MATERIAUX DE COMBLEMENT OSSEUX ET DENTAIRE DESINFECTANTS

COMPRENANT DES LIPOSOMES

La présente invention concerne le domaine des matériaux de comblement osseux ou dentaire comprenant des liposomes leur conférant un pouvoir désinfectant. Ces matériaux de comblement sont notamment utilisés pour le comblement de la pulpe dentaire ou de défaut osseux.

Etat de la technique

L'os est un tissu relativement résilient qui possède de hautes capacités régénératives comparé à d'autres tissus. Dans des conditions physiologiques, l'os est capable de se régénérer quand il s'agit de petits défauts de structure. Par ailleurs, la destruction osseuse résultant de maladies, de résections tumorales, d'infections ou de traumas nécessite une intervention chirurgicale impliquant le remplacement d'os cliniquement viable, qui peut être d'origine autogène, allo génique, xéno génique ou synthétique. Le handicap lié à la récession du tissu osseux est donc une préoccupation majeure tant en orthopédie qu'en chirurgie orale/maxillo-faciale.

En chirurgie dentaire depuis l'essor de l'implantologie et de la parodontologie, le chirurgien-dentiste fait face à un nombre de cas cliniques non négligeable d'insuffisance osseuse. Pour pallier ces défauts osseux le clinicien a recours à des matériaux de comblement osseux de différentes origines : xenogénique, allogénique, polymérique ou minéral comme les céramiques.

Toujours dans le domaine dentaire, lorsqu'une infection des canaux pulpaires est diagnostiquée, le praticien doit procéder à une désinfection puis à un comblement de ces canaux. Le protocole de soins est réalisé en plusieurs étapes. Tout d'abord, les canaux sont désinfectés et mis en forme puis un ciment endodontique est utilisé pour obturer les canaux. Au bout d'une semaine environ, le canal est désobturé sur la moitié de sa longueur afin de poser un tenon soit immédiatement, soit 7 jours plus tard. Les canaux sont donc à nouveau partiellement en contact avec le milieu extérieur lors de la désobstruction et au moment de la pose du tenon avec un risque d'inoculation de bactéries pendant une durée d'environ 15 jours après le début du traitement.

Les matériaux de comblement dentaires sont notamment utilisés à la fin d'un traitement endodontique (ou « root canal therapy ») ; ils visent à sceller un cône de Gutta percha ou à obstruer les canaux pulpaire/pulpe pour permettre une stabilité de l'organe dentaire. Cependant, comme mentionné précédemment, il arrive fréquemment que des bactéries (rémanentes ou inoculées) se développent sous le matériau de comblement entraînant des infections qui conduisent à un échec du traitement endodontique. La solution privilégiée est alors celle du retraitement endodontique long et coûteux avec un faible taux de succès (environ 40%) ou l'extraction de la dent conduisant à un implant, mutilant, lourd et coûteux.

Pour prévenir les infections post-comblement et leurs conséquences, différentes solutions ont été proposées, comme l'irradiation aux UV ou l'ajout des composés antiseptiques dans les ciments [12].

A titre d'exemple, la demande WO2006/070376 décrit un ciment endodontique comprenant des nanoparticules composées de polymères cationiques associés à des ammoniums quaternaires (QPEI). Celui-ci permet l'élimination des bactéries du genre Streptococcus dans un test de contact in vitro. Le même type d'approche est décrit dans la demande WO2015/004450 mais pour un ciment osseux et les auteurs proposent d'ajouter des liposomes chargés en antibiotiques. Aucune des solutions proposées dans l'art antérieur n'est efficace pour lutter contre tous les types de bactéries responsables des infections dentaires, notamment lorsqu'elles se trouvent sous forme de biofilm [13]. Une étude de 2004 a montré l'intérêt d'associer de la chlorhexidine à un matériaux de comblement endodontique de type agrégat de trioxyde minéral (ou MTA pour « minéral trioxide aggregate ») présentant un pH de 11,5 afin d'améliorer le pouvoir désinfectant du ciment. Toutefois, si la présence de chlorhexidine permet d'améliorer la désinfection des bactéries E. faecalis, l'effet sur les biofilms reste limité [12,13].

Les matériaux de comblement endodontiques existants à ce jour sur le marché ont généralement au mieux des propriétés antiseptiques pauvres ou autrement non existantes. Concernant les ciments osseux de scellement associés à des liposomes décrits dans l'art antérieur (WO2015/004450), le problème de désinfection est différent du fait que les contraintes de scellement sont très différentes de celles associées à un matériau de comblement. De plus, le PMMA (composé hydrophobe), ciment utilisé dans ce document n'est pas utilisé en tant que matériau de comblement osseux (il est, dans ce contexte, toxique).

Il existe donc un réel besoin [14] de disposer d'un matériau de comblement osseux et/ou dentaire aux propriétés désinfectantes, efficace à encontre des bactéries responsables des infections osseuses ou dentaires survenant après un comblement, en particulier lorsqu'elles se trouvent sous forme d'un biofilm. Un tel matériau de comblement doit en particulier assurer une désinfection totale et durable vis-à-vis des bactéries sous forme de biofilm, et ne pas être toxique. Avantages de l'invention

La présente invention propose un nouveau type de matériau de comblement à usage dentaire, en particulier endodontique, qui permet de désinfecter à long terme le système du canal radiculaire, le periapex et les tubuli dentinaires, grâce à l'association de liposomes au pouvoir désinfectant. Un tel ciment peut également être utilisé pour un comblement osseux.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Les inventeurs ont mis au point des compositions de matériaux de comblement dentaire ou osseux contenant des liposomes et ont démontré leur capacité à relarguer des antiseptiques pendant au moins 15 jours, temps qui s'écoule généralement entre la désinfection et le comblement définitif des canaux pulpaires. Les matériaux de comblement selon l'invention présentent même des propriétés désinfectantes pendant au moins 30 jours. L'invention concerne, dans son acceptation la plus large, un matériau de comblement dentaire ou osseux comprenant des liposomes et présentant un pouvoir désinfectant vis- à-vis des bactéries responsables des infections dentaires ou osseuses, lesdits liposomes étant soit des liposomes chargés en agent bactéricide ou autre molécule active, soit des liposomes cationiques non chargés.

Par « pouvoir désinfectant » au sens de l'invention, on entend la capacité d'une substance à inhiber ou tuer les micro-organismes indésirables en altérant leur structure, ou leur métabolisme, indépendamment de leur état physiologique afin de réduire leur nombre. Ainsi, les matériaux de comblement selon l'invention présentent notamment un pouvoir désinfectant vis-à-vis des bactéries responsables des infections dentaires, c'est-à-dire suffisant pour les éliminer, et en particulier celles qui résistent au pH élevé (pH=12) induit par les ciments de comblement à base d'hydroxyde de calcium, et qui sont responsables des infections dentaires post-comblement. Un premier objet de la présente invention concerne un matériau de comblement dentaire ou osseux désinfectant vis-à-vis des bactéries responsables des infections dentaires ou osseuses comprenant des liposomes dans lequel :

lesdits liposomes sont soit des liposomes chargés en agent bactéricide, soit des liposomes cationiques non chargés,

- la concentration en agent bactéricide relarguée est au-dessus de la concentration minimale d'inhibition desdites bactéries.

La concentration minimale d'inhibition (aussi appelée MIC pour Minimal Inhibition Concentration) correspond à la plus petite concentration d'un composé qui inhibe la croissance visible bactérienne. La MIC dépend de la bactérie ciblée et de l'agent utilisé pour la détruire. Cette concentration de référence est donc calculée pour chaque expérience en établissant au préalable une courbe étalon définissant la concentration en agent bactéricide/ % de bactéries éliminées. La concentration minimale bactéricide (MBC pour Minimal Inhibition Concentration) correspond à l'élimination de plus de 99,99%. Un agent est généralement considéré bactéricide si sa concentration est égale ou supérieure à 3 ou 4 fois la MIC. Ce test peut être appliqué sur bactéries planctoniques, ou sur biofilm bactérien.

Il existe plusieurs méthodes permettant de mesurer le pouvoir désinfectant d'un matériau de comblement, notamment la méthode du test de contact direct (ou « Direct Contact Test » DCT) et la méthode de diffusion en milieu gélosé (test de diffusion dans de l'agar, ou « agar diffusion test »).

Pour la méthode du test de contact direct, le pouvoir désinfectant est évalué par mesure de la densité optique d'une solution contenant des bactéries (par exemple à 650nm pour E. faecalis). Moins la densité optique est élevée, moins il y a de bactérie dans la solution et plus la substance est désinfectante.

Dans le cas de la méthode de diffusion en milieu gélosé, le pouvoir désinfectant est évalué par la mesure de la zone d'inhibition (en mm). Plus la zone d'inhibition est grande, plus le pouvoir désinfectant est élevé.

Ainsi, dans deux modes alternatifs de réalisation de l'invention, les matériaux de comblement présentent un pouvoir désinfectant évalué comme suit :

soit en mesurant la concentration en bactéries à 7 jours en utilisant la méthode de test de contact direct, cette concentration en bactéries étant inférieure à 10 ⁵ CFU/mL, de manière préférée inférieure à 10 ⁴ CFU/mL, et de manière tout à fait préférée inférieure à 1000 CFU/mL. Ce test peut être réalisé sur bactéries planctoniques ou sur biofilm bactérien.

soit en mesurant une zone d'inhibition en utilisant la méthode de diffusion en milieu gélosé 24 h à 48 h après inoculation des bactéries et placement des matériaux de comblement, la zone d'inhibition obtenue avec le matériau de comblement désinfectant étant supérieure à celle obtenue avec le contrôle.

Dans un mode de réalisation particulier, la zone d'inhibition peut être supérieure à 9 mm, de manière préférée supérieure à 12 mm.

Les bactéries responsables des infections dentaires, notamment retrouvées dans les canaux pulpaires comprennent les souches Streptococcus, Actinomyces, Enterococcus et Propionibacterium, et en particulier Enterococcus faecalis qui résiste à des pH supérieurs à 11,5. Jusqu'à 12 espèces différentes peuvent être retrouvées dans ces canaux.

Les bactéries responsables des infections osseuses post-comblement sont notamment les staphylocoques comme le staphylocoque doré ou les staphylocoques à coagulase négative, le propionibacterium acnés...

Par « matériau de comblement » ou « ciment » ou « ciment de comblement » au sens de l'invention, on entend tout type de matériau de comblement, approprié pour obstruer un canal dentaire ou une chambre pulpaire ou une cavité dentaire de manière provisoire ou permanente, ou un déficit osseux.

Les matériaux de comblement dentaires les plus couramment utilisés sont à base d'hydroxyde de calcium ou de silicate de calcium mais tout ciment à base de disilicate ou trisilicate de calcium, d'hydroxyapatite, de silicone, d'oxyde de zinc-eugénol, de résine, d'alginate et/ou de collagène peut également être employé. En particulier, des ciments commerciaux dépourvus de pouvoir désinfectant peuvent être utilisés pour préparer les matériaux de comblement selon l'invention. A titre d'exemple, on peut citer les ciments commerciaux SealapexTM et Apexit™, BIO ROOT™™ RCS™, PRO ROOT MTA™, Pulp canal sealer™, AH 26™, IROOT™ SP, TOTAL FILL™...

Les matériaux de comblement osseux sont généralement des céramiques bioactives qui peuvent être naturelles ou synthétiques (coralline, Hydroxyapatite (HA), phosphate sulfate tricalcique (TCP), verre bioactif, carbonate de calcium et silicate de calcium). Chimiquement similaire à l'os, cette classe montre une forte résistance à la compression et une faible ductilité, ce qui leur confèrent une forte résistance à la déformation mais aussi une fragilité ¹ . Les céramiques phosphocalciques sont biocompatibles, elles ne présentent pas d'activité ostéogéniques mais sont ostéocondutrices, fournissant un support pour les cellules et protéines de l'os. De manière intéressante, le contact de la matrice avec l'os conduit à la formation d'un tissu ostéoïde acquérant progressivement les propriétés mécaniques de l'os. Parmi les plus utilisées, nous retrouvons les céramiques phosphocalciques composées de :

L'hydroxyapatite est très proche chimiquement de l'apatite de los. Il est considéré comme ostéoconducteur mais est très peu résorbable ² . Le phosphate tri calcique (TCP) de formule Ca3(P0 ₄ ) ₂ se trouve sous une forme cristalline alpha ou bêta. Le plus utilisé étant le bêta-TCP. Il s'agit d'une céramique poreuse qui se transforme en hydroxyapatite in vivo ³ . Le TCP est ostéoconducteur et a une résorption rapide par solubilisation des ions Ca et P utilisés dans la néo formation osseuse.

