La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular, la Medicina y la Farmacia, y se refiere a una composición que puede emplearse como medio de cultivo para mejorar los cultivos celulares, los procesos de criopreservación y de vitrificación celular, la descongelación de células, así como para la elaboración de medicamentos para medicina regenerativa e ingeniería tisular.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El suplemento del medio de cultivo empleado durante el cultivo de células animales y humanas es un punto esencial para la correcta progresión de las líneas celulares. El uso de suero fetal bovino como suplemento del medio de cultivo, requiere del cumplimiento de estándares autorizados por las Agencias Regulatorias con el fin de controlar el producto y mitigar el riesgo de contaminación por agentes adventicios animales (priones, virus, etc.). Además, se ha demostrado que el cultivo celular en presencia de estos sueros provoca la adquisición de antígenos animales por parte de las células que trasplantadas en el paciente pueden provocar rechazo, por lo que podría no descartarse la adquisición de dichos antígenos. Los derivados de plaquetas han sido propuestos como sustitutos del FBS para la expansión ex vivo de diferentes tipos celulares, por lo que el producto aquí propuesto resulta ser una alternativa segura y eficaz para el empleo durante el cultivo de diferentes tipos celulares.

Las condiciones de cultivo in vitro pueden influenciar significativamente el desarrollo celular, determinando cambios responsables de su mayor o menor calidad, viabilidad, etc. Así, está ampliamente descrito el efecto que tienen los factores de crecimiento plaquetario y las citoquinas sobre la proliferación celular, la quimiotaxis, la diferenciación celular, regeneración y angiogénesis sobre diferentes tipos celulares in vitro.

En el caso de la piel, un daño en la misma inicia una cascada de eventos incluyendo la inflamación, la formación de nuevo tejido y su remodelación, lo cual finalmente conduce a una reconstrucción parcial del área de la herida. El proceso de reparación es iniciado inmediatamente tras el daño mediante la liberación de varios factores de crecimiento, citoquinas y componentes de bajo peso molecular procedentes del suero de los vasos sanguíneos dañados y de la desgranulación plaquetaria. La alteración de los vasos sanguíneos también permite la formación de coágulos sanguíneos que además de proporcionar una barrera que evita la invasión de microorganismos, sirve como matriz extracelular para la deposición de células y reservorio de factores de crecimiento requeridos durante los períodos de reparación.

Los fibroblastos (tipo celular residente del tejido conectivo) depositan un gran número de moléculas en la matriz extracelular como glicoproteínas, glicosaminoglicanos (GAGs), proteoglicanos, elastina, colágeno y fibronectina, que emplean para migrar a través de la herida. Está ampliamente descrita la importancia que tienen ciertas proteínas como la fibronectina en las fases iniciales que tienen lugar durante los procesos de cicatrización de heridas, concretamente durante la fase inflamatoria y la fase proliferativa (Stadelmann WK et al.1998). En dichos estadios, fibrina y fibronectina se enlazan formando un coágulo que sirve de soporte estructural hasta que se deposita el colágeno y a su vez, los factores de crecimiento y la fibronectina estimulan la proliferación, la migración al lecho de la herida y la producción de moléculas extracelulares por los fibroblastos.

Además de la importancia que tiene la interacción célula-célula y célula-matriz, todos los estados del proceso de reparación están controlados por una amplia variedad de factores de crecimiento y citoquinas. Muchos estudios han demostrado el efecto beneficioso de factores como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFs- platelet-derived growth factors) o el factor de crecimiento fibroblástico (FGFs- fibroblast growth factors) sobre los procesos de curación en pacientes con diferentes desordenes durante la curación de heridas. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) demostró ser el primer factor de crecimiento que proporcionaba un efecto quimiotáctico a las células que migran al interior de las heridas, tales como neutrófilos, macrófagos y fibroblastos. Además, mejora la proliferación de fibroblastos y su producción de matriz extracelular, estimula la contracción de fibroblastos e induce a las células a mostrar un fenotipo miofibroblástico (Clark RA. Regulation of fibroplasia in cutaneous wound repair. Am J Med Sci. 1993 Jul;306(1):42-8.; Heldin CH1 , Westermark B. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol Rev. 1999 Oct; 79(4): 1283-316) desempeñando por tanto un papel crucial durante la curación de heridas. Por otro lado, un incremento de PDGF podría estar involucrado en la patogénesis de cicatrices hipertróficas y queloides debido a su potencial efecto sobre la proliferación de fibroblastos y sobre la producción de matriz extracelular (Haisa M1 , Okochi H,. Elevated levéis of PDGF alpha receptors in keloid fibroblasts contribute to an enhanced response to PDGF.1994 Oct;103(4):560-3.) La criopreservación de células y tejidos animales y humanos es un proceso muy delicado que incluye varias etapas que afectan a las células a diferentes niveles. Está descrito que una de las etapas más críticas durante el proceso de congelación celular se relaciona directamente con la formación de cristales tanto intra- como extracelulares, que dañan las membranas plasmáticas en muchos casos de manera irreversible hasta el punto de romper la célula. El uso de crioprotectores durante el proceso de congelación es determinante para preservar la integridad celular. Hasta el momento existe una amplia variedad de soluciones en el mercado que mejoran el proceso de criopreservación a dicho nivel, manteniendo la viabilidad y recuperabilidad celular; sin embargo, ninguna es definitiva. Al igual que puede ocurrir durante el cultivo, el uso de compuestos de origen animal empleados en soluciones destinadas a la criopreservación de células y/o tejidos para la posterior fabricación de medicamentos de terapias avanzadas, requiere del cumplimiento de estándares autorizados por las Agencias Regulatorias con el fin de garantizar un producto de calidad.

En el estado del arte existen ya varios lisados plaquetarios: Human platelet lysate (Macopharma). Human Platelet Lysate, Frozen, Pooled (Zen-Bio) Human Platelet Lysate (StemCell Thechnologies) - Human Platelet Lysate, Fibrinogen-Depleted (StemCell Thechnologies)

- CRUX RUFA Media Supplement (TrinovaBiochem)

- PLTMax Human Platelet Lysate (Merck Millipore)

- GMP PLUS™ Cell Culture Supplement (Compass Biomedicals) Stemulate (CookMedical)

