本発明の細胞障害性組成物とは、IgG抗体� ��コードする遺伝子を導入されたトランスジ� ��ニック鳥類が産む卵から得られる抗体を有� ��成分とし、当該抗体のCDC活性、あるいは、C DC活性とADCC活性の両方により、ある種の疾病 、疾患に関与する細胞を破壊、死滅または不 活化し得る組成物を表す。

 トランスジェニック鳥類を作製するため� ��遺伝子導入法については、特に限定される� ��とはないが、ウイルスベクター法や精子ベ� ��ター法、PGC(始原生殖細胞)を使う方法が挙� �られる。

 本発明で使用するレトロウイルスベクタ� ��は、安全性を考慮して、複製能を欠失して� ��ることが好ましい。複製能の欠失方法とし� ��は、ウイルス粒子の複製に必要な内部コア� ��含まれるタンパク質(group specific antigen, gag )、逆転写酵素(polymerase, pol)及びエンベロー� �糖タンパク質(envelope, env)のうちいずれか又� ��その組み合わせが発現しないように、コー� ��配列または発現に必要な配列の少なくとも� ��部または全部を欠失するか、それらが発現� ��能なように置換、挿入変異を含むことが好� ��しい。

 レトロウイルスベクターは、ウイルス毎� ��挿入可能な遺伝子の長さが限定を受ける為� ��欠失変異が好ましく、安全性や挿入断片の� ��さを増やす観点から、gag、pol、envの複数を� ��失させることが好ましい。レトロウイルス� ��クターはウイルス粒子にパッケージされる� ��印として機能するウイルスパッケージング� ��グナル(phi)を含んでいることが好ましい。ga g領域の一部はウイルスパッケージングシグ� �ルとして機能することもあるため、ウイル� �力価向上の観点から、ウイルスベクターは� �現不能としたgag領域の少なくとも一部を含� �でいることが好ましい(J. Virol., 1987, 61(5),  1639-46)。

 レトロウイルスとしては特に限定されな� ��が、モロニーマウス白血病ウイルスやモロ� ��ーマウス肉腫ウイルスやトリ白血病ウイル� ��(ALV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来のウイ ルス等が挙げられる。鳥類の胚へ感染させる ため、マウス肝細胞ウイルス(MSCV)やマウス胚 性肝細胞ウイルス(MESV)等、胚細胞や肝細胞へ の感染性の高いウイルスを用いることが好ま しい。鳥類細胞にこのウイルスベクターを効 率的に感染させるため、外皮タンパク質を人 為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のVSV-G� ��ンベロープタンパク質とすることが好まし� ��が、このウイルスタイプに限定されるもの� ��はない。

 マーカー遺伝子は正しく遺伝子導入された� ��胞の同定及び単離の目印となるタンパク質� ��コードする遺伝子である。レトロウイルス� ��クターにはマーカー遺伝子が含まれていて� ��よい。マーカー遺伝子としては特に限定さ� ��ないが、グリーン・フルオレッセント・プ� ��テイン(GFP)やシアン・フルオレッセント・� �ロテイン(CFP)、ルシフェラーゼ等の蛍光タン パク質の遺伝子、ネオマイシン耐性(Neo ^r )、ハイグロマイシン耐性(Hyg ^r )ピュ-ロマイシン耐性(Puro ^r )等の薬剤耐性遺伝子、他にチミジンキナー� �、ジヒドロフォレート・レダクタ-ゼ、アミ� ��グルコシド・ホスホトランスフェラーゼ、� ��ロラムフェニコール・アセチルトランスフ� ��ラーゼ、β―ラクタマーゼ、β―ガラクトシ ダーゼ等の遺伝子が挙げられる。マーカー遺 伝子はプロモーター遺伝子や発現に必要な要 素を伴っていることが好ましい。

 外来性遺伝子は抗体タンパク質のコード� ��列を含み、コード配列の境界は5’末端の開 始コドン、及び開始コドンに対応する3’末� �の終始コドンにより決定される。5’末端の� ��始コドン近傍はコザックのコンセンサス配� ��を含むことが好ましい。コード配列の上流� ��はリボソーム結合部位が存在していること� ��好ましい。外来性遺伝子は鳥類細胞内で発� ��するために適当なプロモーター遺伝子の少� ��くとも一部または全部を含んでいることが� ��ましい。プロモーター遺伝子とは遺伝子の� ��写開始部位を決定し、またその頻度を直接� ��に調節する、DNAまたはRNA上の領域のことで� ��る。

