Die vorliegende Erfindung betrifft ein Konjugat, daß sich zur Beeinflussung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen eignet, eine ein solches Konjugat kodie¬ rende DNA und die Verwendung des Konjugats.

Viele Vorgänge in einem Organismus beruhen auf Wechselwirkungen zwischen Proteinen. Beispiele solcher Wechselwirkungen finden sich bei Rezeptoren und den an sie bindenden Liganden. Oftmals sind allerdings die Wechselwirkungen zwischen Proteinen gestört. Dies kann daran liegen, daß einzelne an den Wech¬ selwirkungen beteiligte Proteine modifiziert sind, wodurch ihre Affinität zu anderen, ebenfalls beteiligten Proteinen verändert ist. Auch können einzelne an den Wechselwirkungen beteiligte Proteine fehlen. Dies findet man z.B. bei Zellen, die nicht auf lnterleukin-6 (IL-6) reagieren. Solche Zellen weisen einen unvollständigen lnterleukin-6-Rezeptor auf, d. h. dieser Rezeptor umfaßt lediglich die intrazelluläre, Signal-auslösende Untereinheit gp1 30, nicht aber die extrazel¬ luläre, IL-6 bindende Untereinheit (IL-6R) .

Viele Versuche werden unternommen, gestörte Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu beheben. Beispielsweise wird dies bei einem unvollständigen Inter- leukin-6-Rezeptor durch Verabreichung von IL-6 (50 ng/ml) und löslichem IL-6R (slL-6R) ( 1 280 ng/ml) versucht. Die Bereitstellung von slL-6R bedingt jedoch einen großen Kosten- und Zeitaufwand, da slL-6R nur biologisch aktiv ist, wenn es aus eukaryotischen Zellen stammt, und die Erträge aus solchen im Bereich von 1 -6 mg slL-6R/l liegen. Die genannte Verabreichung stellt somit kein ge¬ eignetes Mittel dar, dauerhaft die gestörten Wechselwirkungen bei einem unvoll¬ ständigen lnterleukin-6-Rezeptor zu beheben.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu¬ stellen, mit dem gestörte Wechselwirkungen zwischen Proteinen, insbesondere bei einem unvollständigen lnterleukin-6-Rezeptor, behoben werden können.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Konjugat, das zwei, eine Affinität zueinander aufweisende, Polypeptide umfaßt, wobei die Polypeptide über einen Linker miteinander verbunden sind.

Der Ausdruck "eine Affinität zueinander aufweisende Polypeptide" betrifft Polypeptide jeglicher Art, Herkunft und Länge, die eine Affinität zueinander aufweisen. Zwei solcher Polypeptide liegen in einem erfindungsgemäßen Kon¬ jugat vor. Eines dieser Polypeptide kann ein Rezeptor und das andere ein an den Rezeptor bindender Ligand sein. Der Rezeptor kann in Form seiner Untereinheit bzw. des funktionellen Teils davon vorliegen, die den Liganden binden. Ebenso kann der Ligand in Form seiner Untereinheit bzw. des funktionellen Teils davon vorliegen, die den Rezeptor binden. Vorzugsweise ist der Rezeptor ein Zytokin- Rezeptor, insbesondere ein Rezeptor für Lymphokine, Monokine, Interferone, "colony stimulating factors" oder Interleukine. Besonders bevorzugt ist der Rezeptor ein lnterleukin-6-Rezeptor oder ein CNTF-Rezeptor. Entsprechendes gilt für den Liganden. Dieser ist vorzugsweise ein Zytokin, insbesondere ein Lympho- kin, Monokin, Interferon, "colony stimulating factor" oder Interleukin. Besonders bevorzugt ist der Ligand ein Mitglied der lnterleukin-6-Familie, insbesondere IL-6, IL-1 1 , CNTF, OSM, LIF oder CT-1 . Der Rezeptor und der Ligand können Wildtyp- Sequenzen oder hiervon durch ein oder mehrere Nukleotide unterschiedliche Sequenzen umfassen. Dadurch können der Rezeptor und der Ligand verbesserte und/oder neue Eigenschaften aufweisen. Verbesserte Eigenschaften können z.B. darin liegen, daß die Bindung zwischen dem Rezeptor und dem Ligand verbessert ist. N/ ue Eigenschaften können z.B. darin liegen, daß der Ligand ein verändertes Verhalten zu Proteinen zeigt, mit denen er nach Bindung an den Rezeptor rea¬ giert. Beispielsweise kann IL-6 dahingehend verändert sein, daß es eine stärkere Bindung an den IL-6-Rezeptor hat, das Protein gp1 30 aber nicht mehr aktivieren kann. In einem solchen Fall umfaßt IL-6 vorzugsweise die Sequenz von Fig. 3 oder Fragmente davon. Vorstehende Ausführungen hinsichtlich einer Verände-

