的转录水平提高； 第二个亚家族由 OsPP c- 和 组成， Northern blot分析表明， 这 3个 PP24c基因在所有水稻组织中组成型转录， 但在高 盐或干热胁迫条件的转录水平也会发生变化。

非生物胁迫， 如干旱、 盐渍、 极端温度、 化学污染和氧损伤等能够对植物的 生长发育造成严重的危害， 对作物产量造成极大损失， 其中干旱对作物产量的影 响,在诸多自然逆境中占首位， 其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农 业发 展的瓶颈。 据统计， 世界干旱、 半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、 半干 旱地区约占国土面积的 52%, 年受旱面积达 200〜270万公顷 ， 全国灌溉区每年 缺水约 300亿立方米， 因缺水而少收粮食 350〜400亿公斤； 特别是我国主要产粮 区如华北、 东北和西北， 是我国缺水最严重的地区， 春旱频繁达到十年九遇。

由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状， 现有可利用的种质资源匮乏， 采用 常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大 ， 培育出真正的耐胁迫品种就尤 为困难。近年来， 随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分 子生物学技术的 迅猛发展， 抗逆研究已经从生理水平深入到分子水平， 促进了植物抗逆基因工程 的发展。 当植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应， 来降低或消除给植株带来 的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基 因、 多信号途径、 多基因产物的复 杂过程。 这些基因及其表达产物可以分为 3类： （1)参与信号级联放大系统和转录 控制的基因及产物； （2) 直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其 表达产 物； （3 ) 与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。 近年来， 通过转基因技术提 高植物对胁迫耐受能力的研究， 以及对胁迫具有耐受能力的农作物、 旱生植物和 盐生植物的研究都取得了显著的成果， 对胁迫相关基因和信号转导系统也有了 更进一步的了解 (Liu Q.1998. Two transcription factors,DREB 1 and DREB2,with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought and low temperature responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 10: 1391-1406； KANGJY.2002. Arabidopsis basic leucine zipper proteins that mediate stress responsive abscisic acid signaling. Plant Cell, 14: 343- 357； ABEH.2003.Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2(MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell, 15: 63-78. ) 。

但就目前的研究状况而言， 由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生 物 化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。 在抗逆应答基因的功能及表达调控 方面的研究将对抗逆相关的信号传递途径之间 的联系以及整个信号传递网络系 统的机理研究提供重要的基础。

发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE相结合的方法克隆了棉花的 —个 PP2Ac类磷酸酶蛋白 （本文命名为 PP2AC-4) 的编码基因的 DNA序列。 并 发现将其插入植物基因组后， 可明显改善转基因植株的耐旱性， 而且这些性状可 稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个 PP2Ac类磷酸酶蛋白 PP2AC-4的编码基因， 其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基 因， 其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获 得的， 其中所述基因的核苷 酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作 地连接； 优选地， 所述表达载体是 PCAMBIA2300； 优选地， 所述重组表达载体为 附图 2 所示的 rd29 A-GhPP2 Ac-4-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本 发明第一方面所述的基因或者 本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地 ，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方 法， 包括： 将本发明第一方面 所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表 达载体导入植物或植物组织并使 所述基因表达； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方 法， 包括： 在有效产生植物的 条件下培养含有本发明第一方面所述的基因、 本发明第二方面所述的重组表达载 体的植物或植物组织； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基 因、本发明第二方面所述的重 组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细 胞用于改善植物耐旱性以及用于 植物育种的用途； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的 基因所编码的氨基酸序列，如 SEQ ID NO: 1所示。 附图说明 图 1是 GhPP2Ac-4的植物表达载体 (rd29A-GhPP2Ac-4-2300;>的构建流程。 图 2是 GhPP2Ac-4的植物表达载体 (rd29A-GhPP2Ac-4-2300;)的质粒图。 图 3是 G/^P24 _C -4 T _Q 代转基因烟草植株 （图中， T _Q 2; 右， T _Q 8 ) 和作为对照 的非转基因烟草植株 （图左， CK) 的耐旱模拟实验结果。

