Dominio de la técnica La invención pertenece al campo de los fungicidas agrícolas.

Estado anterior de la técnica Numerosas especies de hongos son capaces de actuar como patógenos sobre cultivos de gran importancia económica. Con el fin de prevenir y reducir enfermedades provocadas por hongos patógenos se han desarrollado un gran número de compuestos con actividad fungicida.

Los hongos del género Botrytis son fitopatógenos de considerable importancia comercial por las graves pérdidas que ocasionan. Dicho género incluye diversas especies tales como B. cinerea, B. allii, B. byssoidea y B. squamosa. B. cinerea presenta un especial interés, ya que es el responsable de la infección generada en frutos tales como la uva y la fresa, hortalizas como judías, tomates y lechugas, y plantas ornamentales tales como geranios, rosas y tulipanes.

También, las especies de hongos fitopatógenos pertenecientes al género Colletotrichunz son consideradas de las más importantes en agricultura debido a la diversidad de especies vegetales que pueden ser afectadas y la magnitud de los daños ocasionados sobre las plantas. Presenta una amplia distribución en todos los continentes, siendo muy graves sus daños en las áreas tropicales y subtropicales del planeta debido a las condiciones ambientales de estas regiones, con temperaturas que van desde medias hasta altas, humedad relativa significativa y lluvias frecuentes que favorecen la dispersión y el desarrollo del patógeno.

Otro hongo de vital importancia en agricultura es Phytopthora infestans, debido a las serias pérdidas producidas en cosechas de patata y tomate, siendo considerado en la actualidad como uno de los mayores fitopatógenos en estos cultivos.

Por otra parte, en los últimos años, la aparición de nuevas variedades de cultivos, con elevados rendimientos y escasa variabilidad genética, así como algunos cambios en las técnicas de cultivo han conllevado la propagación de severas enfermedades criptogámicas, como la causada por el fitopatógeno Pyricularia oryzae en el cultivo del arroz.

No obstante, también debemos considerar los daños producidos por enfermedades fúngicas provocadas por otros hongos fitopatógenos, como los de los géneros Septoria, Drechslera, Alternaria, Fusarium, Cochliobolus, Rizoctonia, etc.. .

La gran adaptabilidad que presentan las diferentes especies de hongos fitopatógenos a fungicidas comerciales ha conducido a un aumento en las cantidades empleadas de estos compuestos, con los consiguientes problemas añadidos de persistencia en el suelo e incorporación a la cadena alimentaria.

Por tanto, se hace necesaria la búsqueda de nuevos fungicidas de bajo impacto ecológico y nuevos métodos que conduzcan a la prevención y al control racional de estos fitopatógenos.

Explicación de la invención La invención comprende compuestos con la fórmula general I (Figura 1), caracterizados por la presencia de un anillo bencénico fusionado a una cadena exocíclica sustituida en el C-2, presentando un grupo hidroxilo secundario sobre el carbono adyacente a dicho núcleo aromático. Con esta estructura base distinguimos dos grandes grupos de compuestos :

1. Compuestos para-sustituidos en el anillo bencénico (II, Figura 2).

2. Compuestos meta-sustituidos en el anillo bencénico (M, Figura 2).

Siendo los sustituyentes R1 y R2 los siguientes : R1= flúor, cloro, bromo, yodo, NO2, hidroxilo, metoxilo, etoxilo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,-SH,-CN.

R2= Alquilos como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo o los diferentes isómeros de butilo, pentilo y hexilo.

Cicloalquilos como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.

Alquenilos, ya sea cadenas lineales o ramificadas, como vinilo, prop-1- enilo, prop-2-enilo y los diferentes isómeros de butenilo, pentenilo y hexenilo.

Alquinilos como etinilo, propinilo y los isómeros de butinilo, pentinilo y hexinilo.

