplasmina, un promotor de plasminógeno, promotores de las proteínas del complemento (CIq, CIr, C2, C3, C4, C5, C6, C8, C9, factor I y factor H del complemento), promotor del activador del complemento C3 y de la glicoproteína αΐ-ácida. Se pueden encontrar promotores específicos de tejido adicionales en Tissue-Specific Promoter Datábase, TiProD (Nucleic Acids Research, J4:D104-D107 (2006).

COMPOSICIONES TERAPÉUTICAS DE LA INVENCIÓN

Las composiciones de la invención resultan de utilidad para el tratamiento de enfermedades que requieran el tratamiento con un interferón de tipo III. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una preparación farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Excipientes preferidos para su uso en la presente invención incluyen azúcares, almidones, celulosas, gomas y proteínas. En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se formulará en una forma farmacéutica de administración sólida (por ejemplo comprimidos, cápsulas, grageas, gránulos, supositorios, sólidos estériles cristalinos o amorfos que pueden reconstituirse para proporcionar formas líquidas etc.), líquida (por ejemplo soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires, lociones, ungüentos etc.) o semisólida (geles, pomadas, cremas y similares). Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas por cualquier ruta, incluyendo, sin ser limitante, oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993 y en Remington ^' s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20 ^a edición, Williams & Wilkins PA, USA (2000) Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos en el estado de la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones aceite/agua, diferentes tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se pueden formular por procedimientos convencionales conocidos en el estado de la técnica.

Las formulaciones para la administración parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas para inyecciones estériles isotónicas. Se pueden preparar, por ejemplo, soluciones inyectables, en las que el portador comprende solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y glucosa. También se pueden preparar suspensiones inyectables, en cuyo caso se pueden utilizar portadores líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares. También se incluyen preparados en forma sólida que pretenden convertirse, poco antes de su uso, en preparados en forma líquida. En las composiciones adecuadas para la administración percutánea, el portador comprende opcionalmente un agente potenciador de la penetración y/o un agente humectante adecuado, opcionalmente combinado con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en proporciones menores, cuyos aditivos no introducen un efecto perjudicial significativo en la piel. Estos últimos aditivos adecuados pueden ser antioxidantes, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica y/o sustancias tampón.

Alternativamente, las composiciones de la invención se pueden liberar a las células diana si la composición se formula en liposomas. Los liposomas se pueden preparar utilizando técnicas convencionales incluyendo sonicación, diálisis con quelatos, homogenización, infusión de disolvente acoplada con extrusión, extrusión por congelación-descongelación, microemulsificación, así como otras. Los reactivos utilizados para reticular un liposoma u otro agente que contiene lípido a las proteínas de la presente invención comprenden un derivado de fosfolípido para anclarse a un extremo de la reticulación en la capa lipídica y un grupo reactivo en el otro extremo para proporcionar un punto de unión a la biomolécula diana. También se pueden utilizar liposomas polimerizados o liposomas recubiertos con polímero. Dichos polímeros pueden estabilizar el liposoma, reducir su depuración del cuerpo y/o reducir su inmunogenicidad. El liposoma se puede cargar con un grupo funcional tal como un agente de diagnóstico o terapéutico durante o después de su formación. El agente puede estar contenido en un núcleo acuoso del liposoma o se puede incorporar en o unido a su membrana circundante.

Alternativamente, las composiciones de la invención pueden formularse en forma de preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contiene la composición de la invención, en los que las matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsula. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente estadounidense n.° 3.773.919), copo limeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOTTM (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como acetato de etilen- vinilo y ácido láctico-ácido glicólico posibilitan la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.

En el caso de que la composición farmacéutica de la invención comprenda ácidos nucleicos (los polinucleótidos de la invención, los vectores o las construcciones génicas), la invención contempla composiciones farmacéuticas especialmente preparadas para la administración de dichos ácidos nucleicos. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender dichos ácidos nucleicos en forma desnuda, es decir, en ausencia de compuestos que protejan a los ácidos nucleicos de su degradación por las nucleasas del organismo, lo que conlleva la ventaja de que se elimina la toxicidad asociada a los reactivos usados para la transfección. Rutas de administración adecuadas para los compuestos desnudos incluyen intravascular, intratumoral, intracraneal, intraperitoneal, intraesplénica, intramuscular, subretinal, subcutánea, mucosa, tópica y oral (Templeton, 2002, DNA Cell Biol., 21 :857-867). Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden administrarse formando parte de liposomas, conjugados a colesterol o conjugados a compuestos capaces de promover la translocación a través de membranas celulares tales como el péptido Tat derivado de la proteína TAT de HIV-1, la tercera hélice del homeodominio de la proteína Antennapedia de D.melanogaster, la proteína VP22 del virus del herpes simplex, oligómeros de arginina y péptidos tales como los descritos en WO07069090 (Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21 :99- 103, Schwarze, S.R. et al, 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21 :45-48, Lundberg, M et al, 2003, Mol. Therapy 8: 143-150 y Snyder, E.L. y Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21 :389-393). Alternativamente, el polinucléotido puede administrarse formando parte de un vector plasmídico o de un vector viral, preferiblemente vectores basados en adenovirus, en virus adenoasociados o en retrovirus, tales como virus basados en el virus de la leucemia murina (MLV) o en lentivirus (HIV, FIV, EIAV).