 抗体分子は抗原の構造に合わせて変化す� ��結合領域と、比較的変化の少ない定常領域� ��らなり、定常領域の構造の違いによってい� ��つかの種類(クラス)に分類される。哺乳類� �、定常領域の構造の違いによりIgG、IgE、IgA� �IgM、IgDの5種類のクラスがあり、それぞれに� ��理活性も異なっている。さらにIgA,IgGはサブ クラスに分けられる。

 抗体医薬品としては、血中寿命が長く効� ��の高いIgG1クラスの抗体が用いられるため、 本発明でトランスジェニック鳥類に導入され る抗体の遺伝子としてはIgG1クラスの抗体の� �造遺伝子が好ましい。またトランスジェニ� �ク鳥類が産む卵中への蓄積効率の観点から� �、IgG1クラスの抗体は優れている。ほかに卵� ��での蓄積がよいことから、ヒトIgGクラスの� ��常領域をもつ抗体の遺伝子や、ヒトIgG1、ウ ズラIgG2、ニワトリIgG2やマウスIgG2のサブクラ スの定常領域をもつ抗体の遺伝子など外来性 抗体の構造遺伝子が好ましい。

 他の好ましい抗体構造遺伝子としては、� ��間キメラ抗体の構造遺伝子が挙げられる。� ��こでいう種間キメラ抗体とは、2種以上の異 なる生物種の遺伝形質から構成される同一の IgGサブクラス間の雑種抗体のことをいう。従 来マウスハイブリドーマによって作製された 医療用抗体は、マウス由来であるためヒト体 内に投与されると免疫系による拒絶反応が引 き起こされるという問題があった。この欠点 を解消するため、例えばマウス(げっ歯類)抗� ��を組換え手法によってFc部等をヒト化する� �とにより、拒絶反応のリスクを大幅に軽減� �ることができる。

 上記種間キメラ抗体としては、例えば抗� ��トCD2抗体、抗CD20受容体抗体、抗TNF抗体など が挙げられ、すでに医薬品として上市されて いるものもある。さらに近年では全てのアミ ノ酸配列がヒト抗体由来である完全ヒト型抗 体が医薬品として実用化されており、本発明 により製造する抗体として好ましいと言える 。

 本細胞障害性組成物の利用分野としては� ��薬品用途が考えられる。抗腫瘍剤や癌疾患� ��改善または治療剤としては、癌細胞に特異� ��に発現する抗原を認識し、癌細胞を破壊す� ��制癌用途に用いられる抗体を有効成分とし� ��含むことが好ましい。癌細胞は正常細胞と� ��構造の違いが少ないため特異的に除去する� ��が難しいが、その細胞表面に特異的に発現� ��る抗原タンパクの存在が明らかになり、抗� ��によって認識する診断や治療が可能になっ� ��きている。

 また、本発明の細胞障害性組成物の有効� ��分としては、自己抗原に反応するエフェク� ��ー細胞を中和・抑制する自己免疫疾患治療� ��体も好ましい。この場合、本発明の細胞障� ��性組成物は抗リウマチ剤等の自己免疫疾患� ��改善または治療剤として用いることができ� ��。

 このような抗体は、単に標的細胞を認識� ��るだけでなく、標的細胞の機能を不活化す� ��必要があり、このときに重要な役割を果た� ��のが、先に述べた抗体依存性細胞障害(ADCC)� ��性や補体依存性細胞障害(CDC)活性である。� �体依存性細胞障害活性とは、標的細胞に結� �した抗体が補体系を活性化させ、補体のも� �酵素によって効果的に標的細胞を溶解する� �用であり、近年抗体医薬品の研究により制� �作用の発現に重要な役割を果たしている事� �知られてきた。

 CHO細胞で作製されたIgG抗体などよりも補� ��依存性細胞障害活性を高められたモノクロ� ��ナル抗体は、標的となる癌細胞を効果的に� ��壊することにより投与量を低く抑えられる� ��め、副作用を小さくして患者のQOLを高める� ��とが可能であり、また製造コストを抑制す� ��ことにより患者負担の軽減につながる。抗� ��組成物のCDC活性が、CHO細胞で生産した抗体� ��成物に比べて5倍以上であるとき、本願発明 の細胞障害性組成物に好適に用いることがで きる。また、抗体組成物のCDC活性が、CHO細胞 で生産した抗体組成物に比べて10倍以上であ� ��とき、本願発明の細胞障害性組成物にさら� ��好適に用いることができる。