Sin embargo, no todos los lisados plaquetarios funcionan de la misma manera, ni son adecuados. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Tasas de proliferación (a)(b) y viabilidad (c) de fibroblastos cultivados con medios de cultivo suplementados con diferentes Usados plaquetarios experimentales. Se muestra la media del número de células (a), la media de las duplicaciones celulares/día (b) y la media de los datos de viabilidad celular obtenidos (c) al final del proceso de expansión de fibroblastos (3 pases) en los distintos medios de cultivo: DMEM suplementado con un 10% de Suero fetal bovino (FBS), DMEM suplementado con lisado plaquetario comercial, DMEM suplementado con un 5% de diferentes soluciones de lisado plaquetario ensayados, tales como lisado plaquetario sin suplemento de plasma y preparado en solución de Composol (Solución 1), lisado plaquetario con suplemento de plasma (40%) + Solución de Composol (60%) y sin filtrar (Solución 2), lisado plaquetario con suplemento de plasma (40%) + Solución de Composol (60%) y filtrado (Solución 3) y lisado plaquetario con suplemento de plasma (20%) y preparado en tampón fosfato salino (80%) (Solución 4). Tras analizar los datos se observó que, comparado con el Gold Standard (medio DMEM suplementado con 10% de FBS), los mejores rendimientos observados en cuanto a la media del número de células levantadas por pase (Figura 1.a), así como la media del número de duplicaciones celulares calculadas por día (Figura 1.b) se obtuvieron en fibroblastos cultivados en presencia de medio suplementado con las Soluciones 2 y 3, siendo la Solución 2 (lisado plaquetario con suplemento de plasma (40%) + Solución de Composol (60%) sin filtrar) la que mostró resultados más equiparables al Gold Standard. A su vez, dichas soluciones experimentales mostraron mejores resultados que la solución comercial empleada en el ensayo (Solución 1). Por otro lado, no se observaron diferencias significativas en cuanto a los datos de viabilidad celular (%) realizada mediante tinción con azul tripánentre los diferentes medios ensayados, encontrando en todos los casos valores próximos al 100% (Figura 1.c). Se muestran los resultados de la media de datos obtenidos tras el cultivo de las células a lo largo de tres pases celulares (n=3) donde *p<0.05, **p<0.01 y ***p<0.001 P-valor procedente de Test ANOVA.

Figura 2. Morfología celular y confluencia observada sobre fibroblastos cultivados con medios suplementados con diferentes Usados plaquetarios experimentales frente a lisado plaquetario comercial. Todas las células mantuvieron una morfología fusiforme y fibroblástica a lo largo de los pases celulares tras ser cultivadas con cada uno de las soluciones experimentales (soluciones 1 , 2, 3 y 4), no apreciándose diferencias significativas de tamaño entre ellas y la solución comercial. Las células alcanzaron confluencia más rápidamente (al 4 ^o día tras la siembra celular) cuando fueron cultivadas con las soluciones 2 y 3, lo cual es indicativo de que el medio de cultivo suplementado con dichas soluciones parece mejorar la recuperabilidad de las células tras un proceso de descongelación. Imágenes tomadas sobre fibroblastos en cultivo en el 4 ^o día tras la siembra celular (microscopio óptico 4x).

Figura 3. Identificación de marcadores específicos de fibroblastos mediante inmunocitoquímica. Se analizó la expresión de fibronectina, CD13, Vimentina, E- Cadherina y pancitoqueratina sobre 4 lotes de fibroblastos en pase 5 (1501-F, 1501- FT01 , 1502-FT02, 1503-FT03) cultivados con un medio suplementado con la Solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar). En todos los lotes analizados los fibroblastos fueron positivos para fibronectina, CD13 y Vimentina (marcadores específicos de fibroblastos) y negativos para E-Cadherina y Pancitoqueratina (marcadores específicos de células epiteliales y que no expresan los fibroblastos).

Figura 4. Identificación y cuantificación de Colágeno Tipo I. a) Se analizó la expresión de Colágeno tipo I sobre fibroblastos cultivados a lo largo de 5 pases celulares con diferentes medios suplementados: 10% de FBS, 5% de la Solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) y 5% de lisado plaquetario comercial. Se observó que los fibroblastos cultivados con lisado plaquetario, ya fuese lisado plaquetario comercial o la solución 2, parecían mostrar mayor expresión de Colágeno Tipo I al ser comparados con el cultivo suplementado con FBS. A su vez, se observó un incremento de la expresión del marcador a lo largo de los pases celulares (pase 2 y pase 5) al ser comparados con el pase 1 dentro de la misma condición. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio de fluorescencia y cada imagen tomada fue sometida a la mínima intensidad de exposición. b) Se analizó de nuevo la expresión de Colágeno tipo I en dos lotes diferentes de fibroblastos cultivados a lo largo de 8 pases celulares con 10% de FBS vs 5% de la Solución 2. Tras la cuantificación de la proteína mediante citometría de flujo, se observó que la media de intensidad de fluorescencia obtenida en los dos lotes analizados era mayor en las muestras cultivadas con la solución 2 al 5% al compararse con las muestras cultivadas en presencia de FBS al 10%. Estos resultados nos indican que ambos medios de cultivo mantienen la expresión de Colágeno Tipo I, aunque los fibroblastos cultivados con la solución 2 al 5% parecen expresar algo más de la proteína que cuando son cultivados con FBS al 10%. La imagen muestra las diferencias de intensidad de fluorescencia de uno de los lotes de fibroblastos analizados.

Figura 5. Cariotipo celular. Se analizó el cariotipo de 4 lotes de fibroblastos cultivados a lo largo de 7 pases celulares con un medio suplementado con un 5% de la solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) obteniéndose un perfil genético normal. La imagen muestra el informe citogenético de una de las muestras analizadas.

Figura 6. Viabilidad celular de fibroblastos inmersos en matrices de Fibrina- Agarosa (F-A) no nanoestructuradas. Se muestra la media de los porcentajes de viabilidad tras el contaje de tres campos aleatorios realizados sobre matrices de fibrina agarosa sin nanoestructurar (NE) en las que no se empleó la solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) en su elaboración frente a matrices de fibrina agarosa sin nanoestructurar (NE) en las cuales se empleó la solución 2 durante su elaboración. La viabilidad celular se analizó mediante tinción con calceína/homodímero de etidio (Uve Dead Viability/Cytotoxicity Kit) y se mantuvo en ambos casos próxima al 100%, no mostrando efectos negativos para las células la presencia de lisado plaquetario en la mezcla.

Figura 7. a) Viabilidad celular de fibroblastos inmersos en matrices de Fibrina- Agarosa (F-A) nanoestructuradas (NE) tras ser criopreservadas con diferentes soluciones de criopreservación. Se muestra la media de los datos obtenidos tras el contaje de tres campos aleatorios realizados sobre matrices de fibrina agarosa con fibroblastos fabricadas con la solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar), nanoestructuradas y posteriormente criopreservadas en presencia de tres soluciones de criopreservación diferentes: Solución A (DMEM 70% + FBS 20% + DMSO 10%), Solución B (40% Solución 2 + Albúmina 2.5% + DMSO 10%) y Solución C (CryostorTM CS10). Se muestran los porcentajes de viabilidad mediante tinción con calceína/homodímero de etidio (Uve Dead Viability/Cytotoxicity Kit) obtenidos en matrices antes de ser criopreservadas y tras su criopreservación en las distintas soluciones a t=0 y t=1 hora tras descongelación. A pesar de que no se obtuvieron cambios significativos excepto en un caso (matriz F-A solución criopreservación A t=1 vs matriz F-A solución criopreservación C t=1), se observó que la solución B mantenía estable la viabilidad a t=0 y a t=1 hora tras la descongelación al ser comparada con la solución A. Se muestran los resultados de la media de datos obtenidos (n=3) donde *p<0.05. P-valor procedente de Test ANOVA. b) Se muestran imágenes de matrices de fibrina agarosa con fibroblastos antes y después de su criopreservación empleando la solución B, que han sido teñidas con calceína/homodímero de etidio (Uve Dead Viability/Cytotoxicity Kit) para el análisis de la viabilidad celular. Se muestran en verde las células vivas y en rojo las células muertas sobre matrices antes de congelar, a t=0 tras la descongelación (b) y a t=1 tras la descongelación (c), observándose un incremento de la viabilidad en el t=1 con respecto al t=0.

