L'épiderme est une structure dynamique de la peau humaine. Il est essentiellement constitué d'une famille cellulaire : les kératinocytes. Ceux-ci, produits par une couche de cellules souches à la base de l'épiderme, se différencient dans l'épaisseur de l'épiderme : initialement quasi-cubiques, ils deviennent polyédriques puis s'aplatissent et aboutissent en surface à la production d'une couche cornée, plus ou moins épaisse. L'épiderme est donc à la fois le siège d'une multiplication cellulaire (couche basale) et une zone de différenciation cellulaire (couche intermédiaire) qui conduit à la formation d'une structure protectrice bien différenciée (couche cornée).

La division des cellules souches est régulée par des cytokines et des facteurs de croissance, comme le facteur de croissance épidermique ou EGF (Epidermal Growth

Factor). On sait que, contrairement aux hormones stéroïdes et aux vitamines d'origine lipidique qui peuvent traverser la membrane plasmatique pour se fixer sur des récepteurs nucléaires, les cytokines et les facteurs de croissance agissent via des récepteurs membranaires.

Parmi les substances thérapeutiques susceptibles de réguler la prolifération et la différenciation des kératinocytes, l'acide rétinoïque (AR) et ses dérivés (rétinoïdes) sont utilisés depuis plusieurs années. Ils ont cependant le désavantage d'tre tératogènes et de présenter une intolérance cutanée. L'application d'acide rétinoïque sur la peau diminue l'expression de protéines habituellement exprimées au cours de la différenciation des cellules épidermiques, notamment la cytokératine 1 (CK1), la transglutaminase 1 (TGM1) et les desmoplakines (DP). L'acide rétinoïque exerce son activité via des récepteurs nucléaires (RAR, RXR), mais aussi via des protéines cytoplasmiques. En effet, il a été détecté, dans le cytoplasme des cellules sensibles à l'acide rétinoïque, des protéines dénommées CRABP-I et CRABP-II, liant spécifiquement l'acide rétinoïque cellulaire (cellular retinoic acid binding proteins I and Ici). La protéine CRABP-II est le produit d'un gène qui est exprimé principalement au cours de l'embryogénèse, particulièrement dans le développement du système nerveux et du visage, mais qui continue à tre exprimé chez l'adulte notamment dans les cellules de la peau. L'expression des ARN messagers de CRABP-II est spécifiquement induite par l'acide rétinoïque et elle est régulée par des cytokines connues pour jouer un rôle dans le différenciation épidermique comme l'interleukine-1. Les protéines CRABP-11 régulent la concentration intracellulaire en acide rétinoïque mais aussi le transport et le métabolisme de celui-ci. En effet, la protéine CRABP-II modifie l'expression des gènes sensibles à l'acide rétinoïque qui régulent la prolifération et la différenciation.

Le problème à la base de l'invention est de proposer une substance régulant la prolifération et la différenciation des kératinocytes et qui ne présente pas les effets indésirables de l'acide rétinoïque.

Le problème est résolu par la découverte de propriétés analogues à celles de l'acide rétinoïque et du facteur de croissance EGF dans des extraits lipidiques de

certaines familles de plantes dites de bord de mer comme le Crithmum maritimum encore appelée Criste marine, le Cistus monspeliensis, l'Helichrysum italicum et le Lavandula stoechas.

De manière étonnante, on a notamment pu montrer que certains extraits de ces plantes, bien que ne contenant pas de pro-Vitamine A (un rétinoïde végétal), pouvaient avoir un effet de régulation similaire à celui de l'acide rétinoïque sans engendrer d'effets inflammatoires.

Pour chacune des plantes Crithmum maritimum, Cistus monspeliensis, Helichrysum italicum et Lavandula stoechas, un extrait a été obtenu par co- extraction au C02 supercritique en présence d'un solvant composé de triglycérides d'origine végétale (C8-C10 TG). Le C02 supercritique et le co-solvant végétal présente l'avantage de stabiliser l'extrait sans le dégrader. On peut néanmoins envisager d'autres types de solvants pour l'extraction.