 抗体組成物のN-グリコシド結合複合体糖� �のフコース含量が、CHO細胞由来抗体の5分の1 以下であるとき、好適に用いることができる し、10分の1以下であるとき、さらに好適に用 いることができる。

 導入される構造遺伝子の発現を制御する� ��めには、組織特異的なプロモーター遺伝子� ��が用いられる。組織特異的なプロモーター� ��伝子とは、鳥類の特定の組織・細胞で特別� ��活性の強いプロモーター遺伝子のことであ� ��。組織特異的なプロモーター遺伝子を用い� ��ことにより、目的タンパク質の発現が鳥類� ��発生や生存に悪影響を与える可能性を減少� ��たは排除できる利点がある。組織特異的な� ��ロモーター遺伝子としては特に限定されな� ��が、卵管特異的なプロモーター遺伝子をあ� ��ることができる。卵管組織は性成熟後に活� ��に活動することから性成熟後に強く誘導さ� ��ることが多い。

 卵管特異的なプロモーター遺伝子として� ��類由来のオボアルブミン、オボトランスフ� ��リン、オボムコイド、オボムチン、リゾチ� ��ム、G2グロブリン、G3グロブリン、オボイン ヒビター、オボグリコプロテイン、オボフラ ボプロテイン、オボマクログロブリン、シス タチン、アビジンのプロモーター遺伝子等を あげることができる。これらの卵管特異的な プロモーター遺伝子を用いた場合、目的タン パク質を卵白中に高発現させることができる ことが特に好ましい。

 このほかのプロモーターとしては、組織� ��特異的なプロモーターがある。組織非特異� ��なプロモーター遺伝子とは、組織特異的な� ��ロモーター遺伝子でないプロモーター遺伝� ��のことである。組織非特異的なプロモータ� ��遺伝子としては特に限定されないが、鳥類� ��ほぼ全ての体細胞で活性のあるものをいう� ��その場合、目的タンパク質は血中にも発現� ��るため雛の段階で発現の可否を検出できる� ��いう利点がある。組織非特異的なプロモー� ��ー遺伝子としては特に限定されないが、β� �クチンプロモーター遺伝子、EF1αプロモータ ー遺伝子、チミジンキナーゼプロモーター遺 伝子やシミアンウイルス40(SV40)プロモーター� ��伝子、サイトメガロウイルス(CMV)プロモー� �ー遺伝子、ラウスザルコーマウイルス(RSV)プ ロモーター遺伝子等のウイルス由来プロモー ター遺伝子が挙げられる。他に、テトラサイ クリン誘導型プロモーター遺伝子のような、 組織非特異的な誘導型プロモーター遺伝子を もちいても良い。

 外来性遺伝子は転写エンハンサー及び/又 は調節エレメントを含んでいてもよい。転写 エンハンサーはプロモーター遺伝子からの転 写を促進する配列であるが、単独では転写を 起こせないDNAまたはRNA上の領域のことである 。本来機能しているものとは異なるプロモー ター遺伝子に連結した場合にも機能すること が多いのでプロモーター遺伝子との組み合わ せについては限定しない。転写エンハンサー としては、特に限定されないが、SV40、CMV、� �ミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド� �答エレメントやリゾチームエンハンサー等� �挙げられる。調節エレメントは転写調節や� �転写後のRNAの安定化に寄与する単独では転� �を起こせないDNAまたはRNA上の領域のことで� �る。調節エレメントとしては特に限定され� �いが、WPRE(ウッドチャック肝炎ウイルス由来 調節エレメント、米国特許6136597号公報)等が� ��げられる。

 また外来性遺伝子は上記以外の非翻訳領� ��を含んでもよい。

 パッケージング細胞又はヘルパーウイル� ��等を利用することにより調製されたシュー� ��タイプのウイルスベクターは、通常のマイ� ��ロインジェクション法(Bosselman, R. Aら、Scie nce 243, 533 (1989))により、初期胚、血管内、� ��臓内へ導入される。遺伝子導入法としては� ��この他にもリポフェクションやエレクトロ� ��レーション法等が考えられるがマイクロイ� ��ジェクション法は操作性、導入効率の高さ� ��点で好ましい。

 外来性遺伝子としては特に限定されず、� ��類以外の遺伝子はもちろん、鳥類のものを� ��んでも良い。トランスジェニック作製に用� ��る個体が有する配列であっても、その個体� ��本来有する全遺伝子にあらたに遺伝子を導� ��するので外来性遺伝子と呼ぶ。