Derivados aromáticos como fenilo, bencilo o fenilos sustituidos con grupos como flúor, cloro, bromo, yodo, NO2, hidroxilo, metoxilo, etoxilo, metilo, etilo, n-propilo,-SH,-CN, etc.

La invención comprende también los compuestos enantioméricamente puros derivados de la diferente disposición del grupo hidroxilo presente en el carbono adyacente al núcleo aromático, tanto en su configuración S como R.

Para preparar compuestos de fórmula general I se puede emplear el siguiente procedimiento :

Partiendo de las cetonas correspondientes (Figura 3) es posible obtener, mediante reducción con NaBH4, los compuestos II y m.

En cambio, los compuestos enantioméricamente puros son obtenidos a través de dos metodologías distintas (ver, por ejemplo, Bustillo, A. J.; Aleu, J; Hernández-Galán, R. ; Collado, I. G. ; Tetrahedron : Asymmetry, 2002, 13, 1681-1686) : a) Reducción asimétrica de las cetonas comerciales mediante métodos enzimáticos a través del uso de la levadura Saccharomyces cerevisiae (obtención de los alcoholes con configuración S) o mediante resolución cinética de los alcoholes racémicos (Figura 3) a través del uso de las lipasas de Pseudomonas cepacia (PS) y de páncreas de cerdo (PPL) (obtención de los alcoholes con configuración R). b) Reducción química asimétrica mediante el catalizador (R)- metiloxazaboralidina y (S) -metiloxazaboralidina (Figura 3).

Estos compuestos, de fórmula general I (II y III), son capaces de prevenir una posible infección fúngica, o bien reducir el crecimiento del hongo, por aplicación de cantidades suficientes de los mismos. Con preferencia, los compuestos descritos se emplean para reducir o prevenir el crecimiento de hongos fitopatógenos ; sin embargo, también se pueden utilizar para inhibir el crecimiento fúngico en diversas aplicaciones no agrícolas (por ejemplo, para reducir daños por humedad sobre madera, pinturas, etc).

Breve descripción de las figuras.

Para la mejor comprensión de lo descrito en esta memoria, se acompañan una serie de figuras que describen los compuestos a los que se hace referencia a lo largo del texto.

La Figura 1 describe compuestos con la fórmula general I caracterizados por la presencia de un anillo bencénico fusionado a una cadena exocíclica sustituida en el C-2,

presentando un grupo hidroxilo secundario sobre el carbono adyacente a dicho núcleo aromático.

La Figura 2 describe la fórmula II, correspondiente a compuestos para- sustituidos en el anillo bencénico y la fórmula la correspondiente a compuestos para- sustituidos en el anillo bencénico.

La Figura 3 describe el esquema sintético correspondiente a la preparación enantioselectiva de los compuestos objeto de la invención.

La Figura 4 describe la fórmula 1 correspondiente al compuesto denominado 4- cloropropiofenona y la fórmula 2 correspondiente al compuesto denominado ()-4'- clorofenilpropan-1-ol.

La Figura 5 describe las fórmulas 3,4 y 5, correspondientes a los compuestos denominados (S)- (+)-4'-clorofenilpropan-1-ol, acetato de (R)- (+)-1- (4'- clorofenil) propilo y (R)- (+)-4'-clorofenilpropan-1-ol, respectivamente.

La Figura 6 describe la fórmula 6 correspondiente al compuesto denominado (R)-1- (4'-clorofenil)-2-feniletanol.

La Figura 7 describe la fórmula 7 correspondiente al compuesto denominado (S)-1- (4'-clorofenil)-2-feniletanol.

Así mismo, se incorporan una serie de tablas. La Tabla 1 describe los diferentes sustituyentes que pueden presentar los compuestos de esta invención.

La Tabla 2 describe los datos de porcentaje de inhibición (I %) para el compuesto 6 frente a Botrytis cinerea.

La Tabla 3 describe los datos de porcentaje de inhibición (I %) para el compuesto 7 frente a Botrytis cinerea.