El experto en la materia apreciará que las composiciones de la invención pueden tener distintas proporciones de ambos componentes y que dicha proporción dependerá del primer y segundo componente usado en cada caso en particular así como de la indicación deseada. Así, la invención contempla composiciones en los que la relación entre las cantidades de los dos componentes puede oscilar entre 50: 1 y 1 :50, en particular entre 20: 1 y 1 :20, entre 1 : 10 y 10: 1, ó entre 5: 1 y 1 :5.

USOS TERAPEÚTICOS DE LAS COMPOSICIONES Y PROTEINAS DE FUSION DE LA INVENCION

Las composiciones de la invención permiten obtener un efecto superior al que se observa cuando se usa el interferón de tipo III de forma individual. Por tanto, las composiciones de la invención son de utilidad para el tratamiento de aquellos trastornos que requieran o que respondan al tratamiento con interferón de tipo III. Teniendo en cuenta que los interferones de tipo III son capaces de inhibir la replicación del replicón HCV en células epiteliales hepáticas (véanse ejemplos 1 y 2) y de promover la expresión de genes implicados en el procesamiento y presentación antigénica (véase ejemplo 3), las composiciones de la invención pueden ser utilizadas para el tratamiento de aquellos trastornos que requieran una aumento en la respuesta inmune frente a un antígeno determinado, en particular enfermedades infecciosas. Por otro lado, dado que es conocida la capacidad de oncostatina M de reducir la proliferación de células de melanoma (véase Zarling et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1986, 83 :9739-9743), las composiciones de la invención también serían adecuadas para el tratamiento de enfermedades neoplásicas y, en particular del melanoma.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a las composiciones de la invención para su uso en medicina. En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa o neoplásica. Alternativamente, la invención se relaciona con el uso de una composición de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad infecciosa o neoplásica. Alternativamente, la invención se relaciona con un método para el tratamiento de una enfermedad infecciosa o neoplásica en un sujeto que comprende la administración a dicho sujeto de una composición de la invención

Las enfermedades infecciosas o neoplásicas que pueden ser tratadas con las composiciones de la invención incluyen, preferiblemente, enfermedades que afectan a las células epiteliales o las células hepáticas.

La expresión "enfermedad infecciosa", según se usa en la presente invención, se refiere a una enfermedad causada por un patógeno incluyendo, sin limitación, enfermedades causadas por un virus, por una bacteria, por un hongo o por un protozoo.

El patógeno celular que infecta la célula epitelial pretende incluir virus patogénicos, bacterias, hongos y parásitos, particularmente retrovirus, adenovirus, virus del papiloma, virus de herpes, citomegalovirus, virus adenoasociados, virus de la hepatitis, pneumovirus, norovirus, rotavirus, astrovirus, paramixo virus, virus de las paperas, proteínas virales, viroides, y similares; meningococos, micobacterias, Salmonella sp., Shigella sp., Staphylococcus sp., Campylobacter jejuni, Clostridium sp., Escherichia coli, Yersinia sp., Bordetella pertussis, Treponema sp., y similares; parásitos, tales como Leishmania sp., Toxoplasma sp., Schistosoma sp., Clonorchis sp., o Plasmodium sp., etc.; u hongos, tales como Histoplasma sp., Aspergillus sp., Candida sp., Cryptococcus sp., Pneumocystis sp., y similares. En una forma particular de realización, las enfermedades infecciosas que se tratan con los compuestos de la presente invención incluyen enfermedades infecciosas que afectan al hígado, tales como, hepatitis virales, incluyendo, hepatitis A, hepatitis B, Hepatitis B crónica, hepatitis C, hepatitis C crónica, hepatitis D, hepatitis E y hepatitis X, infecciones bacterianas tales como los abscesos amébicos, coccidio-micosis diseminada, infecciones por Francisella sp. y, en particular, Francisella tularensis, infecciones por Plasmodium y, en concreto malaria en su fase hepática. En una forma preferida de realización, las composiciones de la invención se utilizan para el tratamiento de infecciones causadas por HCV.

En el caso particular de que las composiciones de la invención se usen para el tratamiento de HCV, éstas pueden ser usadas junto con otros compuestos útiles en el tratamiento de hepatitis. Compuestos adecuados para su uso en combinación con las composiciones de la invención incluyen, sin limitación, inhibidores de la proteasa de HCV, inhibidores de la metaloproteasa de HCV, inhibidores de la serín-proteasa de HCV, inhibidores de la ARN polimerasa de HCV, inhibidores de la helicasa de HCV, ribavirin (e.g., Pegasys(R); Copegus(R) (Roche)), anticuerpos monoclonales específicos frente a HCV, compuestos antisentido, pequeñas moléculas antivirales, ribozimas y combinaciones de los anteriores. Algunos compuestos con capacidad de inhibir la proteasa NS3/4A y que pueden ser administrados oralmente incluyen telaprevir/VX-950 (Vertex/J and J) y Boceprevir/SCH503034 (Schering-Plough). Otros inhibidores que se encuentran en ensayos clínicos incluyen inhibidores macrocíclicos de la proteasa NS3/4A tales como ITMN-191/R7227 (Intermune/Roche), BI-201335 (Boehringer Ingelheim), TMC435350 (Medivir/J and J) y MK7009 (Merck); inhibidores de la proteasa NS5B tales como R7128 (Pharmasset/Roche), VCH-759 (ViRochem Pharma), PF-00868554 (Pfizer), ANA-598 (Anadys); e inhibidores de NS5A tales como BMS- 790052 (Bristol-Myers Squibb).

