MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE DITTRICHIA GRAVEOLENS Y

SUS USOS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un nuevo método para la obtención de extractos de la planta Dittríchia graveolens y a usos de dichos extractos. Más específicamente, la invención se refiere a la obtención de extractos de Dittríchia graveolens por arrastre de vapor y al uso de los mismos como plaguicidas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El abuso en la utilización de productos químicos para el control de plagas agrícolas y parásitos de los animales y del hombre ha generado problemas medioambientales, desarrollo de resistencias y problemas de salud pública. Además, el contexto legislativo de la UE (restricción en el uso de plaguicidas agrícolas, eliminación de ingredientes activos de síntesis) hace necesaria la búsqueda de alternativas de control a nivel agrícola y veterinario.

Las plantas representan una fuente de productos naturales bioactivos eficaces y beneficiosos por su baja persistencia (residuos cero), porque sus extractos, al ser mezclas complejas, impiden el desarrollo de resistencias y porque su producción puede representar una alternativa a cultivos poco productivos y/o de zonas semiáridas.

Las especies del género Dittríchia (mencionado también en muchas publicaciones como Inula) son ruderales y tienen una gran capacidad de propagación. Crecen en campos baldíos, claros de bosques y márgenes de caminos, y generalmente se consideran malas hierbas. Son originarias de la zona mediterránea.

En particular, Dittríchia graveolens es una planta silvestre que crece en distintos lugares del mundo y que en los Estados Unidos y en Australia se considera especie invasora perjudicial para la flora local. La germinación de D. graveolens carece de dormancia, se produce en otoño después de las precipitaciones. En ensayos de laboratorio se ha comprobado que puede germinar en un rango amplio de luz y temperatura. Además, las semillas maduras presentan elevada viabilidad (>80%). Por tanto se trata de una especie oportunista que depende de la precipitación estacional (Brownsey et al., 2013).

Extractos de diversas especies del género Dittríchia {Inula) se han descrito como insecticidas y acaricidas. Por ejemplo, extractos hexánicos de D. viscosa son repelentes de pulgones (incluyendo M. persicae y R. padi), siendo los sesquiterpenos tomentosin e inuviscolide responsables de esta actividad (Mamoci et al., 2012). Extractos orgánicos de /. helenium interfieren con el crecimiento del insecto Oncopeltus fasciatus además de ser antialimentarios (Alexenizer and Dorn, 2007). Eudesmanolidas (alantolactona, isoalantolactona) aisladas de /. helenium son larvicidas frente a Aedes aeypti (Cantrell et al., 2010). El extracto de diclorometano de Inula (Dittrichia) salsoloides y el sesquiterpeno, eupatolide 13-0^-d-glucopiranósido (eupatolide-ll) presentaron toxicidad frente al escarabajo Phyllotreta striolata. Además, el sesquiterpeno inulasaleno mostró repelencia (Bai et al., 2018). Los compuestos inulasalsolin y taraxasterol resultarosn ser los responsables de la toxicidad y efectos antialimentarios del extracto etanólico de /. salsoloides frente al lepdóptero Plutella xylostella, además de ser aficidas frente a Brevicoryne brassicae (Yang and Lin, 2017). El extracto de la raíz de /. racemosa, rica en alantolactona e isoalantolactona, inhibe el crecimiento y consumo de Spodoptera litura, además de aumentar el periodo de desarrollo larvario e inhibir la pupación y la emergencia de adultos (Kaur et al, 2017).

Extractos de éter de petróleo de /. británica son acaricidas frente a Tetranychus cinnabarinus, siendo responsable de esta actividad el palmitato de etilo (Bu et al., 2012; Ma et al., 2012), el lupeol (Ma et al., 2012b) y el estigmsterol (Cheng et al., 2012). De forma similar, se han descrito β-sitosterol, estigmasterol, lupeol (3), y α-amirina como acaricidas en /. japónica frente a T. cinnabarinus (Duan et al., 2012). El ácido cóstico aislado de D. viscosa es efectivo frente al parásito de las abejas Varroa destructor (Sofou et al., 2017).

Otras actividades biológicas descritas para este género incluyen el efecto antifúngico del aceite esencial de D. viscosa (dermatofitos, Candida spp.), siendo el carboxieudesmadieno el responsable de esta actividad (Cafarchia et al., 2002) y de sus extractos orgánicos (hexano, cloroformo y metanol) frente a Trichoderma y Fusarium sp. (Omezzine et al., 201 1 b).

También existen referencias a efectos nematicidas de extractos de Inula/ Dittrichia. Se han ensayado formulaciones de /. viscosa a base de extracto (hexano o hexano-acetona) frente al nematodo fitoparásito M. javanica, siendo efectivos frente a juveniles y reduciendo la formación de quistes en pepino (Oka et al., 2006). El extracto etanólico de D. viscosa tuvo efectos moderados frente a juveniles de M. javanica in vitro (Mamoci et al., 2012). Extractos etanólicos de /. viscosa resultaron tóxicos frente a huevos y juveniles (J1 -J3) del nematodo entomopatógeno Heterorhabditis bacteriophora (Shanti et al., 2017). Además, material vegetal de esta especie presentó efectos in vivo sobre el nematodo en el huésped S. littoralis (Glazer et al., 2015). /. helenium forma parte (8,5%) de una mezcla de hierbas medicinales (Herbmix) que suministrada en la dieta de corderos redujo la dinámica de la infección del nematodo parásito Haemonchus contortus y mejoró los indicadores de producción (Váradyová et al., 2017).

En el caso de Dittrichia graveolens, se ha descrito la actividad fitotóxica de extractos orgánicos y acuosos (Abu-lrmaileh et al., 2015; Omezzine et al., 201 1 a), habiéndose identificado como responsables de esta actividad, en los extractos orgánicos, el ácido ilícico y la 2,3,1 ^,13-tetrahidroaromaticina (Abu-lrmaileh et al., 2015). También se han descrito efectos antioxidantes (Al-Fartosy, 201 1 ) y antifúngicos (Omezzine et al.201 1 b) de sus extractos orgánicos, particularmente del extracto metanólico. El aceite esencial de esta planta se ha descrito como antibacteriano (Guinoseaou et al., 2010), inhibidor de la actividad acetilcolinesterasa (Dohi et al., 20019). El aceite esencial de D. graveolens se ha ensayado frente a la mosca Mayetiola destructor con efectos tóxicos moderados (Lamiri et al., 2001 ) y frente al mosquito Aedes aegypti en ensayos de repelencia y comportamiento sin efectos significativos (Drapeau et al., 2009). Chaieb (201 1 ) cita el aceite de D. graveolens como insecticida en una revisión sin especificar el insecto diana ni la metodología de ensayo. No se han descrito efectos acaricidas o insecticidas para ninguno de los extractos de D. graveolens.

Se ha estudiado la composición química de aceites esenciales de D. graveolens procedente de distintos lugares y partes de la planta, presentando acetato de isobornilo y borneol, T-cadinol y óxido de cariofileno como componentes mayoritarios con algunas variaciones cuantitativas en función del lugar de origen (Boudouda et al., 2013; Ghosn et al., 2006; Blanc et al., 2004). También se ha descrito la presencia de eudesmanolidas, guaianolidas, xanthanolidas, carabrones, ácidos sesquiterpénicos, flavononas, dihidrofalvonoles, y compuestos aromáticos en la composición química de los extractos orgánicos (Abou-Douh, 2008; Topgu et al., 1993; Óksüz and Topgu, 1991 ).

Es conocido que el óxido de cariofileno afecta la supervivencia y fecundidad de Myzus persicae (Petrakis et al., 2014), tiene actividad antialimentaria frente a Spodoptera littoralis y Leptinotarsa decemlineata (Rodilla et al., 2008), tiene efectos larvicidas sobre Anopheles gambiae (Moussavi et al., 2015), Aedes aegypti (Ali et al., 2014) y Spodoptera frugiperda (Cárdenas-Ortega et al., 2015), adulticidas por contacto sobre Lasioderma serricorne (You et al., 2015) y fumigantes sobre Sitophilus zeamais y Triboleum castaneum (Liu et al., 2012). Además este compuesto tiene un gran interés en el control de hormigas desfoliadoras (Boulogne et al., 2012). También se ha descrito como repelente de la garrapata Ixodes ricinus (Ashitani et al., 2015). El α-cadinol tiene actividad antitermita (Chang et al. 2001 a) acaricida frente a Dermatophagoides pteronyssinus (acaro del polvo) (Chang et al., 2001 ), y D. farinae junto al T-cadinol, que tiene menor actividad (Chang et al., 2001 b).

Como se ha comentado previamente, los extractos conocidos hasta ahora obtenidos a partir de D. graveolens son principalmente extractos orgánicos, obtenidos principalmente mediante el uso de compuestos orgánicos para los cuales es conocido un cierto nivel de toxicidad (metanol, cloroformo, hexano...), por lo que es recomendable la eliminación de dichos compuestos antes de su manejo por parte de los seres humanos. Por otra parte, para los extractos acuosos sólo es conocida actividad fitotóxica.

Sería interesante encontrar un método alternativo de obtención de extractos de D. graveolens que no partiera de los disolventes orgánicos habituales, disminuyendo con ello el riesgo de toxicidad. Por otra parte, una preferencia especial sería que dicho método alternativo, optativamente en combinación con etapas posteriores de extracción con uno o más disolventes orgánicos, permitieran llegar a extractos y/o composiciones específicas que mostraran actividades no descritas hasta ahora para los extractos de D. graveolens, particularmente si esas actividades permitieran aplicaciones biocidas no descritas hasta ahora para extractos de esta planta, especialmente actividades no descritas para sus extractos acuosos, tales como nematicidas, ixodicidas o insecticidas.

La presente invención aporta una solución a dicho problema. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método de extracción de compuestos orgánicos de plantas o partes de plantas de Dittrichia graveolens, que comprende las etapas de:

a) recolectar plantas o partes de plantas de la especie D. graveolens para obtener el material vegetal sobre el que se efectúa la extracción; b) someter dicho material vegetal a un proceso de extracción por arrastre de vapor;

c) condensar el vapor obtenido en un condensador;

d) dejar que se separen las fases orgánica y acuosa;

e) recoger separadamente la fase orgánica superior y la fase acuosa situada por debajo de ella y, opcionalmente, una posible fase inferior situada bajo la fase acuosa;

f) opcionalmente, someter la fase acuosa obtenida a un proceso de extracción con un disolvente orgánico y recoger el extracto orgánico obtenido; y en el que la extracción se lleva a cabo a una presión de 50 kPa a 190 kPa.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un extracto obtenido por el método anterior, el método de la invención.

En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de un extracto de la invención como biocida. Preferiblemente, el uso se elegirá entre uso como acaricida, ixodicida, insecticida o nematicida.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 se refiere al proceso de extracción efectuado sobre Dittrichia graveolens:

La Fig. 1 a muestra el esquema de extracción efectuado. Las abreviaturas que comienzan con las letras "DgC" se refieren a fracciones obtenidas habiendo realizado la extracción inicial en un aparato de Clevenger; las que comienzan con las letras "DgP" se refieren a fracciones obtenidas habiendo realizado la extracción inicial en una planta piloto. En concreto: DgCAe: Aceite esencial proveniente del Clevenger; DgCH: hidrolato proveniente del Clevenger; DgCI: fase inferior de compuestos inmiscibles en agua pero de densidad superior a la del agua; DgCHO: fracción orgánica obtenida tras extraer el DgCH con DCM (diclorometano); DgCHR: residuo obtenido tras extraer el DgCH con DCM; DgPAe: DgCAe: Aceite esencial proveniente de planta piloto; DgPH: hidrolato proveniente de planta piloto; DgPHO: fracción orgánica obtenida tras extraer el DgPH con DCM (diclorometano); DgPHR: residuo obtenido tras extraer el DgPH con DCM.

- La Fig. 1 b es una esquematización de una planta de extracción como la utilizada con Dittrichia graveolens sobre la cual se indican los distintos elementos implicados: el vaso destilador (la cámara de destilación), los condensadores y el decantador (el recipiente de decantación). El vapor de agua proviene del depósito de agua anexo ligado a un generador de presión. Aparece también unos elementos opcionales adicionales (un vaso de extracción y un depósito de solvente) que permiten el acoplamiento de la extracción de vapor con métodos de extracción adicionales opcionales o alternativos a la extracción con vapor.

La Fig. 2 muestra curvas de repelencia del aceite esencial obtenido por hidrodestilación en Clevenger (DgCAe14LG, gráfico superior) o en planta piloto (DgPAe14LG, gráfico intermedio) y de la fracción orgánica del hidrolato de planta piloto (DgPH014LG) obtenidos de plantas de D. graveolens recolectadas en 2014 en la finca La Garganta, sobre adultos de H. lusitanicum. La repelencia se expresa en porcentaje sobre el valor máximo, % RP.

La Fig. 3 muestra un gráfico de barras referido a la inhibición de la capacidad de infección de de juveniles de segunda edad (J2) del nematodo Meloidogyne javanica tratados con la dosis LC ₅₀ del hidrolato DgCH (0,052mg/ml). Se muestran los resultados de los dos ensayos realizados en raíces de tomate.

La Fig. 4 muestra la fórmula deducida para el compuesto 3 aislado del aceite esencial de D. graveolens (panel a), fórmula en la que se indica la asignación de los datos de desplazamientos observados en los resultados de 1 H-RMN y 13C-RMN (panel b), así como los espectros de 1 H-RMN y 13C-RMN (paneles c y d, respectivamente).

La Fig. 5 muestra la fórmula del T-cadinol, identificado como el compuesto 4 aislado del aceite esencial de D. graveolens (panel a), fórmula en la que se indica la asignación de los datos de desplazamientos observados en los resultados de 1 H-RMN y 13C-RMN (panel b), así como el espectro de 13C-RMN (panel c).

La Fig. 6 muestra la fórmula del óxido de piperitenona, identificado como el compuesto 5 aislado del aceite esencial de D. graveolens (panel a), fórmula en la que se indica la asignación de los datos de desplazamientos observados en los resultados de 1 H-RMN y 13C-RMN (panel b), así como el espectro de 13C-RMN (panel c).

La Fig. 7 muestra el esquema de fraccionamiento del aceite esencial de D. graveolens. El asterisco indica que el rendimiento se calculó a partir de la cantidad de compuesto obtenido de la fracción 8.