La Tabla 4 describe los datos de máxima actividad fungicida frente a diferentes hongos fitopatógenos para los compuestos derivados del feniletanol (Figura 1).

Modo de realización de la invención. Ejemplo de preparación y actividad.

Ejemplo 1. Preparación del compuesto 2 (Figura 4).

500 mg de la cetona 4'-cloropropiofenona (1) (Figura 4), disuelta en 100 mL de una mezcla diclorometano : metanol (1 : 1) es tratada, a temperatura ambiente, con 200 mg de NaBH4. Tras la desaparición total del material de partida (aprox. 24 horas) la mezcla resultante es llevada a sequedad, adicionándosele posteriormente agua. A continuación es extraída con acetato de etilo, realizándose previamente su neutralización con HCl diluido. La fase orgánica se lava con salmuera y se seca sobre sulfato sódico anhidro. Tras evaporar el disolvente a presión reducida, se obtiene el compuesto 2.

Datos espectroscópicos del compuesto 2 : [α]D20(CHCl3, c=3. 5 mg/mL) : 0 IR (film) : 3364,2965, 1492, 825 cm\ EM Wz (int. rel.) : 172 (M+2, 16), 170 (t, 50), 143 (82), 141 (100), 115 (59), 113 (85), 77 (80).

RMN (200 MHz, CDC13) : 8 0.84 (3H, t, J=7.5 Hz, H-3), 1.68 (2H, m, H-2), 3.06 (1H, s, OH), 4.47 (1H, t, J=6.7 Hz, H-1), 7.15-7. 30 (4H, m, H arom., J=8.3 Hz, J=8. 9 Hz).

13C_RMN (50 MHz, CDC13) : 8 9. 8 (c, C-3), 31. 7 (t, C-2), 75.0 (d, C-1), 127.3 (d, 2C arom.), 128. 3 (d, 2C arom. ), 132. 8 (s, C-1'), 142.8 (s, C-4').

Ejemplo 2. Preparación del compuesto 3 (Figura 5).

En un vaso de precipitados de 2 litros se mezclan 250 g levadura de pan, 100 g de D-glucosa y 1 L de agua a una temperatura de 40°C. Después de 20 min bajo agitación magnética, se adiciona 1 g de 4-cloropropiofenona (1) (Figura 5) disuelto en 8 mL de alcohol alílico y 12 mL de hexano. Después de 48 horas de reacción a la mezcla resultante se le adiciona 1 L de acetato del etilo y es filtrada a presión reducida a través de un embudo Büchner sobre una capa de Celita, lavándose con el mismo disolvente.

Posteriormente es extraída tres veces con acetato del etilo, y la fase orgánica secada sobre Na2S04 anhidro. La posterior evaporación del disolvente nos conduce a una mezcla de reacción que es purificada mediante cromatografía en columna, utilizando gel de sílice con gradientes crecientes de acetato de etilo en éter de petróleo, obteniéndose el compuesto 3 (92 % ee).

Datos espectroscópicos del compuesto 3 : alD (CHC13, c=3 mg/mL) :-30. 3 IR (film) : 3364,2965, 1492, 825 cm\ EM m/z (int. rel.) : 172 (mu+2, 16), 170 (M+, 50), 143 (82), 141 (100), 115 (59), 113 (85), 77 (80).

1H-RMN (200 MHz, Cd13) : 5 0. 84 (3H, t, J=7.5 Hz, H-3), 1. 68 (2H, m, H-2), 3.06 (1H, s, OH), 4.47 (1H, t, J=6.7 Hz, H-1), 7.15-7. 30 (4H, m, H arom., J=8.3 Hz, J=8. 9 Hz).

I3C-RMN (50 MHz, CDC13) : 8 9.8 (c, C-3), 31.7 (t, C-2), 75.0 (d, C-1), 127.3 (d, 2C arom. ), 128.3 (d, 2C arom. ), 132. 8 (s, C-1'), 142.8 (s, C-4').