Les céramiques Biphaséés (BCP) associent ΗΑ et le Beta-TCP. Ce matériau allie les propriétés physiques de chacun des composés : une stabilité à long terme pour l'adhérence cellulaire et une resorbabilité permettant la création de néo tissus. Ainsi le ratio HA/TCP peut être modulé en fonction de la vitesse de résorption et le type d'os.

Les ciments de phosphate de calcium ou silicate de calcium injectables. Ces ciments se présentent sous forme de pâte obtenue par le mélange d'une poudre

(HA, Beta TCP, phosphate dicalcique dihydraté) et d'une solution aqueuse. La solidification du mélange s'opère après la formation d'une apatite carbonatée de faible cristallinité similaire à l'os.

¹ Gao et al., 'Current Progress in Bioactive Ceramic Scaffolds for Bone Repair and Régénération'.

² Daculsi, 'Biphasic Calcium Phosphate Concept Applied to Artificial Bone, Implant Coating and Injectable Bone Substitute'.

³ Hollinger et al., 'Rôle of Bone Substitutes.' Dans un mode particulier de réalisation de l'invention où le matériau de comblement peut être ou est un ciment résineux, celui-ci est différent du PMMA.

On peut également distinguer les matériaux de comblement en fonction de leur utilisation:

1) Usage en dentaire pour le comblement en surface de la dentine ou pour réaliser un pansement pulpaire en remplacement de la dentine et de la pulpe (coiffage).

2) Usage endodontique en cas de dévitalisation de la dent pour combler la pulpe et le canal.

3) Usage en chirurgie osseuse pour combler une vacuité osseuse après curetage.

Un matériau de comblement dentaire provisoire particulièrement simple peut être constitué uniquement d'hydroxyde de calcium et d'eau ou préparé à base de ces deux composants.

Dans le cadre de la présente invention, le matériau de comblement est utilisé comme matrice (ou support) dans laquelle les liposomes sont ajoutés. Les liposomes ne sont donc pas adsorbés à la surface du matériau, mais bien mélangés à la matrice du matériau. Dans un mode de réalisation préféré, le matériau de comblement utilisé est à base de minéraux, notamment d'hydroxyde de calcium, ou à base de minéraux appartenant aux biocéramiques. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le matériau est à base de silicate de calcium, notamment de silicate tricalcique (type Bio Root™) ou d'hydroxyde de calcium, notamment de dihydroxyde de calcium (type Sealapex).

Les liposomes associés au matériau de comblement peuvent être de nature différente. Leurs propriétés, seules ou en association avec des composés actifs de type agent bactéricide ou toute autre molécule active, confèrent un pouvoir désinfectant au matériau de comblement selon l'invention.

Les liposomes particulièrement appropriés sont composés de lipides cationiques, neutres ou anioniques comprenant des entités chimiques chargées choisies parmi:

ALN-TEG-Chol: 8-(cholest-5-en-3p-xyloxy)-3,6-dioxaoctanyl alendronate,

CHEMS: Cholestérol hemisuccinate,

Chol: Cholestérol,

Con-A: Concanavalin A,

DC-Chol: 3-p[N(NlNl-dimethylaminoethane-carbamoyl] cholestérol,

DCP: Dicetyl phosphate,

DDAB: Dimethyldioctadecylammoniumbromide,

DMPC: l,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPG: 1,2-dimyristoyl-sn glycero-

3-phospho-(l'-rac-glycerol),

DOPC: l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPE: l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,

DODAB (bromure de diméthyldioctadécylammonium):

DOTAP: l,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,

DPPA: l,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate,

DPPC: 1,2-dipalmitoyl-snglycero- 3-phosphocholine,

DPPG: l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(l'-rac-glycerol),

DPTAP: Dipalmitoyl trimethylammoniumpropane,

DSPC: l,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,

DSPE: l,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine,

PC: Phosphatidylcholine,

PEG: Poly(ethyleneglycol),

PI: Phosphatidylinositol,

PS: Phytosphingosine,

SA: Stearylamine,

EPC : l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine

DODAc, 1 ,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethyi-hydroxyethyl ammonium

DMRIE, 2,3-dioleoyloxy-N-(2(sperminecarboxamide)ethyl)-N,N- dimethyi-1 propananninium DOSPA.dioctadecylamidoglycylspermine

DOGS, 1 ,2-dimethyl-dioctadecylammoniumbromide

DDAB, 2-dioleyl-3-N,N,N- trimethylaminopropanechloride

DOTMA, 1 ,2-dimyristoy!-3- trimethylammoniumpropane

DMTAP, 1 ,2-distearoyi-3- trimethylammoniumpropane

DSTAP, 1 ,2-Dioleoyl-3-dimethylammonium- propane

phospatidylchoiine,

phosphatidylethanolamine,

sphingomyeline,

acide phosphatidique,

phospatidylglycerol,

phospatidylsérine

phospatidylinositol

DOBAQ : N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-l -aminium phospholipon 90G

phytosphingosine De manière préférée, les liposomes comprennent du DOPE, du DOTAP, un mélange DPPC :SA ou DPPC : cholestérol.... Le DOPE est avantageusement associé à du HSPC. De manière encore plus préférée, les liposomes comprennent du DPPC et du cholestérol.

Après incorporation dans le matériau de base, les liposomes peuvent représenter jusqu'à 20% (poids /poids) du matériau de comblement, au-delà ils déstabilisent et fragilisent la structure. Les liposomes peuvent représenter par exemple 15%, 10%, 8%, 5%, 3%, 2% 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% du matériau. Dans un mode de réalisation préféré, les liposomes représentent entre 0,01% et 15%, de manière encore plus préférée entre 0,5% et 10%, et de manière tout à fait préférée entre 1% et 5%.

Les liposomes permettent une meilleure pénétration du biofilm bactérien [10 ;11] et donc une meilleure efficacité antibactérienne. En effet, ils peuvent fusionner avec les parois du biofilm et ainsi délivrer les molécules actives au cœur du biofilm, en plus de déstabiliser mécaniquement les membranes bactériennes.

Dans un premier mode de réalisation, les liposomes sont chargés en agent bactéricide ou autre molécule active. Ces liposomes peuvent être cationiques, neutres ou anioniques. Ils sont chargés directement ou indirectement avec un agent bactéricide et le cas échéant une autre molécule active. Les liposomes peuvent être chargés après leur formation (chargement actif), ou pendant leur formation (chargement passif). Par « agent bactéricide », on entend au moins un agent bactéricide, mais il peut également s'agir d'une association de plusieurs agents bactéricides. L'agent bactéricide peut être choisi parmi tous les antiseptiques et/ou les antibiotiques locaux ayant démontré une action bactéricide. Il peut en particulier être choisi parmi les composés cités dans la classe ATC D08 de la classification établie par l'OMC et qui correspond aux « antiseptiques et désinfectants ». Parmi les antiseptiques appropriés pour un usage en dentaire, on peut citer l'oxyde de cuivre, l'oxyde de zinc, argent, la chlorhexidine, le triclosan, iode de PVP, le QPEI, le chitosan, la nisine, le NaOCl, les polymères cationiques, le fluorure et le bromure... Dans un mode de réalisation préféré, l'antiseptique est la chlorhexidine.

Le terme « agent bactéricide » au sens de l'invention recouvre les notions d' « agent bactéricide » et d' « agent bactériostatique ». En effet, en fonction de la concentration de l'agent, celui-ci aura à faible concentration une action bactériostatique et à forte concentration une action bactéricide. Ces notions dépendent également des propriétés intrinsèques de l'agent considéré. Par « autres molécules actives », on entend au sens de l'invention toute molécule ayant une activité complémentaire à l'agent bactéricide en tant que tel. Il peut s'agir d'un antibiotique, par exemple de la famille de la pénicilline, tel que l'amoxicilline ou une association antibiotique/antiseptique, telle que l'association nisine/tétracycline. L'encapsulation des agents bactéricides ou d'autres molécules actives dans les liposomes permet une protection de ces derniers contre l'inhibition provoquée par les fluides biologiques, la formation de précipité ou complexe moléculaire avec le matériau d'obturation, mais aussi un relargage contrôlé et efficace dans le temps. Dans un mode de réalisation particulier, les liposomes représentent jusqu'à 10% (poids/poids) du matériau de comblement (après incorporation des liposomes) et ces liposomes sont chargés en agent bactéricide par hydratation d'un film lipidique avec une solution dont la concentration est comprise entre 0,01% et 10%, de manière préférée entre 0,05% et 8%, de manière encore plus préférée entre 0,5% et 5%, de manière tout à fait préférée entre 1% et 5%. Ces pourcentages s'entendent avant évaporation (sachant que la concentration théorique est jusqu'à 4 fois supérieure après évaporation) et sont à adapter en fonction des propriétés intrinsèques désinfectantes des agents utilisés.

La concentration d'agent bactéricide encapsulée dans les liposomes doit être suffisante pour que la quantité relarguée soit supérieure à la MIC.

Les liposomes chargés en un agent bactéricide peuvent être cationiques, neutres ou anioniques.

Dans un autre mode de réalisation préféré, les liposomes chargés en agent bactéricide sont des liposomes neutres ou anioniques. De manière plus préférée, ces liposomes sont neutres, et de manière tout à fait préférée ils contiennent du DOPE (par exemple DOPE : HPSC) ou du DPPC (par exemple DPPC : cholestérol).

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les liposomes sont des liposomes neutres et la molécule active est un antiseptique comme la chlorhexidine.

Dans un autre mode de réalisation préféré, les liposomes sont une association de liposomes de nature différente (cationique, neutre, anionique) et les molécules actives sont un antibiotique et/ou un antiseptique. Un exemple d'association de liposomes de nature différente peut être un mélange de DPPC : cholestérol : SA ou de HSPC :DOPE.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le matériau de comblement comprend un ciment à base d'hydroxyde de calcium ou de silicate de calcium, des liposomes constitués de lipides neutres et l'agent antiseptique est la chlorhexidine. De manière tout à fait préférée, le ciment de base est un ciment à base de tricilicate de calcium, les liposomes comprennent du DOPE ou du DPPC et l'agent antiseptique est la chlorhexidine. Ainsi, les différents modes de réalisation peuvent être combinés entre eux pour définir un matériau de comblement au pouvoir désinfectant, tel que cela est présenté dans la partie expérimentale.

Un mode de réalisation tout à fait préféré est un matériau de comblement à base de trisilicate de calcium comprenant 1% (poids/poids) de liposomes de type DPPC : cholestérol chargés en chlorhexidine avec une solution de chlorhexidine à 1%.

Dans un deuxième mode de réalisation, les liposomes sont cationiques et ne sont pas chargés.

Lorsque les liposomes cationiques ne sont pas chargés en agent bactéricide et le cas échéant en molécules actives, leur pouvoir désinfectant repose sur leur capacité à fusionner avec les biofilms. En fusionnant avec les parois du biofilm et des membranes bactériennes, ils désorganisent le biofilm mais aussi les membranes bactériennes conduisant à la destruction des bactéries.

Lorsque le matériau de comblement comprend des liposomes non chargés, ces derniers représentent jusqu'à 20% (poids/poids) du matériau de comblement, de manière préférée entre 0,01% et 10%, de manière encore plus préférée entre 0,5 et 10% et de manière tout à fait préférée entre 1% et 5%.

Quelque soit le mode de réalisation considéré, l'ajout de liposomes dans les matériaux de comblement est particulièrement intéressant pour la désinfection bactérienne en endodontie du fait que les liposomes sont affins pour les bactéries et peuvent diffuser dans le réseau canalaire pulpaire, les tubuli dentinaires et le péri-apex. Les liposomes permettent une diffusion plus contrôlée de l'agent antiseptique ou batéricide que si cet agent se trouvait seul dans le matériau de comblement.

Dans tous les cas, que les liposomes soient chargés ou non, leur taille doit être suffisamment petite pour leur permettre de pénétrer dans les canaux et tubuli. La taille des tubuli varie généralement entre 100 nm et 3200 nm, avec une moyenne à 800-1200 nm

Ainsi, le « diamètre » ou « taille» des liposomes utilisés dans la présente invention peut varier entre 20 nm et 8000 nm. Des liposomes présentant un tel diamètre permettent une désinfection efficace. Toutefois, il est nécessaire que la taille soit homogène et stable pour assurer une reproductibilité du résultat. L'homme du métier saura adapter ce paramètre.

Dans un mode de réalisation particulier, leur taille est inférieure à 6000 nm, de manière préférée compris entre 600 nm et 50 nm, voire entre 400 nm et 50 nm, de manière plus préférée inférieure à 300 nm et de manière tout à fait préférée compris entre 100 nm et 200 nm, par exemple de 150 nm.