El efecto de las composiciones de la invención sobre las enfermedades hepáticas puede ser monitorizado mediante la medida de la función hepática, en donde dicha función hepática se refiere a sus funciones normales incluyendo, sin limitación, una función de síntesis tal y como la síntesis de proteínas séricas (por ejemplo, albúmina, factores de coagulación, fosfatasa alcalina, aminotransferasas tales como la alanine transaminasa, aspartato transaminasa, 5'-nucleosidase, γ-glutaminiltranspeptidasa, etc.), síntesis de bilirrubina, síntesis de colesterol y síntesis de ácidos biliares; funciones metabólicas tales como metabolismo de carbohidratos, metabolismo de aminoácidos y de amonio, metabolismo de hormonas, y metabolismo de lípidos; destoxificación de xenobióticos; funciones hemodinámicas tales como hemodinámica esplénica y portal y similares.

Las composiciones de la invención son capaces de inhibir la replicación del replicón HCV en células epiteliales hepáticas (véanse ejemplos 1 y 2), de promover la expresión de genes implicados en el procesamiento y presentación antigénica (véase ejemplo 3) y de inhibir la proliferación de células de melanoma (Zarling et al., supra.). Estos efectos permiten el uso de las composiciones de la invención en el tratamiento de enfermedades neoplásicas. La expresión "enfermedad neoplásica", según se entiende en la presente invención, se refiere a toda enfermedad caracterizada por un crecimiento anormal de células, tanto benigno (no canceroso) como maligno (canceroso) e incluye tanto tumores sólidos como líquidos. La expresión "tratamiento del cáncer", según se usa en la presente invención, se entiende todos aquellos tratamientos que consiguen una disminución en el tamaño del tumor, una disminución en la tasa de crecimiento del tumor, una disminución en la migración del tumor, una disminución en la transición epitelial-mesenquimal, la estabilización del tamaño del tumor, una disminución de la capacidad invasiva del tumor, una disminución de la tasa de progresión del tumor desde una estadio al siguiente, una disminución en el número de metástasis así como la regresión del tumor.

Preferiblemente, las enfermedades neoplásicas que pueden ser tratadas con las composiciones de la presente invención son aquellas causadas por una proliferación celular indeseada de células epiteliales. Las células epiteliales tumorales se pueden seleccionar de carcinomas, tales como adenocarcinoma (adenocarcinoma bronquiolo- alveolar, adenocarcinoma de células claras, adenocarcinoma folicular, adenocarcinoma mucino, adenocarcinoma papilar, adenocarcinoma escirro, adenocarcinoma sebáceo, adenocarcinoma adrenocortical, tumor carcinoide, carcinoma de células acinares, carcinoma adenoide quístico , carcinoma ductal, carcinoma endometroide, adenocarcinoma pancreático, carcinoma gástrico, cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular, carcinoma intraductal no infiltrante, carcinoma de células de los islotes, carcinoma lobular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma neuro endocrino, carcinoma de células renales, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma de apéndice cutáneo, colangiocarcinoma, coriocarcinoma, cistadenocarcinoma, tumor de Klatskin, enfermedad de Paget extramamaria), carcinoma adenoescamoso; carcinoma de células básales, carcinoma basoescamoso; carcinoma de tumor de Ehrlich; carcinoma de células gigantes; carcinoma in situ (neoplasia intraepitelial cervical y neoplasia intraepitelial prostática); carcinoma de Krebs 2; carcinoma de células grandes; carcinoma de pulmón de Lewis; carcinoma de pulmón de células no pequeñas; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas (enfermedad de Bowen); carcinoma de células transicionales; carcinoma verrucoso .

Las células epiteliales tumorales también se pueden seleccionar de neoplasmas adnexal y de apéndice cutáneo, tales como adenocarcinomas sebáceos, carcinoma de apéndice cutáneo; neoplasmas de células básales, tales como carcinomas de células básales (síndrome del nevo de células básales), carcinoma basoescamoso y pilomatrixoma; neoplasmas quísticos, mucinos y serosos, tales como adenocarcinomas mucinos, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma de células en anillo de sello /tumor de Krukenberg), cistadenocarcinoma (cistadenocarcinoma mucino, cistadenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma seroso), cistadenoma (cistadenoma mucino, cistadenoma papilar, cistadenoma seroso), tumor mucoepidermoide y pseudomixoma peritoneal, neoplasmas ductal, lobular y medular, tales como carcinoma ductal (carcinoma ductal mamario, carcinoma ductal pancreático), carcinoma intraductal no infiltrante (enfermedad mamaria de Paget), carcinoma lobular, carcinoma medular, enfermedad extramamaria de Paget, papiloma intraductal; neoplasmas fibroepiteliales, tales como adenofibroma, tumor de Brenner; neoplasmas mesoteliales, tales como tumor adenomatoide, mesotelioma (mesotelioma quístico); y neoplasmas de células escamosas, tales como acantoma, carcinoma papilar, carcinoma de células escamosas (enfermedad de Bowen), carcinoma verrucoso, papiloma (papiloma invertido).

En otra forma preferida de realización, las composiciones de la invención se usan para el tratamiento del melanoma.