Ejemplo 3. Preparación del compuesto 5 (Figura 5).

Acetilación enzimática del (~)-1-(4'-clorofenil)propan-1-ol con la lipasa PS 1 g de (+)-1-(4'-clorofenil) propan-1-ol (2) es disuelto en 50 mL de TBME y 20 mL de acetato de vinilo, adicionándole posteriormente, a temperatura ambiente, 1 g de lipasa de Pseudomonas cepacia (PS). Tras 168 horas de reacción, la mezcla resultante se filtra sobre celita en un embudo Büchner, evaporando posteriormente el disolvente a presión reducida. Con ello se obtiene un crudo de reacción, que al ser purificado por cromatografia en columna, empleando gel de sílice con gradientes crecientes de acetato de etilo en éter de petróleo, da el compuesto 4.

Datos espectroscópicos del compuesto 4 : [C] D (CHC13, c=2. 3 mg/mL) : + 75 IR (film) : 2972, 1738, 1238, 822 cm-l.

EM n2/: (int. rel.) : 214 (M+2, 3), 212 (W, 8), 185 (M+2-29, 6), 183 (M-29, 19), 172 (M'+2-COCH3, 4), 170 (M+-COCH3, 11), 143 (28), 141 (98), 127 (21), 125 (65), 117 (100), 77 (32).

1H-RMN (200 MHz, CDCI3) : 8 0.84 (3H, t, J=7. 3 Hz, H-3), 1. 80 (2H, m, H-2), 2.05 (3H, s, COCH3), 5.59 (1H, t, J=6. 7 Hz, H-1), 7.15-7. 35 (4H, m, H arom.).

13C-RMN (50 MHz, CDCl3) : 8 9. 8 (c, C-3), 21.2 (c, COCH3), 29.1 (t, C-2), 76.6 (d, C-1), 127.9 (d, 2C arom.), 128. 5 (d, 2C arom.), 133.5 (s, C-1'), 139.0 (s, C-4'), 170.3 (s, CO).

Hidrólisis química del acetato de (R)-(+)-1-(4'-clorofenil)propilo (4) 215 mg del compuesto 4 disueltos en metanol, son tratados con 71 mg de KOH a temperatura ambiente. Tras dos horas de reacción se le adiciona agua a la mezcla resultante, la cual es extraída con acetato de etilo y secada sobre Na2SO4 anhidro. Tras evaporar el disolvente a presión reducida, se obtiene un crudo de reacción que al ser

purificado por cromatografía en columna, empleando gel de sílice con gradientes crecientes de acetato de etilo en éter de petróleo, da el compuesto 5.

Datos espectroscópicos del compuesto 5 : a] (CDCl3, c=2. 4 mg/mL) : + 27.3 IR Vmax (film) : 3374,2966, 1492,825 cm~l.

EM m/z (int. rel.) : 172 (M++2, 4), 170 (M+, 14), 143 (55), 141 (100), 115 (61), 113 (95), 77 (87).

1H-RMN (200 MHz, CDCl3) : # 0.84 (3H, t, J=7.3 Hz, H-3), 1.68 (2H, m, H-2), 2. 38 (1H, s, OH), 4.49 (1H, t, J=6. 7 Hz, H-1), 7.15-7. 30 (4H, m, H arom., J=8.1 Hz, J=8. 6 Hz).

13C_RMN (50 MHz, CDCl3) : 8 9.9 (c, C-3), 31.8 (t, C-2), 75.1 (d, C-1), 127.3 (d, 2 C arom.), 128. 4 (d, 2 C arom. ), 132.9 (s, C-1'), 142.9 (s, C-4').