Après remontée à la température ambiante et évaporation du C02, l'extrait est solidifié sous forme de cire, par ajout d'une huile d'origine végétale (C16-C18 TG), solide à température ambiante. La cire obtenue présente l'avantage d'tre stable à l'oxydation.

Comme on le verra plus loin, on a pu mettre en évidence que ces cires favorisent l'expression de gènes codant pour des protéines habituellement stimulées par l'acide rétinoïque et ses dérivés.

Ainsi, un traitement par les cires de Criste marine, de Cistus monspeliensis et d'Hélichrysum italicum augmente l'expression du gène CRABP-II codant pour la protéine cellulaire liant l'acide rétinoïque (cellular retinoic acid-binding protein II ou CRABP-II) et favorise la différenciation cellulaire. En outre, comme l'acide rétinoïque et ses dérivés, les cires obtenues favorisent l'expression des gènes codant respectivement pour le facteur de croissance endothélial (vascular endothelial growth factor ou VEGF) et pour son récepteur (VEGFR1), ce qui permet une régulation positive de la division des cellules basales.

Parallèlement, on a pu mettre en évidence que les cires obtenues inhibent l'expression de gènes codant pour des protéines habituellement exprimées au cours

de la différenciation épidermique. Cette action de répression est également une propriété de l'acide rétinoïque et de ses dérivés.

Par exemple, un traitement par les cires de Criste marine, de Cistus monspeliensis, d'Hélichrysum italicum et de Lavandula stoechas diminue l'expression des gènes codant pour des protéines de cohésion intracellulaire telles que la desmoplakine 1, la cytokératine 1, la cytokératine 6 ou des protéines enzymatiques telle que la transglutaminase 1.

Les cires de Criste marine, de Cistus monspeliensis, d'Hélichrysum italicum et de Lavandula stoechas ont donc des effets similaires aux rétinoïdes en ce qui concerne la régulation positive ou négative des gènes intervenant dans la différenciation des kératinocytes.

En revanche, on a montré de manière significative, que contrairement à l'acide rétinoïque, les cires n'induisent pas de réaction de type inflammatoire, car les gènes codant les cytokines inflammatoires que sont l'interleukine-1 alpha (IL-lA) et béta (IL-1B) ne sont pas stimulés. Au contraire, une tendance à augmenter l'expression du gène codant l'antagoniste du récepteur à l'IL-1 alpha (IL-IRA) a mme été observée pour les cires de Criste marine, de Cistus monspeliensis et de Lavandula stoechas, ce qui plaide en faveur d'une action anti-inflammatoire.

On a pu également mettre en évidence que les cires obtenues à partir de Criste marine, de Cistus monspeliensis et de Lavandula stoechas augmentent l'expression du gène codant pour un facteur de réponse à l'EGF (EGF response factor 1 ou ERF1).

De plus, il a été observé que la cire obtenue à partir de Cistus monspeliensis favorise l'expression des gènes codant pour le récepteur au facteur de croissance épidermique (epidermal growth factor receptor ou EGFR).

Enfin, on a noté que les cires de Criste marine, d'Hélichrysum italicum et de Lavandula stoechas augmentent sensiblement l'expression du gène codant pour un facteur de croissance, de type EGF, liant l'héparine (heparin-binding EGF-like growth factor ou HB-EGF). Ce gène est d'ailleurs également stimulé par l'acide rétinoïque.

En conclusion, les cires des plantes précitées agissent donc tant sur la différenciation épidermique (effets inhibiteurs et stimulants similaires à ceux de rétinoïdes) que sur la division des kératinocytes (effet stimulant similaire à celui du facteur EGF).