Les propriétés des matériaux de comblement désinfectants varient en fonction de la combinaison choisie : nature du ciment, nature et concentration des liposomes et nature et quantité de molécule active. De plus, la nature du ciment ainsi que la nature et la taille des liposomes peuvent influencer la diffusion des liposomes et donc le relargage des molécules actives à l'extérieur du matériau de comblement au contact de la dent ou de l'os. Il est important de maîtriser ces paramètres pour contrôler la quantité d'antiseptiques ou autre molécule active relarguée in fine.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le matériau de comblement est à base d'hydroxyde de calcium ou de biocéramiques, et les liposomes sont de type « liposome DOPE », « liposome EPC » ou « liposome DODAP », tels que définis dans la partie expérimentale (Exemple 4.2.). Dans un autre mode de réalisation préféré, le matériau de comblement dentaire ou osseux comprend en outre une molécule de la famille des tensioactifs (anionique, cationique, zwitterionique ou non ionique) tel que les copolymères à blocs. Les molécules de la famille des tensioactifs (notamment les copolymères ayant un pouvoir dispersant) favorisent la distribution homogène des liposomes dans le matériau. A titre d'exemple, le tensioactif peut être choisi parmi les copolymères à blocs séquencés de type Pluronic (PEO-PPO-PEO), le polyéthylène glycol (PEG), l'acide poly-lactique (PLA), l'acide poly(D,L-lactique-co-glycolique (PLGA), le polycaprolactone (PCL), le poly(P- hydroxybutyrate) (PHB) ou un mélange/fusion de ces molécules (par exemple, fusion Pluronic-PLA). Le choix du tensioactif est fonction de l'antiseptique à encapsuler, de la nature des liposomes et du ciment utilisé. Sa concentration peut varier entre 0,1% à 20% (rapport pondéral) de la solution liposomale. Des tensioactifs particulièrement préférés sont les pluronics, choisi parmi les pluronics L31, L61, F68, F127, L43, L44, L62, L64, P85, P84, P104, P123, L35, F38, L42, L63, P65, F68, L72, P75, F77, P87, F88, F98, P103, P105, F108, L122, P123, F127...,

Le choix du tensioactif est fonction de l'antiseptique à encapsuler, de la nature des liposomes et du matériau de comblement utilisé. Sa concentration peut varier entre 0,1% à 20% (rapport pondéral) de la solution liposomale, de manière préférée entre 1% et 10%, et de manière tout à fait préférée entre 1% et 3%. L'addition d'une telle substance permet de faire le lien entre la phase liposomale et le matériau de comblement de base, ce qui va permettre une formulation plus stable des liposomes évitant le pic de relargage (« burst release »), mais aussi une meilleure dispersion des liposomes dans le matériau en évitant les phénomènes d'agrégation, cela se traduisant in fine par un meilleur relargage du produit encapsulé (homogène en quantité et dans le temps).

Des matériaux de comblement selon l'invention particulièrement préférés sont les suivants :

- Ciment à base d'hydroxyde de calcium de type Sealapex ^® avec des liposomes de type DOPE

Ciment à base d'hydroxyde de calcium de type Apexit ^® avec des liposomes de type EPC

Ciment à base de silicate de calcium de type Total fill ^® avec des liposomes de type DODAP

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le matériau de comblement est constitué d'un ciment à base de trisilicate de calcium comprenant l%(p/p) de de solution liposomale anioniques, liposomes chargés avec une solution à 1% (p/p) de chlorhexidine et contenant 2% (p/p) de pluronic L31 .

D'autres combinaisons sont possibles comme par exemple :

DOPE liposome encapsulant du triclosan+ Apexit ^® PEG2000 liposome encapsulant des QPEI +Sealapex ^®

- DODAP liposome + Well Root™ ^® + PEG

DOPE liposome encapsulant du metronidazole+ Bio Root™ ^® + F127 pluronic DOPE liposome encapsulant du PVP iodine+ totalfill ^® + P85 pluronic

- DPPC :SA :CHol liposome + Bio Root™ ^® +Pluronic L61

DOPE liposome encapsulant de la chlorhexidine + Well Root™ ^® +PLGA

DPPC :Chol liposome+ AH plus+ PHB-PEG copolymère

DPPC :Chol liposome encapsulant de la Nisine +AH plus+ Pluronic L31

DOPE liposome encapsulant du PVP iodine + Calcium phosphate cernent

(Genex ^® ,Biograft) + Pluronic F77

DPPC: Cholestérol liposome encapsulant de l'arnoxicilline + ciment à base de Calcium phosphate + PEG

DOPE :HSPC liposome encapsulant de la chlorhexidine+ Ciment verre ionomère + Pluronic P85

- DOPE :HSPC liposome encapsulant de la chlorexidine + Hydroxyapatite (Bio-

Oss ^® )+PEG-PHB-PEG

DOPE:HSPC liposome encapsulant de l'oxyde de zinc + Biodentine+ Pluronic L61 Phospholipon90G:Cholesterol liposome encapsulant de la chlorhexidine + Bio Root™+ PEG-PLGA-PEG copolymère

Les matériaux de comblement selon l'invention peuvent se présenter sous la forme d'un mélange poudre-liquide, de granules ou d'un gel ou pate pré-mixés apte à se solidifier au contact de l'air. Un deuxième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un ciment dentaire tel que défini précédemment comprenant :

a) la préparation de liposomes dont la taille est comprise entre 8000 nm et à 20 nm, b) le mélange desdits liposomes avec un ciment dentaire dans une proportion comprise entre 0,001% et 20%, de préférence comprise entre 1% à 5% de liposomes (poids/poids)

Le matériau de comblement ainsi obtenu peut être à usage dentaire ou osseux.

Dans un mode de réalisation préféré, un surfactant est ajouté à la préparation de liposomes, avant mélange avec le ciment. Celui-ci évite le phénomène de miscellisation et permet ensuite le mélange entre une base de ciment hydrophile et des liposomes hydrophobes.

Parmi les surfactants adaptés à cet usage, on peut citer les pluronics L31, L61, F68, F127, L43, L44, L62, L64, P85, P84, P104, P123. Dans un mode de réalisation préféré, le surfactant est choisi parmi les pluronics L31 et L61. L'ajout de surfactant favorise la distribution homogène des liposomes dans le ciment et permet une bonne reproductibilité de la qualité des produits, et en particulier pour atteindre la qualité requise pour la spécification des produits à usage dentaire. Lorsque les liposomes sont chargés en molécules actives (antiseptiques ou autre), le procédé comprend en outre une étape d'inclusion (ou de chargement) de ces molécules dans les liposomes avant mélange des liposomes avec le ciment.

Le pourcentage de liposomes inclus dans le matériau de comblement peut être compris entre 0,001% et 20% en poids, plus particulièrement inférieur à 20%, typiquement compris entre 1% et 10% ou 0,5% et 10%, de préférence entre 1% et 5% (rapport poids/poids). De manière tout à fait préférée, ce pourcentage sera compris entre 0,5% et 2%, mais peut varier en fonction de la taille des liposomes et de leur charge en agent bactéricide. Dans tous les cas, le pouvoir désinfectant du ciment doit être maîtrisé.

Le matériau de comblement peut se présenter sous forme d'un mélange poudre-liquide, de granules ou d'un gel ou pate pré-mixés.

Dans le cas de la version sous forme d'un mélange poudre-liquide, la solution de liposomes obtenue est lyophilisée et la poudre obtenue est mélangée à la poudre du ciment de base ou la pâte en fonction de la présentation commerciale du matériau de comblement de base. Les liposomes lyophilisés sont hydratés par le liquide du matériau de comblement ou par l'humidité de l'air. La lyophilisation de la solution de liposomes permet une plus grande stabilité dans le temps permettant aux matériaux de comblement d'être conservés à température ambiante.

Un troisième objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ciment dentaire tel que défini précédemment pour prévenir les infections post-comblement dentaire ou osseux, en particulier du canal radiculaire, du periapex et/ ou des tubuli dentinaires ou d'une cavité osseuse, en particulier au niveau de la mâchoire.

Les matériaux de comblement tels que définis précédemment peuvent être utilisés en dentaire pour un comblement temporaire ou permanent en fonction du protocole de soin suivi par le dentiste. Grâce à leur pouvoir désinfectant, ils permettent d'éviter une infection profonde des canaux dentaires, difficile à soigner et qui nécessite une nouvelle intervention thérapeutique.

Un quatrième objet de l'invention concerne une méthode d'évaluation du pouvoir désinfectant d'un matériau de comblement consistant à :

i) disposer, dans un récipient à deux compartiments,

a) une solution comprenant des souches bactériennes susceptibles d'être responsables d'une infection dentaire dans le compartiment inférieur b) une couche de matériau de comblement dont on souhaite tester le pouvoir désinfectant dans le compartiment supérieur,

les deux compartiments étant séparés par une membrane percée de pores dont le diamètre est compris entre 8000 nm et 50 nm ;

ii) incuber le récipient à 37°C pendant une durée choisie ;

iii) évaluer la présence de bactéries dans le compartiment inférieur.

Cette expérience peut être réalisée en préparant des récipients à deux compartiments séparés par une membrane présentant des pores de diamètre approprié. Il est aussi possible d'utiliser des dispositifs commerciaux tels que les plaques Transwell ^® vendues par la société Corning ^® .

Le diamètre des pores de la membrane est choisi à façon. Pour reproduire le diamètre des tubuli, il sera choisi entre 50 et 8000 nm, de préférence entre 300 et 800 nm et manière plus particulière entre 50 nm et 400 nm.

Le temps d'incubation sera généralement compris entre 2h et 48h. L'homme du métier saura adapter ce temps selon les protocoles classiques de microbiologie. L'évaluation de la présence de bactéries sera réalisée par l'une des techniques de microbiologie connue de l'homme du métier, par exemple en mesurant la densité optique de la solution par spectrométrie.

Ce test est particulièrement pertinent pour évaluer le pouvoir désinfectant d'un matériau de comblement à usage dentaire puisque les nanopores de la membrane miment, du fait de leur taille, les tubuli dentaires. Si les bactéries sont éliminées, cela suggère que le ciment sera efficace pour désinfecter les tubuli.

Enfin, ce test pourra être utilisé pour mesurer le pouvoir désinfectant du matériau de comblement soit vis-à-vis de bactéries planctoniques, soit vis-à-vis d'un biofilm bactérien, en fonction des bactéries qui seront ajoutées à la solution placée dans le compartiment inférieur.

Les mêmes tests peuvent être utilisés pour valider le pouvoir désinfectant d'un matériau de comblement osseux, en adaptant le type de bactéries à tester, le cas échéant.

La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : Schéma d'un récipient adapté à la méthode d'évaluation de pouvoir désinfectant d'un ciment dentaire.

Figure 2 : Représentation de la répartition de la taille des liposomes formés.

Figure 3 : Représentation de la cinétique de relargage de ciments comprenant différents types de liposomes chargés en rhodamine. (A) Ciment à base d'hydroxyde de calcium de type Sealapex ^® (B) Ciment à base d'hydroxyde de calcium de type Apexit ^® . Les types de liposomes utilisés sont illustrés comme suit : DOPE : carré ; EPC : triangle ; DODAP : losange ; contrôle sans liposome : rond.

Figure 4 : Représentation du pourcentage de relargage de la rhodamine contenue dans les ciments en fonction du type de liposomes à 15 jours. Ctl = contrôle sans liposome.

