Insbesonders Cannabinoide, die Hauptwirkstoffe der Hanfpflanze (Cannabis sativa) stehen durch ihre vielfältigen und wertvollen pharmakologischen Eigenschaften in letzter Zeit im Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses.<BR> <BR> <P>Für ihren Nachweis sind verschiedene physikalische, chemische und auch diverse nasschemische Methoden bekannt. Letztere werden hauptsächlich in Form von"Spot Tests"unter Verwendung von Sprühreagenzien angewendet.

US 3,656,906 beschreibt den Nachweis von Cannabinoiden in biologischen Materialien wie Blutplasme und Urin durch Kondensation der vorher extrahierten Cannabinoide mit Polycarboxylsäure und anschließender photometrischer Bestimmung.

In US 4,816,415 wird ebenfalls der nachweis von Cannabinoiden in Körperflüssigkeiten beschrieben. Bei diesem Verfahren werden die Cannabinoide mit Hilfe eines Spezialfiltertrichters an Aryl-carboxylsäuren gebunden und anschließend durch Farbreaktion mit bekannten Reagenzien, nämlich Echtblausalz BB, Echtbordeaux-Salz-Gp, Echtgrünsalz, Duquenois- Negm-Reagenz oder Beam-Reagenz der Cannabinoidgehalt ermittelt.

In EP 1 32 313 A2 werden Cannabinoid-Nachweis-Methoden für Drogentest- Packungen auf Basisvon Diazonium-Reagenzien beschrieben. Die Reaktion wird auf Filterpapier durchgeführt und die Reagenzien in flüssiger Form oder als Spray aufgetragen.

Diese und ähnliche Verfahren sind relativ umständlich durchzuführen und meist ist eine Aufbereitung des Probematerials durch maßnahmen wie Trocknung, Extraktion, Filtration und Eindampfen, notwendig, um die entsprechenden Bestimmungen durchführen zu können.

Dies erfordert einen erheblichen Arbeits-und Zeitaufwand und kann mitunter auch zu einer Veränderung der stofflichen Zusammensetzung des Probematerials führen. Außerdem sich bei diesen Methoden häufig die Verwendung von giftigen oder stark ätzenden Chemikalien erforderlich, was für eine breite Anwendung durch den Laine problematisch ist.

Im Bereich der Drogenfahndung wird zur Cannabis-Schnellerkennung hauptsächelich die nasschemische Duquenois-Reaktion in Form eines Reagenzienkits eingesetzt. Diese Methode ist jedoch wenig spezifisch, kann keinerlei Auskunft über das tatsächliche Cannabinoid-Verhältnis geben, arbeitet mit konzentrierter Säure und ist außerdem nicht ganz einfach durchzuführen.

Es bestand also die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, das einen schnellen und einfachen, auch für den Laien vor Ort leicht durchführbaren Nachweis von Cannabinoiden ermöglicht.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum nasschemischen Nachweis von phenolartigen Substanzen, insbesondere von Cannabinoiden und solche Stoffe enthaltenden Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenmaterial direkt mit einem farbbildenden Reagenz A versetzt, zur Entwicklung der spezifischen Farbreaktion ein zusätzliches Reagenz B

zugegeben wird und durch Messung des gebildeten Farbstoffes die zu bestimmende phenolartige Substanz bestimmt und ggf. auch quantitativ erfaßt wird.