En stimulant la division des cellules souches et en régulant la différenciation des cellules kératinocytaires, les cires de plantes favorisent l'épaississement de l'épiderme et sa maturation. Elles peuvent tre utilisées comme principe actif dans un produit cosmétique notamment pour combattre les effets du vieillissement des cellules de la peau. Elles peuvent également tre utilisées en dermatologie, comme principe actif d'un produit pharmaceutique pour traiter les troubles de la différenciation des kératinocytes, notamment comme anti-psoriasique. Un traitement prophylactique est également envisageable. En outre, grâce à leur action de stimulation de la division cellulaire, similaire à celui de l'EGF, les cires de plantes peuvent encore tre utilisées comme principe actif d'un produit pharmaceutique destiné à accélérer la cicatrisation. Le produit cosmétique ou pharmaceutique à base de cires de plantes peut tre destiné à une application externe topique ou à une ingestion par voie orale.

Une autre application des cires végétales est leur incorporation dans des produits alimentaires afin d'obtenir l'effet cosmétique susmentionné.

De manière générale, les cires végétales seront obtenues à partir de plantes de : - la famille des apiacées (Apiaceae), notamment du genre Crithmum, par exemple de Crithmum maritimum ; - la famille des cistacées (Cistaceae), notamment du genre Cistus, par exemple de Cistus monspeliensis ; - la famille des astéracées (Asteraceae), notamment du genre Helichrysum, par exemple de Helichrysum italicum ; - la famille des lamiacées (Lamiaceae), notamment du genre Lavandula, par exemple de Lavandula stoechas.

Protocole expérimental : Les cires obtenues à partir de Crithmum maritimum, Cistus monspeliensis, Helichrysum italicum et Lavandula stoechas ont été diluées à 1% dans le solvant utilisé pour l'extraction, puis appliquées à la surface d'épidermes humains reconstitués (en duplicata) et étalées à l'aide de petits pinceaux stériles. Les épidermes ont été incubés pendant 24 heures à 37°C. Les tissus ont été ensuite dissociés de leurs nacelles, immédiatement placés dans des tubes stériles (RNAse- free) et congelés à-80°C.

L'action des cires précitées sur l'expression des gènes a été étudiée à partir d'une analyse des acides ribonucléiques messagers (ARNm).

Les acides ribonucléiques ont d'abord été extraits et purifiés par des méthodes classiques puis analysés par hybridation spécifique avec des sondes fixées sur une membrane (méthode dite des « microarrays »).

Plus précisément, l'ADN a d'abord été éliminé des échantillons par incubation en présence de Dnase I. L'absence d'ADN résiduel a été vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose.

Les ARN messagers (ARNm) ont été ensuite purifiés par une étape d'hybridation des queues poly (A) des ARNm à des amorces oligo (dT) biotinylées suivie d'une étape de capture sélective sur billes de streptavidine.

Des sondes ADN multiple marquées au 32p ont été réalisées par réverse- transcription des ARNm liés sur billes de poly (dT), à l'aide d'un pool d'amorces ARN (primers) spécifiques des séquences immobilisées sur les « arrays », en présence de [a32P]-dATP.

Des cDNAs immobilisés sur chaque membrane ont été hybridés (pendant une nuit à 68°C) aux sondes marquées correspondantes. Les filtres ont ensuite été lavés en conditions stringentes (à 68°C) et placés dans des sacs plastique individuels pour analyse. L'analyse a eu lieu par quantification directe de la radioactivité des spots.

Résultats :

Les résultats sont regroupés dans le Tableau I. La signification des différentes colonnes est donnée ci-après : T est un épiderme témoin traité par le solvant d'extraction (C8-C10 TG) utilisé pour diluer les cires de plantes ; CRIST est un épiderme traité par la cire de Criste marine diluée à 1% dans le solvant d'extraction (C8-C10 TG) ; CISTE est un épiderme traité par la cire de Cistus monspeliensis diluée à 1% dans le solvant d'extraction (C8-C10 TG) ; HELI est un épiderme traité par la cire d'Hélichrysum italicum diluée à 1% dans le solvant d'extraction (C8-C10 TG) ; LAV est un épiderme traité par la cire de Lavandula stoechas diluée à 1% dans le solvant d'extraction (C8-C10 TG) ; RA donne l'effet de l'acide rétinoïque sur l'expression du gène, tel que connu dans l'état de l'art.