El término "melanoma", según se usa en la presente invención, se refiere a cualquier tumor resultante de la proliferación de melanocitos que aparecen de forma predominante en la piel pero también en el ojo o en el intestino e incluye, sin limitación, melanomas, melanomas metastáticos, melanocarcinomas, melanoepiteliomas, melanosarcomas, melanoma in situ, melanoma que se extiende superficialmente, melanoma modular, melanoma lentigo maligno, melanoma lentiginoso acral, melanoma invasico, lunar atípico familiar y síndrome melanoma (FAM-M). En una forma preferida de realización, las composiciones de la invención se usan fundamentalmente para el tratamiento de enfermedades asociadas con una proliferación indeseada de células hepáticas, incluyendo tanto hiperplasias (hiperplasia nodular focal hiperplasia regenerativa nodular) como tumores hepáticos. El término "tumor hepático", según se usa en la presente invención, se entiende como cualquier tumor que se origina en el hígado e incluye tanto tumores benignos del tipo de adenoma hepatocelular y hemangioma cavernoso como tumores malignos tales como hepatoblastoma (HB) y carcinoma hepatocelular (CHC). No obstante, las composiciones de la invención también pueden ser usadas para el tratamiento de otros tumores hepáticos distintos a los anteriores incluyendo colangiocarcinoma, tumores mixtos y tumores de tejido mesenquimal.

Las composiciones de la invención pueden ser administradas en dosis de menos de 10 mg por kilogramo de peso corporal, preferiblemente menos de 5, 2, 1 , 0,5, 0, 1 , 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ó 0,00001 mg por cada kg de peso corporal. La dosis unitaria se puede administrar por inyección, por inhalación o por administración tópica. Las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente en el órgano en el que se manifieste la enfermedad que deseamos tratar, en cuyo caso se administran dosis de entre 0 , 0000 1 mg a 3 mg por órgano , o preferiblemente entre 0,0001 y 0,001 mg por órgano, en torno a 0,03 y 3,0 mg por órgano, en torno a 0,1 y 3,0 mg por órgano o entre 0,3 y 3,0 mg por órgano. Las expresiones "Unidades internacionales" y "unidades" se emplean indistintamente en la presente invención para referirse al parámetro usado para cuantificar la capacidad del int4erferón de inhibir el efecto citopático de un virus concreto (por ejemplo, el virus de la encefalomiocarditis, el virus de la estomatitis vesicular o el virus del bosque de Semliki) tras la infección de una línea celular adecuada (por ejemplo, las líneas celulares de carcinoma pulmonar A549; HEP2/C y similares). Típicamente, la actividad de la preparación se determina usando el método descrito por Rubinstein et al. (J.Virol, 1981 , 37:755-758) en donde 1 unidad de interferón se define como el inverso de la dilución de la preparación que comprende interferón necesaria para reducir en un 50% el efecto citopático del virus de la estomatitis vesicular en una línea celular de referencia (MDBK).

En el caso de los interferónes de tipo III, aunque no existe un ensayo estándar para determinar la actividad de interferón, es posible definir la actividad del interferón como el inverso de la dilución de la muestra problema que es capaz de reducir en un 50% el efecto citopático (medido por la formación de placas en cultivos monocapa) en la línea celular HepG2 infectada con el virus de la encefalomiocarditis tal y como se ha descrito por Sheppard, P. et al., {Nature Immunol. 2003, 4:63). El valor de ED ₅₀ para conseguir este efecto es de 1- 5 ng/mL para IFN-λΙ y de 10-50 ng/ml para IFN-X2. Típicamente, la actividad antiviral se normaliza por referencia a la actividad de un estándar como el interferón alpha proporcionado por la OMS. Métodos adecuados para determinar las unidades internacionales de una preparación de interferón se describen, por ejemplo, en Familletti, P. C, et al. (Methods in EnzymoL, 1981, 78; S. Pestka, ed, Academic Press, New York pages 387-394) así como en Finter, N.B. (J. Gen. Virol, v. 5, 419 (1969). y Brennan, G.L., y Kronenberg, L.H., (Bio. Techniques., 1, 78 (1983)). La dosis depende de la severidad y respuesta de la condición a tratar y puede variar entre varios días y varios meses o hasta que se observe que la condición remite. La dosificación óptima se puede determinar realizando mediciones periódicas de las concentraciones de agente en el organismo del paciente. La dosis óptima se puede determinar a partir de los valores de la concentración efectiva 50 (EC50) obtenidos mediante ensayos previos in vitro o in vivo en modelos animales. La dosis unitaria se puede administrar una vez al día o menos de una vez al día, preferiblemente, menos de una vez cada 2, 4, 8 o 30 días. Alternativamente, es posible administrar una dosis inicial seguida de una o varias dosis de mantenimiento, generalmente de menos cantidad que la dosis inicial. El régimen de mantenimiento puede implicar tratar al paciente con dosis que oscilan entre 0,01 μg y 1,4 mg/kg de peso corporal por día, por ejemplo 10, 1, 0,1 , 0,01 , 0,001, o 0,00001 mg por kg de peso corporal por día. Las dosis de mantenimiento se administran, preferiblemente, como mucho una vez cada 5 , 10 ó 30 días. El tratamiento se debe continuar durante un tiempo que variará según el tipo de alteración que sufra el paciente, su severidad y el estado del paciente. Tras el tratamiento, se debe monitorizar la evolución del paciente para determinar si se debe incrementar la dosis en caso de que la enfermedad no responda al tratamiento o si se debe disminuir la dosis en caso de observar una mejora de la enfermedad o efectos secundarios indeseados. La dosis diaria se puede administrar en una única dosis o en dos o más dosis según las circunstancias particulares. Si se desea una administración repetida o administraciones frecuentes, es aconsejable la implantación de un dispositivo de administración tal como una bomba, un catéter semipermanente (intravenoso, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular) o un reservorio.