Figura 8. Imágenes de cortes histológicos realizados sobre matrices de fibrina agarosa con fibroblastos criopreservadas en presencia de diferentes soluciones. Se llevó a cabo la criopreservación de matrices de fibrina agarosa con fibroblastos fabricadas con una proporción de lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar (solución 2), nanoestructuradas y posteriormente criopreservadas en presencia de tres soluciones de criopreservación diferentes: Solución A (DMEM 70% + FBS 20% + DMSO 10%), Solución B (40% Solución 2 + Albúmina 2.5% + DMSO 10%) y Solución C (CryostorTM CS10). Tras la descongelación de las matrices, estas fueron fijadas con paraformaldehido al 4% y posteriormente sometidas a un protocolo de tinción para su análisis histológico. Se observó que la solución B fue la mejor que preservaba la estructura del tejido original seguida de la solución C, siendo la solución A la peor que preservó la estructura en el tejido artificial tras el proceso de criopreservación.

Figura 9. Media del n° de células acumuladas por pase celular en cada condición ensayada. Se muestran los resultados de la media del número de células acumuladas en cada una de las 3 líneas experimentales de fibroblastos, cultivados hasta un total de 7 pases celulares (códigos 160805, 160825 y 160902). Tras analizar los datos se observó que los mejores rendimientos se obtenían tras cultivar las células con el medio de cultivo suplementado con las soluciones 5 y 6, obteniéndose diferencias muy significativas (*** p<0.005) cuando las células suplementadas con lisado de ambas soluciones al 15% fueron comparadas con la solución 2 al 5%. Por otro lado, no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas de las soluciones 5 y 6 entre sí. La figura muestra las diferencias estadísticamente significativas de todas las soluciones analizadas respecto a la solución 2 al 5%, siendo (*** p<0.005), (** p<0.01) y (*p<0.05).

Figura 10. Tiempos de duplicación celular. Se muestran los resultados de la media del tiempo de duplicación obtenido en las líneas experimentales de fibroblastos, cultivados hasta un total de 7 pases celulares (códigos 160805, 160825 y 160902), sin tener en cuenta los datos de los fibroblastos cultivados con FBS al 10%. Se observó que las soluciones 5 y 6 al 10% y al 15% mostraban un menor tiempo de duplicación celular al ser comparadas con la solución empleada actualmente (solución 2 al 5%), lo cual se traduce a una mayor velocidad de duplicación celular. Se muestran las diferencias estadísticamente significativas respecto a la solución 2 al 5%, siendo (*** p<0.005), (** p<0.01) y (*p<0.05).

Figura 11. Duplicaciones Celulares Acumuladas. Se muestran los resultados de la media de duplicaciones acumuladas obtenidas en las líneas experimentales de fibroblastos, cultivados hasta un total de 7 pases celulares (códigos 160805, 160825 y 160902). Se observó que en ningún caso superaron las 15 duplicaciones celulares acumuladas. Se muestran las diferencias estadísticamente significativas respecto a la solución 2 al 5% siendo (*** p<0.005), (** pO.01) y (*p<0.05).

Figura 12. Tendencia de las células con diferentes medios de cultivo empleado a diferentes concentraciones. La figura muestra la media del número de células obtenidas por pase con cada uno de los medios incluidos en el ensayo (suero fetal bovino al 10% y distintas condiciones de lisado plaquetario humano al 5, 10 y 15%) en los tres lotes de fibroblastos (n=3). Aunque se observan diferencias entre las tres líneas de fibroblastos, se comprobó que el número de células tendía a disminuir a lo largo de los diferentes pases celulares cuando las células eran cultivadas con lisado plaquetario a cualquiera de las concentraciones ensayadas (5, 10 y 15%). Por el contrario, el número de células se mantuvo más homogéneo a lo largo de los pases cuando las células fueron cultivadas en presencia de FBS 10%.

Figura 13. Fibroblastos descongelados y sembrados con los diferentes medios a testar a diferentes concentraciones y hasta un pase 3 (imágenes obtenidas al microscopio óptico al 10x). A y B) Se observó que los fibroblastos cultivados con lisado plaquetario, tanto con el lisado fabricado acorde al proceso actual GMP (Condición 2) como con los fabricados bajo diferentes condiciones experimentales (condiciones 5, 6 y 7) y empleados a diferentes concentraciones (5, 10 y 15%), presentan un fenotipo diferente al que presentan los fibroblastos cultivados con FBS, siendo aparentemente células más pequeñas que estos últimos. C) Se observa que las células cultivadas con cualquiera de las condiciones experimentales de lisado plaquetario (condiciones 5, 6 y 7) al 15%, comparadas con las células cultivadas con las mismas condiciones de lisado plaquetario al 5% o con FBS 10%, daban lugar a células que presentaban una distribución más errática, así como presencia de Clusters o agregados en algunas zonas se la superficie del cultivo.

Figura 14. Resultados tras el cultivo de fibroblastos con lisado plaquetario obtenido tras dos o tres ciclos de congelación/descongelación. Como se observa en la figura 15.a), el número de fibroblastos obtenidos a lo largo de 5 pases celulares fue muy semejante para ambas soluciones, observándose una diferencia mínima de aproximadamente 43.000 células entre ambas, siendo superior en los fibroblastos cultivados con el medio suplementado con la solución 8. A su vez, el número de duplicaciones celulares por día calculadas a lo largo de los 5 pases celulares fue muy semejante entre ambas condiciones (figura 15. b), obteniéndose valores de 1 , 10 en solución 6 vs 1 ,08 en solución 8, lo cual nos indica que la dinámica de crecimiento era muy similar. A su vez, el número de células obtenidas en cada pase (figura 15.c) se mantuvo igual entre ambas condiciones y disminuyó en la misma proporción conforme se realizaron los sucesivos pases. Concretamente, el ratio de disminución entre el pase 1 y el pase 6 (n° células obtenidas en pase 1/n° células obtenido en pase 6) fue de 3,5 veces con la solución 6 vs 3,3 veces con la solución 8, lo cual podría estar asociado al agotamiento de los factores en el medio de cultivo que había sido completado al inicio de la prueba. Finalmente, tras calcular el número de células acumuladas a lo largo de los 5 pases para ambos cultivos (figura 15.d) observamos que éste fue también muy semejante, obteniéndose 5.214.050 de células acumuladas con la solución 6 vs 5.431.700 de células acumuladas con la solución 8.

Figura 15. Pruebas de actividad en cultivo de 3 lotes de Usado plaquetario obtenido tras tres ciclos de congelación/descongelación (Solución 8). Se fabricaron tres réplicas la solución 8 de lisado plaquetario (lotes: 171 107-b, 171 107-c y 171 120) para comprobar el grado de reproducibilidad del proceso. Tras la obtención de las soluciones, células de un lote común de fibroblastos (1501-FP06 en Pase 9) se sembraron en paralelo a la misma densidad celular empleando cada una de las réplicas obtenidas de la solución 8 y fueron comparadas con células cultivadas con la Solución 6 (control). Se analizó el número de células obtenidas con cada solución tras 4 días en cultivo. Como se muestra en la figura, no se observaron diferencias significativas en el número de células obtenidas con las diferentes réplicas de la solución 8 (171 107-b, 171107-c y 171 120), ni tampoco de estas con la solución 6.