Ejemplo 4. Preparación del compuesto (vit)-1- (4'-clorofenil)-2-feniletanol (6) (Figura 6) Bajo atmósfera de argón, un matraz Schlenk es cargado con 0, 07 mL de (R)- metil oxazaboralidina (disolución 1-1.5 M en tolueno) y 11 mL de tetrahidrofurano (THF), siendo posteriormente tratado a 0°C con 1 mL de BH3-THF (disolución 1,0 M en THF), y dejándose agitar durante 2 horas. Después de dicho tiempo la mezcla resultante se hace reaccionar con 155 mg del compuesto bencil 4-clorofenil cetona, adicionándose ambos simultáneamente durante un periodo de una hora sobre otro matraz Schlenk, colocado a una temperatura de 30°C. Tras dos horas más de reacción se adicionó a dicha mezcla de reacción 3 mL de metanol, evaporando posteriormente el disolvente a presión reducida. El crudo resultante de reacción es purificado por cromatografia en columna, empleando gel de sílice con gradientes crecientes de acetato de etilo en éter de petróleo, obteniéndose el compuesto 6.

Datos espectroscópicos del compuesto 6 : Sólido blanco, cristalino.

PF : 46-48 °C.

[α]D20(CDCl3, c=2. 0 mg/mL) : + 26 IR vm"> (film) : 3398,3026, 2919, 2872, 1089 cm-'.

EM Wz (int. rel.) : 214 (45), (M+018, 45), 179 (45), 178 (52), 141 (35), 139 (30), 111 (23), 91 (100), 77 (48).

1H-RMN (200 MHz, CDC13) : # 2.94 (1H, dd, J=13. 7,8. 3 Hz, H-2a), 3.03 (1H, dd, J=13.6, 5.1 Hz, H-2p), 4.9 (1H, dd, J=8. 3,5. 2 Hz, CH-1), 7.16 (2H, d, J=6.7 Hz, H-2', 6'), 7.24-731 (7H, m, H arom, H-3', 5', 2", 6", 3", 5", 4").

13C_RMN (100 MHz, CDCl3) : 8 46.11 (t, C-2), 74.64 (d, C-1), 126. 78 (d, C- 4"), 127.29 (d, C-2", 6"), 128.51 (d, C-3", 5"), 128. 60 (d, C-2', 6'), 129.49 (d, C- 3', 5'), 133.23 (s, C-4'), 137.49 (s, C-1'), 142.19 (s, C-1'').

Ejemplo 5. Preparación del compuesto (S)-1-(4'-clorofenil)-2-feniletanol (7) (Figura 7) Bajo atmósfera de argón, un matraz Schlenk es cargado con 0,07 mL de (S)- metil oxazaboralidina (disolución 1-1.5 M en tolueno) y 11 mL de tetrahidrofurano (TIF), siendo posteriormente tratado a 0°C con 1 mL de BH3-THF (disolución 1,0 M en THF), y dejándose agitar durante 2 horas. Después de dicho tiempo la mezcla resultante se hace reaccionar con 155 mg del compuesto bencil 4-clorofenil cetona, adicionándose ambos simultáneamente durante un periodo de una hora sobre otro matraz Schlenk colocado a una temperatura de 30°C. Tras dos horas más de reacción se adicionó a dicha mezcla de reacción 3 mL de metanol, evaporando posteriormente el disolvente a presión reducida. El crudo resultante de reacción es purificado por cromatografla en columna, empleando gel de sílice con gradientes crecientes de acetato de etilo en éter de petróleo, obteniéndose el compuesto 7.

Datos espectroscópicos del compuesto 7 : Sólido blanco, cristalino.

PF : 46-48 °C. a] D (CDC13, c=2.9 mg/mL) : -23 IR VmaX (film) : 3398,3026, 2919,2872, 1089 cm-'.

EM m/z (int. rel.) : 214 (45), (M+-18, 45), 179 (45), 178 (52), 141 (35), 139 (30), 111 (23), 91 (100), 77 (48).