Las componentes que forman las composiciones de la invención se pueden administrar conjuntamente como formulaciones farmacéuticas separadas o como parte de la misma forma de dosificación unitaria. Alternativamente, los distintos componentes de las composiciones de la invención se pueden administrar por separado pero como parte de una pauta terapéutica. En el caso de la administración separada, los componentes no necesitan ser administrados esencialmente a la vez, aunque es posible si se desea. De este modo, el agonista de OSMR y el interferón de tipo III o la variante funcionalmente equivalente del mismo se pueden administrar simultáneamente pero por distintas vías de administración. Opcionalmente, la administración separada del agonista de OSMR y del interferón de tipo III o la variante funcionalmente equivalente del mismo se puede realizar a diferentes tiempos y en cualquier orden.

Así, la invención contempla un producto que comprende un agonista de OSMR y un IFN de tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo como un preparado combinado para el uso simultáneo, separado o secuencial para el tratamiento de enfermedades infecciosas o neoplásicas.

Como tal, la presente invención se refiere además a la combinación de formulaciones farmacéuticas separadas en forma de kit. Por ejemplo, un kit puede comprender dos formulaciones farmacéuticas separadas que comprenden: 1) un agonista de OSMR y 2) un IFN de tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo. El kit también comprende un recipiente para las formulaciones separadas, tales como una botella dividida o un envase de aluminio dividido. Algunos ejemplos adicionales de recipientes incluyen jeringas, cajas, bolsas y similares. Habitualmente, un kit comprende instrucciones para la administración de los componentes separados. La forma kit es particularmente ventajosa cuando los componentes separados se administran preferiblemente en formas de dosificación diferentes (por ejemplo, oral y parenteral), se administran a intervalos diferentes de dosis o cuando se desea una concentración de los componentes individuales de la combinación por el médico solicitante.

El producto o kit de la presente invención es particularmente adecuado para aumentar la actividad inmunoestimuladora de células hepáticas en un ser humano. En una realización de la presente invención, el producto o kit que un agonista de OSMR y un interferón tipo III o una variante funcionalmente equivalente del mismo se utiliza en la inmunoterapia del cáncer y enfermedades provocadas por patógenos infecciosos, tales como virus, bacterias, hongos y parásitos.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Entre los ejemplos de dichas formas de dosificación unitarias están los comprimidos (incluyendo comprimidos rayados o recubiertos), cápsulas, pastillas, supositorios, paquetes de polvos, obleas, soluciones o suspensiones inyectables, y similares, y combinaciones múltiples separadas de los mismos. La dosificación diaria de los compuestos según la presente invención variará con el modo de administración, el tratamiento deseado y la gravedad del trastorno.

En general, se contempla que una cantidad diaria eficaz de OSM puede variar desde aproximadamente 0,05 hasta aproximadamente 5,0 mg por paciente. En el caso del IFN tipo III, la cantidad diaria eficaz sería desde 0,5 hasta 100 μg/kg, preferiblemente a dosis de 0,5, 1,5, 5, 10, 20 o 40 μg/kg. La administración puede llevarse a cabo de forma semanal o cada dos semanas. La composición puede ser administrada de forma subcutánea. En algunas formas de realización, el interferón de tipo III o la variante funcionalmente equivalente del mismo se puede administrar mediante una única pauta de administración o bien combinando una primera y una segunda pauta de administración seguida de una segunda administración. Dicha primera administración (conocida como "régimen de inducción") implica la administración de una mayor dosis del interferón y puede ser llevado a cabo mediante una única administración o mediante varias dosis administradas diariamente, cada dos días, tres veces a la semana, cada dos semanas, 3 veces al mes o una vez al mes. Dicha primera administración se lleva a cabo durante un periodo de tiempo que puede oscilar entre al menos 4 semanas, al menos 8 semanas o al menos 12 semanas. Dicha primera administración puede llevarse a cabo simultáneamente con la administración del agonista de OSMR o de forma separada en el tiempo y puede llevarse a cabo por la misma vía de administración o por una vía distinta de administración que el agonista de OSMR. El segundo régimen de administración del interferón de tipo III o de la variante funcionalmente equivalente del mismo (régimen de mantenimiento) implica generalmente la administración de una menor cantidad de dichos compuestos. Así, es posible la administración de al menos en torno a 3 μg, al menos en torno a 9 μg, al menos en torno a 15 μg, al menos en torno a 18 μg. El segundo régimen de administración puede incluir una o varias administraciones diarias, cada dos días, tres veces a la semana, cada dos semanas, 3 veces al mes o una vez al mes. Puede ser apropiado administrar la dosis requerida como una, dos, tres, cuatro o más subdosis en los intervalos apropiados a lo largo del día. Además, es evidente que dicha cantidad diaria eficaz puede disminuirse o aumentarse dependiendo de la respuesta del sujeto tratado y/o dependiendo de la evaluación del médico que prescribe los compuestos de la presente invención. Por lo tanto, los intervalos de las cantidades diarias eficaces son sólo a modo de guía.

La invención se describe a continuación por medio de los siguientes ejemplos que tienen un carácter meramente ilustrativo y en ningún caso limitativo del ámbito de la invención.