Les différentes lignes sont relatives à différents marqueurs ou, de manière équivalente, aux gènes correspondant à ces marqueurs.

Les résultats sont exprimés (chiffres de gauche) en unités relatives (UR). Ils expriment la radioactivité moyenne des points du double spot correspondant à chaque gène, corrigée du bruit de fond et des différences d'intensité de marquage des sondes. Ils ont été également exprimés (chiffre de droite) en pourcentage du témoin non traité.

On a considéré qu'un gène était exprimé significativement lorsque son UR était supérieure ou égale à un seuil de 1.5, c'est à dire lorsque le doublet était visible sur les images.

On a pris pour marqueurs de référence « (housekeeping »), l'ubiquitine et la glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH). Comme le font apparaître les deux premières lignes du tableau, ces gènes ont été bien visualisés et l'on peut vérifier qu'aucune cire n'a d'effet significatif sur l'expression des gènes de

référence. La moyenne des résultats de comptage des marqueurs « housekeeping » a été prise comme référence pour quantifier de façon relative l'expression des autres marqueurs. On s'affranchit ainsi des variations relatives d'intensité de marquage des différentes sondes utilisées. La correction a été réalisée à partir des intensités de marquage des gènes de référence pour les différentes sondes.

On a considéré qu'un produit avait un effet répresseur si le niveau obtenu était inférieur de plus de 50 % à celui du témoin (soit un ratio inférieur à 50 %) et était stimulant si le niveau obtenu était supérieur de plus de 50 % à celui du témoin (soit un ratio supérieur à 150 %).

En ce qui concerne la protéine cellulaire liant l'acide rétinoïque (CRABP-II), on constate une augmentation de l'expression du gène CRABP-II de +113%, +86% et +183% par rapport au témoin (ratios 213%, 186% et 283% respectivement) pour les cires de Criste marine, de Cistus monspeliensis et d'Hélichrysum italicum. La cire de Lavandula stoechas a également une tendance à augmenter ce gène (+43%).

Les cires de Criste marine, de Cistus monspeliensis, d'Hélichrysum italicum et de Lavandula stoechas diminuent l'expression des gènes codant pour des protéines exprimées lors de la différenciation épidermique : la desmoplakine 1 (-80% et-74% pour les cires d'Hélichrysum italicum et de Lavandula stoechas), la desmoplakine 3 (-69% et-59% pour les cires de Cistus monspeliensis et d'Hélichrysum italicum), la cytokératine 1 (-90% pour les 4 cires de plantes), la cytokératine 6 (-79% pour la cire de Cistus monspeliensis), la transglutaminase 1 (-65% et-61% pour les cires de Criste marine et d'Hélichrysum italicum).

Enfin, les quatre cires de plantes augmentent l'expression des gènes codant pour les facteurs de croissance : VEGF (+99% et +58% pour la Criste marine et Cistus monspeliensis) et VEGFR1 (de +55% à +186%).

Les cires ne stimulent en revanche pas la production de cytokines inflammatoires : l'interleukine-1 alpha (IL-1A) ou béta (IL-1B). A contrario, les cires de Criste marine, de Cistus monspeliensis et de Lavandula stoechas ont tendance à stimuler l'expression du gène codant l'antagoniste du récepteur à l'IL-1 alpha (1L- 1RA) (+45%, +29%, +40% respectivement)

Concernant les facteurs de croissance épidermique, les cires de Criste marine, de Cistus monspeliensis et de Lavandula stoechas augmentent de respectivement +74%, +195% et +53% l'expression du gène codant pour un facteur de réponse à l'EGF (ERF1), la cire de Cistus monspeliensis augmente de 57% l'expression du gène codant pour le récepteur EGFR et les cires de Criste marine, d'Hélichrysum italicum et de Lavandula stoechas augmentent de respectivement +120%, +140% et +194% l'expression du gène codant le facteur de croissance HB-EGF.