图 4是利用反转录 PCR对 T _Q 代转基因烟草植株和非转基因对照植株中

G/^P24 _C -4基因在转录水平上的分子检测的验证结� ��。 M为 Marker, 1-5为非转基 因对照烟草植株, 6-18为耐旱效果显著的转基因烟草 T _Q 代植株， 19-24为耐旱效果 不显著的转基因烟草 T _Q 代植株。 具体实施方式 下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步 说明, 实施例 1 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit说明书所示的方法 通过抑制差减杂交方法构建差减文库 (SSH文库；)。在实验过程中以干旱处理的棉 花幼苗的叶子的 mRNA作为样本（tester), 以未处理的棉花幼苗的叶子的 mRNA 作为对照 （driver)。 具体步骤简述如下：

( 1 ) 供试材料：

冀棉 14 (国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所� �统一编号： ZM-30270) 播种到灭过菌的蛭石上， 在 25°C、 光周期 16h/8h条件下培养， 每周浇 1/2MS液 体培养基 （含 9.39 mM KN0 ₃ ， 0.625 mM KH ₂ P0 ₄ , 10.3 mM H ₄ N0 ₃ , 0.75 mM MgS0 ₄ ， 1.5 mM CaCl ₂ , 50 μ M KI, 100 μ Μ Η ₃ ΒΟ ₃ ， 100 μ Μ MnS0 ₄ , 30 μ M ZnS0 ₄ ， 1 μ M Na2Mo0 ₄ , 0.1 μ Μ CoCl ₂ , 100 μ M Na ₂ EDTA, ΙΟΟ μ Μ FeS0 ₄ , 其余为水） 一次。 当苗株高达 25-30cm时用于实验。

(2) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4盆， 每盆 1株。 第一组为对照组， 在 25°C、 光照培养， 正常浇灌。 第二组为干旱处理组， 25°C、 光照培养， 停止浇灌， 处理 10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端 1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于 -70°C 冰箱中保存。

(3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶子各 0.5g， 用植物 RNA提取试剂盒 (Invitrogen) 提取棉花的总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001 测定所得总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD260/OD280比值为 1.8-2.0， 表明总 RNA纯度较高， 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S 条带的亮度约为 18S条带的 2倍， 表明 RNA的完整性良好。 使用 Qiagen 公司 的 Oligotex mRNA纯化试剂盒 (purification of polyA+ RNA from total RNA)分离 mRNAo

(4) 抑制差减杂交： 为了增加获得表达序列标签 （Expressed sequence tag, EST) (unigene)的有效 性， 避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区 。 本实验室用 Rsal， Haelll 分别对双链 cDNA (按照 PCR-select ^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书记载的 方案， 由 mRNA逆转录获得） 进行消化， 做两组抑制差减， 其他步骤及方法按 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进 行， 最后合并两组正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物。

( 5 ) 差减文库的构建与初步筛选、 克隆及鉴定

合并的正向差减杂交 cDNA 片段的第二次 PCR 产物 （QIAquick PCR Purification Kit纯化， 购自 Qiagen) 与 pGEM-T Easy (购自 Promega试剂盒)载体 连接， 依照 pGEM-T Easy试剂盒产品说明书所示方法， 具体步骤如下： 向 200 μΐ PCR管中依次加入下列成分： 纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产 物 3 μ1， Τ4连接酶缓冲液 5 μ1， pGEM-T Easy载体 1 μ1， T4 DNA连接酶 1 μΐ ， 于 4°C连接过夜。取 10 连接反应产物，加入到 100 感受态大肠杆菌 JMI09(购 自 TAKARA)中，冰浴 30 min、热休克 60 s、冰浴 2 min,另加 250 μL L 培养液（含 1% Tryptone购自 OXOID, 0.5% Yeast Extract购自 OXOID, 1% NaCl购自国药） 置 37°C摇床中， 以 225 r/min振荡培养 30 min,取 200 μL菌液种植于含 50 g/mL 氨苄青霉素 (购自 Amresco)、 40 ug/mL X-gaK 24 ug/mL IPTG ( X-gal/IPTG购自 TAKARA)的 LB固体培养板上， 37°C培育 18 h。计数培养板中直径 > 1 mm的清 晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 360个白色菌落 (编号： Gh-D001至 Gh-D360)。 将所有白色菌落挑于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96 孔细胞 培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于 -80°C保存备用。 以巢式 PCR 引物 Primer 1禾 P Primer 2R ( Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA

Subtraction Kit试剂盒自带） 进行菌液 PCR扩增， 得到 245个阳性克隆， 对所有 阳性克隆在送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序。

( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 121个 EST(unigene), 分别编号为 Gh-Dl-121。 经 BlastN发现其中 69 条 unigene在 GenBank 中有同源序列 （蛋白同源性 50%以上）， 31条 EST功能未知或者为假 定蛋白， 另有 21条未获得同源匹配， 推测可能是处于 3 '、 5 ' 末端非翻译区的较 短序列。 实施例 2 棉花磷酸酶蛋白基因 PP2AC-4的克隆

将编号为 Gh-D79的阳性克隆的测序结果去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明该序列的编码的氨基酸序列属于 磷酸酶蛋白序列， 本文将 SEQ ID No: 3编码的全长基因命名为 GhPP2Ac-4， 对应的蛋白命名为 PP2Ac-4。

SEQ ID No: 3

1 GGTTGAATCT GAAATTTTCT GTCTCCATGG TGGGTTATCT CCATCCATTG AAACACTGGA

61 TAACATACGT AACTTTGACC GTGTTCAAGA AGTTCCTCAT GAGGGTCCTA TGTGTGATCT

121 TTTGTGGTCT GACCCTGATG ATCGGTGTGG ATGGGGCATT TCACCTAGGG GTGCCGGATA

181 TACCTTTGGC CAAGACATAT CCGAGCAATT TAACCATACA AACAGTTTGA AGCTGATTGC

241 TAGGGCTCAT CAGCTGGTCA TGGAAGGATA CAATTGGGGT CATGAACAAA AGGTTGTTAC

301 TATATTCAGT GCGCCAAATT ATTGCTATCG ATGTGGAAAC ATGGCCTCCA TCTTGGAAGT

361 AGATGATTGC CAGGGTCATA CATTCATTCA GTTTGAGCCG GCTCCAAGGA GAGGAGAGCC

421 GGATGTGACC CGGAGGACAC CTGACTACTT CCTATAAAAA CAAACCGGCA TTTAATCAAC

481 GAGTCTCCAG CGATTGGTCC CTGTCAATGG GCTTTTCCGG GCGGTTGGGT GGCAGCAAAG

541 CCATTGTATA AGGCTGATCA CACTGATGAG AATCCATGGC AGAAGAAAGG ATCACCGCAA

601 GAGCTGGTAA CACAAGCATA TGTACCATTT CCAGTAAACA ATGAGACAAT TTATTTATTT

661 TCCATTGATT TTTAATTTTT GTTTTTTTGA GGCTTGGGAA GATCTGTAGA AGAAAGATGC

721 TGAGAACATT TGCCCTATAA TTAATGCTTT TTTTTC

GhPP2Ac 全长基因的克隆

已经获得的 GhPP2Ac-4 基因片段， 已经有终止密码子 TGA,只需要做 5 ' RACE。

根据已经获得的 Gh-D79基因片段， 设计三条特异性引物， 作为反转录引物 及 5'RACE的 3 '端特异性引物。

GhPP2Ac-4 GSP 1： SEQ ID NO: 4：

CACCCAACCGCCCGGAAAAGC

GhPP2Ac-4 GSP2： SEQ ID NO: 5：

GTGAAATGCCCCATCCACAC

GhPP2Ac-4 GSP3： SEQ ID NO: 6：

GATCATCAGGGTCAGACCAC

实验步骤按试剂盒说明书操作 （5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 5与 5'通用引物 AAP (试剂盒自带）， 以 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO:4)为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下： Ex Taq购自 TAKARA, 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 2.0 μΐ mRNA反转录的 cDNA， 1.0 μ1 Εχ Τα 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 5和 AAP各 2.0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 变性 30 s，55 °C退火 30 s，72°C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 6 3' 端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下： 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 2.0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物， 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 6和 AUAP各 2.0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应 条件： 94°C预变性 5 min， 94 变性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min， 33个循环后， 72V 延伸 10 min。第二次 PCR产物回收片段约为 750bp条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA)连接于 pGEM-T Easy载体，转化到大肠杆菌 JM109 感受态细胞中 (具体方法同上)，并将转化后的菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素 的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青 霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存 备用。 SEQ ID NO: 6与 3'端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条 件同上）， 得到 3个阳性克隆， 送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序,� �得 该基因的 cDNA的 5'端。 所得的 5'RACE产物克隆测序后， 与 Gh-D79阳性克隆测序结果拼接， 获得