EJEMPLOS

En los ejemplos siguientes se recogen ensayos comparativos realizados con composiciones que comprendían distintas combinaciones de los siguientes compuestos:

Oncostatina M humana recombinante (OSM) obtenida de R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; Catálogo # 295-OM; SEQ.ID.NO.: 2);

Un IFN-λΙ humano recombinante obtenido de PeproTech (PeproTech Inc. Rocky Hill, NJ, USA; Catálogo # 300-02L), cuya secuencia de aminoácidos es (SEQ.ID.NO: 6): PTSKPTTTGK GCHIGRFKSL SPQELASFKK ARDALEESLK LKNWSCSSPV FPGNWDLRLL QVRERPVALE AELALTLKVL EAAAGPALED VLDQPLHTLH HI LSQLQACI QPQPTAGPRP RGRLHHWLHR LQEAPKKESA GCLEASVTFN LFRLLTRDLK YVADGNLCLR TSTHPEST Un ΙΚΝ-λ2 humano recombinante, también obtenido de Peprotech (PeproTech Inc. Rocky Hill, NJ, USA; Catálogo # 300-02K), cuya secuencia de aminoácidos es (SEQ.ID.NO: 10):

PVARLHGALP DARGCHIAQF KSLSPQELQA FKRAKDALEE SLLLKDCRCH SRLFPRTWDL RQLQVRERPM ALEAELALTL KVLEATADTD PALVDVLDQP LHTLHHI LSQ FRACIQPQPT AGPRTRGRLH HWLYRLQEAP KKESPGCLEA SVTFNLFRLL TRDLNCVASG DLCV

Ejemplo 1. Efecto antiviral en células Huh7 que expresan el replicón HCV. Análisis de la expresión de ARNm viral.

El sistema in vitro de replicación del HCV sobre la línea celular hepática Huh7, llamado replicón HCV, es un modelo experimental altamente utilizado en la literatura para valorar el efecto sobre la replicación del HCV de diferentes moléculas [Manns et al. Nat Rev Drug Discov, 2007; 6 : 991-1000] . Esta línea celular posee receptores en su superficie para las moléculas ensayadas, IFN-λ y OSM, por lo que este sistema constituye un ensayo ideal para valorar la eficacia antiviral de ambas moléculas.

En primer lugar se establecieron células Huh7 que expresaban el replicón del HCV de longitud completa como se ha descrito por Pietschmann y cois. [J Virol 2002; 76: 4008- 4021]. Resumiendo, se linealizaron pI389/Core-375.1 con Seal (New England Biolabs, USA) y se utilizaron como plantillas para la síntesis de ARN usando la ARN polimerasa T7 (Promega, USA). Se usaron 20 μg de ARN sintetizado para electroporar 10 ⁷ células Huh7 y, a las 24 horas, se añadieron 500 μg/mL de G418 (Gibco, USA). Dos veces por semana, se reemplazó el medio de cultivo suplementado con G418 y, a las 4 semanas de la transfección, se recogieron las colonias resistentes a G418 mezcladas y se usaron para posterior análisis. Para el análisis del ARNm de HCV, por PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR), se sembraron células Huh7 que expresaban el replicón del HCV de longitud completa a 10.000/pocillo en placas de 96 pocilios en D-MEM con un 10% de FCS. Se añadió la correspondiente sustancia a ensayar y se mantuvo el cultivo celular durante tres días.

Se obtuvo el ARN total de células Huh7 mediante extracción automática. Se trató el ARN total con ADNasa (Gibco-BRL) antes de la transcripción inversa con M-MLV Reverse Transcriptase (Gibco-BRL) en presencia de RNaseOUT (Gibco-BRL). Se midió la expresión del ARNm de HCV y del ARNm de la β-actina por PCR cuantitativa en tiempo real usando un ICycler y la IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). Se usaron alícuotas de 2 μΐ del pool de ADNc para cada PCR, que contenía cebadores sentido y antisentido específicos para la región no traducida 5' del HCV

5 ' CCTGTGAGGAACTACTGTCT 3 ' (SEQ.ID.NO.: 13), y

5 ' CTATCAGGCAGTACCACAAG 3 ' (SEQ.ID.NO.: 14);

o para el gen de la β-actina

5 ' AGCCTCGCCT T TGCCGA 3 ' (SEQ.ID.NO.: 15), y

5 ' CTGGTGCCTGGGGCG 3 ' (SEQ.ID.NO.: 16),

en un volumen final de 20 μΐ.

Para determinar la especificidad de los productos de PCR, se analizó la temperatura de disociación de los mismos. Se normalizaron los resultados según la cuantificación de β-actina en la misma muestra. Se expresó la cantidad de ARNm de HCV por la fórmula fluorescencia sube apreciablemente por

encima de la fluorescencia de fondo.

El análisis del tipo de interacción entre IFN-λ y OSM se realizó mediante análisis multivariante según el método descrito por Chou [Synergism and Antagonism in chemotherapy 1991 ; 61-102].

El tipo de interacción entre dos sustancias se mide mediante un factor denominado índice de interacción "I", donde I=dl/Dl+d2/D2; siendo di y d2 las concentraciones de los inhibidores en la combinación, y DI y D2 las concentraciones de los inhibidores 1 y 2 que por separado ejercen la misma inhibición que la combinación. Así, si "I" es igual a 1 las sustancias no reaccionan entre si (efecto aditivo), si "I" es menor a 1 la combinación es sinérgica y si "I" es mayor a 1 la combinación es antagónica.

Al objeto de obtener las oportunas comparaciones, se realizaron ensayos paralelos utilizando las siguientes sustancias a ensayar:

- Control, en que no se añadieron compuestos;

- IFN-λΙ (50 UI/mL);

- lFN-λΙ (50 UI/mL);

- Combinación de IFN-λΙ (50 UI/mL) con OSM (20 ng/mL);

- Combinación de IFN-λΙ (50 UI/mL) con OSM (10 ng/mL);

- Combinación de IFN- 2 (50 UI/mL) con OSM (20 ng/mL); y

- Combinación de IFN- 2 (50 UI/mL) con OSM (10 ng/mL).