La Fig. 8 muestra la repelencia de la fracción VLC 7 sobre adultos de H. lusitanicum, expresada como porcentaje de la repelencia. (%RP).

La Fig. 9 muestra las estructuras de los compuestos identificados (1 , 2, 7, 6) o aislados (5, 3, 4) de la fracción VLC7, y la Piperitenona (8) de la DgPHO.

La Fig. 10 muestra la repelencia de los compuestos óxido de cariofileno (6), T-cadinol (4), borneol (2) y carvacrol (7) sobre adultos de H. lusitanicum expresado en porcentaje de repelencia (%RP). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En este trabajo se ha seleccionado D. graveolens, abundante en la flora espontánea de muchos puntos de España, para su estudio como fuente de agentes biocidas frente a nematodos, ácaros, e insectos de importancia económica.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "biocida" incluye cualquier producto, compuesto o composición que está destinado o que es capaz de destruir, contrarrestar, neutralizar, impedir la acción o ejercer un control de otro tipo sobre cualquier organismo considerado nocivo para el hombre. La definición, por tanto, incluye no sólo microorganismos como bacterias, levaduras o protozoos, sino también plantas y metazoos (eucariotas heterótrofos pluricelulares y tisulares). Así, el término biocida, tal como se utiliza en la presente solicitud, tiene un significado muy próximo a la definición del término "plaguicida" dada por la FAO {Food and Agricultura! Organization: Organización para la Alimentación y la Agricultura), que es: cualquier sustancia destinada a prevenir, destruir, atraer, repeler o combatir cualquier plaga, incluidas las especies indeseadas de plantas o animales, durante la producción, almacenamiento, transporte, distribución y elaboración de alimentos, productos agrícolas o alimentos para animales, o que pueda administrase a los animales para combatir ectoparásitos. A diferencia de dicha definición de la FAO, y para los efectos de la presente invención, la definición de biocida incluye también la posible administración a seres humanos para combatir infecciones o parásitos internos y no está necesariamente ligada a su uso durante la producción, almacenamiento, transporte, distribución y elaboración de alimentos, productos agrícolas o alimentos para animales, sino que se incluye también la aplicación en cualquier otra industria o incluso en el campo veterinario o clínico.

Por su parte, el término "plaga" se utiliza en la presente memoria en un sentido muy próximo al de su definición en el Diccionario de la Real Academia, refiriéndose a la presencia masiva de una especie de ser vivo (animal, vegetal o microorganismo), que se encuentra en tal densidad que pueden llegar a dañar o ser una amenaza para el bienestar de poblaciones humanas, animales o vegetales. El animal que constituye la plaga puede ser cualquier metazoo, incluidos insectos, arácnidos o nematodos. El término "poblaciones animales", por su parte, incluye a los animales criados y mantenidos por seres humanos para la obtención de alimento y/o de otros artículos de consumo o para ayudar en distintas labores.

El término "acaricida", tal como se utiliza en la presente solicitud, incluye cualquier producto, compuesto o composición que está destinado o que es capaz de destruir, contrarrestar, neutralizar, impedir la acción o ejercer un control de otro tipo sobre cualquier organismo de la subclase Acari que pertenece concretamente a uno de los siguientes superórdenes de dicha subclase: el superorden de los Acariformes (que incluye los organismos a los que comúnmente se denomina ácaros), el de los Opilioacariformes o el de los Parasitiformes (que incluye, dentro del orden Ixodida, a las especies a las que comúnmente se conoce como garrapatas). Por su parte, los términos "ixodicida" y "garrapaticida" se utilizan como sinónimos y como un caso especial dentro de los acaricidas, pues se refieren a cualquier producto, compuesto o composición que está destinado o que es capaz de destruir, contrarrestar, neutralizar, impedir la acción o ejercer un control de otro tipo sobre cualquier organismo del orden Ixodida. Dicha definición incluye, como se ve, tanto la capacidad de "matar" o "destruir" las garrapatas como la capacidad de impedir su acción por actuar como repelente. En localizaciones posteriores de la presente memoria se distingue entre ambas actividades específicas. Para evitar confusiones, en distintos puntos de la presente memoria se alude también al uso para o la capacidad de controlar plagas de organismos del orden Ixodida para incluir ambas actividades.

El término insecticida se refiere a cualquier producto, compuesto o composición que está destinado o que es capaz de destruir, contrarrestar, neutralizar, impedir la acción o ejercer un control de otro tipo sobre cualquier organismo de la clase Insecta de animales invertebrados artrópodos, es decir, los animales comúnmente conocidos como insectos. Los animales de dicha clase se caracterizan por presentar un par de antenas, tres pares de patas y un máximo dos pares de alas (que pueden ser un solo par o estar ausentes). Aunque hay distintas clasificaciones para dividir los organismos de la clase Insecta, comúnmente se consideran incluidos en ella, entre otros, los órdenes con mayor número de especies dentro de dicha clase: los de los coleópteros (escarabajos), dípteros (como las moscas), himenópteros (como las abejas y las hormigas) y lepidópteros (mariposas y polillas), así como también otros como los hemípteros (las chinches, por ejemplo). A este último orden pertenecen también los insectos fitopatógenos de la familia Aphidoidea, que es la de los áfidos o pulgones. Como en el caso del término ixodicida, el término insecticida incluye tanto la capacidad de "matar" o "destruir" insectos como la capacidad de impedir su acción por actuar como repelente. En localizaciones posteriores de la presente memoria se distingue entre ambas actividades específicas. Para evitar confusiones, en distintos puntos de la presente memoria se alude también al uso para o la capacidad de controlar plagas de insectos para incluir ambas actividades

El término nematicida se refiere a cualquier producto, compuesto o composición que está destinado o que es capaz de destruir, contrarrestar, neutralizar, impedir la acción o ejercer un control de otro tipo sobre cualquier organismo del filo Nematoda, es decir, los invertebrados también conocidos como nematodos, nematodos o nematelmintos y que vulgarmente se denominan también gusanos redondos. Se trata de organismos esencialmente acuáticos, aunque también existen en ambientes terrestres. Entre las especies que pertenecen a este filo, las hay de vida libre, tanto en ámbitos acuáticos como en el suelo, pero también especies parásitas de plantas y animales, incluido el hombre, en el que provocan enfermedades como la triquinosis (causada por especies del género Tríchinellá) o la anisakiasis (provocada por larvas del género Anisakis). Análogamente a los términos anteriormente definidos, el término nematicida incluye tanto la capacidad de "matar" o "destruir" nematodos como la capacidad de impedir su acción por actuar como repelente. En localizaciones posteriores de la presente memoria se distingue entre ambas actividades específicas. Para evitar confusiones, en distintos puntos de la presente memoria se alude también al uso para o la capacidad de controlar nematodos para incluir ambas actividades, principalmente en lo que se refiere a su posible uso en el sector agrícola. Dada la importancia de algunas de las enfermedades provocadas por nematodos, se considera también su uso terapéutico para seres humanos y/o animales, aunque en ese caso se prefiere aludir a dicho uso como uso para la preparación de un medicamento destinado a tratar una enfermedad o alteración de la salud provocada por un nematodo.

En cuanto a las técnicas empleadas debe comentarse que, tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende por extracción por arrastre de vapor, aplicado sobre plantas o partes de plantas, el proceso en el cual el material vegetal se pone en contacto con vapor de agua, generalmente proveniente de una caldera anexa. Cuando el vapor de agua entra en contacto con el material vegetal, hace que los compuestos volátiles, que generalmente tienen un punto de ebullición más bajo que el agua, se vaporicen y sean arrastrados juntos con el vapor a un condensador, donde se condensan junto con el vapor de agua, recogiéndose todo ello en un separador, tal como un tanque de decantación. Habitualmente, el producto inmediato del proceso es un sistema en dos fases de agua y un destilado orgánico, en el que habitualmente se encuentran compuestos de densidad menor que el agua y que quedan por encima de ella tras un tiempo de reposo, lo que permite separar los componentes por decantación, reparto u otros métodos. A la fase orgánica de menor densidad se la conoce por lo general como "aceites esenciales" (término que se utiliza en la presente memoria), pues la extracción por arrastre de vapor fue un método muy usado para extraer ese tipo de compuestos de plantas y utilizarlos, por ejemplo, en perfumería. La fase acuosa inferior se suele denominar hidrosol o hidrolato (término utilizado en la presente memoria), y a menudo contiene también compuestos orgánicos de interés, que pueden ser extraídos por otros métodos, como puede ser el uso de disolventes orgánicos (Dellacassa, 2010).

Tal como se utiliza en la presente memoria, se considera como una variante de la extracción por arrastre de vapor la llamada hidrodestilación, que es el proceso en el que el material se sumerge y empapa de agua durante un tiempo, tras el cual se calienta la mezcla hasta el punto de ebullición del agua, con lo que los compuestos orgánicos volátiles son arrastrados por el vapor, condensándose en otro recipiente y dando lugar igualmente a una fase orgánica de aceites esenciales y un hidrolato. A escala de laboratorio, es habitual llevar a cabo el arrastre de vapor mediante esta variante de la técnica, siendo muy común el uso de un aparato conocido como Clevenger (acogido a la farmacopea Europea). Esta técnica y el mencionado aparato se utilizaron en fases preliminares del desarrollo de la presente invención; su aplicación es compatible con el método de la presente invención, de forma que se consideran posibles realizaciones del método de la presente invención aquellas en las que la etapa inicial de extracción inicial por arrastre de vapor se lleva a cabo en un aparato tipo Clevenger. La aplicación del método al material vegetal de D. graveolens da lugar a una fase superior de aceites esenciales, a la que se alude a menudo en la presente memoria como "aceites esenciales de Clevenger" o DgCAe, una fase acuosa que se sitúa por debajo de esta, a la que se alude a menudo en la presente memoria como "hidrolato de Clevenger" o DgCH, y una fase inferior de compuestos inmiscibles en agua pero de densidad superior a la del agua (que sólo aparece en la extracción por Clevenger), que se conoce también como agua de infusión y a la que se alude en lo sucesivo mediante la abreviatura DgCI.

El término "extracto", por su parte, tal como se utiliza en la presente memoria, incluye cualquiera de las fases o fracciones que se obtienen en una etapa del método de extracción de la invención. Por tanto, están incluidos dentro del término extracto tanto la fase orgánica de densidad inferior (fase de aceites esenciales) como la fase acuosa inferior (hidrolato) resultante de la etapa inicial de extracción por arrastre de vapor, así como también las dos fases (la fase orgánica y la fase residual que se separa de la misma) que resultan de la etapa posterior opcional de extracción de compuestos orgánicos presentes en el hidrolato, bien mediante tratamiento con un disolvente orgánico, preferiblemente diclorometano, o bien mediante extracción con un sólido, ligada por ejemplo a carbón activo, la cual, tras el proceso de filtración y la extracción de carbón activo, es la que da lugar a un extracto de menor volumen. Cualquiera de dichos extractos, obtenidos por la aplicación del método de la presente invención, se considera un extracto de la presente invención. En la presente solicitud se describe, por primera, la obtención de un aceite esencial y un hidrolato de arrastre de vapor de Dittrichia graveolens, en planta piloto. Esto supone una importante diferencia con los procesos de extracción efectuados hasta ahora sobre plantas o partes de plantas de D. graveolens, basados principalmente en la utilización de disolventes orgánicos en la fase inicial del proceso de extracción. Realizar la primera extracción por arrastre de vapor evita (al menos en la primera etapa), el uso de sustancias que a menudo son nocivas para la salud de los operarios y que, con frecuencia, suele ser necesario o conveniente eliminar antes de proceder al uso de los extractos obtenidos, eliminación que no siempre se puede garantizar que sea total. Además, la capacidad de extracción de un disolvente líquido (ya sea un disolvente orgánico o el agua), depende principalmente de la solubilidad que puedan tener las sustancias contenidas en el material de partida en dicho disolvente, por lo que algunos disolventes orgánicos dan lugar a la extracción de un número muy reducido de compuestos, o incluso uno solo, pudiendo ser igualmente muy reducidas las posibles aplicaciones del extracto orgánico obtenido. En ocasiones sucede también que algunos compuestos de interés reaccionan con el disolvente orgánico, sufriendo modificaciones, lo que da lugar a cambios que modifican su estructura química y, con ello, modifican sus propiedades, que pueden ser diferentes a las que presentan en el material de partida, que es en este caso las plantas o partes concretas de la misma. Por ello, la extracción por arrastre de vapor, hasta ahora no aplicada a D. graveolens, puede considerarse ventajosa respecto a los métodos de extracción con distintos disolventes orgánicos hasta ahora aplicados, especialmente si se tiene particular interés en la extracción de volátiles. Puede considerarse también ventajosa respecto a la extracción con agua líquida, pues el vapor consigue arrastrar compuestos orgánicos insolubles en agua cuyo punto de ebullición puede ser superior al de la propia agua y que consiguen extraerse del material vegetal de partida a una temperatura inferior a la temperatura a la que ocurre su descomposición.

En el Ejemplo 1 de la presente invención se describen realizaciones del método de la presente invención llevadas a cabo en un aparato tipo Clevenger ("hidrodestilación de Clevenger"), en el laboratorio, y ensayos llevados a cabo después en una planta piloto, a escala industrial, en una instalación de mayores dimensiones que incluye, entre otros elementos, una caldera en la que se genera el vapor que es conducido al recipiente en el que está el material vegetal, para que se produzca el fenómeno de arrastre de compuestos orgánicos. La Fig. 1 b muestra un esquema de lo que sería una instalación de una planta industrial de destilación adecuada para llevar a cabo el método de la invención, planta que en este caso incluye, además, elementos adicionales que permitirían acoplar la extracción por arrastre de vapor a métodos alternativos o complementarios de extracción. Por su mayor capacidad, se prefiere que el método de la invención se lleve a cabo en este tipo de instalaciones, que presentan una caldera o calderín anexo en el que se genera el vapor, con preferencia a la hidrodestilación en la que el vapor se genera a partir del agua presente en el mismo recipiente que el material vegetal, especialmente si se realiza a pequeña escala en aparatos tipo Clevenger. Preferiblemente, la planta industrial de destilación comprende una cámara de destilación (o un vaso destilador) y un recipiente de decantación.