SEQ ID NO: 17：

1 CCTTTTTTTT AACTTTTTTC TCTCCACTAA ACTAAAAAAT CTCTTGAAAT TTTATAATTT

61 TGGGGGAAAT TTTCGTAATC TAGGGTTAGG ATTTTTAAAT AAAAAAGAGA AAGAAAACAT

121 GACGTCTTCG GTGGATTCAA ACTCACATGG AAACCTAGAC GAGCAGATTT CGCAGTTGAT

181 GCAGTGCAAG CCCTTATCGG AGCAAGAGGT TAGGGTATTA TGTGATAAGG CTAAGGAGAT

241 ACTGATGGAT GAAAGCAATG TTCAGCCTGT GAAAAGTCCT GTTACAATAT GCGGTGATAT

301 TCATGGGCAA TTTCATGATC TTGCAGAGCT TTTTCGAATT GGGGGGAAGT GTCCAGATAC

361 AAATTACTTG TTCATGGGAG ATTATGTTGA TCGTGGTTAC TATTCAGTTG AAACTGTAAC

421 ACTCTTGGTA GCTCTCAAAG TGCGTTACCC CCAACGGATA ACTATTCTGA GGGGAAATCA

481 TGAGAGCCGT CAGATTACTC AAGTGTATGG GTTTTATGAT GAGTGCCTAA GGAAGTACGG

541 CAGTGCCAAC GTTTGGAAGA TCTTCACTGA TCTGTTTGAT TATTTTCCAC TAACAGCATT

601 GGTTGAATCT GAAATTTTCT GTCTCCATGG TGGGTTATCT CCATCCATTG AAACACTGGA

661 TAACATACGT AACTTTGACC GTGTTCAAGA AGTTCCTCAT GAGGGTCCTA TGTGTGATCT

721 TTTGTGGTCT GACCCTGATG ATCGGTGTGG ATGGGGCATT TCACCTAGGG GTGCCGGATA 781 TACCTTTGGC CAAGACATAT CCGAGCAATT TAACCATACA AACAGTTTGA AGCTGATTGC