1H-RMN (200 MHz, CDCl3) : # 2.94 (1H, dd, J=13.7, 8.3 Hz, H-2a), 3.03 (1H, dd, J=13.6, 5.1 Hz, H-2ß), 4.9 (1H, dd, J=8.3, 5.2 Hz, CH-1), 7.16 (2H, d, J=6. 7 Hz, H-2', 6'), 7.24-731 (7H, m, H arom, H-3', 5', 2", 6", 3", 5", 4").

13C_RMN (100 MHz, CDC13) : 8 46. 11 (t, C-2), 74.64 (d, C-1), 126. 78 (d, C- 4''), 127.29 (d, C-2", 6"), 128.51 (d, C-3", 5"), 128.60 (d, C-2', 6'), 129.49 (d, C- 3', 5'), 133.23 (s, C-4'), 137.49 (s, C-1'), 142.19 (s, C-1'').

Ejemplo 6. Ensayos de actividad antifúngica"in vitro"de los compuestos.

Un medio de cultivo denominado agar-malta es empleado como sustrato para el crecimiento de B. cinerea. Una preparación típica de este medio consiste en 20 g de glucosa, 20 g de extracto de malta y 1 g de peptona que se disuelven en un litro de agua destilada o desionizada. Seguidamente se ajusta la acidez del medio a pH 6.5-7. 0, añadiéndose luego 20 g de agar. Tras ser este medio esterilizado y dejado enfriar hasta unos 45-50°C, se toman alícuotas de 10 mL, a las que se añaden volúmenes de 20 tilde etanol, que contienen concentraciones de 25,50, 75,100 ó 150 ppm del producto objeto del bioensayo. Cada concentración se probó por triplicado, de igual manera que los controles, para los que se añadieron 20 pLI de etanol al medio, sin adicionar producto.

Las mezclas todavía líquidas de medio y producto se vierten, en condiciones de esterilidad, sobre placas Petri de 60 mm de diámetro. Una vez que se han enfriado éstas, se saca del centro de las mismas un cilindro de unos 5 mm de diámetro, siendo

reemplazado éste por otro de idénticas dimensiones, pero recubierto por un cultivo de B. cinerea de 24 horas de antigüedad.

Tras esta operación, las placas se disponen en las condiciones óptimas para el crecimiento del micelio (aprox. 25-28°C, con iluminación continua), procediéndose cada 24 horas a la medida del diámetro promedio de la colonia, para cada concentración y réplicas. Esto permite obtener una serie de relaciones de crecimiento del micelio, para cada concentración y día.

Se presentan los mejores resultados del porcentaje de inhibición tras 3 y 6 días de bioensayo (ver Tablas 2 y 3).

El porcentaje de inhibición, a la dosis indicada se obtuvo aplicando la fórmula : I =100 (C-T)/C donde : I = porcentaje de inhibición C= diámetro promedio de la colonia control.

T= diámetro promedio de la colonia objeto del tratamiento.

Ejemplo 7. Ensayos"in vitro"de actividad fungicida frente a diferentes especies de hongos fitopatógenos.

Un medio de cultivo líquido constituido por un 2% de extracto de malta en agua destilada es empleado como sustrato para el crecimiento de los diferentes hongos fitopatógenos. Tras ser este medio esterilizado y dejado enfriar se le adiciona a una concentración de 125 ppm el producto objeto del bioensayo en un pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos.

Sobre dichos pocillos se inocula un número definido de conidios de los hongos fitopatógenos : Plzyptopthora infestans, Botrytis cinerea, Pyricularia oryzae, Septoria triciti, Drechslera teres, Colletotrichum lagenarium, Alternaria sola i, Fusarium culmorum, Cochliobolus m'ryabeanus y Rhizoctonia solani.

Tras esta operación, las placas se disponen en las condiciones óptimas para el crecimiento del micelio (aprox. 25-28°C, con iluminación continua), procediéndose a la medida fotométrica del crecimiento de la colonia después de 7 días.

Se presentan los mejores resultados del porcentaje de inhibición tras 7 días de crecimiento obtenidos con estos compuestos (ver Tabla 4).