La extracción con vapor en una planta industrial se lleva a cabo en condiciones similares a las utilizadas en los Ejemplos 1 y 2 de la presente solicitud, a una presión de entre 50 kPa y 190 kPa, que es un rango de presión adecuado para D. graveolens. Se tiene preferencia porque el valor sea de al menos 90 kPa y, más preferiblemente, de al menos 130-140 kPa, pues el aumento de la presión, según los ensayos realizados, aumenta el rendimiento en aceites esenciales y facilita la extracción. Otra posible realización preferida es aquella en la que la extracción se realiza en dos fases de presión: una fase inicial a 60 - 70 kPa, y una segunda fase a 80 - 120 kPa. La duración del proceso de extracción de la biomasa (el material vegetal, generalmente sin secar) con vapor puede ser, por ejemplo, de una hora, como en los Ejemplos 1 y 2 de la presente solicitud, durante la cual, como se acaba de mencionar, el valor de presión puede ser el mismo, o pueden establecerse tramos en los que se utilicen valores diferentes de presión, pudiendo ser cada tramo de igual duración (como en el Ejemplo 2) o diferente. Es también compatible con el método de la presente invención y queda comprendido dentro de su alcance que la duración del proceso de extracción del material vegetal tenga una duración mayor o menor que una hora.

Concretamente, en los Ejemplos mostrados en la presente solicitud, el material vegetal utilizado fueron partes aéreas - hojas y tallos- de la planta, recolectados durante la etapa de floración y sometidos a secado. Las plantas utilizadas fueron siempre plantas que habían crecido en la Península Ibérica. Los ensayos iniciales llevados a cabo con partes aéreas de plantas recolectadas en distintos puntos de la finca La Garganta, así como con el testigo (partes de plantas recolectadas en Jaca) mostraron que cualquiera de las muestras podía utilizarse para llevar a cabo el método de la invención. El método de la invención puede también aplicarse sobre plantas domesticadas en zonas de la Península Ibérica distintas a las anteriores, (como muestran los ensayos realizados con las plantas que se están cultivando en Ejea de los Caballeros, Zaragoza), dando lugar a resultados similares, químicamente, a los obtenidos con las plantas silvestres. Tal como se describe más adelante en la sección de Ejemplos de la presente memoria, se realizaron ensayos de actividad biocida con los extractos obtenidos de la extracción por arrastre de vapor efectuada sobre el material vegetal de D. graveolens, o con composiciones preparadas a partir de dichos extractos. Sorprendentemente, los extractos obtenidos, particularmente las fases de aceites esenciales, demostraron una potente actividad biocida, particularmente acaricida e insecticida. Por tanto, el método de la presente invención permite llegar a extractos que presentan actividades no descritas hasta ahora para extractos de D. graveolens. Por ello, los extractos obtenidos por aplicación del método de la invención constituyen también un aspecto de la presente invención, así como las composiciones que comprenden al menos uno de dichos extractos o que se preparan incluyendo al menos uno de dichos extractos en su formulación.

Tal como se utiliza en la presente invención, se considera que una composición comprende un extracto de la presente invención cuando el extracto es uno de los componentes que forma parte de la formulación de la composición. Son realizaciones de interés de las composiciones de la presente invención aquellas que comprenden uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, y/o excipientes aceptables o de uso común en los sectores veterinario o agronómico. También son realizaciones de interés de las composiciones de la presente invención las que comprenden surfactantes, entendiendo como tales las sustancias tensioactivas que tienen un efecto sobre la tensión superficial en la superficie de contacto entre dos fases, que muy frecuentemente son una fase acuosa y una fase lipídica, y las que comprenden coadyuvantes, que pueden estar en combinación con los surfactantes y/o con uno o más de los excipientes antes citados. Tal como se utiliza en la presente solicitud, se denomina coadyuvantes los coadyuvantes tecnológicos, es decir, las sustancias que se añaden a una composición tanto para facilitar su preparación (por ejemplo, emulsionantes, gelificantes ), como para facilitar la estabilidad de la misma. Otra posible realización de las composiciones de la invención, compatible y combinable con cualquiera de las anteriores, son aquellas composiciones que comprenden también uno o más extractos de otra planta (una planta de una especie distinta de D. graveolens) o de varias plantas distintas, entendiendo en como extractos los obtenidos por cualquier método de extracción, no solo mediante extracción con vapor.

El uso como biocidas de los extractos de la presente invención o de las composiciones preparadas a partir de ellos es también otro aspecto de la presente invención. Dentro de dicho uso, y dado que las especies con las que se han realizado los ensayos son plagas que dan lugar a pérdidas económicas en el sector agrícola en general, y especialmente en los cultivos hortícolas, los extractos de la invención, o las composiciones que los contienen o se preparan incluyéndolos en su formulación, se presentan como apropiados para su uso como plaguicidas en el sector agrícola en general y, especialmente, en el sector hortícola en particular.

Más concretamente, en la presente memoria se describe por primera vez la actividad acaricida, especialmente ixodicida (frente a varias especies de garrapatas) y repelente (de garrapatas y pulgones) del aceite esencial y de la fracción orgánica del hidrolato de la planta silvestre y de la planta cultivada de D. graveolens, así como la actividad postingestiva insecticida (probada en lepidópteros) de la fracción orgánica del hidrolato y la actividad antialimentaria frente a pulgones del aceite esencial y de la fracción orgánica del hidrolato. Por ello, son realizaciones preferidas de la invención aquellas en las que se elige entre el aceite esencial y la fracción orgánica del hidrolato como el extracto que se usa bien como ixodicida o bien para el control de pulgones, especialmente como repelente de los mismos. Dado que los ensayos se han realizado con diluciones de dichos extractos, añadiendo en algunos casos compuestos adicionales, se entiende que quedan comprendidos también dentro del alcance de la invención los usos que se realizan con las composiciones que comprenden uno o más extractos de la invención.

Respecto a la composición de los extractos obtenidos, debe comentarse que los compuestos que caracterizan el extracto de aceites esenciales, como puede verse en el Tabla 13, son, teniendo en cuenta su abundancia relativa (p/p)

- acetato de endobornilo, que es el compuesto mayoritario, y cuya abundancia relativa oscila entre 73,0% y 86,5%, (considerando todos los extractos de aceites esenciales analizados)

- borneol, cuya abundancia relativa oscila entre 3,5% y 8,57% (considerando todos los extractos de aceites esenciales analizados)

Así, puede considerarse que un extracto que comprenda acetato de endobornilo en una abundancia relativa de entre 73,0% y 86,5%, y borneol en una abundancia relativa entre 3,5% y 8,57% será un extracto de la presente invención, pues será un extracto obtenible por el método de la presente invención. Merece destacarse el alto contenido en acetato de endobornilo, pues es un compuesto con interés industrial, tanto en la industria de perfurmería, como aditivo alimenticio, como saborizante en la industria tabacalera e incluso como espasmolítico, calmante, antiinflamatorio, analgésico y antibacteriano.

En los extractos de aceites esenciales presentes en dicha Tabla 13 puede observarse también la presencia de: T-cadinol, carvacrol, óxido de cariofileno, β-pineno y γ-cadinene, por lo que el extracto de la invención que contenga acetato de endobornilo y borneol contendrá preferiblemente también al menos uno de dichos compuestos. De ellos, se prefiere la presencia de T-cadinol, por ser uno de los compuestos que se ha visto en los ensayos que parece estar implicado en la actividad de control de especies del orden Ixodida, tanto como repelente como compuesto causante de mortalidad en individuos de dicha especie. Su abundancia relativa puede ser, por ejemplo, la que figura en una de las columnas de la Tabla 13, de 1 ,2% a 5,03%. Un ejemplo de composición de un extracto de D. graveolens según la invención puede ser, por ejemplo, la de ese extracto de la Tabla 13, es decir, un extracto que comprende: acetato de endobornilo en una abundancia relativa de 84,6 a 86,5%, borneol en una abundancia relativa de 5,6% a 6,4%, canfeno en una abundancia relativa de 1 ,4% a 4,3%, y β-t-cariofileno en una abundancia relativa de 1 ,2% a 1 ,7%. Como se puede ver en dicha Tabla, y como demuestran los estudios de composición adicionales, el extracto puede comprender también otros compuestos y puede haber variaciones en la abundancia relativa, que, como es de esperar, parece mostrar variaciones según las estaciones y porque, además, hay compuestos que parecen estar en cantidades traza (abundancia relativa igual o menor a 0,1 %) y que son difíciles de detectar mediante determinadas técnicas, pero que, según se demuestra en los estudios de asignación de actividad que también se muestran en la presente solicitud, tienen su influencia en la actividad de los extractos. Y dado que el extracto de aceites esenciales presenta tanto actividad ixodicida como de repelencia de áfidos o pulgones debido, por una parte, al hecho de que comprende óxido de piperitenona, T-cadinol, carvacrol, óxido de cariofileno, y también borneol, además de T-cadinol, se prefiere que un extracto de la invención comprenda al menos un compuesto del grupo de T-cadinol, óxido de piperitenona, carvacrol, óxido de cariofileno y 3-metilbutanoato de (Z)-3,7- dimetil-6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo, o combinaciones de los mismos, además de otros posibles compuestos. Y, dado que la capacidad de provocar la mortalidad de individuos de especies del orden Ixodida parece deberse a un efecto sinérgico entre esos compuestos (pues las cantidades de cada uno de ellos en los ensayos realizados parece indicar que esto es así), se prefiere que un extracto de la invención comprenda T-cadinol, óxido de piperitenona, carvacrol, óxido de cariofileno y 3-metilbutanoato de (Z)-3,7- dimetil-6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo, pudiendo estar cada uno de ellos en cantidades traza.

Las condiciones anteriores respecto a la composición de un extracto se observan en extractos de aceites esenciales de D. graveolens obtenidos por el método de la presente invención, luego el extracto anterior puede ser un extracto de aceites esenciales obtenido por el método de la presente invención. Es interesante insistir en que el estudio de caracterización de los compuestos presentes en los extractos y de la actividad de los mismos permitió identificar el óxido de piperitona, T-cadinol, carvacrol, 3-metilbutanoato de (Z)-3,7-dimetil-6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo y óxido de cariofileno como los componentes ixodicidas, con capacidad de matar animales del orden Ixodida, del aceite esencial, con ese orden de potencia, aunque están presentes en cantidades pequeñas o traza en el aceite esencial e incluso en las diluciones del mismo utilizadas en los ensayos, por lo que se concluyó que la actividad ixodicida del aceite esencial se debe a una acción sinergista de esos componentes; por su parte, la repelencia del aceite esencial sobre garrapatas parece deberse principalmente al borneol y también al acetato de bornilo, sin descartar la contribución de otros compuestos minoritarios. Este efecto sinérgico entre compuestos difiere de las atribuciones de actividad realizadas hasta ahora, donde las actividades que se encontraban en distintos extractos eran generalmente atribuidas a un compuesto en concreto, lo que hace especialmente sorprendentes los hallazgos encontrados. Así, se tiene especial preferencia por que el extracto o composición del mismo que se use como acaricida o ixodicida, para el control de especies del orden Ixodida, sea entre un extracto de D. graveolens que comprende óxido de piperitenona, T-cadinol, carvacrol, 3-metilbutanoato de (Z)-3,7-dimetil-6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo y óxido de cariofileno, o combinaciones de los mismos, y/o un extracto que comprende borneol, preferiblemente en combinación con los anteriores, pues ello permite el uso de dicho extracto tanto para matar animales del orden Ixodida, como también repelerlos. Por ello, un uso preferido de los extractos obtenibles por el método de la presente invención que cumplen esa característica y, en concreto, del aceite esencial obtenido por el método de la presente invención (que comprende óxido de piperitenona, T-cadinol, carvacrol, 3-metilbutanoato de (Z)-3,7-dimetil-6-oxoocta-2,7-dien- 1 -ilo y óxido de cariofileno y también borneol), es su uso como ixodicida tal como se ha definido previamente este término al comienzo de la presente sección. También es una posible realización de la presente invención que el extracto que se usa como ixodicida sea la fracción orgánica del hidrolato, pues presenta también actividad ixodicida, destacando en él la repelencia de garrapatas.

Por otro lado, dado que el T-cadinol, como se ha mencionado previamente, aparece como uno de los compuestos responsables de la repelencia frente a pulgones del aceite esencial de D. graveolens. Así, de nuevo, se tiene especial preferencia por que el extracto, o composición del mismo, que se use para el control de una especie de áfido o pulgón sea un extracto que comprenda T-cadinol. Así, el aceite esencial presenta tanto actividad ixodicida como de repelencia de áfidos o pulgones debido, por una parte, al hecho de que comprende óxido de piperitenona, T- cadinol, carvacrol, 3-metilbutanoato de (Z)-3,7-dimetil-6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo y óxido de cariofileno, y también borneol. Por ello, un aspecto de la presente invención es un extracto de D. graveolens, obtenible por el método de la presente invención, que comprende óxido de piperitenona, T-cadinol, carvacrol y óxido de cariofileno y opcionalmente borneol. Dicho extracto puede ser el extracto de aceites esenciales obtenido por el método de la presente invención. Dicho extracto podrá usarse como ixodicida, en el control de especies del orden Ixodida, tanto cuando el control busca la destrucción de los individuos (el tipo de control al que más comúnmente se alude al hablar de garrapaticida), como también como repelente (en el caso de estar presente el borneol); debido a la presencia del T-cadinol, el extracto puede usarse también en el control de áfidos, preferentemente como repelente de los mismos.

Así, son posibles usos del extracto de aceites esenciales:

a) ixodicida, por lo que puede utilizarse para el control de especies del orden Ixodida (garrapatas), tanto repeliéndolas como provocando su mortandad;

b) insecticida, particularmente con actividad repelente de pulgones (áfidos) y con actividad antialimentaria contra los mismos, por lo que se prefiere su uso insecticida para el control de áfidos.