841 TAGGGCTCAT CAGCTGGTCA TGGAAGGATA CAATTGGGGT CATGAACAAA AGGTTGTTAC

901 TATATTCAGT GCGCCAAATT ATTGCTATCG ATGTGGAAAC ATGGCCTCCA TCTTGGAAGT

961 AGATGATTGC CAGGGTCATA CATTCATTCA GTTTGAGCCG GCTCCAAGGA GAGGAGAGCC

1021 GGATGTGACC CGGAGGACAC CTGACTACTT CCTATAAAAA CAAACCGGCA TTTAATCAAC

1081 GAGTCTCCAG CGATTGGTCC CTGTCAATGG GCTTTTCCGG GCGGTTGGGT GGCAGCAAAG

1141 CCATTGTATA AGGCTGATCA CACTGATGAG AATCCATGGC AGAAGAAAGG ATCACCGCAA

1201 GAGCTGGTAA CACAAGCATA TGTACCATTT CCAGTAAACA ATGAGACAAT TTATTTATTT

1261 TCCATTGATT TTTAATTTTT GTTTTTTTGA GGCTTGGGAA GATCTGTAGA AGAAAGATGC

1321 TGAGAACATT TGCCCTATAA TTAATGCTTT TTTTTC

根据 SEQ ID NO: 17序列设计一对引物如下：

GhPP2Ac尋. SEQ ID NO: 7：

ATGACGTCTTCGGTGGATTC

GhPP2Ac-4R: SEQ ID NO: 8：

TTATAGGAAGTAGTCAGGTG

通过 SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO: 8来克隆 GhPP2Ac-4全长。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以棉花的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5><PS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO: 8各 2.0 μ1， 以及 30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94V 变性 30 s， 58 °C 退火 30 s， 72V 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10 分钟， 离心， 去上清， 晾干， 用 21 μΐ双蒸水溶解。 加入 2.5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 0.5 μ1 5 ιηΜ的 dATP ， 2.5 μΐ ΙΟχΕχ Taq。 反应条件： 70°C反应 30分钟。 将得到约 900 bp的 DNA片段回收 （Omega回收试剂盒）， 连接至 pGEM T-easy载体上，转 化 JM109(方法同上)，随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 7与 SEQ ID NO: 8进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上）， 得 到 4个阳性克隆,送至英潍捷基（上海）贸易有限� ��司测序,序列为 SEQ ID NO: 2。 根据该核苷酸序列， 可推论该基因编码的 PP2AC-4 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID ΝΟ: 1所示。

PP2Ac-4蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 TSSVDSNSH GNLDEQISQL 2 1 QCKPLSEQE VRVLCDKAKE

4 1 IL DESNVQP VKS PVTI CGD

61 IHGQFHDLAE LFRIGGKCPD

81 TNYLF GDYV DRGYYSVETV

101 TLLVALKVRY PQRITILRGN

12 1 HESRQITQVY GFYDECLRKY

14 1 GSANVWKIFT DLFDYFPLTA

161 LVESE IFCLH GGLS PS IETL

181 DNIRNFDRVQ EVPHEGP CD

2 01 LLWSDPDDRC GWGI SPRGAG

22 1 YTFGQDI SEQ FNHTNSLKLI

24 1 ARAHQLV EG YNWGHEQKW

261 TIFSAPNYCY RCGNMAS ILE

2 81 VDDCQGHTFI QFEPAPRRGE

3 01 PDVTRRTPDY FL*

GhPP2Ac-4 编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

1 ATGACGTCTT CGGTGGATTC AAACTCACAT GGAAACCTAG ACGAGCAGAT TTCGCAGTTG

61 ATGCAGTGCA AGCCCTTATC GGAGCAAGAG GTTAGGGTAT TATGTGATAA GGCTAAGGAG

121 ATACTGATGG ATGAAAGCAA TGTTCAGCCT GTGAAAAGTC CTGTTACAAT ATGCGGTGAT

181 ATTCATGGGC AATTTCATGA TCTTGCAGAG CTTTTTCGAA TTGGGGGGAA GTGTCCAGAT

241 ACAAATTACT TGTTCATGGG AGATTATGTT GATCGTGGTT ACTATTCAGT TGAAACTGTA

301 ACACTCTTGG TAGCTCTCAA AGTGCGTTAC CCCCAACGGA TAACTATTCT GAGGGGAAAT

361 CATGAGAGCC GTCAGATTAC TCAAGTGTAT GGGTTTTATG ATGAGTGCCT AAGGAAGTAC

421 GGCAGTGCCA ACGTTTGGAA GATCTTCACT GATCTGTTTG ATTATTTTCC ACTAACAGCA

481 TTGGTTGAAT CTGAAATTTT CTGTCTCCAT GGTGGGTTAT CTCCATCCAT TGAAACACTG

541 GATAACATAC GTAACTTTGA CCGTGTTCAA GAAGTTCCTC ATGAGGGTCC TATGTGTGAT

601 CTTTTGTGGT CTGACCCTGA TGATCGGTGT GGATGGGGCA TTTCACCTAG GGGTGCCGGA

661 TATACCTTTG GCCAAGACAT ATCCGAGCAA TTTAACCATA CAAACAGTTT GAAGCTGATT

721 GCTAGGGCTC ATCAGCTGGT CATGGAAGGA TACAATTGGG GTCATGAACA AAAGGTTGTT

781 ACTATATTCA GTGCGCCAAA TTATTGCTAT CGATGTGGAA ACATGGCCTC CATCTTGGAA

841 GTAGATGATT GCCAGGGTCA TACATTCATT CAGTTTGAGC CGGCTCCAAG GAGAGGAGAG

901 CCGGATGTGA CCCGGAGGAC ACCTGACTAC TTCCTATAA 实施例 3 GhPP2Ac 基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责 任公司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΡΤΠ基因含双增强子的 35S 启动子， 以降低 ΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择诱导型启动子 rd29A及 Tnos 终止子作为 GhPP2Ac-4基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 10以植物表达载体 PBI121 (购自北京 华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos,采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ PBI121 , 1.0 ^ PrimeSTAR 10 μΜ的引物 SEQ ID NO:9和 SEQ ID NO: 10各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 通过 EcoRI、 Bglll酶切连接到 pCAMBIA2300 (Promega, T4 连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 9 ：