rung der Wildtyp-Sequenz eines Rezeptors bzw. eines Liganden gelten entspre¬ chend für deren Untereinheiten und funktionellen Teile davon, die zu einer gegenseitigen Bindung beitragen.

Der Ausdruck "Linker" betrifft Linker jeglicher Art, die sich zur Verbindung von Polypeptiden eignen. Beispiele solcher Linker sind bifunktionelle, chemische Cross-Linker, z.B. DPDPB. Ferner kann der Linker eine durch die beiden Polypep¬ tide ausgebildete Disulfidbrücke sein. Desweiteren kann der Linker ein Polypeptid sein.

In bevorzugter Ausführungsform ist ein vorstehendes Konjugat ein Fusions- polypeptid. In diesem können die zwei, eine Affinität zueinander aufweisende Polypeptide miteinander fusioniert sein und der Linker einer durch die zwei Polypeptide ausgebildete Disulfidbrücke darstellen. Vorzugsweise ist der Linker ein Polypeptid, das die zwei anderen Polypeptide miteinander verbindet. Beispiele letzteren Fusionspolypeptids sind in den Figuren 1 und 2 angegeben. Diese Fusionspolypeptide umfaßen ein humanes slL-6R-Polypeptid, d.h. die extra¬ zelluläre Untereinheit eines lnterleukin-6-Rezeptors, und ein humanes IL-6-Poly- peptid, wobei die Polypeptide über unterschiedliche Polypeptid-Linker mitein¬ ander verbunden sind. Diese Fusionspolypeptide werden mit H-IL-6 bezeichnet. Eine Variation von H-IL-6, die von dem slL-6R-Polypeptid nur die Aminosäuren Pro 1 14 bis Ala 323 enthält, wird ebenfalls bereitgestellt. Ferner wird eine Variation von H-IL-6 bereitgestellt, welche die Aminosäuren 1 1 3 bis 323 des sIL- 6R-Polypeptids und die Aminosäuren 29 bis 21 2 des IL-6-Polypeptids umfaßt. Desweiteren wird ein Fusionspolypeptid H-IL-6 bereitgestellt, dessen IL-6-Poly- peptid die Sequenz von Fig. 3 umfaßt. Das slL-6R-Polypeptid dieses Fusions¬ poly ^p eptids umfaßt eine vollständige Sequenz bzw. die Sequenz zwischen den Aminosäuren 1 1 3 ( 1 14) bis 323 eines slL-6R-Polypeptids. Darüberhinaus wird ein Fusionspolypeptid bereitgestellt, das die extrazelluläre Untereinheit eines humanen CNTF-Rezeptors und humanes CNTF umfaßt, wobei beide Polypeptide über einen Polypeptid-Linker miteinander verbunden sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine für ein vorstehendes Fusionspolypeptid kodierende DNA. Vorzugsweise kodiert die DNA für ein Fusionspolypeptid, bei dem die zwei, eine Affinität zueinander aufweisenden Polypeptide über einen Polypeptid-Linker miteinander verbunden sind. Ein Bei¬ spiel letzterer DNA ist in Fig. 1 angegeben. Diese DNA wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) als CDM8-H-IL-6 unter DSM 10549 am 27. 2. 1 996 hinterlegt.

Eine erfindungsgemäße DNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Ex¬ pressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z.B. pY100, Ycpadl und Vektoren für Pichia pastoris zu nennen, wobei letztere bevorzugt sind, während für die Expression in tierischen Zellen, die in einem Organismus oder außerhalb eines solchen vorliegen können, z.B. pKCR, pEFBOS, pCEV4 und pCDM8 an¬ zugeben sind, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A. Der Fachmann wird berücksichtigen, daß für die Expression einer erfindungsgemä¬ ßen, slL-6R-Sequenzen enthaltenden, DNA Vektoren angeraten sind, die eine Expression in eukaryotischen Zellen ermöglichen.