Die Probe wird direkt, d. h. beispielsweise in vorbehandelter oder unbehandelter Form, auch ohne vorherige Trocknung direkt mit einem farbbildenden Reagenz A versetzt. Das Reagenz A kann als Lösung einer farbbildenden Substanz mit oder ohne Zusatz organischer Lösungsmittel eingesetzt werden. Bevorzugte Beispiele für die farbbildende Substanz sind Echtschwarz K, Echtblausalz B, 2,6-Dibromchinon-chlorimid, 2,6- Dichlorchinon-chlorimid, Formaldehyd, Acetaldehyd, Salicylaldehyd, Vanillin, p-Dimethylamino-benzaldehyd, p-Diethylamino-benzaldehyd, Eisen-III-chlorid, 4-Amino-antipyrin, 4-Aminophenol oder Kaliumhexacyanoferrat. Die Reagenzien werden vorzugsweise in Form von 0,001 bis 10%igen Lösungen der farbbildenden Substanz (Gewicht/Volumen) in Wasser und/oder primären, sekundären und tertiären Alkoholen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen mit oder ohne Zusatz von organischen Lösungsmittel wie gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, halogenierten Kohlenwasserstoffen, Ethern, Ketonen, Carbonsäureestern und/oder aromatischen Kohlenwasserstoffen vorgelegt. Reagenz B ist vorzugsweise eine Lösung einer farbentwickelnden Substanz, z. B. einer Base wie etwa einem Alkalihydroxid und/oder einem Alkalicarbonat, einem ggf. durch einen oder mehrere organische Reste, z. B. Alkyl-Gruppen substituierten Ammonium-oder Alkalisalz einer organischen Säure oder Gemischen davon und liegt in Form einer Lösung von 1 bis 50% der farbentwickelnden Substanz (Gew./Vol.) in Wasser und/oder primären, sekundären und tertiären Cl-calo Alkoholen oder deren Gemischen vor. Gegebenenfalls können Ammonium-oder Alkalisalze organischer Säuren wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Äpfelsäure,Sorbinsäure,Fumarsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure,Phthalsäure, Naphthylessigsäure und/oder Indol-3-essigsäure, z. B. in Mengen von 0,1 bis 20% (Gew./Vol.) dem Reagenz B zugesetzt werden.

Überraschenderweise ist es gelungen, ein Verfahren zu entwickeln, in dem speziell ausgewählte Farbreaktionen so modifiziert werden, daß die Reagenzien unmittelbar dem als Extraktionsmittel fungierenden Lösungsmittel zugefügt und in der nasschemischen Nachweisreaktion direkt eingesetzt werden. Dadurch sind die sonst notwendigen Vorbehandlungen des Probenmaterials, wie Trocknen, Extraktion und abschließendes Eindampfen nicht mehr erforderlich.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird durch geeignete Auswahl und Konzeption der Reagenzien, sowie durch spezielle Modifikation bei der Durchführung des Verfahrens erreicht, daß der jeweils vorherrschende Phenolkörper durch Entwicklung eine spezifischen, deutlich unterscheidbaren Farbtones einzeln für das Auge sichtbar gemacht und so auf bisher nicht bekannte, einfache und schnelle Weise direkt nasschemisch nachgewiesen werden kann.

Durch Verfeinerung des Verfahrens konnte zusätzlich eine optimale, besonders leicht ablesbare Abstufung, sowie eine mehrere Stunden anhaltende Beständigkeit der entstandenen Farbtöne erreicht werden.

Auf diese Weise ist es erstmals auch möglich, frisches, unbehandeltes Probematerial und sogar Frischpflanzen in vorbehandelter oder unbehandelter Form auch ohne vorherige Trocknung z. B. am Feld direkt der Untersuchung zu unterwerfen und nach phenolischen oder cannabinoiden Bestandteilen zu analysieren.

Besonders bewährt hat sich das erfindungsgemäße Verfahren beim Nachweis von Cannabinoiden, den pharmakologisch interessanten Hauptwirkstoffen des Hanfes. Damit ist erstmals eine Unterscheidung von Drogen-und Industriehanf bei jungen oder erwachsenen, männlichen oder weiblichen Pflanzen ab einem Alter von zwei Wochen möglich. Des weiteren

kann die Bestimmung des Reifegrades von Hanfpflanzen auf schnelle und einfache Weise sogar direkt an Frischpflanzen vorgenommen werden.

Die Einsatzbereiche des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen den land- wirtschaftlichen Hanfanbau (Industrie), die Hanfzüchtung, die Hobby- Gärtnerei ("Home Grow"-Bereich), die Cannabis-Forschung und Medizin, den Cannabis-Konsum (Qualitätskontrolle) und behördliche Anwendungen (Drogen-Kontrolle). Weiterhin kann das Verfahren zum Nachweis von Cannabis-Präparaten in biologischen Probenmaterialien, insbesondere humanen Proben, z. B. Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel oder Urin, oder Gewebeproben wie Haaren oder Nägeln eingesetzt werden.

Durch spezielle Modifikationen der Reagenzien und der Verfahren konnten neue Methoden zum selektiven nasschemischen Nachweis einzelner spezi- fischer Cannabinoide gefunden werden.

Die Verfahren können auch für die Identifizierung und Qualitätsbeurteilung von ätherischen Ölen und Pflanzenmaterialien durch Bestimmung vorhande- ner Phenolkörper eingesetzt werden. Durch die einfache Durchführung und die Verwendung möglichst ungiftiger Reagenzien und Lösungsmittel ist es auch für den ungeübten Laien möglich, die beschriebenen Tests ohne Schwierigkeiten durchzuführen.