Figura 16. Marcadores de identidad y potencia analizados en los lotes de fibroblastos 120614 (a) y 120717 (b) cultivados con las soluciones 2 y 6. Se llevó a cabo un análisis mediante inmunofluorescencia de los siguientes marcadores de identidad y potencia sobre dos lotes de fibroblastos cultivados a lo largo de 5 pases celulares: Colágeno tipo I (+), Fibronectina (+), Vimentina (+), CD13 (+), Pancitoqueratina (-) y E-Cadherina (-). Como se obsera en ambos lotes analizados, los fibroblastos expresaron Colágeno tipo I , Fibronectina, Vimentina y CD13, bajo todas las condiciones de cultivo analizadas (soluciones 2 y 6) a las diferentes concentraciones ensayadas (5% y 15%), y no expresaron Pancitoqueratina ni E- Cadherina. Por otro lado, no se observaron diferencias de expresión de los marcadores ni entre las diferentes soluciones ni a los diferentes porcentajes.

Figura 17. Marcadores de identidad y potencia analizados sobre fibroblastos cultivados bajo las condiciones 6 y 8. Se analizó el fenotipo de los fibroblastos cultivados hasta el pase 6 con las soluciones 6 y 8, analizándose para ello los marcadores CD44 (+), CD13 (+), CD324 (-) y HLA-DR (-) mediante citometría de flujo (Figura 18.a) y Colágeno Tipo I (+) mediante técnicas de inmunofluorescencia (Figura 18.b). No se observaron diferencias en la expresión de ninguno de los marcadores analizados entre ambas condiciones. Figura 18. Resultados tras el test de cariotipo realizados a fibroblastos cultivados con tres lotes diferentes de la solución 8 al 5%: 171107-b (a), 171107-c (b) y 171120 (c). Como se observa en la figura, los cariotipos obtenidos fueron normales en todos los casos, por lo que puede concluirse que el medio de cultivo suplementado con la solución 8 no generan inestabilidad genética a lo largo los pases testados.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los autores de la presente invención han desarrollado una composición que promueve el crecimiento celular, mantiene el fenotipo celular favoreciendo la expresión de ciertos marcadores y favorece la criopreservación de las células o tejidos promoviendo la recuperación de las mismas tras su descongelación.

Además, el producto aquí propuesto contiene niveles moderados de PDGF y otros factores suficientes para proporcionar una tasa de crecimiento adecuado durante el cultivo in vitro de fibroblastos. Otros productos presentes en el mercado contienen niveles de PDGF muy superiores, lo cual podría ser contraproducente para el cultivo de ciertos tipos celulares destinados al tratamiento de heridas de diversa índole.

COMPOSICIÓN Y MEDIO DE CULTIVO DE LA INVENCIÓN

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende Usado plaquetario humano (hPL) y Plasma AB.

La composición de la invención se obtiene mediante un proceso de fabricación que consiste en un 60% de Lisado plaquetario humano (hPL) obtenido a partir de plaquetas leucodeplecionadas de grupo 0 en Solución de Composol cuya concentración final supone 1 x 10 ⁹ plaquetas/ml de mezcla total y suplementado con un 40% de Plasma AB.

Tras la obtención de la composición de la invención esta podría ser filtrada. Por tanto, en una realización preferida, la composición de la invención es filtrada. En otra realización preferida, la composición de la invención no es filtrada. Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la concentración inicial de plaquetas de partida para obtener el lisado plaquetario es de entre 1x10 ⁸ - 5x10 ⁹ plaquetas/ml, y preferiblemente de 0.5-1.5 x 10 ⁹ plaquetas/ml y más preferiblemente de 1 x 10 ⁹ plaquetas/ml. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la proporción de hPL y de plasma AB es de 90% hPL y 10% de plasma AB, preferiblemente de 80% hPL y 20% de plasma AB, y más preferiblemente, de 60% hPL y 40% de Plasma AB. En otra realización preferida, la proporción de hPL y de plasma AB es de 98% hPL y 3% de plasma AB. Es posible emplear hPL al 100%, ya que se ah visto que mantiene la funcionalidad, pero es mejor cuando se añade una proporción de plasma AB.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención el lisado plaquetario humano (hPL) se ha obtenido a partir de plasma transfusional del grupo AB, y más preferiblemente de plasmaféseris del grupo AB.

El hPL se puede generar a partir del buffy coat, plasma enriquecido en plaquetas (platelet-rich plasma (PRP)), o concentrados de plaquetas derivados de aféresis.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención el lisado plaquetario humano (hPL) se ha obtenido a partir de plaquetas leucodeplecionadas, y más preferiblemente de plaquetas leucodeplecionadas del grupo 0.

En otra realización preferida de este aspecto la composición de la invención se obtiene por un procedimiento que comprende: a) generar un concentrado de plaquetas frescas, b) suplementarias con plasma AB, y c) lisar las plaquetas.

Tanto la etapa (a) de generar un concentrado de plaquetas como la etapa (b) de suplementarias con plasma AB son opcionales. Así, el lisado de las plaquetas cuando están suplementadas con plasma es más efectivo. Por tanto, en una realización más preferida de la invención la composición de la invención se obtiene por un procedimiento que comprende: a) suplementarias con plasma AB, y b) lisar las plaquetas. En otra realización preferida, el procedimiento comprende:

I) Obtener una mezcla de Plaquetas frescas leucodeplecionadas de grupo 0,

II) Eliminar los posibles restos de plasma de grupo 0 procedentes de las bolsas de plaquetas de partida y concentración de plaquetas mediante un proceso de centrifugación, preferiblemente a 2000g durante 20 minutos, más preferible a 2500g durante 10 minutos a temperatura ambiente (22°C).

III) Obtención de 1x10 ⁹ plaquetas/ml diluidas en 60% Solución de Composol y 40% plasma AB o plasmaféresis de grupo AB.

IV) 1 ^o Congelación del concentrado de plaquetas preferiblemente a -40°C durante al menos 6 horas, más preferiblemente a -80°C durante al menos 12 horas y descongelación a 34°C durante 2-8 horas, preferiblemente a 36°C durante 2-5 horas.

V) 2 ^o Congelación del concentrado de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, preferiblemente a -80°C durante al menos 12 horas y 2 ^o descongelación a 34°C durante 2-8 horas, preferiblemente a 36°C durante 2-5 horas.

VI) Centrifugación del lisado plaquetario a 3500g durante 45 min., más preferiblemente 4000g durante 30 min. a temperatura ambiente (20-25°C), más preferiblemente a 22°C y eliminación de restos

VII) Centrifugación del lisado plaquetario a 3500g durante 25 min., preferiblemente a 4000g durante 15 min. a temperatura ambiente (20- 25°C), más preferiblemente a 22°C y eliminación de restos.

VIII) Conservación del lisado plaquetario entre -20°C y -80°C, más preferiblemente por debajo de -80°C.

Preferiblemente la centrifugación del paso II) de realiza a 2500g durante 10 minutos a temperatura ambiente (22°C).

En otra realización preferida la 1 ^o congelación del paso IV) se realiza a -80°C durante al menos 12 horas.