Figure 5 : Schéma d'un moule utilisé pour la préparation des plots de ciment

Figure 6 : Courbe étalon d'une solution de diglucuronate de chlorhexidine à 255 nm

Figure 7 : Relargage de la chlorhexidine

Figure 8 : Courbe étalon pour déterminer la densité optique/concentration bactérienne Figure 9 : Mesure de la Densité optique à Jl Figure 10 : Mesure de la Densité optique à J7 Figure 11 : Mesure de la Densité optique à J20

Figure 12 : Graphique MDCT planctonique

Figure 13 : Agar diffusion test Figure 14 : Courbe étalon chlorhexidine

Figure 15 : Graphique représentant la concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée au cours du temps par un matériau de comblement à base de ciment de type Bio Root™ comprenant des liposomes DOPE chargés à l'aide d'une solution de CHX à 1%. Les résultats sont montrés à la fois sous la forme d'histogrammes et des courbes de tendance logarithmique. Série 1 : 0,5% de liposome, série2 : 1% liposome, série 3 : 3% liposome, série 4 : 10% liposome Figure 16 : Graphique représentant la concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée au cours du temps par un matériau de comblement à base de ciment de type Bio Root™ comprenant des liposomes DOPE chargés à l'aide d'une solution de CHX à 5%. Les résultats sont montrés à la fois sous la forme d'histogrammes et des courbes de tendance logarithmique . Série 1 : 0,5% de liposome, série2 : 1% liposome, série 3 : 3% liposome, série 4 : 10% liposome

Figure 17 : Graphique représentant la concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée au cours du temps par un matériau de comblement à base de ciment de type Bio Root™ comprenant des liposomes DPPC :SA chargés à l'aide d'une solution de CHX à 1%. Les résultats sont montrés à la fois sous la forme d'histogrammes et des courbes de tendance logarithmique. Série 1 : 0,5% de liposome, série2 : 1% liposome, série 3 : 3% liposome, série 4 : 10% liposome Figure 18 : Graphique représentant la concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée au cours du temps par un matériau de comblement à base de ciment de type Bio Root™ comprenant des liposomes DPPC :SA chargés à l'aide d'une solution de CHX à 5%. Les résultats sont montrés à la fois sous la forme d'histogrammes et des courbes de tendance logarithmique. Série 1 : 0,5% de liposome, série2 : 1% liposome, série 3 : 3% liposome, série 4 : 10% liposome

Figure 19 : Graphique représentant la concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée au cours du temps par un matériau de comblement à base de ciment de type Bio Root™ comprenant une solution de CHX seule. Les résultats sont montrés à la fois sous la forme d'histogrammes et des courbes de tendance logarithmique. A = 1% CHX ( CHX concentrée à 1%) ; B = 1% CHX ( CHX concentrée à 5%) ; C = 10 % CHX ( CHX concentrée à 1%) ; D = 10 % CHX ( CHX concentrée à 5%) ; CTL xontrôle négatif (ciment sans CHX). BA: Bio Root™ +A ; BB: Bio Root™ +B ; BC: Bio Root™ +C ; BD: Bio Root™ +D Figure 20 : Graphique représentant la concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée au cours du temps par un matériau de comblement à base de ciment de type Well Root™ comprenant des liposomes DOPE chargés à l'aide d'une solution de CHX à 1%. Les résultats sont montrés à la fois sous la forme d'histogrammes et des courbes de tendance logarithmique. Série 1 : 0,5% de liposome, série2 : 1% liposome, série 3 : 3% liposome, série 4 : 10% liposome.

Figure 21 : Graphique représentant la concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée au cours du temps par un matériau de comblement à base de ciment de type Well Root™ comprenant des liposomes DOPE chargés à l'aide d'une solution de CHX à 5%. Les résultats sont montrés à la fois sous la forme d'histogrammeset des courbes de tendance logarithmique. Série 1 : 0,5% de liposome, série2 : 1% liposome, série 3 : 3% liposome, série 4 : 10% liposome Figure 22 : Graphique représentant la concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée au cours du temps par un matériau de comblement à base de ciment de type Well Root™ comprenant des liposomes DPPC :SA chargés à l'aide d'une solution de CHX à 1%. Les résultats sont montrés à la fois sous la forme d'histogrammes et des courbes de tendance logarithmique. Série 1 : 0,5% de liposome, série2 : 1% liposome, série 3 : 3% liposome, série 4 : 10% liposome

Figure 23 : Graphique représentant la concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée au cours du temps par un matériau de comblement à base de ciment de type Well Root™ comprenant des liposomes DPPC :SA chargés à l'aide d'une solution de CHX à 5%. et des courbes de tendance logarithmique. Série 1 : 0,5% de liposome, série2 : 1% liposome, série 3 : 3% liposome, série 4 : 10% liposome

Figure 24 : Graphique représentant la concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée au cours du temps par un matériau de comblement à base de ciment de type Well Root™ comprenant une solution de CHX à 5%. et des courbes de tendance logarithmique. Les résultats sont montrés à la fois sous la forme d'histogrammes et des courbes de tendance logarithmique. A = 1% CHX ( CHX concentrée à 1%) ; B = 1% CHX ( CHX concentrée à 5%) ; C = 10 % CHX ( CHX concentrée à 1%) ; D = 10 % CHX ( CHX concentrée à 5%) ; CTL xontrôle négatif (ciment sans CHX). WA : Well Root™+ A; WB :Well Root™+B ; WC : Well Root™+ C ; WD :Well Root™+D.

Figure 25 : Courbe représentant la taille de la zone d'inhibition en fonction de la concentration en chlorhexidine lors d'une expérience de diffusion gel d'agarose.

Figure 26 : Zone d'inhibition crée par les échantillons A) ciment Bio Root™ additionné de 1% de solution liposomale, B) Bio Root™ seul. Résultats à 24h d'incubation.

Figure 27 : Expérience de diffusion en gel d'agarose. Bio Root™ + 1% CEM CHX 0918-001 après 7 jours d'incubation dans la gélose avant ensemencement avec E.faecalis.

PARTIE EXPERIMENTALE EXEMPLE 1 : préparation des ciments comprenant des liposomes

1.1 - Préparation des liposomes

Les liposomes ont été formés à partir des différents lipides d'intérêt décrits précédemment en utilisant différentes techniques classiques : sonication ou hydratation d'un film lipidique [9].

Dans tous les cas, les solvants organiques résiduels ont été éliminés pour récupérer une poudre pure, dont le total a été ensuite remis en suspension dans un solvant biologiquement compatible (généralement de l'eau) pour générer des liposomes. Ceci a été obtenu grâce à des techniques d'évaporation, ce qui n'est pas nécessaire si le détergent liposomal est acheminé dans la phase aqueuse dans une concentration minimale satisfaisante. Pour la présente preuve de concept, des réactifs de moyenne à haute qualité ont été nécessaires (> 97,0% de pureté). Pour préparer les ciments à usage dentaire, cela devra être amélioré à un minimum> 99,0% de pureté (purification par HPLC).

Un des protocoles utilisés suit, avec une adaptation, les protocoles précédemment publiés [1, 2,9].

Dans la préparation des liposomes, un rapport (poids / poids) de la combinaison désirée de lipides a été réalisé par pesée précise du lipide détergent donné avant leur mélange dans un grand ballon à fond rond. A cela, 5 ml de solvant organique (chloroforme, qualité HPLC) ont été ajoutés et la suspension a été mélangée par vortex jusqu'à dissolution complète des lipides. Le même ballon a été attaché à un kit d'évaporation rotatif, associé à une pompe à vide avec une rotation à une révolution par seconde. Le système a été maintenu à une température constante généralement de 60 ° C par bain d'eau, cette température étant déterminée par la transition de phase du mélange lipidique d'intérêt. Lors de l'élimination de tout solvant organique, de l'eau désionisée MQ stérilisée a été ajoutée pour donner une concentration de 5 mg.mL-1. La suspension a ensuite été maintenue pendant encore 30 minutes pour permettre la formation de liposomes.

Ensuite, la suspension a été prélevée et extrudée dix fois sous 8 bars de pression d'azote à travers une extrudeuse de type Lipex. Ensuite, le mélange a été extrudé un deuxième tour de dix fois à travers des membranes en polycarbonate de 400 nm et un troisième tour de membranes en polycarbonate de 10 fois à travers 100 nm pour permettre une plus grande homogénéité dans la gamme de taille des liposomes. Enfin, la suspension a été centrifugée à 100 000 g pendant une heure (à 4° C) pour avoir un culot de liposomes et éliminer l'excès d'eau en préparation pour le chargement.

Dans ces essais, les liposomes ont été préparés à partir de DOPE, EPC, DODAP et PEG.

1.2- Inclusion des composés bactéricides

Le composé bactéricide est chargé dans les liposomes par des voies actives ou passives, en fonction des propriétés chimiques du lipide détergent et du composé chimique en question. Les études précédemment publiées ont examiné le chargement liposomique avec l'antibiotique sulfate de gentamicine pour former un ciment osseux, en trouvant un indice thérapeutique amélioré de l'antibiotique, ainsi qu'une plus grande accumulation sur les sites d'intérêt [2]. Une étude connexe a examiné le chargement de l'amphotéricine B antifongique dans les liposomes pour générer un ciment osseux pour un traitement actif [3]. Les antiseptiques particulièrement intéressants sont l'oxyde de cuivre, la chlorhexidine, le triclosan, l'iode de PVP et la nisine, dont chacun peut être chargé selon les protocoles publiés précédemment. Ceux qui ont été chargés par des moyens actifs (généralement ceux de nature hydrophile) ont été ajoutés par l'utilisation d'un gradient généré de l'extérieur, en particulier en modifiant le pH [4] ou électrochimiquement [5, 6]. Le chargement passif de composés chimiques est un processus plus simple, et ici, les composés chimiques de choix ont été dissous dans la phase solvant / organique, en cas de nature hydrophobe ou dissous dans la phase aqueuse si hydrophiles.

Dans tous les cas, la concentration des échantillons liposomaux a été considérée à toutes les étapes pour aider à maintenir le mélange à des niveaux qui tiennent compte de la valeur CMC (concentration critique de miscellisation). Dans l'étude des lipides, la CMC est la concentration au-dessus de laquelle la solution va commencer à générer des micelles tensioactives. Généralement, la CMC est déterminée par le désagrégement hydrophobe- hydrophile dans l'échantillon, de sorte que plus il est important, plus la CMC est basse. La base chimique de la molécule lipidique affecte également la CMC par ses longueurs de segments, grâce à quoi des segments plus longs donnent une CMC plus faible. Tous ces facteurs ont été pris en considération pour la présente étude.

1.3 - Détermination de la taille et de l'homogénéité des liposomes

La technique de diffraction laser a été utilisée pour déterminer le diamètre moyen des liposomes chargés et pour confirmer que les liposomes ne sont pas endommagés que leur taille est de l'ordre de 100 à 150 nm. Cette analyse, présentée à la Figure 2, est réalisée à l'aide d'un analyseur de taille de particules Beckman Coulter N4 Plus, dans des conditions correspondant à celles publiées précédemment [2].

Une fois les liposomes chargés, un surfactant (2% poids/poids) dépendant de la nature des liposomes choisi a été ajouté. Ainsi, différents types de surfactant ont été utilisés tels que : Pluronics L31 , L61 , F68, F127, L43, L44, L62, L64, P85, P84, P104, P123,F127.

1.4 - Mélange des liposomes avec le ciment et analyse du produit résultant Une fois les nanoparticules liposomales formées, elles ont été intégrées dans le ciment choisi, mélangées et préparées pour les essais. Ces techniques suivent, avec l'adaptation indiquée, les travaux précédemment publiés [2]. Dans ces essais, les ciments utilisés sont les ciments commerciaux Sealapex ^® et Apexit ^® . Après la préparation des liposomes, le ciment définitif est obtenu par le mélange de la solution liposomale avec le ciment pour obtenir une concentration finale en liposome de 3% (poids/poids). Le ciment définitif peut être obtenue de manière alternative par l'incorporation des liposomes lyophilisés dans la poudre du ciment endodontique.

La technique de microscopie électronique à transmission a été utilisée pour visualiser le mélange de liposome / ciment, afin de mieux comprendre la dispersion liposomale dans la matrice. La technique peut être effectuée comme suit, en préparant un rapport 1: 1 des nanoparticules de liposomes avec de l'acétate d'uranyle aqueux à 4% p / v et en incubant le mélange pendant 60 minutes. Les liposomes ont été concentrés par centrifugation comme ci-dessus et remis en suspension dans 10 ml d'un ciment donné, ou le même volume d'eau que le témoin. La suspension a encore été diluée à une concentration finale de 10% v / v et 10 μΐ ajoutés à un film de carbone Formvar supporté sur une grille de nickel à 400 Mesh (EM Systems Support Ltd). Le support a été séché à l'air et un contrôle de chaque ciment non dilué a également été réalisé. Les réseaux de nickel sec ont été analysés par microscopie électronique à transmission de 80 kv (Philips CM12 TEM) et les images enregistrées pour analyse.

EXEMPLE 2 : Etude de la libération des molécules chargées dans les liposomes Les expériences décrites ici concernent la détection de la libération des molécules encapsulées dans les liposomes et l'évaluation du pouvoir antiseptique du ciment endodontique formé. Les essais ont été effectués avec des mélanges de ciments contenant au volume final chacun de 0%, 1% et 3% (poids / poids) de liposomes chargés. 2.1 - Relargage de nanoparticules a. Relargage simple

Les ciments endodontiques utilisés dans ses expériences sont commercialement disponibles. Il s'agit des ciments Sealapex ^® et Apexit ^® . Ils ont été préparés conformément aux instructions du fabricant.