GCACG^rJCATACAAATGGACGAACGGAT

SEQ ID NO: 10：

ATCC^G^rCJAGATCCGGTGCAGATTATTTG

用引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12以 PBI121为模板扩增 Tnos， 采用

TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ PBI121 , 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变 性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 通过 Sacl、 EcoRI酶切连接到 pCAMBIA2300-1 (Promega T4 连接 酶盒；)获得 pCAMBIA2300-2

SEQ ID NO: 11：

AAGG^GCJCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO: 12：

TCKGAA r7UCC AGTGAATTCCCGATCT AGT A

用引物 SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14以拟南芥 （哥伦比亚型 ， 购自 www.arabidopsis.org) DNA为模板扩增拟南芥 rd29A启动子 （参考 Zeng J., et L. 2002, Preparation of total DNA from"recalcit rant plant taxa", Acta Bot. Sin., 44(6): 694-697 中的方法提取拟南芥 DNA)。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合 酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5><PS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ拟南 芥 DNA， 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72V 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。通过 HindIII、 Pstl酶切连接到 （连接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3 SEQ ID NO: 13：

ACT^GCrJCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA

SEQ ID NO: 14：

TGACJGC4GTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG

用引物 SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16扩增 GhPP2Ac-4 (模板是实施例 2 所获得 GhPP2Ac-C 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR 反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ GhPP2Ac-4-pGEM, 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16各 2.0 μ1， 以 及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退 火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 通过 Pstl、 Sacl酶 切连接到 （连接方法同上） pCAMBIA2300-3， 获得植物表达载体 rd29A- GhPP2Ac-4-2300 (图 2)。

SEQ ID NO: 15：

TGACJGC4GATGACGTCTTCGGTGGATTC

SEQ ID NO: 16：

AAGG^GCJCTTATAGGAAGTAGTCAGGTG 实施例 4 rd29 A-GhPP2 Ac-4-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab,Inc)感受态制备： 提前 1-2天 将农杆菌 LBA4404在含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB固体培养基上 划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。 挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ _§ /ιη1利福平和 50 g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16 h)至 OD600 值为 0.4， 形成种子菌液。 取 5 ml活化后的菌液 （1 :20的比例） 接种于 100 ml 同样浓度抗生素的 LB液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2.5 h至 OD _6(K) =0.8。 冰浴 菌液 10 min， 每隔 3 min摇匀一次， 令细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g 离心 10 min, 弃上清液； 加入一定量预冷 10%甘油重悬浮菌体, 4°C下 4000 g离 心 10 min， 收集沉淀； 用 10%甘油重复洗 3-4次； 加入适量冰浴预冷的 10%甘 油重新悬浮细菌沉淀， 以 40 μΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化 LBA4404感受态细胞，往 40 μΐ的所述感受态细胞 中加入 1 μΐ 的质粒， 混匀后冰浴约 10 min。 将冰浴后的感受态细胞和 rd29A- GhPP2Ac-4-2300质粒 DNA的混合物用微量移液器转移到预冷的电击杯 中，轻敲 使悬浮液到达底部， 注意不要有气泡。 将电击杯 （购自 bio-rad) 放到电击室的 滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电 极处。使用 0.1cm的电击杯的时候， MicroPulser (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr"， 电击一次 。 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 LB培养基。快速而轻柔的用微量移液器将细胞� ��匀。将悬浮液 转入 1.5 ml的离心管， 28°C， 225 rpm培养 1 h。 取 100〜200 μΐ的菌液涂布与 相应的抗性筛选培养基平板上 （LB固体培养基， 含 50 g/ml利福平、 50 μ _§ /ιη1 链霉素、 50 μ _§ /ιη1卡那霉素）， 28°C培养。 实施例 5 利用农杆菌介导的叶盘转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子（国家烟草中期库，获取 单位：中国农科院烟草所， 库编号 I5A00660) 30 s, 用灭菌双蒸水洗两次。 再用 0.1%升汞浸泡 8 min， 用灭 菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌 的烟草种子置于 MS固体培养基（含 18.78 mM KN0 ₃ , 1.25 mM KH ₂ P0 ₄ ， 20.6 mM H ₄ N0 ₃ , 1.5 mM MgS0 ₄ ， 3.0 mM CaCl ₂ ， 50 μΜ ΚΙ, 100 μΜ Η ₃ Β0 ₃ ， 100 M MnS0 ₄ ， 30 M ZnS0 ₄ ， 1 μΜ Να ₂ Μο0 ₄ , 0.1 M CoCl ₂ ， 100 μΜ Να ₂ ΕϋΤΑ, 100 μΜ FeS0 ₄ ， 7.4 g/L琼脂， 蔗糖 30 g/L， 其余为水） 上于无菌条件下发芽， 制备无菌苗。 取无菌苗叶片剪成 5 mmx5 mm 大小的叶盘， 用处于对数生长期的含表达载体 rd29A-GhPP2Ac-4-2300的农杆菌 浸染叶盘 10 min, 吸干菌液， 在黑暗条件下共培养 2天 （MS培养基）。 将叶片 转到分化培养基 （MS+1 mg/L细胞分裂素 （BA) +0.1 mg/L萘乙酸 （NAA) +50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素） 上， 光照条件下培养 45天左右， 待芽长大 后切下转移到生根培养基 （MS+50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素） 中培养 30天左右， 待根系发达后将小苗转入仅加有 500 mg/L头孢霉素的 MS培养基上 进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片， 提取 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方 法），用 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO: 8 ( 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ DNA, 1.0 μΐ Ex Taq 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 9 禾口 SEQ ID NO: 10各 2.0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min， 33个循环后， 72°C 延 伸 10 min)， PCR鉴定， 保存阳性植株进行编号 TQ1-T ₀ 20。