Femer kennt der Fachmann geeignete Zellen, um eine erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101 , DH 1 , x1 776, JM 101 , JM 109, BL21 und SG 1 3009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris, wobei letzterer bevorzugt ist, die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, Vero, HeLa und COS, wobei letztere bevorzugt sind, sowie die Insektenzellen sf9.

Desweiteren weiß der Fachmann, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Auch kennt er Bedingungen, Zellen zu transformieren bzw. transfizieren und diese dann zu kultivieren. Da- rüberhinaus sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA

exprimierte Fusionspolypeptid zu isolieren und zu reinigen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen¬ des Fusionspolypeptid gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden Fusionspolypeptid zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen Fusionspolypeptid erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusio¬ niert.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu beeinflussen. Dies kann durch die Verabreichung erfindungsgemä¬ ßer Konjugate wie auch durch den Einsatz erfindungsgemäßer DNA in einer Gentherapie erfolgen. Insbesondere können die gestörten Wechselwirkungen bei einem unvollständigen lnterleukin-6-Rezeptor behoben werden. Die vorliegende Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß sie kostengünstig eingesetzt werden kann. Dies zeigt sich insbesondere in der Verabreichung erfindungsgemäßer Konjugate zur Beeinflussung der gestörten Wechselwirkungen bei einem unvoll¬ ständigen lnterleukin-6-Rezeptor.

Ferner eignet sich die vorliegende Erfindung zur ex vivo Expansion von Stamm¬ zellen, insbesondere humanen Stammzellen. Besonders bemerkenswert ist es dabei, daß mit einem erfindungsgemäßen Konjugat H-IL-6 mehr Stammzeil- Kolonien im Soft-Agar erhalten werden, als dies mit den einzelnen Komponenten IL-6 und slL-6R möglich ist. Die vorliegende Erfindung stellt somit auch einen wichtigen Beitrag dar, gezielt in die Bildung von Blutzellen einzugreifen.

Desweiteren stellt die vorliegende Erfindung mit einem Fusionspolypeptid H-IL-6, das als IL-6-Polypeptid die Sequenz von Fig. 3 umfaßt, ein Mittel bereit, das sich

als IL-6-Rezeptor-Antagonist eignet. Ein solches Mittel ist von hohem therapeuti¬ schen Wert.

Die Durchführung der vorliegenden Erfindung kann durch die erfindungsgemäßen Antikörper überwacht werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt die Aminosäure (DNA)-sequenz eines erfindungsgemäßen

Fusionspolypeptids H-IL-6. Sequenzen für das Restriktionsenzym Sall (GTCGAC), das Signalpeptid (MLAVGCALLAALLAAPGAA) und den Linker (RGGGGSGGGGSGGGGSVE) sind angegeben. Der Linker verbindet den COOH-Terminus von humanem slL-6R mit dem NH ₂ - Terminus von humanem IL-6.

Fig. 2 zeigt die Aminosäure (DNA)-sequenz eines erfindungsgemäßen

Fusionspolypeptids H-IL-6. Sequenzen für das Restriktionsenzym Sall (GTCGAC), das Signalpeptid (MLAVGCALLAALLAAPGAA) und den Linker (RGGGGSGGGGSVE) sind angegeben. Der Linker ver¬ bindet den COOH-Terminus von humanem slL-6R mit dem NH ₂ - Terminus von humanem IL-6.

Fig. 3 zeigt die Aminosäuresequenz des in einem erfindungsgemäßen

Fusionspolypeptid H-IL-6 vorliegenden IL-6-Polypeptids.