Pour chaque ciment endodontique, le volume final de chaque formulation de nanoparticules liposomales est de 0%, 1% et 3%. Le ciment a été appliqué au fond du puits d'une plaque 96 puits en triplicat. Après prise complète du ciment, 1 mL de PBS pH 7.2 a été versé dans chaque puits, puis prélevé et remplacé par une solution fraîche selon la cinétique suivante : 4 h , 8 h , 12h , 24h , 36h , 48 h puis 1 fois par 24 h pendant 15 jours. Une première étude de relargage a été réalisée en utilisant des ciments comprenant des liposomes chargés en rhodamine, sans ajout de tensioactif. Les résultats de cette étude sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous : ils montrent un relargage de la rhodamine dans des quantités relativement faibles. Tableau 1 : Quantité de chlorexidine relarguée par les ciments

Ces résultats ont conduit les inventeurs à améliorer la préparation de ciment par l'ajout d'un surfactant à la solution liposomale avant mélange avec le ciment. Les ciments utilisés dans la suite de l'étude comprennent un agent de surface de type surfactant. b. Relargage au travers d'une membrane poreuse

Le ciment a été placé dans le compartiment supérieur de l'insert Transwell ^® sur la membrane poreuse (400 nm). Après le temps de prise du ciment, le compartiment inférieur a été rempli de 3 fluides différents : de l'eau, du liquide physiologique ou du liquide dentaire artificiel (liquide céphalo-rachidien artificiel).

La présence de liposomes a été mesurée par spectrophotométrie à 1 h, 4 h, 24 h, 48 h, 72 h, 2 semaines et 3 semaines. La même expérience a été réalisée avec des souches E. Faecalis placées dans le compartiment inférieur (voir Transwell® insert test). Trois souches de E. Faecalis ont été utilisées: une de ATCC 29212 et deux autres, RW35 et RN44 (voir ci-dessous la méthode de culture et d'identification). EXEMPLE 3 : Evaluation des propriétés antibactériennes des ciments comprenant des liposomes

3.1 - Test de contact direct

L'efficacité antibactérienne des nanoparticules a été testée contre E. faecalis un agent pathogène intracanalaire commun et résistant. Pour étayer l'effet antibactérien des nanoparticules, elles ont été testées après immobilisation. Pour définir le mode d'action, l'effet a encore été évalué dans la suspension bactérienne. a. Préparation de la suspension bactérienne

E. faecalis a été cultivé pendant une nuit dans 5 mL de bouillon de perfusion de cerveau- coeur (BHI, Difco, Détroit, MI, USA), à 37 °C dans des conditions d'aérobies. Les 4 ml supérieurs ont été transférés dans un tube à essai neuf et centrifugés pendant 10 min à 4 165 x g. Le surnageant a été éliminé et les bactéries ont été remises en suspension dans 5 ml de PBS et agitées pendant 10 s. La densité optique de la suspension bactérienne est ajustée à 650 nm, ce qui correspond à une transmittance de 90 T (0,5 échelle Me Farland : 1,5 10. ⁸ CFU /mL b. Effet antibactérien des liposomes immobilisés

L'effet antimicrobien de surface du ciment endodontique incorporant des liposomes 0%, 1% ou 3% (poids / poids) a ensuite été évalué. Une plaque de microtitrage (plaque à fond plat de 96 puits, Nunclon, Copenhague, Danemark) a été positionnée verticalement et les parois latérales de 8 puits ont été revêtues de quantités similaires du matériau (lOmg) testé selon la procédure décrite ci-dessus.

10 uL de la suspension bactérienne ont été ajoutés sur la surface de chaque ciment et dans des puits vides. Après inoculation (à 37°C à saturation en humidité) pendant 2, 5, 20 et 60 minutes, 240μί de PBS ont été ajoutés dans chaque puits. Après agitation pendant 1 minute à l'aide d'une pipette, la solution résultante a été transférée et diluée en série. La survie bactérienne a été mesurée par la culture d'aliquot de 20μΙ des solutions transférées sur des plaques Triptic soy agar après une dilution en série par un facteur 10. Après une incubation pendant 24h à 37°C, les colonies sur la plaque ont été comptées et le CFU/mL a été calculé.

La présence de bactéries a été mesurée par spectrophotométrie (à 1 h, 4 h, 24 h, 48 h, 72 h, 2 semaines et 3 semaines).

3.2. Test en Transwell® insert

Une membrane avec des pores de 400 nm a été utilisée pour évaluer la diffusion des liposomes à travers ces nanopores ; ces nanopores simulent, du fait de leur taille, les tubili dentinaires. Dans une plaque 96 puits, le compartiment supérieur a été rempli avec 10 mg de ciment comprenant des liposomes ou non, et le compartiment inférieur a été rempli avec une solution comprenant les souches bactériennes.

Trois souches de E. Faecalis ont été testées, il s'agit des souches ATCC 29212, RW35 et RN44.

L'évaluation du pouvoir désinfectant à été mesurée de la même manière que dans le test de contact direct. 3.3. Test de diffusion dans l'agar

Un test complémentaire a été réalisé pour démontrer le pouvoir désinfectant de notre ciment endodontique comprenant des liposomes et le comparer à celui des ciments sans liposomes (qui présentent un pouvoir désinfectant limité, notamment sur le biofilm dentaire).

Le test a été réalisé dans une plaque de pétri rempli d'une couche de 10 mL d'agar de Muller Hinton stérilisé. Des puits de 4 mm de diamètre ont été formés dans cette couche d'agar pour contenir les ciments endodontiques réalisés dans les mêmes conditions que ci-dessus.

Dans cette expérience, l'activité antibactérienne a été évaluée contre les souches de Pseudomonas aeruginosa, Enteroccus faecalis, Staphylococcus aureus et Escherichia coli.

Les souches bactériennes ont été cultivées à 37 °C pendant 24 h dans le milieu MH agar pour produire une turbidité de 0,5 sur l'échelle de Me Farland correspondant à une concentration de 10. ⁸ CFU/mL. Une couche contenant ces bactéries ont été déposées de sorte à recouvrir les ciments fraîchement mélangés. Les plaques ont été conservées 2 h à température ambiante et incubées à 37 °C pendant 24 h. Un suivi a été réalisé à 4 h , 8 h , 12h , 24h , 36h , 48 h puis 1 fois par 24 h pendant 15 jours : la zone d'inhibition en mm est mesurée avec un pied à coulisse (test visuel).

3.4. Test de contact direct modifié (biofilm)

Ce test permet de démontrer le pouvoir désinfectant d'un ciment endodontique contre un biofilm bactérien (forme majoritaire des bactéries dans le canal pulpaire.). Le biofilm à été formé sur des tranches d'incisives bovines de 4 mm x 4mm x 1,5 mm (largeur x longueur x épaisseur) utilisant un disque diamanté à faible vitesse sous irrigation.

Les échantillons sont trempés dans de l'EDTA à 17 % pendant 3 minutes pour enlever la boue dentinaire puis stérilisés à 121°C pendant 20 min.

Une souche standard de E. faecalis (ATCC 51299) est utilisée pour la formation du biofilm bactérien. La culture de E. faecalis est effectuée dans les mêmes conditions que précédemment. Les tranches de dent bovine sont placées dans des puits d'une plaque 24 puits. On ajoute dans chaque puits 220μΙ d'inoculum, on complète ensuite le puits avec l,8mL d'une solution stérile de BHI. Les puits sont cultivés à 37 °C avec 5% de C0 ₂ pendant 14 jours. Le surnageant est complètement changé tous les 48 h par une solution stérile fraîche de BHI.

Les ciments endodontiques préparés dans les conditions précédemment citées sont disposés sur les coupes de dent bovine recouvertes de biofilm.

Les échantillons de dent/ciment endodontiques sont placés dans une nouvelle plaque 24 puits, et conservé à 37°C avec 5% de C0 ₂ pendant 2,7 et 14 jours.

Après ces périodes d'incubation les biofilms restants sont transférés dans des tubes contenant lmL de solution saline. Les tubes sont agités avec un sonicateur ultrasons pendant 30 secondes à 40 W pour détacher les biofilms.

La mesure du nombre de bactérie (CFU/mL) est effectuée comme précédemment décrit.

EXEMPLE 4 : Evaluation du pourcentage de relargage des molécules fluorescentes contenues dans les liposomes mélangés au ciment 4.1 - Objectif de l'expérience

L'expérience qui suit a pour objectif d'évaluer le pourcentage de relargage d'une molécule fluorescente (rhodamine) incorporée dans des liposomes mélangés à un ciment endodontique. En pratique, elle a consisté à comparer i) le relargage obtenu à partir de lOmg de ciment comprenant 3% de liposomes (en poids) contenant de la rhodamine (ce qui correspond à l'ajout en poids de 1% de lipides dans le ciment) versus ii) le relargage obtenu avec un ciment ne comprenant pas de liposome mais seulement de la rhodamine (fluorescence seule). Les ciments de base utilisés dans cette expérience sont les ciments commerciaux Apexit®, Sealapex® et Bio Root™® RCS. Les liposomes ont été préparés à partir des lipides suivants : EPC, DOPE, DODAP.

4.2 - Préparation des liposomes

Les liposomes ont été préparés selon la méthode décrite ci-dessus. L'expérience a été réalisée avec les compositions suivantes : « liposome DOPE » (DOPE, HSPC), « liposome DODAP » (DODAP, PC, Cholestérol), « liposomes EPC » (EPC, HSPC ) dans des proportions respectives suivantes ( 5 :2 :3 ratio molaire) , ( 3 :7 ratio poids) , ( 35 :65 ratio poids) Une solution de rhodamine (0,04 nMol) est utilisée pour hydrater le film lipidique et obtenir des liposomes contenant des molécules fluorescentes (chargement des liposomes).

4.3 - Préparation du matériau de comblement comprenant les liposomes chargés en rhodamine

Après l'obtention des liposomes, ces derniers sont mélangés avec du Pluronic L31 à 2% w/w. La solution de liposomes fluorescents préparée précédemment a ensuite été incorporée aux différents ciments testés,

lOOmg d'un ciment donné ont été mélangés avec lmg de lipides. 10 mg du mélange lipide/ciment est ensuite disposé en triplicat dans des puits d'une plaque de 96 puits. Pour préparer le ciment contrôle « sans liposome », la solution de rhodamine a été incorporée directement dans les ciments dans les mêmes proportions que celles utilisées pour les ciments contenant des liposomes (même quantité de rhodamine contenue dans le ciment). Les mélanges ainsi obtenus ont été placés dans un incubateur à 37°C saturé en humidité.

4.4 - Méthodes d'analyse utilisées Cinétique d'étude du relargage :

Après prise complète du matériau (soit environ 4 heures), lmL de PBS (pH 7.2) a été ajouté dans chaque puits puis enlevé et remplacé par une solution fraîche surnageant selon la cinétique suivante : 4h , 8h , 12h , 24h , 36h , 48 h puis 1 fois par 24 h pendant 15 jours.

Taille des liposomes :

La mesure de la taille des liposomes a été réalisée selon la méthode décrite ci-dessus. Nous avons aussi mesuré la taille des liposomes après relargage par le ciment.

Dosage fluorescence :

La solution de rhodamine sert d'étalon pour le dosage de la fluorescence.

Au moment de réaliser le dosage, les surnageants ont été prélevés dans chaque puits et transférés respectivement dans un puits d'une autre plaque utilisée pour le dosage. Le dosage est réalisé par spectrophotométrie (Plaque reader BIOTEK).

4.5 - Résultats

Les résultats de cette étude sont présentés aux Figures 2, 3 et 4.

Ont été intégrés dans différents types de ciment, soit des liposomes encapsulant de la rhodamine, soit de la rhodamine non encapsulée.

Relargage de la rhodamine :

Les résultats montrent que les ciments qui intègrent des liposomes permettent un relargage supérieur en quantité et en durée comparée aux ciments qui n'intègrent pas de liposomes (les courbes marquées d'un rond correspondent au ciment sans liposomes). Cette propriété est particulièrement intéressante en endodontie, car pour une élimination bactérienne efficace il faut un relargage suffisant en quantité et durable dans le temps [10 ; 11]. Ainsi, ces résultats montrent que l'intégration de liposomes permet de libérer jusqu'à 19,43% de la quantité de rhodamine incorporée dans le ciment versus 1,67% quand la rhodamine n'est pas encapsulée dans des liposomes (Figure 4).

Par ailleurs, la totalité de la quantité de rhodamine libérée dans les ciments sans liposomes intervient dans les 24-48h, après ces temps le ciment ne relargue que très peu de substance fluorescente. La présente innovation permet donc un relargage diffus sur une durée longue 15 jours. Le ciment développé permet d'atteindre une concentration d'inhibition/bactéricide minimale constante dans le temps, contrairement au ciment endodontique sans liposome qui atteignent cette concentration pendant 24h (le relargage les jours suivants ne permet pas d'atteindre localement la concentration minimale d'inhibition).

Enfin, les résultats montrent que la combinaison ciment + liposomes encapsulant de la rhodamine permet un relargage supérieur à celui de la combinaison ciment + rhodamine, quelque soit le type de ciment et le type de liposomes utilisés. Néanmoins, les profils de relargage diffèrent en fonction des lipides utilisés et des ciments.