En el caso de la fase orgánica del hidrolato, los altos niveles de borneol (entre 34,93% y 50,10% de abundancia relativa, según puede verse en la Tabla 13) explican parte de la actividad ixodicida, aunque no se descarta la contribución de otros compuestos. La actividad ixodicida y la actividad antialimentaria frente a pulgones es una de las actividades que comparte la fase orgánica del hidrolato con el extracto de aceites esenciales. Pero, en las diferencias en su composición con la composición del extracto de aceites esenciales, destaca no sólo el mayor contenido de borneol en la fase orgánica del hidrolato, sino también el menor contenido de acetato de endobornilo (abundancia relativa de 17,92% a 47,59%). Dependiendo del año de recolección y las condiciones de crecimiento, el contenido de borneol puede ser aproximadamente igual (44,70% frente a 47,59%) o hasta casi tres veces mayor (50,10% frente a 18,40%) que el de acetato de endobornilo, caso este último que corresponde con la fase orgánica del hidrolato obtenida de la planta cultivada en Ejea de los Caballeros. Dado que esos dos compuestos, y su abundancia relativa, parecen ser los que caracterizan a la fase orgánica del hidrolato, puede considerarse que un extracto que comprenda acetato de endobornilo en una abundancia relativa de entre 34,93% y 50,10%, y borneol en una abundancia relativa entre 17,92% a 47,59% será un extracto de la presente invención, pues será un extracto obtenible por el método de la presente invención, y cuya composición puede ayudar a diferenciar no sólo unos extractos de otros sino, también, a diferenciar plantas de D. graveolens de distintos orígenes geográficos, para lo cual también puede ser el extracto de aceites esenciales. Merece destacarse el alto contenido en borneol, no sólo porque parece ser el principal responsable de la capacidad ixodicida (principalmente de repelencia de garrapatas), sino por las diferentes actividades adicionales que se conocen de este compuesto.

En las composiciones de fases orgánicas de hidrolatos obtenidos por el método de la presente invención y presentes en la Tabla 13 puede observarse también la presencia de otos compuestos, como: p-cimen-a-ol, p-menta-1 ,5-dien-8-ol, timol, carvacrol, piperitenona, óxido de piperitenona y algunos compuestos en principio no identificados (que aparecen en la Tabla con los datos de 13C-RMN del compuesto), por lo que el extracto de la invención con alto contenido en borneol contendrá preferiblemente también al menos uno de dichos compuestos. De ellos, se prefiere la presencia de piperitenona (por su actividad frente a garrapatas y su actividad antialimentaria frente a S. littoralis), carvacrol y/o timol (estos últimos, por actividad frente a garrapatas y nematodos) (ver sección 4.3 del Ejemplo 3). Un ejemplo de composición de un extracto de D. graveolens según la invención puede ser, por ejemplo, la de la fracción orgánica del hidrolato de la Tabla 13 obtenida a partir de plantas cultivadas en Ejea de los Caballeros, es decir, un extracto que comprende: acetato de endobornilo en una abundancia relativa 18,40% (p/p), borneol, en una abundancia relativa de 50,10% (p/p), p-cimen-a-ol, en una abundancia relativa de 1 ,22% (p/p), p-menta-1 , 5-dien-8-ol, timol, en una abundancia relativa de 3,35% (p/p), carvacrol, en un abundancia relativa de 7,50% (p/p), el compuesto caracterizado por el espectro de 13C-RMN con los datos: 94/79/59/43/93/95/41/97/77/91 , en una abundancia relativa de 9,71 % (p/p), el compuesto caracterizado por el espectro de 13C-RMN con los datos 59/94/79/43/95/93/77/58/137/41 , en una abundancia relativa de 8,65% (p/p). Como se puede ver en dicha Tabla, y como demuestran los estudios de composición adicionales, el extracto puede comprender también otros compuestos y puede haber variaciones en la abundancia relativa, que, como es de esperar, parece mostrar variaciones según las estaciones, por lo que la composición anterior es sólo una composición orientativa, que se indica por claridad. De nuevo, los datos posteriores de análisis de composición reflejados en el Ejemplo 4 de la presente solicitud indican que hay compuestos que parecen estar en cantidades traza (abundancia relativa igual o menor a 0,1 %) y que son difíciles de detectar mediante determinadas técnicas, pero que, según se demuestra en los estudios de asignación de actividad que también se muestran en la presente solicitud, tienen su influencia en la actividad de los extractos. Como las condiciones anteriores respecto a la composición de un extracto se observan en fracciones de hidrolatos de D. graveolens obtenidos por el método de la presente invención, el extracto que se ha estado definiendo inmediatamente antes atendiendo a su composición puede ser la fracción orgánica de un hidrolato obtenido por el método de la presente invención, concretamente por la realización del método que incluye la etapa de extracción del hidrolato con diclorometano, recogiéndose la fase orgánica extraída.

En la presente solicitud también se describe por primera vez la actividad nematicida (demostrada sobre el nematodo fitopatógeno Meloidogyne javanica y sobre el nematodo parásito de animales Teladorsagia circumcincta, que es un nematodo gastrointestinal ovino) de la fracción orgánica del hidrolato, por lo que son posibles realizaciones preferidas de la invención aquellas en las que se usa un extracto de D. graveolens como nematicida, con especial preferencia por su uso en el sector agrícola, particularmente cuando se usa la fracción orgánica del hidrolato y/o una composición preparada a partir del mismo y/o cuando se intenta controlar una o más especies del género Meloidogyne, muy especialmente M. javanica, o un nematodo parásito de animales, tal como Teladorsagia circumcincta.

Así, son posibles usos de la fracción orgánica del hidrolato los siguientes:

a) nematicida, demostrada tanto sobre nematodos fitopatógenos como los del género Meloidogyne (muy especialmente M. javanica), como frente a parásitos de animales, como pueden ser parásitos gastrointestinales, tales como Teladorsagia circumcincta. En este último caso, se ha visto actividad ovicida y larvicida. La actividad larvicida es compartida por el hidrolato

b) ixodicida, por lo que puede utilizarse para el control de especies del orden Ixodida (garrapatas)

c) insecticida, particularmente con actividad repelente de pulgones (áfidos), actividad antialimentaria contra pulgones (áfidos) y con actividad postingestiva frente a lepidópteros, por lo que se prefiere su uso particularmente para el control de áfidos o de lepidópteros. En el caso de estos últimos, dado que este extracto no tuvo efectos antialimentarios en ensayos de elección, se contempla el uso de este extracto como retardador del crecimiento de poblaciones de insectos lepidópteros plaga.

Teniendo en cuenta las actividades divulgadas para extractos de D. graveolens en la presente solicitud, es también un uso interesante aquel en el que se aprovecha la actividad biocida para el control de parásitos o plagas molestas, que afectan directamente a poblaciones animales o a los seres humanos. En ese sentido, tiene también especial interés el uso de uno cualquiera de los extractos de D. graveolens de la presente invención, o combinaciones de los mismos, o de una composición de la presente invención, en la ropa o en la piel de un animal, incluyendo dentro de la definición de animal a los seres humanos, siendo una realización particularmente preferida de la anterior el uso en la piel de un ser humano. El uso en la ropa, o en la piel de un animal, incluidos los seres humanos, puede tener especial interés como repelente de ácaros, insectos o nematodos, en particular garrapatas y/o pulgones, para los cuales hay ensayos específicos en la presente solicitud que muestran actividad repelente de tanto de los aceites esenciales como de la fracción orgánica del hidrolato extraídos de D. graveolens.

En cuanto a los compuestos activos identificados, debe comentarse que era conocido que el óxido de piperitenona (PO) tiene efectos larvicidas en mosquitos (revisado en Bozovic et al., 2015) y presenta toxicidad tópica y fumigante sobre áfidos { Toxoptera auranti. Sitophilus zeamais) (Zekri et al.. 2016; Herrera et al.. 2015). Este compuesto es larvicida e inhibe el desarrollo de Anopheles stephensi (Tripathi et al.. 2004). Sin embargo, no se le conocían efectos ixodicidas.

El óxido de cariofileno afecta la supervivencia y fecundidad de Myzus persicae (Petrakis et al.. 2014). Tiene actividad antialimentaria frente a Spodoptera littoralis y Leptinotarsa decemlineata (Rodilla et al.. 2008). Tiene efectos larvicidas sobre Anopheles gambiae (Moussavi et al., 2015). Aedes aegypti (Ali et al., 2014) y Spodoptera frugiperda (Cárdenas-Ortega et al., 2015), adulticidas por contacto sobre Lasioderma serricorne (You et al., 2015) y fumigantes sobre Sitophilus zeamais y Triboleum castaneum (Liu et al.. 2012). Además este compuesto tiene un gran interés en el control de hormigas desfoliadoras (Boulogne et al.. 2012). También se ha descrito como repelente de la garrapata Ixodes ricinus (Ashitani et al., 2015). Tampoco se le conocía el efecto ixodicida al que parece dar lugar en combinación con otros componentes del aceite esencial.

El α-cadinol tiene actividad antitermita (Chang et al. 2001 ^a ) acaricida frente a Dermatophagoides pteronyssinus (acaro del polvo) (Chang et al.. 2001 ) y D. farinae junto al T-cadinol, que tiene menor actividad (Chang et al.. 2001 b).

El carvacrol presenta toxicidad tópica en áfidos {Toxoptera auranti) (Zekri et al.. 2016) y actividad fumigante e inhibición de la reproducción sobre el pulgón Aphis gossypii, el thrips Frankiliella occidentalis y el ácaro Tetranychus cinnabarinus (Erler and Tune. 2005). Sus efectos ixodicidas y repelentes se han descrito en varias especies de garrapatas incluyendo Rhipicephalus microplus, R. turanicus, Dermacentor nitens, Hyalomma marginatum, Ixodes scapularis, Amblyomma americanum (Cruz et al.. 2013. Koc et al.. 2013; Cetin et al.. 2010; Dolan et al.. 2009; Dietrich et al.. 2006; Panella et al.. 2005; Lwande et al.. 1999), también actúa en sinergismo con timol frente a Amblyomma sculptum y Dermacentor nitens (Novato et al.. 2015). Respecto al modo de acción, el carvacrol inhibe moderadamente la actividad acetilcolinesterasa en artrópodos incluyendo garrapatas (Anderson and Coates. 2012). Por otra parte estudios previos demuestran que el carvacrol induce una alta mortalidad en M. javanica (Oka, 2001 ; Andrés et al., 2012). Sin embargo, en el presente caso, como se ha comentado, la actividad nematicida observada no se explica por su contenido en carvacrol y timol

La piperitenona tiene toxicidad por contacto y actividad fumigante frente al insecto Sitophilus zeamais (Herrera et al., 2015); y es el componente mayoritario del aceite esencial de Lantana viburnoides, con efecto repelente frente al mosquito Anopheles gambiae (Innocent and Hassanali, 2015). En el presente estudio se demuestra por primera vez la actividad nematicida de este compuesto.

Por tanto, puede concluirse que la extracción por arrastre de vapor permite la obtención de distintos extractos que incluyen compuestos que dan lugar a actividades de dichos extractos que no eran esperables para los extractos de D. graveolens y que posibilita distintos usos de gran interés industrial para los mismos, lo que confirma el interés de la presente invención.

Merece destacarse también que el método de la invención ha permitido identificar en los extractos de D. graveolens, concretamente en la fracción 7 obtenida al someter a cromatografía líquida a vacío el extracto de aceites esenciales, un compuesto previamente no conocido, 3-metilbutanoato de (Z)-3,7-dimetil-6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo, cuya fórmula química y proceso de aislamiento se describen en el Ejemplo 4 (Compuesto 3). Este compuesto parece estar presente en concentraciones de trazas tanto en la fracción de aceites esenciales como en Al no conocerse previamente este compuesto (aunque sí su alcohol), no hay referencias sobre su posible aplicación biocida. Los ensayos sobre actividad específica realizados con distintos compuestos han demostrado que el mismo es uno de los compuestos a los que se debe la actividad ixodicida del extracto de aceites esenciales de la presente invención, posiblemente colaborando sinérgicamente con los demás compuestos en los que se ha identificado actividad de provocar mortalidad en garrapatas. No había indicaciones de que este compuesto pudiera estar presente en D. graveolens. Así, este compuesto, su método de aislamiento, las composiciones que lo contienen y el uso de las mismas forman parte también de la presente invención.

También forman parte de la presente invención las fracciones VLC obtenidas al someter a cromatografía líquida a vacío en gel de sílice como fase estacionaria, utilizando como fase móvil un gradiente de mezcla de disolventes n-hexano-acetato de etilo (n-hexano- AcOEt) y acetato de etilo-metanol (AcOEt-MeOH) en proporciones de polaridades crecientes, así como las composiciones que las comprenden, es decir, aquellas en las que se ha incorporado una o más de dichas fracciones al prepararlas. Como puede verse en el Ejemplo 4 de la presente solicitud, dichas fracciones presentan actividad ixodicida frente a larvas de H. lusitanicum, destacando las fracciones 1 a 3 y 7 a 10, siendo la más activa la fracción 7, que mantiene su actividad a varias concentraciones. También presentan actividad antialimentaria frente al pulgón R. padi las fracciones 1 , 2, 2 y 7 ^a 10, destacando las fracciones 2 y 7 a 10, particularmente de nuevo la 7. Dicha fracción 7, además, fue la que se utilizó para aislar el compuesto 3-metilbutanoato de (Z)-3,7-dimetil- 6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo. En su composición química destaca la abundancia relativa del T- cadinol (cercana al 50%) y la del óxido de cariofileno (aproximadamente 35% de abundancia relativa), y también están presentes endo-borneol, acetato de bornilo, carbacrol y óxido de piperitenona, todos ellos con una abundancia relativa igual (carvacrol) o inferior al 3,0%. Estas fracciones, las composiciones que las comprenden y el uso de todas ellas, particularmente de la fracción 7, quedan comprendidos dentro del alcance de la presente invención, incluido su uso para aislar 3-metilbutanoato de (Z)-3,7- dimetil-6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo.

Debe comentarse también que la aplicación de la extracción por vapor a D. graveolens da lugar, sin la necesidad de aplicar disolventes orgánicos, a extractos que contienen una mezcla de compuestos activos que permiten que cada uno de dichos extractos presenten cada uno de ellos distintas actividades biocidas, algunas de las cuales parecen resultar de la presencia simultánea de varios compuestos activos en ese mismo extracto y de un efecto sinérgico entre ellos. Así, por ejemplo, como se acaba de comentar, el extracto que corresponde a la fase de aceites esenciales, el llamado simplemente "aceite esencial", presenta una actividad ixodicida que incluye tanto la capacidad de matar especies del orden Ixodida como de repeler expecies de dicho género, y también capacidad de controlar especies de áfidos, con la particularidad de que la capacidad de matar especies del orden Ixodida parece resultar de la presencia simultánea de varios compuestos activos en ese mismo extracto. Por otra parte, la actividad antialimentaria de R. padi del aceite esencial y de la fase orgánica del hidrolato no se explica por ninguno de los componentes de los mismos de forma individual (Tabla 18)

La invención se explicará con más detalle mediante los ejemplos y figuras que se presentan a continuación.