En otra realización preferida la 1 ^o descongelación del paso IV) se realiza a 36°C durante 2-5 horas.

En otra realización preferida la 2 ^o congelación del paso IV) se realiza a -80°C durante al menos 12 horas. En otra realización preferida la 2 ^o descongelación del paso IV) se realiza a 36°C durante 2-5 horas.

En otra realización preferida la centrifugación del lisado plaquetario del paso VI) se realiza a 4000g durante 30 min. En otra realización preferida la centrifugación del lisado plaquetario del paso VI) se realiza a una temperatura de 22°C,

En otra realización preferida la centrifugación del lisado plaquetario del paso VII) se realiza a 4000g durante 15 min.

En otra realización preferida la centrifugación del lisado plaquetario del paso VII) se realiza a una temperatura de 22°C,

En otra realización preferida la conservación del lisado plaquetario del paso VIII) se realiza por debajo de -80°C.

En otra realización preferida la temperatura de centrifugación de los pasos IV y I IV es de 4°C.

En otra realización aún más preferida, la temperatura de centrifugación de los pasos VI y VII es de 4°C.

El proceso se realiza bajo Normas de Correcta Fabricación (NCF) y conlleva una secuencia que consiste en la generación de un concentrado de plaquetas preferiblemente frescas suplementadas con plasma que posteriormente se lisan para generar una solución final de lisado plaquetario enriquecido.

En otra realización más preferida el procedimiento comprende:

I) Obtener una mezcla de plaquetas frescas leucodeplecionadas de grupo 0,

II) 1 ^o Congelación de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, preferiblemente durante al menos 12 horas, y descongelación entre 33°C y 37°C, más preferiblemente a 36°C durante 2-8 horas, preferiblemente durante 5 horas.

III) 2 ^o Congelación de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, preferiblemente durante al menos 12 horas, y descongelación entre 33°C y 37°C, más preferiblemente a 36°C durante 2-8 horas, preferiblemente durante 5 horas. IV) 3 ^o Congelación de plaquetas y descongelación progresiva entre 10 y 30 horas a al menos 2°C, y preferiblemente durante aproximadamente 24 horas a 4°C.

IV) Centrifugación del lisado plaquetario entre 3300g y 4300 g durante 25 y 50 minutos y entre 2 ^o y 25° C, preferiblemente a 4000g durante 30 min, a 4°C y eliminación de restos

V) Centrifugación del lisado plaquetario entre 3300g y 4300 g durante 10 - 40 minutos y entre 2 ^o y 25° C, preferiblemente a 4000g durante 15 min., a 4°C y eliminación de restos.

Más preferiblemente el procedimiento de obtención adicionalmente comprende una etapa Γ) (entre la etapa I y II), para eliminar los posibles restos de plasma de grupo 0 procedentes de las bolsas de plaquetas de partida y concentración de plaquetas mediante un proceso de centrifugación, preferiblemente a 2000g durante 20 minutos, a temperatura ambiente (22°C).

13. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, donde el procedimiento de obtención adicionalmente comprende una etapa III ^' ) (entre la etapa III y IV), de tercera congelación del concentrado de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, y una 3 ^a descongelación que se hace de manera progresiva entre 2°C y 10°C durante 10 a 30 horas, y preferiblemente entre 16 - 24 horas.

Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende la composición de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención además comprende otro principio activo. Un tercer aspecto de la invención se refiere a un medio de cultivo, de ahora en adelante medio de cultivo de la invención, que comprende la composición de la invención o la composición farmacéutica de la invención.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un tejido artificial, de ahora en adelante tejido artificial de la invención, que comprende la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención o el medio de cultivo de la invención y además comprende al menos una célula. Las células pueden ser de cualquier estirpe celular, como por ejemplo, pero sin limitarnos, células epiteliales, neuronas, fibroblastos, adipocitos, osteoblastos, hepatocitos, células básales, odontoblastos, neumocitos, miocitos, o células endoteliales. También pueden ser células madre, preferiblemente células madre mesenquimales. También pueden ser células madre pluripotentes inducidas (iPSs). Preferiblemente son fibroblastos. En otra realización preferida la célula es una célula madre mesenquimal, y más preferiblemente una célula madre mesenquimal procedente de cordón umbilical.

USO DE LAS COMPOSICIONES Y DEL MEDIO DE CULTIVO DE LA INVENCIÓN

El uso del producto como suplemento del medio de cultivo mantiene la viabilidad e incrementa, o al menos iguala, las tasas de crecimiento de diferentes tipos celulares tras compararse con otros suplementos normalmente empleados como el suero fetal bovino o lisados plaquetarios comerciales. Preferiblemente el medio de cultivo de la invención ha resultado idóneo para fibroblastos y células madre mesenquimales.

Además, los autores de la presente invención han demostrado que el uso de la composición de la invención mantiene la expresión de los marcadores celulares en las líneas testadas e incluso en algunos casos incrementa la expresión de marcadores específicos tras ser comparados con medios suplementados con otros aditivos como suero fetal bovino y lisado plaquetario comercial.

Es decir, la composición de la invención podría utilizarse como un suplemento del medio de cultivo de diferentes líneas celulares, mejorando las tasas de crecimiento de células animales y humanas, así como favoreciendo la expresión de marcadores celulares implicados en rutas importantes.

Por tanto, un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención, la composición de la invención o el medio de cultivo de la invención para el cultivo de células. En una realización preferida de este aspecto las células son células madre, y aún más preferiblemente células madre mesenquimales. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las células son células pluripotentes inducidas.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las células son fibroblastos.

La composición de la invención obtenida es un producto libre de anticuerpos plasmáticos y antígenos celulares, cuya presencia podrían afectar el cultivo de las diferentes líneas celulares y la aplicación de estas en pacientes como medicamento en terapia celular.

En una realización preferida de este aspecto de la invención los cultivos son "xeno- free". Los autores de la presente invención han demostrado que la composición de la invención como suplemento del medio de cultivo mantiene la recuperabilidad (n° de células recuperadas) tras la descongelación y siembra de células al ser comparadas con medios suplementados con otros lisados plaquetarios comerciales.

Así pues, la composición de la invención podría utilizarse como un suplemento del medio de cultivo empleado durante la descongelación y posterior siembra de diferentes líneas celulares, manteniendo y posiblemente mejorando la recuperabilidad celular (n° de células obtenidas días después tras la siembra).

También han demostrado que la composición de la invención puede emplearse como parte componente de una solución de criopreservación que mantiene la viabilidad e incrementa en la mayoría de los casos la recuperación de las células en el momento de la descongelación, así como la integridad de tejidos artificiales al ser comparada con otras soluciones empleadas para la criopreservación de células y/o tejidos.

Preferiblemente las células se encuentran embebidas en una matriz biológica.

Por tanto, un sexto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención, la composición de la invención o el medio de cultivo de la invención en un procedimiento de criopreservación celular.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención, la composición de la invención o el medio de cultivo de la invención en un procedimiento de vitrificación celular. Un octavo aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención, la composición de la invención o el medio de cultivo de la invención para la recuperación de las células sometidas a congelación.