Enfin, nous retrouvons les mêmes profils de relargage que dans les précédentes études associant un ciment osseux et des liposomes [1]. Par ailleurs, la formulation peut être modulée en fonction de l'objectif à atteindre, en modifiant la nature des lipides, la nature de l'antiseptique et la nature de ciment endodontique. En conclusion, les liposomes ont été incorporés avec succès au ciment de comblement pour permettre un relargage contrôlé (en quantité et en durée) d'une molécule d'intérêt. Cette innovation pourrait jouer un rôle important dans la diminution des infections endodontiques post-traitement qui concernent 44% à 77% des dents traitées. L'amélioration de la désinfection par cette innovation permettrait moins de complications cardiovasculaires (infarctus) et respiratoires (sinusites) et une réduction des coûts liés à l'échec du traitement endodontique (antibiotiques, couronne, implant, etc.).

EXEMPLE 5 : Evaluation du pourcentage de relargage de la chlorhexidine contenue dans les liposomes mélangés au ciment

5.1 - Préparation de liposomes chargés avec de la chlorhexidine

Les liposomes ont été formés à partir des différents lipides d'intérêt décrits précédemment en utilisant différentes techniques classiques : sonication ou hydratation d'un film lipidique ou vortexage.

Dans tous les cas, les solvants organiques résiduels ont été éliminés pour récupérer un film lipidique pur, qui a été ensuite remis en suspension dans un solvant (généralement de l'eau) pour générer des liposomes. Ceux-ci ont été obtenus grâce à des techniques d'évaporation, ce qui n'est pas nécessaire si le détergent liposomal est acheminé dans la phase aqueuse dans une concentration minimale satisfaisante. Pour la présente preuve de concept, des réactifs de moyenne à haute qualité ont été nécessaires (> 97,0% de pureté). Dans cet essai, un protocole différent de celui utilisé dans les essais précédents a été mis en œuvre. Les lipides utilisés ici sont d'une part le DOPE et le HSPC dans un rapport massique respectif de 30% et 70% et d'autre part le DODAP, le PC, le cholestérol avec un ratio molaire de 5 :2 :3.

Dans la préparation des liposomes, le rapport (poids / poids ou molaire) au sein de la combinaison désirée de lipides a été réalisé par pesée précise du lipide détergent donné avant mélange des lipides dans un grand ballon à fond rond. A cela, 5 ml de solvant organique (chloroforme, qualité HPLC) ont été ajoutés et la suspension a été mélangée par vortex jusqu'à dissolution complète des lipides. Le même ballon a été attaché à un kit d'évaporation rotatif, augmenté d'une pompe à vide avec une rotation à une révolution par seconde. Le système a été maintenu à une température constante généralement de 60° C par bain d'eau, cette température étant déterminée par la transition de phase du mélange lipidique d'intérêt.

Lors de l'élimination de tout solvant organique, de l'eau désionisée MQ stérilisée contenant 1% ou 5% de digluconate de chlorhexidine a été ajoutée pour donner une concentration de lipide de 200 mg.mL-1. La suspension a ensuite été mélangée par vortexage, pour permettre la formation de liposomes avec une taille comprise entre 100- 200 nm. A la fin de cette opération, il est ajouté 2% (poids/poids) de Pluronic L61.

La solution de liposomes ainsi obtenue peut alors être mélangée avec le ciment endodontique ou osseux d'intérêt. Dans cet exemple, une solution de chlorhexidine de 5% avec un rapport pondéral liposome/ciment de 3% ont été utilisés. Le ciment utilisé est le Sealapex.

La solution de liposomes est injectée au sein du ciment et un mélange manuel pendant 30 secondes est effectué.

Alternativement la solution de liposomes obtenue peut être lyophilisée et la poudre obtenue peut être mélangée à la poudre du ciment ou à la pâte en fonction de la présentation commerciale du ciment. Les liposomes lyophilisés sont hydratés par le liquide du ciment ou par l'humidité de l'air. La lyophilisation de la solution de liposome permet une plus grande stabilité dans le temps permettant au ciment d'être conservé à température ambiante.

5.2 - Méthode de calcul de la concentration de chloréxidine relarguée

La concentration de chloréxidine (CHX) relarguée a été déterminée par spectrophotométrie selon le protocole suivant : a. Préparation des plots de ciment Les plots de ciment (matériau de comblement) sont préparés dans des moules en téflon cylindriques d'un diamètre de 3 mm et d'une hauteur de 3.5 mm (Figure 5). La quantité de ciment nécessaire à préparer 5 plots est de 350 mg. Le ciment est pesé à l'aide d'une balance de précision AB204 Mettler (N° appareil P31828, dernier contrôle le 17/10/2016). Pour les ciments WELL ROOT™ et TOTAL FILL, les 350 mg correspondent à la préparation vendue. Pour le Bio Root™ elle est constitué de 250 mg de poudre et ΙΟΟμί de liquide. Une quantité X (cf tableau N°3) de liposome est ajouté au ciment qui est alors spatulé à l'aide d'une spatule à ciment sur un bloc de spatulation (3M) pendant 30 seconde. Les moules sont alors remplis à l'aide d'une spatule à bouche. La prise du ciment se fait à température ambiante pour les plots de Bio Root™ et à 37°C en ambiance humide (incubateur de culture cellulaire) pour les ciments Well Root™ et Total fill. b. Mesure de la libération de la chlorhexidine Les plots sont, dans un premier temps, pesés. Pour ce faire afin d'éviter le maximum de manipulation des plots, ceux-ci sont mis dans des tubes Eppendorf de 1.5 mL préalablement pesé (tare). Les tubes contenant les plots sont ensuite pesés afin de déterminer le poids de chaque plot. 1 mL d'eau milliQ est ajouté dans chaque Eppendorf. Ce volume correspond à 10 fois le volume du plot. Les échantillons sont alors incubés à température ambiante. Régulièrement 100 microlitres du solvant sont prélevés et transférés dans un puits d'une plaque 96 puits (Greiner Bio-One™ UV-Star™ 96-Well UV Spectroscopy Microplate). Une mesure de l'absorbance est alors réalisée à 255 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV/visible (Xenius XLM, SAFAS, Monaco). Cette longueur d'onde correspond au pic d'absorption du di-glucuronate de chlorhexidine (vérification expérimentale avant le début de l'expérience). 100 microlitres d'eau milliQ sont alors ajoutés dans chaque échantillon afin de compenser le volume prélevé pour l'analyse. La mesure de l'absorption à 255 nm est utilisée pour calculer la concentration en chlorhexidine (CHX) de la solution à partir d'une courbe étalon expérimentale de l'absorption de la chlorhexidine en fonction de sa concentration en utilisant le même spectrophotomètre (Figure 6 : Il existe une linéarité entre la quantité de CHX en solution et sa concentration dans le ciment. Cette courbe étalon a été utilisée pour le calcul de la concentration de CHX relarguée). La concentration est normalisée par le poids des plots et exprimée en mg chlorhexidine /mL. Le calcul des concentrations tient compte de l'ajout de 100 microlitres d'eau milliQ pour remplacer les 100 microlitres de solution utilisés pour la mesure. c. Résultats de la mesure du relargage de la chlorhéxidine

Les résultats sont présentés à la Figure 7. Ceux-ci montrent que l'encapsulation de la chlorhexidine dans un système liposomal et son injection dans un ciment endodontique tel que le Sealapex permet un relargage de chlorhexidine significativement supérieur à celui mesuré à partir d'un ciment contenant de la chlorhexidine seule sur une période d'au moins 9 jours. Par ailleurs, la concentration de chlorhexidine relarguée est supérieure à la MIC (concentration correspondant à l'élimination de 90% des bactéries) des bactéries Gram + et Gram - ; le seuil étant respectivement de 0,022 et 0,04 mg/mL (données de la littérature).

EXEMPLE 6 : Evaluation de l'efficacité de désinfection d'un ciment de comblement contenant des liposomes chargés en chlorhexidine

6.1 - Test de contact direct (ou Direct Contact Test). a. Conditions du test

Cette méthode a été décrite précédemment au paragraphe 3.1. Pour cet essai, le Sealapex seul est utilisé comme témoin négatif (FREE Sealapex) et le sealapex mélangé avec de la chlorhexidine seule (sans liposome) (CHX Sealapex) comme témoin positif. La chlorhexidine seule est incorporée dans les mêmes proportions que celle encapsulée dans les liposomes. b. Résultats

La Figure 8 représente la courbe étalon établie pour cet essai. Cette courbe montre l'existence d'une linéarité entre la concentration de bactéries et la densité optique. Cette courbe étalon a été utilisée pour le calcul de la concentration bactérienne et la mesure du pouvoir désinfectant des différentes formulations. Une fois les mélanges effectués à J0, leur pouvoir désinfectant des différents ciments a été testé à Jl, J7 et J20.

Les résultats sont présentés aux Figures 9, 10 et 11, correspondant respectivement aux résultats obtenus à Jl, J7 et J20.

Il est constaté que l'intégration de liposomes encapsulant de la chlorhexidine dans un ciment permet d'obtenir un pouvoir désinfectant supérieur à celui d'un ciment incorporant de la chlorhexidine seule et à celui du ciment seul jusqu'à au moins 20 jours. Aussi, à 20 jours après prise du ciment, le ciment seul ou intégrant de la chlorhexidine non encapsulée n'a plus de pouvoir désinfectant, et les bactéries sont capables de croître dessus. Le mélange DOPE Sealapex montrant une légère supériorité à celui du DODAP Sealapex. 6.2 - Test de contact direct modifié (ou Modified Direct Contact Test) a. Conditions Cette méthode a été décrite précédemment au paragraphe 3.4.

Pour cet essai, les mêmes ciments que ceux testés au a. sont utilisés à la seule différence qu'ici le milieu de culture bactérien (BHI) est utilisé comme contrôle négatif. b. Résultats Les résultats sont présentés à la Figure 12. On observe que l'ajout de liposomes encapsulant de la chlorhexidine permet de d'éliminer 99,99% des bactéries avec un effet au moins jusqu'à J15 comparativement à une élimination de 54% des bactéries pour le ciment avec la chlorhexidine non encapsulée. En outre, la formulation liposomale de ciment permet de conférer à ce dernier un pouvoir bactéricide alors que le ciment sans liposome est bactériostatique. Nous retrouvons une supériorité antibactérienne de la formulation de DOPE comparativement à celle avec le DODAP.

Le Sealapex à une action bactéricide à court terme (Jl) grâce un son pH élevé (12). La croissance bactérienne après Jl s'explique par une baisse du pH et une sélection des bactéries résistante à un pH >12.

Des tests ont été réalisés avec les mêmes bactéries sous forme de biofilm (14 jours de maturation). Les résultats montrent les mêmes tendances, à savoir une meilleure désinfection du ciment contenant des liposomes à J15 après mise en contact (données non présentées).

6.3 - Test de diffusion dans l'agar ( ou Agar Diffusion Test - ADT) a. Conditions

Cette méthode a été décrite précédemment au paragraphe 3.3.

Pour cet essai, les mêmes ciments que ceux testés au a. sont utilisés à la seule différence qu'ici de l'eau saline est utilisée comme contrôle négatif. b. Résultats

Les résultats sont présentés à la Figure 13. Les résultats nous montrent que les formulations liposomales avec le Sealapex permettent une plus grande zone d'inhibition que la formulation sans liposome à 24 h, 48 h et 72 h après incubation. Ces résultats confirment un meilleur pouvoir désinfectant de la formulation liposomale de chlorhexidine contre la bactérie E. faecalis, principalement responsable des échecs endodontique.

6.4 - Conclusions

En conclusion, il a été montré que les ciments contenant des formulations liposomales contenant une molécule désinfectante (ici, la chlorhexidine) et un tensioactif (voir la description ci-dessus) permettent un relargage diffus et contrôlé sur une période d'au moins 15 jours de la molécule désinfectante. Ce relargage est supérieur à celui d'un ciment ne contenant que de la chlorhexidine, ce qui permet d'améliorer significativement les propriétés désinfectantes du ciment choisi.

Il a également été montré que l'ajout de chlorhexidine seule améliore peu ou pas les propriétés antibactériennes du ciment et qu'un ajout trop important de chlorhexidine entraine la formation de précipité et l'altération du ciment (délitement). Ce phénomène est dû au relargage faible de la chlorhexidine seule à partir du ciment, et à l'interaction de cette dernière avec des éléments chimiques du ciment comme les groupements phosphate. La présente invention permet de réduire la charge bactérienne dans un canal endodontique par une diffusion efficace d'un antiseptique. Cette diminution permettrait une réduction de la prescription d'antibiotiques, du nombre d'échecs du traitement endodontique, ce qui entraînerait une réduction des réfections prothétiques et une baisse de l'édentement des patients améliorant donc leur qualité de vie.