Aufgrund der einfachen Konzeption des Verfahrens und der dazu nötigen Reagenzien, eignen sich diese Verfahren besonders für Analysenpackungen (Testkits) die direkt an Ort und Stelle eingesetzt werden können. Mittels dem Fachmann bekannter, photometrischer Messung der Absorptions- hauptmaxima der entwickelten Farbtöne können die Verfahren auch zur quantitativen Bestimmung der nachgewiesenen Phenolkörper herangezogen werden. In der Reagenzlösung A werden als Lösungsmittel vorzugsweise ein-oder mehrwertige Alkohole alleine oder deren Gemische verwendet, welche einerseits eine optimale Extraktion der Wirkstoffe und andererseits

aber auch gute Löse-Eigenschaften für das verwendete Reagenz und eine störungsfreie Farbreaktion garantieren. Die zur Farbentwicklung notwendigen Reagenzlösungen B wurden so konzipiert, daß sie zwecks möglichst einfacher und effektiver Handhabung nur in Tropfenmengen dem Reagenzgemisch zugegeben werden können. Durch die Zugabe von Salzen organischer Säuren zu der Reagenzlösung B konnte weiters eine bessere Ablesbarkeit der entwickelten Farbtöne, sowie eine verbesserte Haltbarkeit derselben erzielt werden.

Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele erläutert und illustriert werden, ohne sich jedoch auf diese zu beschränken.

1. Nasschemische Bestimmung von Phenolen und Cannabinoiden in verschiedenen Materialien und Frischpflanzen a) Reagenzien : Reagenz A : Lösung von 0,01 % p-Aminophenol in Isopropanol Reagenz B : 10%ige Lösung von Natriumhydroxid in H20-lsopropanol (2 : 1) b) Durchführung : 20 bis 100 Milligramm des Probenmaterials werden in einem klaren, farblosen Reagenzröhrchen mit 2 ml Reagenz A versetzt, mehrmals geschüttelt, mit 2 Tropfen Reagenz B versetzt, wieder geschüttelt und die entstandene Färbung nach 10 Minuten abgelesen. c) Farbreaktionen @. gelblichgrau(negativ)#

II. Hanf-Frischpflanzen unreifer Drogenhanf violett rötlich ausgereifterblaugrün# reifer EU-industriehanf (Felina violettrötlich# ÖleIII.Ätherische <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> olivgrünRosmarinöl# <BR> <BR> <BR> <BR> blauOreganoöl# <BR> <BR> <BR> <BR> Thymianöl- » blau IV. Phenolische Verbindungen : Thymol tiefblau Cannabidiol (CBD) violettrosa Tetrahydrocannabiolgrünblau# Cannabinol (CBN) blau 2. Selektiver nasschemischer Nachweis von Tetrahydrocannabinol (THC) a) Reagenzien Reagenz A : 0,15% Eisen-(III) Chlorid in absolutem Ethanol Reagenz B : 1 % Ammonium-Acetat in absolutem Ethanol b) Durchführung : 10 bis 100 mg des Probematerials werden in einem klaren, farblosen Probenröhrchen mit 1,5 ml Reagenz A versetzt und geschüttelt. Dann versetzt man mit 5 Tropfen Reagenz B. Die Farbtöne werden nach 1 Minute abgelesen.

c) Farbreaktionen : Blindwert- schwach bräunlichgelb = negativ Cannabidiol (schwach bräunlichgelb) = negativ Cannabinol # (schwach bräunlichgelbt) = negativ THC # orange rotbraun = positiv 3. Selektiver nasschemischer Nachweis von THC a) Reagenzien : Reagenz A : 0,01 % ige Lösung von Echtschwarz K in Ethanol Reagenz B : 5% ige Natriumhydroxid-Lösung in Ethanol 50% ig b) Durchführunq : 50 bis 100 mg Probenmaterial werden in einem klaren, ungefärbten Probenröhrchen mit 5 ml Reagenz A versetzt und mehrere Male durchgeschüttelt. Ein Tropfen Reagenz B wird zugegeben, abermals durchgeschüttelt und die entstandene Färbung innerhalb von 1 Minute abgelesen. c) Farbreaktionen : Blindwert = hell violettrosa = negativ Cannabidiol = hell violettrosa = negativ Cannabinol = hell violettrosa = negativ THC = bräunl. orangerot = positiv