Preferiblemente, las células sometidas a criopreservación o vitrificación son células madre. En otra realización preferida, las células sometidas a criopreservación o vitrificación son células madre mesenquimales. En otra realización preferida, las células sometidas a criopreservación o vitrificación son células madre pluripotentes inducidas (iPSs). En otra realización preferida, las células sometidas a criopreservación o vitrificación son fibroblastos.

Únicamente y en el caso particular de no utilizar embriones humanos o células pluripotentes con fines industriales o comerciales en el entorno de la Unión Europea, aún más preferiblemente, las células y/o los embriones son células de mamífero no humano o embriones no humanos.

Sin embargo, en el caso particular de que el cultivo de las células tenga una finalidad terapéutica o de diagnóstico para el propio embrión, las células y/o los embriones son de mamífero humano. Así, por ejemplo, la composición farmacéutica de la invención, o el medio de cultivo de la invención puede emplearse en el diagnóstico genético preimplantacional.

USOS MÉDICOS DE LA INVENCIÓN

La composición de la invención es un producto libre de anticuerpos plasmáticos y antígenos celulares que podría evitar un posible rechazo en pacientes en el caso de ser usado como producto de terapia celular.

El proceso de fabricación de la composición de la invención ha sido validado bajo Normas de Correcta Fabricación e inspeccionado con resultados satisfactorios por la AEMPS (Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios). Además, es "Xeno-free": no tiene ningún producto animal. Esto supone una ventaja respecto a otras soluciones disponibles en el mercado, mostrándose una herramienta útil para la fabricación de medicamentos de terapias avanzadas ya que no contiene productos animales que pueden provocar contaminación cruzada con agentes adventicios de origen no humano y rechazo en el paciente.

Por tanto, un noveno aspecto se refiere al uso de la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, el medio de cultivo de la invención y/o el tejido artificial de la invención, en la elaboración de un medicamento, o alternativamente, a la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, al medio de cultivo de la invención y/o el tejido artificial de la invención, para su uso como medicamento. Debido a la composición del producto y a las propiedades regenerativas y cicatrizantes que este presenta, el producto podría emplearse también como medicamento en medicina regenerativa o como solución empleada con fines estéticos. Así pues, un décimo aspecto de la invención se refiere a la composición, la composición farmacéutica de la invención, al medio de cultivo de la invención y/o el tejido artificial de la invención, para su uso como cosmético.

Preferiblemente dicho medicamento es un medicamento de terapia celular somática. Se entiende por "terapia celular somática" la utilización de células somáticas vivas, autólogas, alogénicas o xenogénicas, cuyas características biológicas han sido alteradas sustancialmente como resultado de su manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen la acción pretendida en principio en el producto acabado; derivados de células autólogas expresadas ex vivo (in vitro) en condiciones específicas de cultivo; o células modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar propiedades funcionales homologas o no homologas anteriormente no expresadas. El uso del producto de la invención como suplemento durante el cultivo parece incrementar la expresión de algunos marcadores específicos de fibroblastos como el colágeno tipo I que está estrechamente relacionado con los procesos de remodelación y cicatrización de heridas. Esto puede suponer una ventaja frente otros productos empleados durante el cultivo de determinados tipos celulares con fines terapéuticos. Así pues, un undécimo aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, del medio de cultivo de la invención y/o del tejido artificial de la invención, en la elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado, o alternativamente, a la composición, la composición farmacéutica de la invención, al medio de cultivo de la invención, para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado.

La composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, o el medio de cultivo de la invención, preferiblemente junto con las células adecuadas, puede emplearse para para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado.

Las células pueden ser de cualquier estirpe celular, como por ejemplo, pero sin limitarnos, células epiteliales, neuronas, fibroblastos, adipocitos, osteoblastos, hepatocitos, células básales, odontoblastos, neumocitos, miocitos, o células endoteliales. También pueden ser células madre, preferiblemente células madre mesenquimales. También pueden ser células madre pluripotentes inducidas. Preferiblemente son fibroblastos.

El tejido o el órgano pueden ser internos como, por ejemplo, pero sin limitarse, la uretra o la vejiga, o externos como, por ejemplo, pero sin limitarse, la córnea o la piel. En una realización preferida, el tejido o el órgano dañado se seleccionan de la lista que comprende: piel, vejiga, uretra, córnea, mucosa, conjuntiva, pared abdominal, conjuntiva, tímpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendón, hueso, meninge o vagina. El tejido o el órgano pueden estar enfermos o dañados como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad, por ejemplo, pero sin limitarse, una enfermedad infecciosa, inflamatoria, genética o degenerativa; un daño físico como un traumatismo o una intervención quirúrgica, un daño químico o una interrupción del flujo sanguíneo.

Una realización preferida de este aspecto se refiere al uso de la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, o del medio de cultivo de la invención, y/o el tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una piel. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una piel enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación o una malformación congénita.

Una realización preferida de este aspecto se refiere al uso de la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, o del medio de cultivo de la invención y/o el tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una vejiga. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una vejiga enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, una extrofia vesical, una extrofia de cloaca o una microvejiga), una vejiga neurógena, una incontinencia urinaria, una disfunción vesical, una infección o una litiasis vesical. Una realización preferida de este aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una uretra. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una uretra enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, un hispospadias o un epispadias) o una estenosis.

Una realización preferida de esteaspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una córnea. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una córnea enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una úlcera corneal, un queratocono, un queratoglobo, un descematocele, un traumatismo, una causticación, una insuficiencia I ímibica, una queratitis atrófica, una distrofia corneal, una queratopatía primaria o secundaria, una infección , un leucoma, una queratopatía bullosa, un fallo endotelial corneal o una neoplasia benigna o maligna.

Una realización preferida de este aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para la elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una mucosa, preferiblemente de una mucosa oral. Una realización aún más preferida se refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una mucosa oral enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia ben igna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación, una malformación congénita, una pérdida de sustancia o una enfermedad periodontal.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición, la composición farmacéutica de la invención, el medio de cultivo de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad embrionaria, o alternativamente, a la composición, la composición farmacéutica de la invención, o al medio de cultivo de la invención para su uso en el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad embrionaria. Más preferiblemente, se refiere al uso de la composición, la composición farmacéutica de la invención, el medio de cultivo de la invención, en la elaboración de un medicamento para el diagnóstico genético preimplantacional, o alternativamente a la composición, la composición farmacéutica de la invención, el medio de cultivo de la invención, para su uso en el diagnóstico genético preimplantacional.

Definiciones: El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención se refiere a la composición, composición farmacéutica o medio de cultivo de la invención, que tiene un objetivo terapéutico o de diagnóstico que se aplican al embrión y que le son útiles.

Las células madre pluripotentes son células indiferenciadas, inmaduras y con capacidad de autorrenovación capaces de diferenciarse a células que constituyen tejidos derivados de cualquiera de las tres capas embrionarias, el ectodermo, el endodermo y el mesodermo, que darán lugar a los tejidos y estructuras conocidas en los animales superiores.

Los mamíferos pertenecen al Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Metazoa, Phylum Chordata, Subphylum Craniata, Clase Mammalia.

Los organismos de la especie Homo sapiens pertenecen al Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Metazoa, Phylum Chordata, Subphylum Craniata, Clase Mammalia, Orden Primates, Familia Hominidae y Género Homo.