Tabla 4. Estudio del tipo de interacción que se establece entre el IFN-lambda (IFN-λΙ o IFN-λΙ) y la OSM sobre la replicación de HCV en células Huh7 transfectadas con el replicón del HCV de longitud completa.

Las letras A y B hacen referencia al estudio llevado a cabo en dos clones distintos de células Huh7 portadoras del replicón genómico de HCV, mostrados en la Figura 1.

En conclusión, los experimentos llevados a cabo pusieron de manifiesto que el tratamiento combinado de IFN-lambda junto con OSM provoca una inhibición de la replicación del HCV superior a la inducida por las citoquinas administradas individualmente (Figura 1). Además, el análisis del tipo de sinergismo que se establece entre ambas moléculas puso de manifiesto que la interacción que se da entre ellas es de tipo sinérgico. Ejemplo 2. Efecto antiviral en células Huh7 que expresan el replicón HCV. Análisis de expresión de la proteína viral Core.

En primer lugar y de la misma manera como se describe en el ej emplo 1 , se establecieron líneas celulares Huh7 portadoras del replicón del HCV de longitud completa.

A continuación, se sembraron células Huh7 que expresaban el replicón del HCV de longitud completa a 200.000/pocillo en placas de 6 pocilios en D-MEM (Gibco) con un 10% de FCS (Gibco). Se añadió la correspondiente sustancia a ensayar y se incubó durante 72 horas. Después, se lisaron las células Huh7 en tampón de lisis (Tris-HCl 60 mM pH 6,8, SDS 2%, glicerol 2,5%, β-mercaptoetanol 0,7 M y azul de bromofenol 0,02%)). Se resolvieron las muestras en geles de SDS-poliacrilamida (Bio-Rad Laboratories, CA) al 15% en condiciones reductoras. Después de la electro foresis, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories) y se tiñeron con solución roja de Ponceau (Sigma-Aldrich, Alemania), para verificar que había una carga igual de proteínas. Se incubaron las membranas en TBS-T (Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 200 mM y 0, 1 % de Tween-20) con leche deshidratada al 5%. Las proteínas se detectaron por incubación con el anticuerpo primario específico (anti-Core a dilución 1/1000) en TBS-T durante 1 hora. Después se lavaron las membranas en TBS-T y se añadió anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa durante 1 hora. Se sometieron las membranas a lavados extensos en TBS-T y se visualizaron las bandas proteicas específicas usando el sistema de detección de quimioluminiscencia "Western Lightning chemiluminescence reagent plus" (Perkin Elmer, USA), según las instrucciones del fabricante.

Al objeto de obtener las oportunas comparaciones, se realizaron ensayos paralelos utilizando las siguientes sustancias a ensayar: - Control, en que no se añadieron compuestos;

- IFN-λΙ (50 UI/mL);

- OSM (10 ng/mL); y

- Combinación de IFN-λΙ (50 UI/mL) con OSM (10 ng/mL).

Como se muestra en la Figura 2, el análisis por Western Blot de la proteína estructural Core puso de manifiesto una mayor inhibición de la replicación viral cuando se combina un IFN-λ con OSM, ratificando los resultados obtenidos en el análisis por PCR en tiempo real (Figura 1).

Ejemplo 3. Efecto inmunomodulador. Análisis de la expresión de genes implicados en el procesamiento y presentación de antígenos.

Un aspecto crucial en la defensa frente a infecciones víricas es la habilidad de la célula infectada para presentar péptidos virales en la membrana celular en el contexto de moléculas HLA tipo I. Para que las proteínas virales puedan ser presentadas deben ser previamente procesadas en forma de péptidos pequeños y transportadas a la membrana plasmática. PSMB9 es una de las subunidades constituyentes del inmunoproteasoma, que juega un papel crucial en el procesamiento y presentación de péptidos específicos a linfocitos citotóxicos [Strehl et al. Immunol Rev. 2005; 207: 19-30]. TAP 1 y TAP 2 son dos proteínas críticas para la carga de péptidos antigénicos en HLA de clase I [Van den Eynde et al. Curr Opin Immunol., 2001; 13: 147-153].

De la misma manera descrita en el ejemplo 1 , se establecieron líneas celulares Huh7 portadoras del replicón del HCV de longitud completa.

Para el análisis del ARNm de genes inmunomoduladores por PCR cuantitativa en tiempo real, se sembraron células Huh7 que expresaban el replicón del HCV de longitud completa a 10.000/pocillo en placas de 96 pocilios en D-MEM con un 10% de FCS. Se añadió la correspondiente sustancia a ensayar, se recogieron las células tras diferentes tiempos de incubación (24 y 48 horas) y se analizó el perfil de expresión de genes implicados en la respuesta celular frente a una infección. Se obtuvo el ARN total mediante extracción automática. Se trató el ARN total con ADNasa (Gibco-BRL) antes de la transcripción inversa con M-MLV Reverse Transcriptase (Gibco-BRL) en presencia de RNaseOUT (Gibco-BRL). Se midió la expresión del ARNm de TAP 1 , TAP 2 y PSMB9 y del ARNm de la β-actina por PCR cuantitativa en tiempo real usando un ICycler y la IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). Se usaron alícuotas de 2 μΐ del pool de ADNc para cada PCR, que contenía cebadores sentido y antisentido específicos de TAPl , TAP2, PSMB9 y para el gen de la β-actina en un volumen final de 20 μΐ. Los cebadores utilizados fueron los siguientes:

para TAPl

5' TCGTTGTCAGTTATGCAGCG 3' (SEQ.ID.NO.: 17), y

5' CCCGTAAAGAATGGAATGGC 3' (SEQ.ID.NO.: 18);

para TAP2

5' GGACCAGGTGAACAACAAAG 3' (SEQ.ID.NO.: 19), y

5' CAAAGGAGAAGAGGCACATG 3' (SEQ.ID.NO.: 20);

para PSMB9

5' CATCATGGCAGTGGAGTTTG 3' (SEQ.ID.NO.: 21), y

5' TGAGATGTGCAGACAAGTCC 3' (SEQ.ID.NO.: 22); y

para β-actina

5' AGCCTCGCCTTTGCCGA 3 ' (SEQ.ID.NO.: 15), y

5' CTGGTGCCTGGGGCG 3 ' (SEQ.ID.NO.: 16).