Fig. 4 zeigt die Expansions- und Koloniebildungsfähigkeit eines erfin¬ dungsgemäßen Fusionspolypeptids H-IL-6.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 : Herstellung einer erfindungsgemäßen DNA

Es wurde die DNA von Fig. 1 hergestellt. Dazu wurde humane IL-6R cDNA (Schooltink et al., Biochem. J. (1991) 277, 659-664) verwendet. Diese cDNA wurde in das Expressionsplasmid pCDM8 über die Restriktionsstelle Xho I einkloniert (Müllberg et al., Eur. J. Immunol. (1993) 23, 473-480). Mit Hilfe einer Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung der Primer (1) (pCDM85' Primer: 5' TAATACGACTCACTATAGGG3') und Primer (2) (slL-6R 3' Primer: 5'CCGCTCGAGCTGGAGGACTCCTGGA 3') bei Standardbedingungen ein slL-6R Fragment generiert, das nach Schneiden mit den Restriktionsenzymen

Hind III und Xho I in das geöffnete Plasmid pCDM8 einkloniert wurde. Es ent¬ stand das Plasmid pCDM8-slL-6R. Anschließend wurde eine zweite PCR Reak¬ tion mit IL-6 cDNA, die ebenfalls in das Expressionsplasmid pCDM8 unter Verwendung von Xho I einkloniert worden war, durchgeführt. Es wurden die Primer (3) (IL-6-5' Primer: 5' CGGCTCGAGCCAGTACCCCCAGGAGAA3') und

Primer (4) (pCDM8 3' Primer: 5'CCACAGAAGTAAGGTTCCTT3') verwendet. Das PCR Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Xho l und Not I geschnit¬ ten und in das Plasmid pCDM8-slL-6R einkloniert. Es entstand das Plasmid pCDM8-slL-6R-IL-6. Anschließend wurde ein synthetischer Linker hergestellt, der aus zwei Oligonukleotiden bestand: Primer (5) (5'TCGAG-

GAGGTGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCTG3') und Primer (6) (5'TCGACAGAACCTCCACCTCCAGAACCTCCACCTCCA- GAACCTCCACCTCC3'. Die Oligonukleotide (5) und (6) wurden nach Standard¬ methoden zu einem Doppelstrang zusammengefügt und anschließend in das mit dem Restriktionsenzym Xho I verdaute Plasmid pCDM8-slL-6R-IL-6 einkloniert.

Es entstand das Plasmid pCDM8-H-IL-6.

Beispiel 2: Herstellung einer erfindungsgemäßen DNA

Es wurde die DNA von Fig. 2 hergestellt. Hierzu wurde vorgegangen, wie in

Beispiel 1 beschrieben. Als Primer (5) und (6) wurden jedoch verwendet: Primer (5) (5TCGAGGAGGTGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCTG3') und Primer (6)

(5TCGACAGAACCTCCACCTCCAGAACCTCCACCTCC3'. Es wurde das Plas¬ mid pCDM8-H-IL-6-(2) erhalten.

Beispiel 3: Expression eines erfindungsgemäßen Fusionspolypeptids

COS-7-Zellen wurden mit pCDM8-H-IL-6 von Beispiel 1 bzw. pCDM8-H-IL-6(2) von Beispiel 2 mit Hilfe der Elektroporation transfiziert. Es wurden 10 ⁷ COS-7 Zellen mit 20μg Plasmid mit Hilfe eines Gene-Pulsers (Bio-Rad) bei 960//F und 230 V elektroporiert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen metabolisch mit [ ³⁵ S]-Cystein/Methionin 4 h radioaktiv markiert und 2 h mit nicht radioaktiv markierten Aminosäuren inkubiert. Der Überstand aus Zellysat und Zeilüberstand wurde nach Standardmethoden (Müllberg et al., Eur. J. Immunol. ( 1 993) 23, 473-480) mit einem anti-IL-6 Antikörper immunpräzipitiert und nach SDS-Gel- elektrophorese durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Transfizierte C0S-7 Zellen sezernierten ein 70-75 kDa Protein, das von einem anti-IL-6 Antikörper erkannt und nicht von untransfizierten Zellen gebildet wurde.

Überstände von transfizierten COS-7 Zellen wurden durch SDS-Gelelektrophore- se aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit einen anti-IL-6 Antikörper detektiert. Wiederum exprimierten transfizierte COS-7 Zellen ein 70-75 kDa

Protein, das von einem anti-IL-6 Antikörper erkannt wurde.

Überstände von transfizierten COS-7 Zellen wurden mit Hilfe eines kommerziel¬ len ELISA auf IL-6 (CLB, Amsterdam) und slL-6R (Seromed, Gießen) untersucht. Mit beiden ELISAs wurde H-IL-6 detektiert. Die Konzentration von H-IL-6 im

Zellüberstand betrug etwa 1 μg/ml.