 複製能欠失型レトロウイルスベクターを� ��染させる胚は、孵卵開始から24時間以上経� �していることが望ましい。より望ましくは� �卵開始から32時間以後72時間以前の胚である� ��更に望ましくは、48時間以後64時間以前の胚 である。感染させる、つまりウイルス液を導 入する場所としては、心臓内あるいは血管内 が好ましい。遺伝子導入効率の高いG0トラン� ��ジェニックキメラ鳥類を作製する上で、心� ��の拍動を観察することができる初期の段階( 心臓が拍動を開始してから6時間以内)に、遺� ��子を導入することが好ましい。そして、そ� ��は血流に乗せて全身に遺伝子を運ぶという� ��点と、細胞数が少ないという観点による。

 マイクロインジェクションは顕微鏡下で� ��端を細くした微小ガラス管等を用い、特定� ��場所に直接ウイルス液を導入する方法であ� ��。本研究では、心臓や血管という特定の場� ��にウイルス液を導入するため、リポフェク� ��ョン法やエレクトロポレーション法といっ� ��他の遺伝子導入法より好ましい。

 本発明で使用する鳥類としては特に限定� ��れないが、家畜として利用可能な家禽鳥類� ��あることが好ましい。家禽鳥類としては、� ��ワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラ� ��アヒル等を挙げることができる。なかでも� ��ワトリは入手が容易で、産卵種としても多� ��であり、卵も大きく大量飼育方法が確立し� ��いる点で特に好ましい。

 生殖細胞に外来性遺伝子を保有するG0ト� �ンスジェニックキメラ鳥類を野生型鳥類、� �はG0トランスジェニックキメラ鳥類又はその 子孫と交配させ、孵化したヒナを選別するこ とによりG1トランスジェニック鳥類を得るこ� ��ができる。G0トランスジェニックキメラ鳥� �は全ての細胞に外来性遺伝子が導入される� �率は低く、ほとんどの場合外来性遺伝子が� �入された細胞と野生型の細胞との異なる遺� �子型の細胞が共存しているキメラ状態であ� �。一方で、G1トランスジェニック鳥類は、好 ましくは、全ての体細胞に均一に導入遺伝子 を保有している。体細胞や生殖細胞への遺伝 子導入の確認は血や体細胞や精子や卵由来の DNAやRNAをPCR法等によって調べることによって 確認できる。また、目的タンパク質の発現か らも判断できる。目的タンパク質の発現はELI SA法や電気泳動法、目的タンパク質の活性測� ��等によって調べる事ができる。

 G2以降の世代のトランスジェニック鳥類� �、G1トランスジェニック鳥類を交配させるこ とにより作製される。交配型はG1トランスジ� ��ニックオスと野生型メス、G1トランスジェ� �ックメスと野生型オス、G1トランスジェニッ クのオスとメス等が考えられ、さらに子孫と その親による戻し交配も可能である。なかで もG1オスと野生型メスの交配型は、1羽のG1オ� ��に対し複数の野生型メスを交配させること� ��できるため、効率の点から好ましい。

 本発明の目的タンパク質生産法は、前述� ��トランスジェニック鳥類から目的タンパク� ��を回収することを特徴とする。より詳細に� ��、作製されたトランスジェニック鳥類の血� ��及び/又は卵中から因子を抽出、精製するこ とを特徴とする。

 精製は、トランスジェニック鳥類の卵と� ��に卵白成分を純水もしくは平衡塩類溶液で� ��釈した溶液からカラム法やろ過法で行うこ� ��を特徴とする。希釈は卵白の粘性を低減し� ��カラム法を円滑に行う目的で行われ、粘性� ��減のためには高倍に希釈することが望まし� ��反面、容積が増えると回収が困難になるこ� ��から、2倍から10倍が好ましく、5倍から6倍� �希釈するのがより好ましい。

 この卵白溶液から目的とする抗体組成物� ��回収するため、プロテインAカラム法、塩析 法、吸着カラムクロマトグラフ法、イオン交 換カラムクロマトグラフ法、ゲルろ過カラム クロマトグラフ法、抗体カラム法を単独、も しくは組み合わせて精製するが、これらのみ に限定されるものではない。吸着クロマトグ ラフ法としては、ブルーセファロースクロマ トグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー 等があり、イオン交換カラム法としては、陰 イオン交換クロマトグラフィー法等がある。