Il est à noter que le Sealapex utilisé dans cet essai est un matériau avec une composante hydrophile et hydrophobe. De nombreux ciments utilisés aujourd'hui en chirurgie dentaire comme en orthopédie, sont à base de silicate de calcium. Dans le cadre du développement de la présente invention, dans un contexte proche de la clinique, nous avons aussi intégré des liposomes dans des matériaux à base de silicate de calcium sous forme poudre liquide ou pré mixés (tel que décrit précédemment).

EXEMPLE 7 - Validation de nouveaux matériaux de comblement

Dans l'optique d'un développement commercial de nouveaux ciments, de nouvelles méthodes de production de liposomes, de nouvelles formulations de liposomes et de nouveaux surfactants/ polymères ont été testés. Les matériaux de comblement utilisés sont des ciments à base de silicate de calcium. En effet, ce type de ciment est utilisé pour des applications endodontiques (matériau de comblement ou ciment endodontique), de restauration dentaire (exemple de la Bio dentine™), de coiffage pulpaire / Apexification (exemple du Proroot MTA) ou de matériau de comblement en orthopédie (exemple du Cranioscult™). De plus, ces matériaux peuvent être utilisés en association avec du calcium de phosphate.

Pour ces essais, des formulations de liposomes encapsulant du digluconate de chlorhexidine ont été préparées. Les lipides DOPE, SA, Cholestérol et la CHX ont été fournis par l'entreprise Sigma Aldrich et les lipides DPPC et HSPC sont fournis par l'entreprise Lipoid.

7.1 - Procédé de préparation de solutions lipososomales contenant de la chlorhexidine.

Le protocole suivant a été suivi :

1. Solubilisation des lipides dans le chloroforme suivi d'une évaporation sur un évaporateur rotatif.

2. Hydratation des lipides avec une solution de CHX (1 ou 5%, 4 ml pour 200 mg de lipides).

3. Extrusion des liposomes (8 fois) en utilisant une extrudeuse LIPOFAST LF-50 (Avestin), avec des membranes poreuses de lOOnm.

4. Concentration des formulations par évaporateur,

5. Mesures du potentiel DLS et Zeta.

6. Ajout de 2% p / p de Pluronic L 31.

7.2 - Solutions liposomales produites

En suivant le protocole décrit ci-dessus les formulations liposomales suivantes ont été produites :

• DPPC: Chol: SA ( liposome cationique), rapport molaire 52,8: 26: 21,2, hydratation dans une solution à 1% de CHX. Dit « DPPC 1% »

• DPPC: Chol: SA (liposome cationique), rapport molaire 52,8: 26: 21,2, hydratation dans une solution de CHX à 5%. Dit « DPPC 5% » · HSPC: DOPE (liposome neutre), rapport pondéral 7: 3, hydratation dans une solution à 1% de CHX. Dit « DOPE 1% »

• HSPC: DOPE (liposome neutre), rapport pondéral 7: 3, hydratation dans une solution de CHX à 5%. Dit « DOPE 5% »

Ainsi, deux types de liposomes ont été produits et ont été associés à deux concentrations différentes de CHX. Les concentrations théoriques de lipides et de CHX dans des formulations sont :

Hydratation de 200 mg de lipides avec 4 ml d'une solution de CHX à 1%, puis concentration à 1 ml.

200 mg / ml de lipides + 40 mg / ml de CHX.

Hydratation de 200 mg de lipides avec 4 ml d'une solution de CHX à 5%, puis concentration à 1 ml

200 mg / ml de lipides + 200 mg / ml de CHX

7.3 - Taille des liposomes Les Résultats sont présentés au Tableau 2 ci-dessous :

Tableau 2 : Taille, potentiel zêta et polydispersité des liposomes produit.

Ainsi, il est observé que :

La taille des liposomes HSPC: DOPE hydratés avec une solution à 1% de CHX n'a pas changé après la concentration de la formulation (164,5 nm avant et 167,7 nm après).

La taille des liposomes HSPC: DOPE hydratés avec une solution de CHX à 5% a augmenté après concentration de la formulation (106,1 nm avant et 624,4 nm après).

La taille des liposomes DPPC: Chol: SA hydratés avec une solution de CHX à 1% a augmenté lors du stockage (avant la concentration de la formulation). NB : Les liposomes DPPC: Chol: SA hydratés avec une solution de CHX à 5% ont été obtenus par hydratation simple.

7.4 - Préparation des matériaux de comblement contenant des solutions liposomales Des matériaux de comblement ont été préparés en ajoutant des solutions liposomales contenant de la chlorhexidine à différents types de ciments à base de silicate de calcium. Les échantillons sont sous la forme de plots tel que représentés à la Figure 5. a. Protocole

Pour les matériaux de comblement à base de ciments de type TOTAL FILL et WELL ROOT™ :

Après mélange manuel du ciment et de la solution de liposome, la mixture a été vortexée pour une meilleure homogénéisation et placée dans les moules en plastique jusqu'à prise du ciment. Ces deux ciments ayant une formulation ne nécessitant pas de mélange poudre liquide, ils sont directement mélangés avec la solution de liposomes.

Pour les matériaux de comblement à base de ciments de type BIO ROOT™™ RCS : Le Bio Root™ étant un mélange poudre liquide, les liposomes ont été ajoutés avant mélange et le ciment a été préparé selon les recommandations du fabricant (méthode préférée). Alternativement, la solution de liposomes peut être ajoutée au liquide dans le cas du ciment Bio Root™ ou ajoutée après mélange poudre liquide et mélangée comme décrit ci-dessus.

Pour les ciments endodontiques contrôle, la solution de digluconate de chlorhexidine (CHX) est ajoutée de la même manière et dans les mêmes proportions que les solutions de liposomes, pour avoir le même pourcentage en poids de corps étranger dans le ciment et la même quantité de CHX. Après l'homogénéisation le ciment est considéré comme prêt et peut être utilisé pour les tests. b. Description des matériaux de comblement obtenus

Les différentes combinaisons sont résumées au Tableau 3 ci-dessous

Ciments testés: Total Bio Well

FM™ Root™ Root™ masse échantillon : 55mg 55mg 55mg

Nombre échantillons 6 6 6 par combinaison: 6

Nombre de 18 18 18 combinaisons 24 (16

lipos + 8 contrôles)

Liposomes testés DOPE DOPE DOPE contiennent: DPPC DPPC DPPC

Concentration de lipide 0,5% 0,5% 0,5% dans ciment 1% 1% 1%

3% 3% 3%

10% 10% 10%

Concentration de CHX 1% 1% 1% dans liposome 5% 5% 5%

Concentration de CHX N.A 1% 1% seule en solution 5% 5%

Concentration de CHX N.A 1% 1% seule dans le ciment 10% 10%

Tableau 3 : Caractéristiques des matériaux de comblement testés

7.5 - Etude du relargage de la chlorhexidine a. Conditions La concentration de chlorhexidine (CHX) relarguée a été déterminée par spectrophotométrie selon le protocole décrit ci-après :

Les plots sont, dans un premier temps, pesés. Pour ce faire afin d'éviter le maximum de manipulation des plots, ceux-ci sont mis dans des tubes Eppendorf de 1.5 mL préalablement pesé (tare). Les tubes contenant les plots sont ensuite pesés afin de déterminer le poids de chaque plot. 1 mL d'eau milliQ est ajouté dans chaque Eppendorf. Ce volume correspond à 10 fois le volume du plot. Les échantillons sont alors incubés à température ambiante. Régulièrement 100 microlitres du solvant sont prélevés et transférés dans un puits d'une plaque 96 puits (Greiner Bio-One™ UV-Star™ 96-Well UV Spectroscopy Microplate). Une mesure de l'absorbance est alors réalisée à 255 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV/visible (Xenius XLM, SAFAS, Monaco). Cette longueur d'onde correspond au pic d'absorption du di-glucuronate de chlorhexidine (vérification expérimentale avant le début de l'expérience). 100 microlitres d'eau milliQ sont alors ajoutés dans chaque échantillon afin de compenser le volume prélevé pour l'analyse. La mesure de l'absorption à 255 nm est utilisée pour calculer la concentration en chlorhexidine (CHX) de la solution à partir d'une courbe étalon expérimentale de l'absorption de la chlorhexidine en fonction de sa concentration en utilisant le même spectrophotomètre (Figure 6 : Il existe une linéarité entre la quantité de CHX en solution et sa concentration dans le ciment. Cette courbe étalon a été utilisée pour le calcul de la concentration de CHX relarguée). La concentration est normalisée par le poids des plots et exprimée en mg chlorhexidine /mg ciment. Le calcul des concentrations tient compte de l'ajout de 100 microlitres d'eau milliQ pour remplacer les 100 microlitres de solution utilisés pour la mesure

Une nouvelle courbe étalon a été établie et celle-ci est présentée à la Figure 14.

On observe une forte corrélation entre la concentration de chlorhexidine l'absorbance de la solution à 255 nm. Cette courbe a été utilisée pour le calcul de la chlorhexidine relarguée.

Les ciments Well Root™ et Bio Root™ RCS intégrant de la chlorhexidine non encapsulée dans les mêmes proportions et concentrations théoriques en CHX que dans les formulations liposomales ont été utilisés comme témoins. b. Résultats

Les résultats présentés aux Figures 15 à 19 ont été obtenus avec le ciment de base Bio Root™.

Les résultats présentés aux Figures 20 à 24 ont été obtenus avec le ciment de base Well Root™.

Résultats obtenus avec le matériau de comblement désinfectant à base de ciment Bio Root™

Cette association montrent des profils de relargage différents en fonction du type liposomes et de la concentration de chlorhexidine théorique.

On remarque que l'intégration d'une quantité de liposome à au moins 10 % altère le profil de relargage quel que soit le liposome utilisé et quel que soit la concentration de chlorhexidine encapsulée. La concentration la plus reproductible étant le ciment chargé avec 1% de liposome. Le relargage est lent de Jl à J13 puis accélère entre J13 et J20 pour se stabiliser autour de J27. La valeur maximale atteinte par toutes les combinaisons est de 0,008mgCHX/mg Ciment. Nous observons qu'il n'y a pas de proportionnalité directe entre la concentration de CHX encapsulée et la CHX relarguée. Aussi de trop forte concentration de CHX semblent perturber le relargage de cette dernière, même si l'aspect de la solution relarguée est clair. Les ciments intégrant DOPE ou DPPC à 1% de CHX encapsulée relarguent jusqu'à 90 % de leur contenu théorique en CHX. Les ciments intégrant DOPE ou DPPC à 5% de CHX encapsulée relarguent un maximum de 30% de leur contenu théorique en CHX théorique. Nous voyons aussi que la taille et la nature des liposomes influent moins que la concentration de chlorhexidine encapsulée. Enfin la spatulation du ciment comprenant la solution liposomale et son temps de prise ont été les mêmes que pour les ciments sans ajout de solution liposomale.

En conclusion, nous avons montré que l'intégration de solution liposomale dans un ciment à base de silicate de calcium non pré-mixé (Bio Root™ RCS) permet un relargage efficace de chlorhexidine sur une période de 30 jours. Cette intégration peut se faire entre 0,01% et 20% du poids du ciment avec des concentrations de chlorhexidine encapsulée comprise entre 0,1% et 20%.

Avec le ciment Bio Root™, la combinaison optimale est l'intégration dans le ciment d'une solution liposomale à une concentration de 1% du poids du ciment, cette solution liposomale encapsulant une solution de chlorhexidine à 1%.

Résultats obtenus avec le matériau de comblement désinfectant à base de ciment Well Root™ Les ciments à base de silicate de calcium contiennent généralement un agent épaississant tel que le PEG.

Nous avons constaté un relargage diffus et constant pour la formulation DOPE 1% CHX. Cette formulation produit un pic de relargage (« burst release ») dans les premiers jours (J0 à J3) puis une stabilisation du relargage s'opère entre J15 et J20 en fonction des concentrations de lipides dans le ciment. Cette formulation permet de relarguer un maximum de 20% de la quantité de CHX intégrée dans les ciments. Les autres formulations montrent une quantité proche ou équivalente de CHX relarguée (entre 15 et 20% de la quantité intégrée au ciment) mais avec un profil de relargage moins contrôlé, notamment pour la formulation DPPC 5%. La concentration maximale moyenne de CHX relarguée (0,0005mg CHX /mg de ciment) est environ 10 fois inférieure à la concentration maximale moyenne de CHX relarguée par le Bio Root™. Ceci pouvant s'expliquer par la nature chimique différente des ciments et leurs porosités respectives.