En otra realización preferida, pero no limitante, las células son de mamífero, como por ejemplo, primates, ovinos, caprinos, porcinos, bovinos, equinos. Sin embargo, la presente invención también es de aplicación en otras especies, como por ejemplo, pero sin limitarnos, en peces óseos u osteictios (Osteichthye), como por ejemplo los peces del orden Salmoniformes.

El hombre es un mamífero humano que pertenece a la especie Homo sapiens. En esta memoria, el término célula incluye también a los ovocitos u oocitos. El término "ovocito u oocito" se refiere a una célula germinal femenina que está en proceso de convertirse en un óvulo maduro.

La "criopreservación" es el proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80 °C y -196 °C (el punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas. Uno de los principales problemas de la criopreservación es la formación de cristales de hielo durante la congelación del agua. Estos cristales se forman tanto fuera como dentro de la célula y son los cristales intracelulares los que comportándose como cuchillas cortan las estructuras internas de la célula, especialmente las membranas.

Tanto las células, incluyendo los ovocitos, como los embriones pueden ser sometidos a un proceso de criopreservación. Así, preferentemente, las células o embriones han sido previamente criopreservados.

Los ovocitos es el material más sensible a la criopreservación. Este hecho se debe probablemente a que su placa metafásica es muy sensible. Los ovocitos sobreviven poco y mal a la congelación, siendo la tasa de gestación por ciclo de descongelación sólo del 10%.

Por tanto, en otra realización preferida las células o embriones han sido previamente sometidos a un proceso de vitrificación.

El término "embrión" como se usa en el contexto de la presente invención está destinado a incluir en su ámbito de aplicación de las diversas etapas de desarrollo del embrión, incluyendo la fase de blastocisto como así como la fase de mórula anterior. En ocasiones en todo el texto los términos "embrión" y "blastocisto" se utilizan indistintamente, pero a partir de la descripción proporcionada será evidente para los expertos en la técnica lo que se entiende por estos términos y su alcance.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la expansión de células madre. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para el mantenimiento de las células madre en forma indiferenciada. El término "cuerpo embrionario" hace referencia a los agregados derivados de células madre pluripotentes en proceso de diferenciación. El cultivo de estos cuerpos embrionarios bajo diferentes condiciones da lugar a los diversos tipos de células indiferenciadas. La formación de estos cuerpos embrionarios se realiza por cualquier técnica descrita en el estado de la técnica y que conoce el experto en la materia.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para el cultivo de cuerpos embrionarios.

A menos que el contexto requiera otra cosa claramente, a lo largo la descripción y las reivindicaciones, las palabras 'comprenden', 'comprende', y similares, se han de interpretar en un sentido inclusivo en oposición a un sentido exclusivo o exhaustiva; es decir, en el sentido de "incluye, pero no limita a ".

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Bloque I. Uso de la invención como suplemento del medio de cultivo celular

1. Obtención de diferentes preparados de lisado plaquetario

Se llevó a cabo la preparación de diferentes soluciones de lisado plaquetario a partir de 10 Buffy Coat del grupo 0 que fueron mezclados previamente. Tras ello se generaron las siguientes soluciones:

• Solución 1 : Plaquetas frescas→ Congelación -80°C→ Descongelación 36°C→ Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Centrifugación 4000g 30 min. a temperatura ambiente→ Centrifugación 4000g 15 min. a temperatura ambiente→ Conservación -80°C. Solución 2: Plaquetas frescas diluidas en 60% Solución de Composol y 40% plasma AB (1x10 ⁹ plaquetas/ml)→ Congelación -80°C→ Descongelación 36°C→ Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Centrifugación 4000g 30 min. a temperatura ambiente→ Centrifugación 4000g 15 min. a temperatura ambiente→ Conservación -80°C.

Solución 3: Plaquetas frescas diluidas en 60% Solución de Composol y 40% plasma AB (1x10 ⁹ plaquetas/ml)→ Congelación -80°C→ Descongelación 36°C→ Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Centrifugación 4000g 30 min. a temperatura ambiente→ Centrifugación 4000g 15 min. a temperatura ambiente→ Filtración 0.48μηι→ Conservación -80°C.

Solución 4: Plaquetas frescas diluidas en 80% Solución Salina Fosfatada + 20% plasma (1x10 ⁹ plaquetas/ml) → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Centrifugación 4000g 30 min. a temperatura ambiente→ Centrifugación 4000g 15 min. a temperatura ambiente→ Conservación -80°C.

Solución 5: Plaquetas frescas suplementadas con 20% de Plasma AB (plasmaféresis)→ Congelación -80°C→ Descongelación 36°C→ Congelación - 80°C → Descong. 36°C → Centrifugación 4000g 30minutos a 4°C → Centrifugación 4000g 15minutos a 4°C→ Conservación -80°C.

Solución 6: Plaquetas frescas no suplementadas → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → suplemento con 20 % de Plasma AB (plasmaféresis)→ Centrifugación 4000g 30 minutos a 4°C→ Centrifugación 4000g 15 minutos a 4°C→ Conservación -80°C.

Solución 7: Plaquetas frescas no suplementadas → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Centrifugación 4000g 30 minutos a 4°C→ Centrifugación 4000g 15 minutos a 4°C → Conservación -80°C.

Solución 8: Plaquetas frescas no suplementadas → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Congelación -80°C→ Descongelación 4°C→ Centrifugación 4000g 30 minutos a 4°C→ Centrifugación 4000g 15 minutos a 4°C→ Conservación -80°C. 2. Cultivos celulares

Se llevaron a cabo varios ensayos in vitro para analizar el efecto que tiene sobre el cultivo de fibroblastos el empleo de diferentes suplementos, entre ellos, las soluciones obtenidas en el punto anterior (soluciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8) así como otros suplementos normalmente empleados como el Suero fetal bovino (FBS o Fetal Bovine Serum) o Usado plaquetario Humano comercial. Para ello, fibroblastos dérmicos obtenidos mediante técnicas de explantes y procedentes de pases tempranos fueron descongelados y sembrados a una densidad de 4000 cel/cm ² en presencia de un medio DMEM suplementado con 10% de FBS. Tras mantenerse las células al menos 48 horas en cultivo, estas se levantaron y se sembraron de nuevo a razón de 3000 cel/cm ² empleando para ello las condiciones indicadas a continuación:

1. DMEM suplementado con 10% FBS, aminoácidos no esenciales (NEAA) (0,1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina {20vg/m\).

2. DMEM suplementado con 5% Lisado Plaquetario Humano comercial (Cook Medical), NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΛηΙ).

3. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 1 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0,1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).

4. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 2 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).

5. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 3 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).

6. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 4 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).

7. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 5 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).

8. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 6 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).

9. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 7 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).

10. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 8 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΛηΙ). Se mantuvieron las mismas condiciones de cultivo a lo largo de todo el ensayo, aplicando el pase celular a todos los cultivos a la vez tras alcanzar al menos uno de ellos el 90-100% de confluencia celular. Tras el levantamiento, las células se sembraban de nuevo a una densidad de 3000 cel/cm ² empleando las mismas condiciones hasta alcanzar un máximo de 7-8 pases celulares. Finalizado el ensayo, se llevó a cabo un análisis de los rendimientos celulares obtenidos: Figura 1.a, Figura 9, Figura 15 y Figura 16; de la dinámica de crecimiento (duplicaciones celulares): Figura 1.b, Figura 10, Figura 11 y Figura 15; de la viabilidad celular: Figura 1.c, de la morfología de los fibroblastos cultivados: Figura 2, Figura 13 y Figura 14; así como de la tendencia de los cultivos a lo largo de los pases celulares en presencia de diferentes soluciones empleadas a diferentes concentraciones: Figura 12.