Al objeto de obtener las oportunas comparaciones, se realizaron ensayos en paralelos utilizando las siguientes sustancias a ensayar:

- Control, en que no se añadieron compuestos;

- IFN-λΙ (50 UI/mL);

- IFN- 2 (50 UI/mL);

- OSM (10 ng/mL);

- Combinación de IFN-λΙ (50 UI/mL) con OSM (10 ng/mL); y

- Combinación de IFN- 2 (50 UI/mL) con OSM (10 ng/mL).

Como se muestra en la Figura 3, los resultados obtenidos pusieron de manifiesto una mayor expresión de genes implicados en el procesamiento y presentación antigénica, tales como TAP1, TAP2 y PSMB9, cuando se combina un IFN-λ con OSM en células Huh7 portadoras del replicón genómico de HCV. Estos resultados muestran que la ac ción conc ertada de l I FN l amb da y O S M p otencia las prop i edade s inmuno estimuladoras en la célula hepática. Este perfil génico es clave para la resolución de procesos que alteran la homeostasis celular tales como infecciones virales o la adquisición de un fenotipo tumoral.

Ejemplo 4. Efecto de la combinación de IFN-λΙ y OSM sobre la cascada de señalización en células de hepatoma -Huh- o en células que mantienen la replicación de HCV.

Se analizaron varios de los componentes de la cascada de señales Jak-STAT (STAT1, STAT2, STAT3 y STAT5), tras el tratamiento con las citoquinas IFN-λΙ y/o OSM, que activan esta vía de señalización.

En la figura 4 se muestra la cantidad de proteína activada (fosforilada) y cantidad de proteína total presente en unas células de hepatoma humano (Huh7) en presencia (Huh7-Core 3') o ausencia (Huh7) del replicón genómico del HCV a diferentes tiempos (3, 12, 24 y 48 horas) tras la adición de la sustancia a ensayar. Transcurridos los tiempos señalados se prepararon extractos celulares en los que se examinó mediante SDS-PAGE/Western-blot la cantidad de STAT1, STAT2, STAT3 y STAT5 fosforiladas y totales presentes. Se incluyó un análisis de la cantidad de actina existente en cada una de las muestras mostrando que en todos los casos se había cargado la misma cantidad de extracto celular.

Los anticuerpos utilizados para el análisis fueron: anti fosfo-STAT-l ^Tyr701 (9171L/Cell signaling technology), anti-fosfo-STAT-2 (07-224/Upstate) anti fosfo-STAT-3 ^Tyr705 (9131/ Cell signaling technology), anti fosfo-STAT-5 (9351S/ Cell signaling technology), anti-STAT-l(sc-346), anti-STAT-2 (06-502/Upsate), anti-STAT-3 (06596/Upstate), anti-STAT-5 (9363/Cell signaling technology) y anti-actina (A2066/Sigma Aldrich). Se realizaron ensayos paralelos utilizando las siguientes sustancias a ensayar:

- Control, en el que no se añadieron compuestos,

- IFN-λΙ (5000 UI/mL),

- Oncostatina M (OSM, 10 ng/mL), y

- la combinación de IFN-λΙ (5000 UI/mL) con OSM (10 ng/mL)

La incubación de las células Huh7 y las células Huh7-Core-3', con el IFN-λ, la OSM o la combinación de IFN-λΙ y OSM induce la fosforilación de STATl , STAT2, STAT3 y STAT5, siendo la activación de STAT2 específica del IFN-λΙ y la de STAT3 de la OSM. Cuando se observan los resultados del uso combinado de ambas citoquinas se comprueba que se produce una activación continuada en el tiempo de las cuatro proteínas analizadas lográndose niveles de activación iguales (STAT3 y STAT5) o superiores (STATl y STAT2) a los observados cuando se usan las citoquinas de manera aislada.

La administración aislada de IFN-λΙ genera un incremento a lo largo del tiempo de la cantidad de STATl total presente en las células y la OSM de la cantidad de STAT3 total. Estos efectos se reproducen cuando se administran de manera conjunta ambas citoquinas viéndose además un incremento de la cantidad de STAT2 total detectada en las células.

Tras estos experimentos se puede concluir que el uso combinado de ambas citoquinas es capaz de reproducir los efectos inducidos por cada una de las citoquinas aisladas (activación de STAT3 y STAT5) pero además provoca un incremento notable en la cantidad de STATl y STAT2 activados. De esta manera, se pueden generar un mayor número de complejos transcripcionales activos y aumentar la actividad biológica del uso combinado de ambas citoquinas frente al uso de manera individual. Es de particular relevancia la potenciación de la activación de STAT2, ya que a diferencia de STATl, STAT3 y STAT5 esta molécula es solamente activada por el IFN-λΙ .