EJEMPLOS

Ejemplo 1.- Extracción inicial

1 .1 . Preparación de la biomasa

Las plantas de D. graveolens con las que se comenzó el estudio fueron plantas silvestres recolectadas en la finca La Garganta. La Garganta está localizada en España, en la zona mesomediterránea, al sur de la provincia de Ciudad Real (37 ^e 2478"N 42 ^e 59'101 " E).

Se recolectó la parte área (hojas y tallos) en el mes de octubre de 2014, en plena época de floración de la planta. La identificación de la planta fue realizada por el Dr. V. J. Aran, del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Se recolectaron plantas silvestres de distintas zonas de la finca La Garganta, que diferían en el grado de floración de las plantas, oscilando entre el 40-50% y el 90-100%. A cada lote de plantas recolectadas se les asignó un número distinto, del 1 al 7, según la zona de recolección dentro de la finca. El orden de las zonas según su grado de floración, ordenadas de menor a mayor, era el siguiente: 4 - 3 - 1 - 2 - 5 - 6 - 7). Para cada lote se calculó el rendimiento en Materia Seca (%), separando una muestra del material fresco para realizar el proceso de secado, a la sombra, en un secadero, con corriente de aire, a temperatura ambiente (valor medio: 25 ^e C), durante una semana. Los rendimientos obtenidos fueron similares, oscilando entre el 40% (lote 5) y el 55% (lote 6).

Como plantas de referencia testigo se recolectaron plantas de la misma especie en Jaca, Huesca (42 ^e 34'20" N, 0 ^e 33'1 "W), que dieron lugar a rendimientos similares a materia seca (49%)..

Las muestras de plantas se sometieron a un proceso de extracción en laboratorio en aparato Clevenger (hidrodestilación) y luego en una Planta Piloto (arrastre de vapor), resultando en diferentes extractos y rendimientos. Los hidrolatos obtenidos en cada caso (DgCH y DgPH, respectivamente) se sometieron después a extracción con diclorometano, para separar la fracción orgánica presente en cada uno de ellos (DgCHO y DgPHO) del residuo. El esquema de extracción aplicado se muestra en la Fig. 1 a.

1 .2. Hidrodestilación en Clevenger La hidrodestilación en Clevenger se realizó siguiendo las indicaciones de la Farmacopea Europea (http://www.edqm.eu/en/Homepage-628.html). Se extrajeron 100 g de hojas con 1 I de agua destilada durante 3 horas, a 100 ^e C. Los rendimientos medio en aceite esencial (fase superior), referidos a la biomasa verde (peso seco) de partida se muestran en la Tabla 1 .-

Tabla 1 .- Rendimiento medio de aceite esencial obtenido por hidrodestilación en Clevenger

N ^a Muestra / Aceite esencial

Ubicación (zona recolección) (DgCAe) (% ¹ )

1 . Cerro Gaznateo 0,14

2. Olivar Cruz del Muerto 0,14

3. Pista de la avioneta 0,17

4.Arroyo de San Serafín 0,17

5. Era del Olivar 0,10

6.Paso de la Encinilla 0,15

7.Pantano de la cal 0,13

8.Jaca, Huesca (Testigo) 0,14

¹ Valor medio resultante de los ensayos realizados con plantas recolectadas en tres años diferentes (2014, 2015, 2016).

1 .3. Arrastre de vapor en planta piloto

El proceso se llevó a cabo en una planta de destilación de una cámara de destilación de 100 kg, un vaso de 500 litros y un rango de presión de vapor global de 0,5 a 1 ,4 bar (50 a 140 kilopascales, kPa) (ver más adelante las condiciones de presión específicas según el año). El agua recolectada después de decantar el aceite esencia se filtró para dar el hidrolato (DgPH). La fracción orgánica del mismo se extrajo con diclorometano (DCM) en proporción 1 :1 , (150 mi x 3 veces, a temperatura ambiente, durante 1 hora) para dar una fracción orgánica (DgPHO).

El material recolectado en la finca La Garganta fue destilado en planta piloto, en los años de 2014, 2015 y 2016. En el vaso se introducía el material vegetal verde hasta que la cámara se llenaba.

En el año 2014, el proceso se llevó a cabo a una presión de entre 0,5 y 1 ,3 bar (entre 50 y 130 kPa), observándose dificultades para la extracción de aceite en los lotes iniciales (7 y 4) tratados a una presión cercana a 0,5-0,6 bar (50-60 kPa) y para los cuales el aceite se depositó en las paredes del destilador. Por ello, se fue aumentando gradualmente la presión, extrayéndose entonces aceite, mejorando así el rendimiento y la operatividad del proceso.

El rendimiento de la destilación en planta piloto para el total de la biomasa (594,3 kg) fue 0,66 ml/kg de biomasa. Los cuatro lotes que dieron mayor rendimiento fueron los que presentaban menor floración en el momento de recoger las muestras, como puede verse en la Tabla 3.

Tabla 2.- Rendimiento en planta piloto de los lotes recolectados en la finca La Garganta en 2014.

Lote Presión Biomasa verde Aceite esencial Hidrolato Fase

N ^e (kPa) Peso (DgPAe) separado intermedia

(kg) Rendimiento (%) (DgPH) (mi)

(ml/100 kg biomasa) (mi)

1 60 - 130 95,5 0,07 30 6

2 60 - 130 1 15 0,06 13 5

3 100 -120 54,2 0,01 102 5

4 60 - 70 44,4 0 ^* 127 0

5 80 - 100 1 17,3 0,01 42 10

6 60 - 130 72,4 0,07 8,5 2

7 60 95,5 0 ^* 1 17 0

^* Restos limpieza

(mayoritariamente aceite

depositado en las paredes):

En años posteriores se siguió aumentando gradualmente la presión, llegando hasta 1 ,9 bar en el año 2016. obteniendo así un aumento visible de rendimiento año tras año (Tabla 3).

Rendimiento medio en planta piloto del material recolectado en la finca la

Garganta según el año de recolección

1 .4. Extracción con diclorometano del idrolato

Una vez obtenidos los hidrolatos anteriores, se procedió a la extracción con diclorometano (DCM) (150 mi x 3 veces, en proporción 1 :1 volumen:volumen, a temperatura ambiente) de compuestos orgánicos presentes en los hidrolatos obtenidos en los dos procedimientos (hidrodestilación en Clevenger: DgCH, y destilación en planta piloto: DgPH). Tras la separación de las fases por decantación en embudo de decantación y eliminación del disolvente en rotavapor, se obtuvieron las fracciones orgánicas DgCHO y DgPHO, respectivamente, así como las correspondientes fracciones acuosas residuales DgCHR y DgPHR, tal como se esquematiza en la Fig. 1 a

Tomando conjuntamente los datos de todos los lotes, los rendimientos de los distintos extractos obtenidos, bien partiendo de una hidrodestilación en Clevenger o bien realizando la destilación inicial por arrastre de vapor en planta piloto, fueron:

Tabla 4.- Resumen de los rendimientos de los extractos

Una vez obtenidos los extractos, se procedió a comprobar su posible acción biocida y a establecer un cultivo experimental de esta especie de planta, tal como se describe a continuación.

Ejemplo 2.- Cultivo experimental de plantas de D. graveolens

Para seleccionar el material vegetal y estandarizar la composición química del mismo, se procedió a realizar el cultivo experimental de plantas de D. graveolens, en la finca experimental del CITA (Centro de Investigación y Tecnología Alimentaria de Aragón) en Ejea de los Caballeros, Zaragoza.

Las semillas se originan a partir de plantas silvestres recogidas en la finca La Garganta en el mes de octubre. Como se ha comentado antes, La Garganta está localizada en la zona mesomediterránea, al sur de la provincia de Ciudad Real. Como semillas de referencia "testigo" se recolectaron plantas de Jaca, Huesca. Estas semillas pasaron por ensayos de multiplicación en placas Petri, sin medio de cultivo, sobre papel filtro humedecido a temperatura y luz controladas (24 ^e C-34 ^e C; 22 ^e C y 4 ^e C-14 ^e C), hasta que se produjo su germinación. Se observó que las semillas se multiplicaban mejor y muy rápidamente en el ensayo de calor (>22 ^e C), por lo que su cultivo pareció factible. Las plántulas obtenidas de cada ensayo se trasplantaron a alveolos en invernadero, y de ahí, plántulas seleccionadas de cada lote fueron plantadas manualmente en la finca experimental de Ejea de los Caballeros (Zaragoza, España, 42 ^e 07'38" N, 1 ^Q 08'18" W, situada a una altitud de 342 m., en una instalación de riego por goteo. En total se sembraron plantas de los 7 lotes originados en la finca La Garganta más un lote de plantas testigo procedentes de Jaca, con una media de 200 plantas por lote, dando lugar a un total aproximado de 1600 plantas. Las plantas de un mismo lote se plantaron formando una fila, en un marco de plantación de 0,255 m ² /planta. Así, para cada lote procedente de La Garganta, se obtuvo una población de plantas cultivadas en Ejea de los Caballeros. La plantación tuvo lugar en mayo de 2015, recogiéndose en el mes de septiembre, controlándose la recolección por lotes. En el momento de su recolección, el grado de floración era del 0-50%. Además, plantas seleccionadas de cada población se cubrieron para producción de semillas (selección), utilizándose después para sembrar plantas de las mismas poblaciones en la siguiente temporada.

Las partes aéreas de las plantas recolectadas se secaron de forma análoga a la descrita en el Ejemplo 1 , separando de cada lote 2 kg de biomasa para el control de materia seca y la destilación en laboratorio en Clevenger. Con el resto se procedió a la extracción en planta piloto.

La extracción en planta piloto se realizó de manera análoga a la descrita en el Ejemplo 1 , sección 1 .3., con la particularidad de que la extracción se realizó en dos fases de presión: la primera media hora entre 0,6 y 0,7 bares (entre 60 y 70 kPa), y la segunda media hora de 0,8 a 1 ,2 bares (de 80 a 120 kPa).

Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 5 a continuación. Tabla 5.- Rendimiento de las distintas poblaciones (Pob) de D. graveolens cultivadas, tras extracción en planta piloto

Garganta

2 BV - Biomasa Verde

a De cada lote se separan 2 kg de biomasa para el control de MS y destilación en laboratorio

b Porcentaje en peso respecto al peso de la biomasa verde

c Lote testigo

Para comprobar la existencia o no de diferencias debidas a la sesión de recolección, en septiembre de 201 5 se recogieron también plantas silvestres en la finca La Garganta, que se trataron del mismo modo que las recogidas en Ejea de los Caballeros y se sometieron a extracción por arrastre de vapor en planta piloto en las mismas condiciones. En la Tabla 6 se resumen los rendimientos de los extractos de plantas de una y otra procedencia, pudiendo observarse que los rendimientos son similares.

Tabla 6.- Resumen de los rendimientos de los extractos según su procedencia

Ejemplo 3.- Bioactividad de extractos de D. graveolens

Las plagas diana utilizadas en estos ensayos, particularmente los insectos y ácaros (garrapatas), se seleccionaron por la importancia económica de su incidencia sobre cultivos hortícolas, su capacidad de transmisión de virus (particularmente en el caso de los áfidos), así como su disponibilidad y facilidad de cría y mantenimiento en el laboratorio. Por lo demás, los resultados obtenidos con ellas pueden considerarse extensibles a otras especies de su mismo grupo (los acáridos en general y dentro de ellos, las garrapatas, los insectos y los nematodos).

3.1 . Efectos ixodicidas

Los ensayos de toxicidad se realizaron en tres géneros distintos de garrapatas {Hyalomma, fíhipicephalus y Haemaphysalis), concretamente las especies: Hyalomma lusitanicum, fíhipicephalus pusillus y Haemaphysalis hispánica. Para garantizar la homogeneidad de los lotes se partió de hembras grávidas recogidas sobre animales silvestres, en condiciones de campo y áreas libres de tratamientos con acaricidas convencionales. Las hembras se incubaron hasta la oviposición y eclosión de las larvas.

Los ensayos de repelencia se realizaron sobre adultos de Hyalomma lusitanicum recogidos de vegetación en zonas libres de tratamientos acaricidas convencionales. Esta especie es la más abundante de la zona centro de España (Estrada-Peña et al., 2004) y ha cobrado gran interés en los últimos tiempos por su posible papel en la transmisión del virus Crimea Congo (Oteo Revuelta et al, 2010).

Tras la recolección las garrapatas se identificaron utilizando claves específicas (Gil Collado, 1979; Estrada y et al, 2004).

- Toxicidad: Para los ensayos de toxicidad, la preparación de los lotes se realizó inmediatamente antes de los ensayos mediante recuento manual de 20 larvas (3 lotes por producto a ensayar) de 15-16 días de vida, para garantizar su quitinización (Ouhelli et al 1984), seleccionando exclusivamente las que presentaban movilidad adecuada. Para garantizar la homogeneidad de los lotes, todo el ensayo se realizó con larvas de una misma puesta. Cada lote se mantuvo en tubo de ensayo de vidrio cerrado con una película plástica flexible (Parafilm M®, Sigma Aldrich) hasta la aplicación del tratamiento. Cada extracto a ensayar se preparó por triplicado en microtubos de 2 mi (Eppendorf Ibérica) con 25 mg de celulosa (celulosa cristalizada, Merck). Sobre la celulosa se depositaron 50 μΙ de la solución stock a la concentración deseada (20, 15, 10, 5, 2,5 y 1 μ9/ Ι de extracto). Por otro lado, se procedió de igual manera con el disolvente empleado, acetona, que se utilizó como control negativo, y con el producto ixodicida comercial (Acibelte® =0,5 % cipermetrina) utilizado como control positivo. A continuación se dejó secar la celulosa con los productos a vacío y temperatura ambiente. El contenido de los microtubos (celulosa) de cada lote se aplicó al correspondiente tubo de larvas que se taponó con algodón hidrófilo. Se aseguró mediante movimientos rotatorios que la celulosa impregnaba las larvas y se dispusieron a condiciones de incubación (24 ^e C y HR superior al 70%).

La mortalidad de las larvas se analizó a las 24h de aplicar el tratamiento, procediendo al recuento de larvas vivas y muertas de cada tubo de ensayo. Posteriormente se calculó el porcentaje de mortalidad con la siguiente ecuación:

% Mortalidad= (% T - % C / 100 - %C) x 100

donde

%T: Porcentaje de mortalidad en el tratamiento, y

%C: Porcentaje de mortalidad en el control.