El cálculo del número de duplicaciones celulares se realizó acorde a la siguiente fórmula:

Log N - Log No

Duplicaciones celulares =

^P Log 2

Donde N = n° final de células obtenidas tras el pase celular y No = n° inicial de células sembradas al inicio del pase celular.

Se calcularon en cada caso el n° de duplicaciones celulares obtenidas en cada pase celular, así como las duplicaciones celulares acumuladas a lo largo de todo el experimento.

3. Expresión de marcadores celulares

Se analizó la expresión de marcadores específicos de fibroblastos cultivados hasta un pase 5 con un medio de cultivo DMEM suplementado con un 5% de la solución 2 descrita en el apartado 1 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar). Se analizó la expresión de Fibronectina, CD13, Vimentina, Pancitoqueratina y E-Cadherina (Figura 3) mediante técnicas de inmunocitoquímica.

En una segunda tanda de experimentos se analizó la expresión de Colágeno tipo I sobre fibroblastos cultivados hasta pase 5 con diferentes suplementos en el medio: DMEM suplementado con 5% de lisado plaquetario comercial, DMEM suplementado con 5% de la solución 2 descrita en el apartado 1 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) y DMEM suplementado con 10% de FBS. Para ello se emplearon técnicas de inmunocitoquímica (Figura 4.a) y citometría de flujo (Figura 4.b).

En una tercera tanda de experimentos se analizó la expresión de Colágeno tipo I (+), Fibronectina (+), Vimentina (+), CD13 (+), Pancitoqueratina (-) y E-Cadherina (-) mediante test de inmunofluorescencia sobre fibroblastos cultivados a lo largo de 5 pases celulares con la solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) y la solución 6 (lisado plaquetario enriquecido post-congelación con un 20% de Plasma), ambas empleadas al 5% y al 15% (Figuras 16.A y 16.B). En una cuarta etapa de experimentos se analizó la expresión de CD44 (+), CD13 (+), CD324 (-) y HLA-DR (-) mediante citometría de flujo (Figura 17.a) y Colágeno Tipo I (+) mediante técnicas de inmunofluorescencia (Figura 17.b).

4. Cariotipo celular

Se analizaron los perfiles genéticos mediante técnicas de cariotipado sobre muestras representativas de fibroblastos cultivados con medio DMEM suplementado con un 5% de la solución 2 descrita en el apartado 1 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) hasta alcanzar un pase 7 o tras acumular al menos 16.5 duplicaciones celulares (Figura 5).

Adicionalmente se analizó el cariotipo de fibroblastos cultivados hasta superar 16.5 duplicaciones acumuladas cultivados con un 5% de la solución 8 (Figura 18 a, b y c).

Bloque II. Uso de la invención como parte integrante de matrices biológicas celularizadas

1. Generación de matrices celulares con lisado plaquetario Se analizó el efecto que tenía la presencia de lisado plaquetario durante la fabricación de una matriz biológica celularizada fabricada siguiendo la metodología descrita en la solicitud de patente WO/201 1/023843. Para ello, se fabricaron dos matrices biológicas con fibroblastos: una añadiendo la solución 2 de la presente invención en la mezcla y otra sin añadirla, y posteriormente se tiñeron con calceina/homodímero de etidio (Live Dead Viability/Cytotoxicity Kif) para analizar la viabilidad de las células incluidas en la matriz (Figura 6). 2. Empleo de matrices celulares para el tratamiento de grandes quemados como medicamento de uso compasivo

Se llevó a cabo la fabricación de dos lotes de matrices biológicas celularizadas siguiendo la metodología descrita en la solicitud la patente WO/2011/023843y fabricadas bajo Normas de Correcta Fabricación para el posterior tratamiento de dos pacientes de uso compasivo que presentaron, en el peor de los casos, un 70% de espesor total de piel quemada. Para ello, fibroblastos dérmicos obtenidos por digestión enzimática con Colagenasa fueron aislados y expandidos con medio DMEM suplementado con un 5% de la Solución 2 de la presente invención hasta obtener un Banco Celular Maestro (BCM) y posteriormente un Banco Celular de Trabajo (BCT). La obtención de las matrices biológicas se llevó a cabo acorde a la patente, empleando fibroblastos procedentes del BCT, obteniendo finalmente un medicamento (denominado "producto terminado") que cumplió con todos los criterios de calidad establecidos para su liberación y uso en pacientes. Ninguno de los pacientes tratados mostró ningún síntoma de rechazo al medicamento, observándose indicios de repitalización de la herida unas semanas tras el tratamiento.

Bloque III. Uso de la invención como parte integrante de una solución para la criopreservación de células y/o tejidos.

1. Obtención de diferentes soluciones de criopreservación

Se realizaron las siguientes mezclas, manteniéndose en todo momento refrigeradas hasta su uso: Solución A: 70 % DMEM + 20% FBS + 10% DMSO.

Solución B: 40% de la Solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) + 2,5 % Albúmina humana + 10% DMSO.

2. Criopreservación de tejidos artificiales

Se llevó a cabo la generación de matrices biológicas celularizadas siguiendo la metodología descrita en la solicitud de patente WO/201 1/023843 con el fin de ver el efecto que tienen las diferentes soluciones de criopreservación definidas anteriormente (soluciones A y B) frente a una solución comercial (solución C=CryostorTM CS10) durante la criopreservación de tejidos artificiales.

Tras la generación de las matrices, estas fueron nanoestructuradas siguiendo la metodología descrita en la solicitud de patente WO/2011/023843 (proceso que consiste en la deshidratación del tejido hasta alcanzar un 10% de agua) e incluidas independientemente en bolsas de congelación a las que se añadió las soluciones a testar. Posteriormente, las bolsas con las matrices fueron rápidamente termoselladas y sometidas a un proceso progresivo de criopreservación que consistió en mantener las láminas durante 30 minutos a 4°C, posteriormente 24 horas a -20°C, tras ello 48 horas a -80°C y al menos 24 horas a -196°C antes de ser descongeladas de nuevo (Rodríguez MA, López-López MT, Duran JD, Alaminos M, Campos A, Rodríguez IA Cryopreservation of an artificial human oral mucosa stroma. A viability and rheological study Cryobiology. 2013 Dec;67(3):355-62). La descongelación de las matrices se llevó a cabo rápidamente a 37°C y tras lo cual se tiñeron con calceina/etidio homodymer (Live Dead Viability/Cytotoxicity Kit) para analizar la viabilidad de las células inmersas en las matrices (Figura 7).

3. Análisis Histológicos

Muestras representativas de las matrices fabricadas en el punto anterior criopreservadas con las tres soluciones a testar (soluciones A, B y C) fueron fijadas tras la descongelación con paraformaldehido al 4% y sometidas a un proceso de tinción para su posterior análisis histológico (Figura 8).