实施例 6 过表达 GhPP2Ac-4 T _Q 代转基因烟草的耐旱模拟实验及功能鉴定 将 灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T _Q 1-T _Q 20及对照烟草组培苗分别移栽至蛭 石上， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环， 每 5天浇一次 1/2MS, 壮苗 培养 15天之后进行干旱胁迫实验， 转基因烟草、 对照烟草干旱 14天 (不浇水)， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T _Q 代转基因植株的抗旱性鉴定表明， 对照植株都萎蔫严重， 而 Τ ₀ 1、 Τ ₀ 2、 Τ ₀ 7、 Τ ₀ 8、 Τ ₀ 14、 Τ ₀ 16六个植株能够正常 生长， 其中 Το2、 Το8表现出明显的耐旱性 （参见图 3 )。 实施例 7 在转录水平上验证 G/^P24c-4基因的表达 分别取对照烟草、 耐旱效果不显著的转基因烟草 T _Q 代植株、 耐旱效果显著 的转基因烟草 T _Q 代植株（生长状况良好）干旱 14天叶子 0.05g， 用植物 RNA提 取试剂盒 (Invitrogen)提取的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001 测定所得总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 计算各个 RNA浓度。 依照 Invitrogen反转录试齐 [J盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录 (2μ _β 总 RNA作为模板，反转录引物 SEQ ID NO: 8)。通过 SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO: 8扩增 GhPP2Ac-4， 检测 PP2Ac-4蛋白相对表达情况。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上述反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO: 8各 2.0 μ1， 以及 30 μΐ 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94V 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72V 延伸 lmin， 29个循环后， 72°C 延伸 10 min。 产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000,购自深圳瑞真生物技术有限公司）， 1-5为对 照烟草， 6-18为耐旱效果显著的转基因烟草 T _Q 代植株， 19-24为耐旱效果不显著 的转基因烟草 T _Q 代植株。 图中所示条带大小与 G/^ ¾4c-4的大小一致。 结果表 明对照烟草没有外源基因 GhPP2Ac-4 的转录信号， 耐旱效果显著的转基因烟草 To代植株中外源 GhPP2Ac-4基因的转录较强， 耐旱效果不显著的转基因烟草 To 代植株没有转录或转录很弱。