- Repelencia: Se utilizaron 3 lotes, de 10 garrapatas adultas (5 machos y 5 hembras) por extracto/producto (a dosis de partida de 20 o 10 mg/ml), mantenidas en tubos de ensayo tapados con algodón. Los ejemplares se mantuvieron a 24 ^e C y HR superior al 70%. Se emplearon discos de papel de filtro de 2 cm de diámetro impregnados con 20 μΙ de disolvente (control negativo) o extracto/producto a evaluar. El test se realizó en dos Erlenmeyer de 100 mi conectados y tapados con algodón, en uno se introdujo un disco con el extracto a testar y en el otro un disco control. Se contabilizaron las garrapatas, en función de su localización (Erlenmeyer con tratamiento, zona intermedia y Erlenmeyer control) a los 10, 20, 30, 40 y 50 minutos; 1 , 2, 3 y 4 horas. Se calculó el porcentaje de repelencia. % RP, aplicándose la fórmula:

RP = [ 1 - ( %T / %C ) x 100]

donde

% T: porcentaje de garrapatas en el Erlenmeyer con tratamiento, y

% C: porcentaje de garrapatas en el control.

Se consideró que un extracto es activo cuando su RP >75%.

En la Tabla 7 se muestran los efectos (mortalidad de larvas) de los extractos de aceites esenciales (Clevenger: DgCAe, y planta piloto, DgPAe) y de la fase orgánica del hidrolato de planta piloto (DgPHO) de D. graveolens frente a varias especies de garrapatas {Hyalomma lusitanicum, fíhipicephalus pusillus, Haemaphysalis hispánica). Se muestran los resultados para las recolecciones del 2014 (extractos con la anotación 14) y 2015 (extractos con la anotación 15) de la planta silvestre (abreviaturas terminadas en LG), y del cultivado (abreviaturas terminadas en E). Como puede observarse, todos los extractos fueron activos, con variaciones en el nivel de efectividad, correspondiendo la mayor efectividad a las fases orgánicas de los hidrolatos. También los hidrolatos como tales mostraron actividad, de forma que los resultados de las fases orgánicas de los hidrolatos confirman que la actividad de éstos se debe a los compuestos orgánicos presentes en los mismos.

Tabla 7.- Mortalidad de larvas de garrapatas por extractos de D. graveolens

Concentración % Mortalidad larvas

Origen Extracto (mg/ml) H. R. H.

lusitanicum pusillus hispánica

Silvestre DgPAe14LG 20 100±0 100±0 100±0

(La 10 100±0 100±0 100±0

Garganta) 5 23,2±7,9 30,7±13,4 36,6±9,5

DgPH014LG 20 100±0 100±0 100±0

10 100±0 100±0 83,0±9,5

5 97,9±2,0 98,1 ±1 ,9 51 ,3±16,4

2,5 39,4±6,4

DgPAe15LG 20 100±0 100±0 98,4±1 ,6

10 65,8±6,3 100±0 91 ,4±8,6

5 0 0,24±9,5 63,1 ±1 ,2

DgPH015LG 20 100±0 100±0 100±0

10 100±0 100±0 96,4±1 ,7

5 15,9±9,1 91 ,8±2,2 5,6±0,7

Cultivada DgPAe15E 20 100±0 100±0 98,3±1 ,7

(Ejea de 10 64,1 ±25,4 100±0 91 ,0±2,3 los 5 0 16,1 ±16,7 40,3±15,3

Caballeros) DgPH015E 20 100±0 100±0 100±0

10 100±0 100±0 89,5±10,5

5 54,9±21 ,2 100±0 46,8±10,2

El estudio de la repelencia de estos extractos frente a adultos de H. lusitanicum (Fig. 2) dio resultados similares a los de toxicidad por contacto en larvas, siendo mayor la actividad de los extractos orgánicos de los hidrolatos que la de los aceites esenciales. 3.2. Efectos insecticidas

Los ensayos de efectos insecticidas se llevaron a cabo con un lepidóptero, Spodoptera littoralis, conocida también como rosquilla negra, y con dos especies de áfidos, Myzus persicae (pulgón verde del melocotonero) y fíhopalosiphum padi (pulgón de la avena o pulgón de los cereales. Estas especies se seleccionaron por la importancia económica de su incidencia sobre cultivos hortícolas, su capacidad de transmisión de virus en el caso de los áfidos, su disponibilidad y su facilidad de cría y mantenimiento en laboratorio.

Spodoptera littoralis es un lepidóptero de la familia Noctuidae conocido por su extrema voracidad. Los principales cultivos a los que afecta son hortícolas: pimiento, alfalfa, maíz, algodón, tomate, patata, entre otros. Presenta seis estadios larvales y en su mayor desarrollo pueden alcanzar 4 cm de longitud. La oruga tiene actividad nocturna y come cualquier parte verde de la planta y los frutos. Su extrema voracidad y su alta capacidad reproductora y de migración les confiere una gran importancia económica en el Norte de África y Europa meridional.

Myzus persicae es un pulgón de tamaño medio, de 1 ,2 a 2,3 mm, cuyo hospedador primario suele ser una planta del género Prunus, sobre todo Prunus pérsica L. (el melocotonero), aunque es muy polífago y presenta más de cuarenta familias de hospedadores secundarios, muchas de ellas de elevado interés económico. Es capaz de transmitir más de 100 tipos de virus, que afectan a plantas de gran interés comercial, algunos persistentes, otros semipersistentes y también no persistentes. Al igual que su hospedador primario, es originario de Asia aunque actualmente se considera cosmopolita.

fíhopalosiphum padi (L) es uno de los 14 áfidos considerados dentro de los de mayor importancia económica en el mundo y es altamente polífago. Como en el caso de Myzus persicae, el hospedador primario suele ser una planta del género Prunus, generalmente Prunis padus (L.). En lo que se refiere a sus hospedadores secundarios, es bastante polífago. Prefiere las gramíneas, incluidos los cereales y las plantas de pasto. En vector de virus vegetales persistentes y algunos no persistentes. Se distribuye por todo el mundo.

La cría y mantenimiento de los insectos se llevó a cabo en una cámara de temperatura controlada a 24+1 ^e C, 60-70% de humedad relativa y un fotoperíodo de 16:8 horas (luz:oscuridad). S. littoralis se crió en cajas de plástico de diferentes dimensiones dependiente del estadio larval, tamaño y número. Las larvas de S. littoralis se mantuvieron con una dieta semisintética (Poitout & Bues. 1970) y los adultos con solución azucarada. Los áfidos se criaron sobre sus plantas hospedadoras, cebada {Hordeum vulgare L.) en el caso de R. padi y pimiento {Capsicum annum L.) para M. persicae, en cámaras climatizadas, en jaulones ventilados, transfiriéndose a plantas frescas cada 7-10 días.

-Actividad alimentaria: Los ensayos se realizaron con larvas recién emergidas de sexto estadio (L6) de S. littoralis y pulgones adultos ápteros. La superficie superior de discos de hoja (1 ,0 cm ² ) de pimiento {Capsicum annum L.) en el caso de M. persicae, o de cebada (Hordeum vulgare L.) en el caso de R. padi, fueron tratados con 10 μΙ de la muestra a ensayar. Cada ensayo consistió en 5 placas Petri con dos larvas por placa (S. littoralis) o veinte cajas (2x2 cm) con diez áfidos de M. persicae y R. padi, incubados en una cámara de crecimiento en las mismas condiciones descritas para la cría de los insectos. Una vez consumido el 75% de la superficie de los discos control (S. littoralis) o después de 24 h (áfidos) se calculó el índice de consumo (% Fl) o de asentamiento (% de SI), respectivamente, según las fórmulas:

% FI = [ 1 - ( T / C ) x 100 ],

donde T y C son el consumo de discos de hojas tratadas y control; y

% de SI = [ 1 - ( % T / C % )],

donde % C y % T son el porcentaje de áfidos asentados en los discos de hojas control y tratadas (Burgueño -Tapia et al. 2008). Cuando la solución ensayada dio lugar a un Fl / SI > 70 %, se ensayó también en un experimento de dosis - respuesta para calcular su potencia relativa (EC50), que es la dosis efectiva para una reducción de un 50 % de la alimentación.

-Toxicidad: Se seleccionaron larvas de Spodoptera littoralis en estado L6 (con un peso entre 0,2 y 0,3 g). Se colocan 20 placas Petri por tratamiento y 25 para el control, en las que se coloca un disco de papel de filtro por placa. Se pesa entre 4-5 g de dieta por placa. Una vez pesadas dieta y larvas y anotados los pesos en cada placa, se canulan las larvas con 5 μΙ de producto a cada una. Una vez canuladas se dejan 72 horas en la cámara. Después se congelan durante otras 72 horas. Se pasan a la estufa a 60 ^e C durante 72 horas. Por último se pesan las larvas y la dieta (peso seco) y se calcula el peso fresco de ambos, una vez transcurrido el ensayo.

La Tabla 8 muestra la actividad antialimentaria (ensayos de elección) frente a insectos plaga {Spodoptera littoralis. Myzus persicae. Rhopalosiphum padi) de los extractos de D. graveolens, cuyos nombres se han abreviado siguiendo los mismos criterios que en la Tabla 7. Los aceites esenciales fueron activos como repelentes (actividad antialimentaria) frente a S. littoralis y frente a los pulgones, siendo R. padi el más sensible; también la fracción orgánica del hidrolato dio lugar a actividad frente a pulgones. Los extractos del año 2015 de planta silvestre y cultivada no presentaron actividad significativa frente al pulgón.

Tabla 8.- Actividad antialimentaria frente a insectos herbívoros de extractos de D. graveolens en ensayos de elección.

Extracto Plantas Concentración S. littoralis M. persicae R. padi

(mg/mL) % FI % SI % SI

DgPAe14LG Silvestre 10 72,2 ± 17,2 ^a 70,12 ± 5,91 ^a 95,86 ± 1 ,97 ^b

DgPH014LG (La 10 51 ,9 ± 14,4 88,49 ± 2,84 ^b 81 ,78 ± 6,18 ^b

DgPAe15LG Garganta) 10 52,9±16,2 59,55 ± 7,95 41 ,32 ± 9,48

DgPH015LG 10 62,7±17,6 51 ,26 ± 9,65 69,09 ± 6,79

DgPAe15E Cultivada 10 64,9±16,1 58,40 ± 9,65 64,01 ± 6,95

DgPH015E (Ejea) 10 49,9±,8 44,85 ± 9,61 61 ,78 ± 7,05 ^a Moderadamente activo. ^b Muy activo

El estudio de los efectos postingestivos (inyección oral) en larvas de S. littoralis se muestra en la Tabla 9, donde la influencia en el crecimiento se expresa mediante ΔΒ (variación en peso seco del insecto respecto del control), y la variación en la ingesta mediante. ΔΙ (variación en la ingesta en peso seco respecto del control). Como puede verse, el aceite esencial (DgPAe) no afectó al crecimiento (ΔΒ) o la ingesta (ΔΙ) de las larvas, mientras que la fase orgánica del hidrolato (DgPHO) redujo significativamente ambos parámetros, lo que sugiere interferencia en los procesos digestivos y de crecimiento del insecto. Es importante destacar que este extracto (DgPHO) no tuvo efectos antialimentarios en los ensayos de elección efectuados con este insecto (véase la Tabla 8), lo que permitiría la utilización de este extracto como retardador del crecimiento de poblaciones de insectos lepidópteros plaga.

Tabla 9.- Actividad postingestiva de extractos de D. graveolens sobre el insecto S. littoralis en inyección oral

Extracto Dosis Inyección oral S. littoralis

g/larva ΔΒ (% Control) ΔΙ (% Control)

DgPAe14LG 100 95,9 100,8

DgPH014LG 100 77,4 ^a 94,4 a Moderadamente activo 3.3. Efectos nematicidas

3.3.1 . Actividad sobre nematodos parásitos de plantas

En el ensayo se utilizaron nematodos de la especie Meloidogyne javanica. Los nematodos formadores de nodulos del género Meloidogyne son uno de los principales patógenos de especies vegetales y presentan una distribución mundial. Son endoparásitos obligados, de naturaleza polífaga e infectan más de 3000 plantas cultivadas a las que causan severos daños, con las consiguientes pérdidas económicas. La infección se produce cuando el juvenil de segunda edad, móvil e infectivo, es atraído por el sistema radical de la planta hospedadora. Durante todo su ciclo vital el nematodo permanece en el interior de la raíz y la infección afecta al crecimiento de la planta, causa marchitamiento, aumenta su susceptibilidad a otros patógenos y, en determinadas condiciones, puede causar su muerte.

El inoculo de M. javanica se obtiene por la eclosión de juveniles de segunda edad (J2) a partir de las masas de huevos recogidas manualmente, bajo microscopio estereoscópico, de raíces infectadas de tomate. Dichas masas se colocan con la ayuda de pinzas en filtros semisumergidos en un pequeño recipiente con agua destilada. Los filtros se incuban en la cámara a 24 ^e C para que los huevos comiencen a eclosionar.

-Ensayos in vitro con juveniles infectivos (J2): Se llevaron a cabo en placas de plástico de 96 pocilios (con fondo en U) con 4 réplicas para cada tratamiento, además del control. En cada pocilio se añadieron 95 μΙ de la solución de agua con nematodos más 5 μΙ del extracto analizado a una concentración de 20 μΙ, para de este modo obtener una concentración final del tratamiento de ^/μΙ. Asimismo los controles incluían 95 μΙ de la solución con nematodos más 5 μΙ del disolvente utilizado (DMSO+Tween 0,6%). La distribución de las muestras dentro de la placa se realizó en grupos de 4 al azar y dejando la fila y la columna externas rellenas de agua para mantener la humedad y evitar el efecto borde. Se incubó a 24 ^e C durante 72 horas y a continuación se realizó el recuento de nematodos muertos y vivos en un microscopio estereoscópico. Como se puede ver más adelante, los datos de actividad nematicida se presentan como porcentaje de J2 muertos corregido según la fórmula de Scheider-Orelli (Püntener W., 1981 ). Las dosis letales eficaces (LC50 y LC90) se calcularon mediante análisis Probit con los resultados obtenidos en distintas concentraciones, empleando para ello el programa estadístico Statgraphics Centurión, versión 2010.