Beispiel 4: Stimulation der Haptoglobin-Expression durch ein erfindungsgemäs- ses Fusionspolypeptid

Es wurden die humanen Hepatomazellinien HepG2, HepG2-IL-6 und HepG2-PDI verwendet.

HepG2 Zellen (ATCC HB 8065) werden durch IL-6, nicht aber durch slL-6R stimuliert, Haptoglobin zu exprimieren.

HepG2-IL-6 Zellen wurden durch stabile Transfektion von HepG2 Zellen mit einem humanen IL-6-Expressionsplasmid erhalten. Diese Zellen regulieren auf¬ grund der IL-6 Expression endogenes IL-6R herunter und exprimieren somit kein IL-6R. HepG2-IL-6 Zellen werden nicht durch IL-6, aber durch slL-6R stimuliert, Haptoglobin zu exprimieren.

HepG2-PDI Zellen wurden durch stabile Transfektion von HepG2 Zellen mit einem humanen IL-6-Expressionsplasmid erhalten. Hierzu wies das Expressions¬ plasmid eine IL-6 cDNA auf, durch die das exprimierte IL-6 Protein ein COOH- terminales Retentionssignal für das Endoplasmatische Retikulum (ER) enthielt. Daraus resultierte, daß diese Zellen nicht durch das exprimierte IL-6, sondern auch IL-6R im ER zurückhielten. Im Gegensatz zu HepG2-IL-6 Zellen sezernieren aber HepG2-PDI Zellen kein IL-6 und können nur durch die Kombination von IL-6 und slL-6R stimuliert werden, Haptoglobin zu exprimieren.

Die vorstehenden Hepatomazellinien wurden nach Standardbedingungen in 96er Zellkulturplatten kultiviert (Rose-John et al., J. Biol. Chem. 268 ( 1 993), 22084-

22091 ). Die Zellen wurden mit IL-6, slL-6R, IL-6 + slL-6R bzw. Zellüberständen aus mit pCDM8-H-IL-6, pCDM8-H-IL-6(2) bzw. pCDM8 transfizierten COS-7 Zellen von Beispiel 3 1 8 h stimuliert. Der Zellüberstand wurde geerntet und die Haptoglobinkonzentration im Überstand mittels ELISA bestimmt (vgl. Tabelle I).

Tabelle I

Stimulation der Haptoglobin-Expression

IL-6 slL-6R IL-6 + slL-6R H-IL-6 Kontrolle

HepG2 + - + + + + + -

HepG2-IL-6 - + + + + + + + -

HepG2-PDI - - + + + + + .

Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid, H-IL-6, in der Lage ist, die Expression von Haptoglobin in Zellen zu stimulieren, d.h. die Wechselwir¬ kungen zwischen Proteinen zu beeinflussen.

Beispiel 5: Expansion und Koioniebildung von humanen CD34 ⁺ -Zellen durch ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid

Aus humanem Knochenmark bzw. aus Blut von Patienten, deren Stammzellen durch Injektion von G-CSF mobilisiert worden waren, wurden Zellen isoliert, die den Oberflächenmarker CD34 exprimieren. 6000 dieser Zellen wurden in 3ml Medium in Zellkulturgefäße platiert. Nach zwei Wochen zeigte es sich, daß eine

Inkubation der Zellen mit den Zytokinen SCF, IL-3 und H-IL-6 (erfindungsgemä¬ ßes Fusionspolypeptid), wie auch mit SCF, IL-3 und IL-6 eine starke Proliferation verursachte. Von den entstandenen Zellen wurden 1000 Zellen in neue Zell¬ kulturgefäße platiert. Nach zwei Wochen in einem standartisierten Kolonie- Induktions-Versuch waren die mit SCF, IL-3 und H-IL-6 behandelten Zellen in der

Lage, etwa dreimal mehr Kolonien zu bilden als mit SCF, IL-3 und IL-6 behandel¬ te Ze^'en.

Dieses Ergebnis zeigt, daß Zellen, die durch ein erfindungsgemäßes Fusions- polypeptid H-IL-6 stimuliert wurden, ein höheres koloniebildendes Potential besitzen als durch IL-6 stimulierte Zellen (vgl. Fig. 4).