Concernant l'influence des liposomes, nous constatons que les liposomes neutres comme le DOPE semblent mieux adaptés que les cationiques (DPPC). La taille des liposomes aussi influent le mode de relargage. Ils semblent que les formulations de liposomes avec des tailles inférieures au micron relargent de manière plus efficace la CHX. Ceci pouvant être expliqué par une taille de pores du Well Root™ relativement faible par rapport à celle des pores du Bio Root™.

En conclusion, l'intégration de solution liposomale dans un ciment à base de silicate de calcium pré- mixé permet un relargage contrôlé dans le cas de liposomes dont la taille est inférieure au micron et neutre. Aussi une trop grande concentration de CHX encapsulée semble perturber le relargage de cette molécule par de possibles interactions chimiques avec le ciment.

Avec le ciment de type Well Root™, la combinaison optimale est l'intégration dans le ciment d'une solution liposomale à une concentration de 1% du poids du ciment, cette solution liposomale encapsulant une solution de chlorhexidine à 1%.

Des essais réalisés avec le ciment Total Fill™ qui est, comme le Well Root™, un ciment à base de silicate de calcium contenant un agent épaississant, ont abouti à des résultats similaires à ceux obtenus avec le Well Root™.

Conclusion : Ces expériences mettent en évidence le fait que la qualité du matériau de comblement désinfectant selon l'invention dépend bien de trois paramètres : la nature du ciment, la nature et la concentration des liposomes et la nature et la concentration de la molécule désinfectante.

Le ciment à base de trisilicate de calcium de type Bio Root™ sans agent épaississant permet d'obtenir de meilleurs résultats que les ciments contenant un épaississant. L'absence d'épaississant donne un ciment plus pur et plus poreux qui facilite le relargage. - Résultats obtenus avec des ciments comprenant de la chlorhexidine seule (sans liposome) : comparaison

Les graphiques des résultats sont représentés aux Figures 19 et 24. Nous observons que l'intégration de chlorhexidine au sein des ciments endodontiques crée un précipité blanc visible à l'œil nu. Ce précipité est probablement engendré par la réaction de la chlorhexidine avec des groupements phosphates présents dans les biomatériaux minéraux. Il est à noter qu'au-delà de 5% de concentration de la solution de CHX, le ciment endodontique se délite complètement et n'est pas utilisable.

Nous constatons que le relargage en CHX de ces combinaisons est faible et ne correspond pas à un relargage contrôlé. L'essentiel de la chlorhexidine relarguée intervient au cours de la première semaine dans des quantités faibles voire nulles. La concentration maximale moyenne relarguée par le Well Root™ est de 0,00015mg CHX /mg pour la meilleure des combinaisons comparativement à 0,0005 CHX /mg Ciment dans le cadre d'une formulation liposomale de la chlorexidine.

Le Bio Root™ intégrant la CHX seule relargue une concentration maximale moyenne de 0,0008 mg CHX /mg Ciment pour la meilleure des combinaisons, comparativement à 0,005mg CHX /mg Ciment pour une formulation liposomale ; soit un relargage 6,25 fois supérieur de la formulation liposomale. Par ailleurs il est à noter que les données de relargage de chlorhexidine seule ont un écart type (données non montrées) beaucoup plus élevé que celles avec la solution liposomale, ce qui témoigne d'une forte variabilité caractéristique d'un mode de relargage non contrôlé et une faible reproductibilité (réaction chimique chlorhexidine- biomatériaux de comblement).

En conclusion, l'incorporation de chlorhexidine même à concentration élevée relargue une concentration faible ne pouvant pas être efficace contre les bactéries. Les matériaux selon la présente invention permettent un relargage soutenu dans le temps conférant au biomatériau de comblement un meilleur pouvoir désinfectant sur une période de 25 jours. Enfin l'encapsulation d'un agent permet de protéger ce dernier contre des réactions indésirables : l'inhibition de son action par certains composés, la formation de précipitée, la formation de produits de réaction nocifs ... etc

Cette protection permet in fine d'incorporer une quantité supérieure en CHX, et donc d'obtenir une efficacité de désinfection élevée, sans nuire aux propriétés physicochimique du biomatériau.

EXEMPLE 8 - Étude de l'activité antimicrobienne des matériaux de comblements désinfectants sur des solutions planctoniques

8.1- Procédé de préparation des liposomes et des matériaux de comblement Ces essais ont eu pour objectif de produire une solution liposomale encapsulant de la chlorhexidine. Les liposomes sont composés des lipides PHOSPHOLIPON 90G et cholestérol dans un rapport molaire (2 :1).

Les liposomes oligolamellaires encapsulant la CHX ont été préparés en hydratant les films lipidiques à 30° C avec une solution aqueuse de CHX à 1% (p / p). Si nécessaire, une agitation mécanique (vortex ou sonication) a été utilisée pour obtenir une hydratation complète des lipides. Les liposomes chargés en CHX résultants ont été ensuite extrudés cinq fois à travers deux membranes de polycarbonate avec des pores de 1 μιη et 900 nm pour obtenir une taille moyenne des liposomes inférieure à 900 nm et avoir une homogénéité des particules formées. La distribution de taille fut déterminée par des techniques de spectrophotométrie après extrusion. Du Pluronic L 31 a ensuite été ajouté à la formulation liposomale à une concentration de 0,5% (p / p) avant concentration puis la solution est concentrée pour obtenir une concentration finale en lipides de 200 mg / ml. La solution obtenue est appelée CEM CHX 0918-001.

Afin de vérifier que l'étape de concentration n'a eu aucun impact sur la structure des vésicules des liposomes, des mesures de la taille de la suspension liposomique concentrée ont été effectuées. À chaque instant, l'aspect de la formulation a été examinée avant et après agitation des flacons. Les caractéristiques visibles à l'œil nu, c'est-à-dire turbidité, couleur, agrégation, sédimentation et la séparation des phases a été analysé. Les liposomes produits sont ensuite intégrés -comme décrit précédemment- dans le ciment endodontique Bio Root™ RCS dans un rapport pondéral de 1%.

Les échantillons de matériaux désinfectants ont été produits de la même manière et dans les mêmes conditions que décrit au paragraphe 5.2 a.

8.2 - Test de diffusion en gel d'agarose a. Conditions du test

Une méthode modifiée des tests de diffusion en gel d'agarose a été testée et validée pour les ciments dentaires. L'analyse a été faite par mesure du diamètre de la plage de lyse. Dans le cas d'un test d'échantillons de concentrations variables une estimation de la MIC peut être réalisée par l'intermédiaire d'un logiciel sur une plateforme en ligne développée par Bonev en 2008 (http ://agardiffusion.com) [Principles of assessing bacterial susceptibility to antibiotics using the agar diffusion method I. Antimic. Chemoth.. 61. 1295- 13011

Pour cette expérience, les liposomes et les matériaux de comblement désinfectants ont été produits tel que décrit au paragraphe 8.1 et 7.6 a.

Des puits de 3 mm de diamètre sont poinçonnés à l'aide d'un trépan jetable pour biopsie dans une gélose Mueller-Hinton. La gélose est ensuite ensemencée de manière homogène à l'aide de 100 μΐ d'une solution à' Enterococcus faecalis ajuster à une concentration de 0,5 MacFarland. Le ciment Bio Root™ est alors préparé (500 mg de poudre + 250 μΐ de liquide +/- 35 μΐ de CEM CHX 0918-001). Les puits sont alors remplis de ciment à l'aide d'un pipetman pour solution visqueuse. Les géloses sont alors incubées à 37°C en aérobiose pour 24h. La plage d'inhibition de croissance est alors mesurée à l'aide d'une règle (Figure 26).

Pour mesurer l'effet de la libération prolongée de l'agent antimicrobien des géloses sont préparées comme précédemment mais sans être inoculées avec E.faecalis. Elles sont conservées pendant 7 et 14 jours à température ambiante. Le jours du test une solution bactérienne est préparée dans du BHI à une concentration de 0,5 Macfarland. 5 mL de la solution bactérienne sont ajoutés sur la gélose. Cette dernière est alors agitée pendant 30 secondes afin d'obtenir un ensemencement homogène de la gélose, puis les 5 mL de milieu sont retirés de la gélose. La gélose est alors incubée pendant 24h et les plages de lyse mesurées à l'aide d'une règle.

b. Résultats La courbe d'étalonage pour cette expérience est présentée à la Figure 25. Cette courbe représente la taille de la zone d'inhibition en fonction de la concentration en chlorhexidine lors d'une expérience de diffusion sur gel d'agarose. Les résultats de l'inhibition à 24 heures (Jl) sont présentés à la Figure 26.

Les résultats de l'inhibition à J7 sont présentés à la Figure 27.

A Jl après la prise du ciment, on note une absence de plage d'inhibition de croissance pour le ciment Bio Root™ et la présence d'une plage d'inhibition d'un diamètre moyen de 9,8 ± 0,8 mm (n= 9) pour le ciment Bio Root™ additionné de 1% de solution liposomale. L'effet d'inhibition de croissance observé correspond à une concentration de 40 μg/mL de chlorhexidine selon une courbe étalon déterminée dans une expérience précédente avec du diglucuonate de chlorhexidine (Cf Figure 25). La MIC calculée du digluconate de chlorexidine pour cette expérience est de 15,5 μg/mL A J7 on note l'absence de plage d'inhibition de croissance pour le ciment Bio Root™ et la présence d'une plage d'inhibition d'un diamètre moyen de 18 ± 2 mm (n= 8) pour le ciment Bio Root™ additionné de 1% CEM CHX 0918-001. On notera néanmoins que l'incubation pendant 7 jours assèche la gélose et que la croissance bactérienne est moins homogène. Néanmoins l'effet d'inhibition de croissance est indéniable (Figure 27). Conclusion : L'adjonction de 1 % de CEM CHX 0918-001 confère une activité inhibitrice sur la croissance d' Enterococcus faecalis qui se prolonge et s'amplifie au cours des 7 premiers jours. L'amplification pourrait être reliée à une libération prolongée au cours du temps de l'agent antimicrobien.

8.3- Test d'activité antimicrobienne

Les tests ont été réalisés sur deux souches bactériennes différentes : Enterococcus faecais et Escherichia coli. Ces souches ont été incubées en culture planctonique dans un milieu de type MHB (Mueller Hinton Broth).

L'analyse de la prolifération a été faite en présence des échantillons de matériau de comblement (ciment) ou en présence de milieu après incubation des milieux de culture pendant 24h à 37°C en aérobiose. Elle a été réalisée après 24h et 4 jours de culture à 37 °C. L'évaluation de la prolifération a été réalisée par turbidimétrie (de façon identique à la référence Appl. Biochem. Biotechnol., 2014, 172 :1652). Chaque mesure a été réalisée en simultanée avec 3 échantillons et chaque condition expérimentale a été testée 3 fois (3 cultures bactériennes indépendantes), ceci afin de disposer de 9 points de mesure pour chaque condition.

Différents ratios volume échantillon/ volume milieu de culture, ont été testés et un contrôle avec antibiotiques (Tétracycline à 10 μg·mL-l + Céfotaxime à 0,1 μg·mL-l) a été inclus systématiquement. Cette expérience a pour but de monter l'activité antibactérienne d'un produit à l'aide d'un test de référence. 8.4 - Test d'activité sur coupe de dentine infectée

Ce test a pour vocation de se mettre dans les conditions futures de l'utilisation du matériau de comblement endodontique, le matériau devant être en contact direct avec une dentine infectée. Des lamelles de dentine humaine préalablement stérilisées d'une épaisseur de 1 mm sont incubées dans une solution de BHI inoculée avec E. faecalis. L'incubation pendant 3 semaines va permettre l'infection des tubuli dentinaires par les bactéries.

Le test consiste donc en l'application du matériau de comblement (ciment) sur une des faces de la dentine ainsi infectée. Préalablement la lamelle de dentine aura été désinfectée dans des conditions similaires à un traitement endodontique (NaOcl 6 % 5 minutes/ EDTA 17% 3 minutes). Après prise du ciment, l'ensemble dent/ciment sera incubé dans un milieu BHI et remise en culture. Une analyse quotidienne visuelle permettra de déterminer quand le milieu sera réinfecté (contrôle de la turbidité). Une dizaine de lamelles sera réalisée par type de ciment. L'ensemble de la surface sera recouvert de ciment. Le résultat sera exprimé en pourcentage de lamelle infectée au temps T. Un test de Fisher exact permettra de déterminer si des différences significatives existent entre les différentes conditions testées. Dans ce cas ne peuvent être testé que des ciments et pas le principe active seul. Une observation des lamelles en microscopie électronique à balayage est envisageable pour mettre en évidence la contamination des tubulis dentinaires. Temps de manipulation : 6 semaines pour un jeu d'échantillon.

Ce test permettra de confirmer dans des conditions proches de l'utilisation endodontique, les capacités désinfectantes du matériau de comblement selon l'invention.

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