-Ensayos In vivo: Efectos en la capacidad de infección de nematodos (J2): En estos ensayos se evaluó la actividad del extracto sobre la capacidad infectiva en raíces de tomate. Para ello, se realizó un ensayo con nematodos J2 en placa de 96 pocilios tal y como se especifica en el párrafo anterior de ensayos de actividad in vitro, pero en este caso con una dosis de tratamiento subletal. Tras 72 horas de incubación, el inoculo se filtró, se lavó y se aplicó a las plántulas de tomates que previamente habían sido transplantados en pequeñas macetas con arena estéril. Se realizaron 6 réplicas con el tratamiento, con sus respectivos controles inoculados con J2 sin tratar. Los tomates se mantuvieron en cámara (25 ± 2 °C, 60% HR, 16:8 Día:Noche) durante una semana, tras la cual se procedió al procesamiento de las raíces y su tinción. Estas se lavaron con una solución de lejía con 1 % de hipoclorito sódico y sin detergentes, y posteriormente con agua., y se colocaron separadamente en vasos de precipitados pequeños a los que se añadieron 40 mi de agua y 1 mi de colorante fucsina. Se llevaron a ebullición en un microondas y se dejaron enfriar. Se lavaron las raíces y se conservaron en frío y tapadas durante 24 h. Una vez transcurrido ese tiempo, se cuantificó el número de J2 en el interior de las raíces bajo un microscopio estereoscópico

En la Tabla 10 se nuestros los resultados de actividad de los aceites esenciales y fases orgánicas de hidrolato sobre el nematodo fitopatógeno Meloidogyne javanica. El hidrolato obtenido en la extracción en planta piloto (DgPH) de la planta silvestre (La Garganta) no presentó actividad nematicida, pero sí lo hizo su fase orgánica extraída con diclorometano. También presentó actividad nematicida el hidrolato procedente de la planta cultivada (Ejea) (Tabla 10) debido a una variación cuali/cuantitativa en la composición química con respecto a la planta silvestre, como se discutirá posteriormente.

El hidrolato indujo fuertes efectos nematicidas en juveniles infectivos. Así mismo el tratamiento de juveniles con hidrolato a dosis subletal produce una supresión significativa de su capacidad para infectar raíces de tomate (Fig. 3).

Tabla 10. Actividad de extractos de D. graveolens sobre la mortalidad de J2 de M. javanica

Extractos Concentración % Mortalidad J2

aLCso ^a LCgo

% mg/ml 72h

DgPAe15LG Silvestre 1 ,0 4,08 ± 1 1 ,55

DgPH15LG (La 100 1 ,18 ± 0,36

DgPH015LG Garganta) 1 ,0 38,27 ± 0,69

DgPAe15E Cultivada 1 ,0 12,3 ± 3,8

DgPH15E (Ejea) 100 1 ,33 ± 0,77

DgPH015E 1 ,0 94,21 ± 5,19 ^a 0,6 ^a ' ^b 1 ,1 ^{¾b a} Muy activo; ^b Valores de LC50 y LC90 (mg/ml) calculados por análisis Probit 3.3.2. Actividad frente a nematodos parásitos de animales

Se realizaron también ensayos frente a nematodos gastrointestinales ovinos {Teladorsagia circumcincta y otros) con el extracto de aceites esenciales (DgPH15E) y la fase orgánica del hidrolato (DgPH015E) obtenidos con plantas cultivadas en Ejea de los Caballeros.

Los ensayos con nematodos gastrointestinales ovinos se realizaron a partir de huevos eliminados por ovejas infectadas experimentalmente con una composición principal de Teladorsagia circumcincta (>90%) y otras especies de nematodos gastrointestinales.). Para ello se siguieron las normas de la Asociación Mundial para el Avance de la Parasitología Veterinaria (WAAVP) y en concreto el test de inhibición de la eclosión larvaria y el ensayo de mortalidad larvaria (Coles et al, 1992, Taylor et al., 2002)

En un primer ensayo se analizó la actividad ovicida (inhibición de la eclosión de huevos de los nematodos) de los mencionados extractos, analizándose en otro ensayo la acción larvicida.

-Acción ovicida. Test de eclosión de huevos: basado en la capacidad de los huevos de nematodos para embrionar y eclosionar en soluciones acuosas. Los ensayos se realizaron en placas de 48 pocilios. En cada pocilio se añadió 50 μΙ con un número aproximado de 122 huevos, se le añadió la cantidad de extracto estimado para cada dilución y se completó con agua hasta llegar a un volumen final de 200 μΙ por pocilio. En estas condiciones, los huevos de tricostrongílidos se incubaron a 23 ^e C con las diluciones seriadas de los productos y a las 48 horas se determinó el porcentaje de inhibición de la eclosión de huevos en cada dilución. Los ensayos se realizaron con hidrolato (puro) que se diluyó para los ensayos al 75, 50, 25 y 12,5% y con fracción orgánica en dmso- tween (20 mg/ml) que se diluyó para el ensayo hasta 15, 7,5, 3,75 y 1 ,9 mg/ml. Como control positivo se usó tiabendazol 1 μΙ/ml) y como negativo, agua.

Las condiciones específicas utilizadas y los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1 1 . Como puede observarse en dicha Tabla, el hidrolato no presentó actividad ovicida (inhibición de la eclosión) significativa. Por el contrario, la fracción orgánica tuvo una gran actividad ovicida en todas las diluciones ensayadas. Tabla 1 1 Actividad ovicida de extractos de D. graveolens sobre huevos de nematodos intestinales {Teladorsagia cicumcincta y otros)

a Muy activo

-Acción larvicida. Ensayo de mortalidad larvaria: se realizó con larvas de primer estadio (L1 = larva 1 ) recién eclosionadas que se expusieron a dosis crecientes de producto. Los ensayos se realizaron en placas de 48 pocilios. En cada pocilio se añadió 50 μΙ con un número aproximado de 120 L1 , se le añadió la cantidad de extracto estimado para cada dilución y se completó con agua hasta llegar a un volumen final de 200 μΙ por pocilio. En estas condiciones, las L1 de tricostrongílidos se incubaron a 23 ^e C con las diluciones seriadas de los productos y a las 48 horas se determinó el porcentaje de mortalidad larvaria en cada dilución. Los ensayos se realizaron con hidrolato (puro) que se diluyó al 75, 50, 25 y 12,5% y con fracción orgánica en DMSO- Tween (20 mg/ml) que se diluyó para el ensayo hasta 3,75 y 1 ,9 mg/ml. Como control positivo se utilizó Ivermectina 10 micromolar y como control negativo, agua.

Los resultados se muestran en la Tabla 12, en la que puede obserarse que el hidrolato presentó actividad larvicida máxima sólo a las dosis más altas; la fracción orgánica tuvo actividad larvicida máxima en las dos diluciones ensayadas (las más bajas).

Tabla 12. Actividad larvicida (mortalidad) de extractos de D. graveolens sobre larvas de primer estadio de nematodos intestinales { Teladorsagia cicumcincta y otros)

a Muy activo Una vez establecido el valor biocida del aceite esencial de D. graveolens se ha procedido al estudio químico biodirigido del aceite esencial para determinar los principios activos.

Ejemplo 4.- Estudio químico biodirigido de extractos. Caracterización de principios activos Para llevar a cabo la caracterización de los principios activos presentes en los extractos, se utilizaron las siguientes técnicas:

Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Los espectros de RMN se realizan en los espectrómetros Bruker Avance 400 MHz y Bruker AMX 500 MHz (500 y 400 MHz para ¹ H y 100 y 125 MHz para ¹³ C). Los productos se disuelven en CDCI ₃ . MeOD y DMSO-d ₆ . Los valores de los desplazamientos químicos (δ) se expresan en partes por millón (ppm), en relación al disolvente empleado como referencia interna que, salvo que se indique lo contrario, fue cloroformo deuterado (δ _Η =7,26 ppm y 5 _C =77,16 ppm). Las constantes de acoplamiento (J) se midieron en Hertzios (Hz). Los experimentos bidimensionales de correlación homo y heteronuclear ( ¹ H- ¹ H. ¹ H- ¹³ C): COSY, NOESY, HSQC y HMBC de los productos puros se realizan en equipos de espectroscopia de la marca Bruker AMX 500, utilizando el software estándar suministrado por la firma Bruker.

Espectrometría de Masas (EM). Los espectros de masas de baja y alta resolución se realizaron en un equipo de espectrometría Vg-Micromass modelo Zab 2F (la temperatura de la fuente fue de 220 ^e C y la energía de ionización de 70 eV) y en un espectrómetro Micromass modelo LCT Premier XE, usando electroespray (ESI) como fuente de ionización de modo positivo y negativo. Para cada producto se indican las fragmentaciones más significativas y su intensidad relativa.

Cromatografía en columna (CC). Para la separación de los compuestos se utilizaron columnas cromatográficas, donde se emplean como fase estacionaria diferentes tipos de gel de sílice y un tipo de óxido de aluminio de la casa comercial Merck:

1 . Gel de sílice 60, Art. 7734 (0,063-0,200 mm).

2. Gel de sílice 60 HF ₂₅ 4_ ₃₆₆ , Art. 7741 (5-40 μηι).

3. Gel de sílice 60 PF ₂₅₄ . Art. 7749.

4. Óxido de aluminio, Actividad neutra. Art. 1076.

Como fase móvil se utilizaron mezclas de disolventes de n-hexano-acetato de etilo (AcOEt), CH ₂ CI ₂ -MeOH y AcOEt-MeOH en polaridades crecientes.

Cromatografía líquida a vacío CLV). Se utilizó como fase estacionaria dos tipos de gel de sílice (art. 7734 y 7749), sescritos en el párrafo anterior y como fase móvil un gradiente de mezcla de disolventes n-hexano-AcOEt y AcOEt-MeOH en proporciones de polaridades crecientes.

Cromatografía en Capa Fina (CCF). El seguimiento de las columnas cromatográficas se llevó a cabo mediante cromatografía en capa fina, usando cromatofolios comerciales de gel de sílice 60 F ₂₅₄ con base de aluminio (20 x 20 cm, Art. 5554) y óxido de aluminio neutro 60 F ₂₅₄ con base de aluminio (20 x 20 cm, Art. 5550), adquiridas en la casa comercial Merck. En el sistema de elución se utilizaron los mismos disolventes y polaridades que en las columnas cromatográficas. El revelado de los cromatofolios se realizó utilizando el reactivo óleum/vainillina para detectar los compuestos, mediante pulverización sobre los cromatofolios y calor. Oleum: está compuesto por una mezcla de ácido sulfúrico (4%), ácido acético (80%) y agua destilada (16%). Las placas se pulverizaron con este reactivo y se visualizaron aplicando calor (1 10-130 ^e C).

VAINILLINA: 0,5 g vanillina, 100 mi ácido sulfúrico/etanol (40:10).

Se disuelve la vainillina en el etanol y luego se adiciona el ácido sulfúrico lentamente con agitación constante. Al adicionar el ácido sulfúrico la mezcla cambia de color. Con el paso del tiempo el etanol se evapora y el revelador se pone oscuro. Se adicionar más etanol hasta obtener el color inicial.

Cromatografía de gases acoplada a masas (GC-MS) Para la determinación cualitativa y cuantitativa de los compuestos presentes en los aceites esenciales y fracciones volátiles se utiliza como metodología básica el acoplamiento cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), en un cromatógrafo de gases Agilent modelo 5973N acoplado a un detector de masas con fuente de ionización por impacto electrónico (IE) a 70eV.

Con este equipo se ha utilizado una columna capilar HP-1 (fase ligada de metil silicona) de Hewlett-Packard: 25 m de largo, 200 μηι de diámetro interno y 0,n2 μηι de espesor de fase. Las condiciones utilizadas han sido: split (30:1 ); temperatura del inyector 260 ^e C; temperatura de la columna 70 ^e C, calentando hasta 270 ^e C a 4 ^e C/min. Los espectros de masas y el tiempo de retención han sido utilizados para identificar los compuestos por comparación con los encontrados en la base de datos Wiley (Wiley 275 Mass Spectra Datábase, 2001 ) mientras que para la cuantificación se han utilizado los % del área de los picos obtenidos en los cromatogramas. Por esa razón, se ha considerado que los porcentajes de las abundancias relativas están expresados como relación peso/peso (p/p), masa a masa más exactamente; en caso de duda, debe tenerse en cuenta que todas las abundancias relativas se cuantificaron de esta manera. Cromatografía líquida de alta resolución acoplada a masas (HPLC-MS). Los extractos no volátiles se analizaron por HPLC-MS en un equipo Shimadzu con bomba LC-20AD acoplado a un espectrómetro de masas con cuadrupolo como analizador (LCMS-2020 QP) y usando una interfase e ionización por electroespray (ESI). Para la separación se utilizó una columna Teknokroma Mediterránea Sea ₁₈ column (250 mm x 4.6 mm, 5 μηι de tamaño de partícula) con una pre-columna analítica ACE3 C18. Las soluciones stock de los extractos se analizan a 0,25 μς/μΙ y los compuestos puros a 0,05 μQ/μ\ (patrones) disueltos en 100% MeOH para llevar a cabo su inyección (10 μΙ). Todos los disolventes utilizados son de grado HPLC-MS. - Aislamiento de los compuestos El aceite esencial DgPAe14LG (30g) se fraccionó mediante cromatografía líquida de vacío (VLC) sobre sílica gel (Si-gel) usando mezclas Hx:DCM en gradiente de polaridad (100:0-0:100), obteniendo de esta manera 10 fracciones (VLC 1 -10) claramente diferenciadas mediante TLC. El análisis de GC-MS de estas fracciones mostró que el componente mayoritario del aceite (Acetato de bornilo) se encontraba presente en las fracciones VLC 3-5.

La fracción VLC-8 se fraccionó mediante cromatografía Flash sobre Si-gel usando una mezcla de Hx:AcOEt (100:0-60:40). Mediante TLC sem ¡preparativa y usando la misma mezcla de disolventes, se aislaron los compuestos 3, 4 y 5.

Estos compuestos se identificaron mediante resonancia magnética nuclear y espectrometría de masas.

Dentro del análisis realizado, deben destacarse los siguientes hallazgos:

COMPUESTO 3. En los datos espectroscópicos (1 H-RMN y 13C-RMN) se puede observar la presencia de cuatro metilos (dos de ellos sobre doble enlace). Cinco grupos metilenos (uno de ellos unido a un átomo de oxígeno y otro formando parte de un doble enlace). Dos metinos (uno de ellos olefínico) y cuatro carbonos cuaternarios (dos de ellos pertenecientes a dobles enlaces y los otros dos a grupos carbonilos). Teniendo en cuenta las correlaciones ¹ H- ¹ H (Cosy) y las correlaciones ¹ H- ¹³ C (HSQC y HMBC) fue posible identificar el compuesto 3 como isovalerato de (2Z)-3,7-dimetil-6-oxo-octa-2,7- dien-1 -ilo (o, siguiendo la nomenclatura de la IUPAC, 3-metilbutanoato de (Z)-3,7-dimetil- 6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo), cuya fórmula se representa a continuación. La Fig. 4 muestra de las asignaciones de los desplazamientos, así como los espectros de 1 H-RMN y 13C- RMN.

3-metilbutanoato de (Z)-3,7-dimetil-6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo

Este compuesto aún no ha sido descrito en la literatura. Aunque su ácido y la forma trans de su correspondiente alcohol sí lo están.

La forma trans del alcohol y su correspondiente acetato están descritos (Zdero. et al..1986). También han sido aislados de Artemisia granatensis con actividad frente a pulgones (Barrero, et al., 2013)

En el cromatograma de este compuesto aparece un pico minoritario con menor tiempo de retención que presenta un patrón de fraccionamiento muy similar en su espectro de masas, por lo que podría tratarse del isómero trans. COMPUESTO 4 Dq 11(23) = DGIIK21 -32)

T-Cadinol

Los datos de ¹³ C coinciden con los publicados (Appendino et al., 1997). El 1 H-RMN y el [a] _D de este compuesto aparecen en Cheng. et al (1967), pero no coinciden tan fielmente como lo hace el ¹³ C antes mencionado.

COMPUESTO 5: Oxido de piperitenona (96 % Wilev) Dglll(10-12)-2bis = DGIII(13-16)bis

Óxido de piperitenona ¹ H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-c δ ppm 3,24 (1 H, s), 2,43 - 2,54 (1 H, m), 2,33 - 2,42 (1 H, m), 2,05 - 2,21 (1 H, m), 2,1 1 (3 H, d, J=2,5 Hz), 1 ,88 (1 H, ddd, J=14,6, 12,9, 5,9 Hz), 1 ,80 (3 H, d, J=1 ,5 Hz), 1 ,48 (3 H, s),

¹³ C RMN (101 MHz, CLOROFORMO-c δ ppm 198,45, 149,26, 127,68, 63,46, 63,41 , 27,94, 23,16, 23,13, 23,13, 21 ,81 .

Los datos coinciden con los publicados por Thach. et al. (2013) y son muy parecidos a los publicados por Nakamura. et al ( 2014).

4.1 . Análisis químico de los extractos de Dittríchia graveolens

Una vez realizado el aislamiento e identificación de los compuestos, según se ha indicado en la parte metodológica, se obtuvo la composición de los extractos volátiles que se muestra en la Tabla 13.

Tabla 13. Composición química (abundancia relativa %) de los aceites esenciales obtenidos en planta piloto (PAe), y fases orgánicas de los hidrolatos (PHO) obtenidos de plantas recolectadas en la finca La Garganta (LG) (años 2014 o 2015, partes finales de abreviaturas 14LG o 15LG, respectivamente) o en el cultivo de Ejea de los Caballeros (E) (año 2015, parte final de abreviatura: 15E)

^* Datos de 13C-RMN del compuesto

El aceite esencial de D. graveolens silvestre (DgPAeLG) y cultivado (DgPAeE) se caracteriza por su contenido en acetato de endobornilo y borneol. Las diferencias cualitativas entre esos dos aceites se centran en la presencia de pequeñas cantidades de carvacrol y un compuesto no identificado de tiempo de retención (rt) 17,16 en DgPAeE y la presencia de τ-cadinol en DgPAeLG. Las diferencias cuantitativas entre esos dos aceites afectan al contenido en β-cariofileno, óxido de cariofileno y un compuesto no identificado de rt 18,76 (mayor en DgPAeE).

La fase orgánica del hidrolato de la planta silvestre (DgPHOLG) y cultivada (DgPHOE) se diferencian cualitativamente por la presencia de p-cimenol, mentadienol, un compuesto no identificado de rt 10,71, timol, carvacrol y un compuesto no identificado de rt.11,14 en DgPHOE. Además, en DgPH014LG aparecen piperitenona, oxido de piperitenona, τ- cadinol y un compuesto no identificado de rt 18.76.

4.2 Estudio químico biodirigido del aceite esencial de Dittrichia graveolens (DgPAe)

El aceite esencial (DgPAe) obtenido por extracción en planta piloto de planta silvestre (La Garganta.2014) se sometió a estudio químico biodirigido mediante cromatografía guiada por bioensayo (actividad ixodicida sobre H. lusitanicum y antialimentaria sobre R. padi) (Fig.7).

La fracción VLC7 fue las más activa frente a la garrapata (Tabla 14: toxicidad de larvas, y Fig.8: repelencia de adultos) y el pulgón (Tabla 15). Tabla 15.- Actividad ixodicida (% mortalidad) de las fracciones VLC del aceite esencial de D. graveolens (DgPAe14LG) frente a larvas de H. lusitanicum.

Concentración (mg/ml)

Muestra

20 10 5 2,5 1,25

DgVLCI 98,33 ± 1,7 13,79 ±9,12 5,45 ± 6,59

DgVLC2 100,00 ±0,0 100,00 ±0,0 100,00 ±0,0 30,51 ± 16,69 14,96 ± 1,53

DgVLC3 100,00 ±0,0 0,0 ±0,0 0,0 ±0,0

DgVLC4 53,06 ± 6,4

DgVLC5 20,82 ± 7,8

DgVLC6 31,35 ± 17,9

DgVLC7 100.00 ±0.0 100.00 ±0.0 100.00 ±0.0 96.43 ± 1.78 38,41 ± 1,36

DgVLC8 100.00 ±0.0 100.00 ±0.0 75,26 ± 9,57 46,82 ± 4,89 19,21 ±4,89

Dg VLC9 100.00 ±0.0 98.62 ± 1.38 17,44 ±9,29

Dg VLC10 100.00 ±0.0 85.71 ± 11.12 5,17 ± 1,72

(Datos subrayados: concentraciones muy activas) Tabla 15: Actividad antialimentaria de las fracciones VLC del aceite esencial de D. graveolens (DgPAe14LG) frente a R. padi (%S\).

Concentración (mg/ml)

Muestra 10 5 2,5 1 ,25 0,62 0,31

DgVLCI 59,18±8,76 5,45±6,59

DgVLC2 84,83±7,4 87,69±3,56 60,67±1 1 ,97 51 ,35+9,7

DgVLC3 62,88±8,27

DgVLC7 89,52±5,65 91 ,83±3,08 91 ,35±3,64 60,77±7,94 73,01 ±6,28 36,76±10,03

DgVLC8 89,82±5,65 91 ,96±5,27 76,03±6,61 42,33±10,27 30,88±7,78

Dg VLC9 85.07±4.01 84.86±4.26 67,51 ±6,19 30,2±8,31

Dg VLCI 0 91 ,19±2,77 82,79±3,76 66,16±6,35 45,02±8,54

(Datos subrayados: concentraciones muy activas)

La purificación mediante cromatografía de la fracción VLC7 permitió el aislamiento del compuesto minoritario nuevo 3-metilbutanoato de (Z)-3,7-dimetil-6-oxoocta-2,7-dien-1 -ilo (3), oxido de piperitenona (5) y τ-cadinol (4) (Fig. 5).

En la Tabla 16, por su parte, se muestra la composición química de la fracción VLC7, que destaca por el contenido en óxido de cariofileno y τ-cadinol como mayoritarios.

Tabla 16. Composición química (abundancia relativa %) de la fracción VLC7 activa del aceite esencial DgPAe14LG

17,18 Isovalerato de geranilo

17,33 NI

17,36 Oxido de cariofileno 35,3

17,97 NI 3,0

17,78 NI

18,34 NI

18,41 NI

18,50 T-Cadinol 47,6

18,55 NI

18,76 NI

18,78 Selin-1 -en-4a-ol

19,08 NI

19,19 NI

19,23 Caproato de geranilo

20,18 NI

25,07 NI

25,19 NI

NI: No identificado

En la Fig. 6 se muestran los efectos repelentes de τ-cadinol, borneol, carvacrol y óxido de cariofileno sobre adultos de H. lusitanicum. Según estos resultados la repelencia del aceite esencial de D. graveolens (DgPAe) podría deberse a su contenido en borneol (2). Tabla 17.- Actividad ixodicida (% mortalidad) de los compuestos 1 -7 frente a larvas de H. lusitanicum y concentración a la que se encuentran en el aceite esencial ensayado (dosis máxima).

Compuesto Concentración % PAe (mg/ml) PHO (mg/ml)

(mg/ml) Mortalidad

LG E LG E

2 Borneol 10 100.0±0.0 1 ,7 1 ,6 9,0 10,0

5 13,8±4,5

1 Acetato de 10 3,2±1 ,6 17 16 9,5 3,7 bornilo 33-metilbutanoato 20 100.00±0.0 tr tr tr tr de (Z)-3,7-dimetil-

6-oxoocta-2,7-dien-

1-ilo

10 98,55±2,5

5 56,89±14,7

1,25 19,54±17,7

7 Carvacrol 10 100,0±0,0 0,6 1,5

5 100,00±0,0

2,5 80.0±5.7

1,25 16,7 ±3,3

9 Timol 5 100.0 ±0.0 0,2

2,5 78,0±5,1

1,25 43,8±7,6

5 Oxido de 5 100.0 ±0.0 tr 0,8 piperitenona

2,5 100,0±0,0

1,25 100.0±0.0

0,62 47,5±14,3

0,31 0,2±3,1

0,15 0,0±0,0

6 Oxido de 10 100.0±0.0 0,3 0,5

cariofileno

5 100,0±0,0

2,5 62,5 ±7,2

1,25 0,00 ±0,0

4 T-Cadinol 10 100,0±0,0 1,0 0,6

5 100.0±0.0

2,5 100.0±0.0

1,25 17,4 ±5,8

8 Piperitenona 10 100.0±0.0 1,9

5 100.0±0.0

2,5 100.0±0.0

1,25 98.3±1.6

0,62 0,0±0,0

Datos subrayados: concentraciones muy activas. Tr: trazas. La actividad antialimentaria frente a R. padi (Tabla 18) del aceite esencial PAe y extracto PHO 2014 de la planta silvestre se debe al τ-cadinol 4.

Tabla 18. Actividad antialimentaria de los compuestos 1-9 frente a R. padi (%SI)

Compuesto Concentración (mg/ml)

5 2,5 1 ,25 0,62 0,31 0,16

1 Ac. bornilo 65,3±7,5

2 Borneol 45,1 ±8,7

3 3- 73 ₅ 6±7,7 75.7±7.1 55,1 ±6,8 40,6±5,5

metilbutanoato

de (Z)-3,7- dimetil-6- oxoocta-2,7- dien-1 -ilo

4 T-Cadinol 89.3±4.3 88.3±3.6 88.1 ±2. 81 .6±5.5 51 .0±6.5 29.9±7.5

5 0x. 74,7±6,5 62,4±7,4

piperitenona

6 0x. 80,1 ±5,0 34,7±8,1

cariofileno

7 Carvacrol 90,6±5,3 77,2±6,4 40,6±7,4

8 Piperitenona 44,5±6,6

9 Timol 40,60±7,44 65,6±6,4 38,5±10,5 12,3±4,0

(Datos subrayados: en continuo: concentraciones muy activas; en punteado: moderadas)

4.3. Estudio biodirigido del hidrolato fase orgánica de Dittrichia graveolens (PH)

En la fase orgánica del hidrolato (PHO) de planta silvestre se detectó la piperitenona (8), que ha resultado muy activa frente a la garrapata (ver Tabla 18 anterior). En el extracto DgPHO de planta cultivada se ha detectado la presencia de carvacrol (7) y timol (9) en pequeñas cantidades. Estos compuestos también se han ensayado y son muy activos frente a la garrapata y el nematodo.

El compuesto 8. También presenta una importante actividad antialimentaria frente a S. littoralis pero no frente a M. persicae (Tabla 19). También es muy activo frente a M. javanica (Tabla 20). Tabla 19. Actividad antialimentaria de los compuestos 1-5 y 7-8-9 frente a S.littoralis

Compuesto Concentración S, littoralis

(Mg/cm2) % FI

1 50 34,3±14,2

2 50 24,5 ± 7,8

3 50 52,92 ± 12,31

4 50 56,03 ± 10,82

5 50 78,89 ± 4,4

10 72,36 ± 9,9

2 66,54 ± 7,8

0.4 64,80 ± 2,9

0.08 36,70 ± 5,6

EC ₅₀ (Mg/cm ² ) 5.0 (1 .8. 13.5)

7 50 55,8 ± 1 1 ,8

8 50 91 ,8 ± 4,9

10 73,62 ± 7,7

2 53,57 ± 3,7

EC ₅₀ (Mg/cm ² ) 1 .4 (0.2. 9.9)

9 50 52,4 ± 13,1

(Datos subrayados: concentraciones muy activas)

Tabla 20. Efectos de los compuestos aislados (0,5 μ9 μΙ) en la mortalidad de juveniles infectivos (J2) de Meloidogyne javanica

Compuesto Mortalidad de J2 LC ₅₀ mg/ml_ ^B LCgo mg/mL ⁰

(%f (95% CL ^C ) (95% CL ^C )

1 4,05±0,68

2 2,06±0,95

3 10±1

4 8,90±1 ,86

5 100.00±0.00 0,04 (0,04-0,42) 0,05 (0,05-0,06)

6 7,95±1 ,51

7 100.00±0.00 0,15 (0,146-0,155) 0,21 (0,206-0,219)

8 100.00±0.00 0,15 (0,14-0,15) 0,24 (0,23-0,25)

9 100.00±0.00 0,14 (0,131 -0,143) 0,22 (0,210-0,232) ^a Los valores son medias de cuatro; ^b Mortalidad observada después de 72 h de tratamiento: para obtener LC ₅₀ y LC ₉₀ se usaron cinco concentraciones; ^C CL es el límite de confianza

(Datos subrayados: concentraciones muy activas) Referencias bibliográficas

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