4. Selektiver nasschemischer Nachweis von Cannabinol a) Reagenzien : Reagenz A : 0,01% ige Lösung von 2,6-Dichlorchinon-chlorimid in Isopropanol Reagenz B : wässrige, gesättigte Kaliumcarbonat-Lösung b) Durchführunq : 10 bis 50 mg Probe werden in einem glasklaren, ungefärbten Proberöhrchen mit 5 ml Reagenz A versetzt, mehrere Male durchgeschüttelt. Dann wird mit 1 Tropfen Reagenz B versetzt, eine Minute kräftig durchgeschüttelt und die entstandene Färbung sofort abgelesen. c) Farbreaktionen : Blindwert » hell bräunlichgelbe Färbung = negativ Cannabidiol hell bräunlichgelbe Färbung = negativ THC = hell bräunlichgelbe Färbung = negativ Cannabinol = blaue Färbung = positiv 5. Anwendung des Tests für die Cannabinoid-Bestimmung (Reagenzien siehe Beispiel 1) a) Probenauswahl Art der Analyse Art der Probe Hanf-Reifetest weibliche Fruchtstände Unterscheidung zwischen Industrie-völlig entwickelte fingrige Blätter und Drogenhanf männlicher, weiblicher oder junger Pflanzen von 2 Wochen Mindestalter Haschisch,Haschisch-Öl,Cannabis-Präparate-Qualitäts-Marih uana, KonrolleHanf-Kraut

Für die Bestimmung des Reifegrades wird frisches, nicht getrocknetes Pflanzenmaterial verwendet, da beim Trocknen der Cannabinoid-Gehalt verändert werden kann (z. B. Umwandlung von Cannabidiol zu THC).

Zur Unterscheidung von Industrie-oder Drogenhanf werden voll ausgebildete fingrige Normalblätter (frisch oder getrocknet) der Pflanze und nicht die Blüten-oder Fruchtstände verwendet. Durch einen Test der normalen, fingrigen Blätter einer bestimmten, mindestens zwei Wochen alten Jungpflanze kann deren maximal erreichbares zukünftiges Cannabinoid-Spektrum ermittelt werden. b) Probenmengen Probenart Hinweis frisch getrocknet Pflanzenmaterial weibliche Blüten-zerkleinert ohne etwa 100 mg etwa 10 mg oder Blätter und junge (~ 2 (kleine Samenstände Triebe Messerspitzen) Messerspitze) Hanfblätter voll ausgebildet etwa 300 mg etwa 50 mg von männlichen (große (eine oder weiblichen Messerspitze) Messerspitze) oder jungen Pflanzen Cannabis-Präparate -etwaMarihuanazerkleinert 10 mg Haschisch fein zerkleinert etwa 5 mg (sehr kleine Messerspitze) Haschisch-01 etwa 2 mg Wenn die entwickelten Farbtöne zu intensiv und damit schwer ablesbar sind, sollte der Test mit reduzierter Probenmenge wiederholt werden. Zu kleine Probenmengen können wiederum blasse, undeutliche und ins gelbe verschobene Farbtöne ergeben. In diesem Fall sollte der Test mit größerer Probenmenge wiederholt werden.

c) Durchführunq der Tests Eine kleine Menge der Proben (siehe unter Probenmengen) wird in ein Glasröhrchen gegeben. Das Röhrchen wird bis zu Hälfte mit Reagenz A aufgefüllt, mit einer Kunststoffkappe verschlossen und innerhalb von etwa 1 min mehrere Male durchgeschüttelt.

Dann wird das Röhrchen geöffnet und mit einem Tropfen Reagenz B versetzt, sofort wieder verschlossen und wieder durchgeschüttelt. Innerhalb einer Minute kann die entstandene Färbung der überstehenden Lösung abgelesen werden. Die besten Ergebnisse werden bei durchscheinendem Tageslicht oder gegen eine erhalten.Fläche Durch Trennung der gefärbten, überstehenen Lösung vom Bodensatz des Probenmaterials mittels Abgießens in ein anderes Glasröhrchen kann die erhaltene Färbung lichtgeschützt und unter Verschluß länger stabil gehalten werden. d) Farbreaktion und Bedeutung verwendete Probe gelblich rötlich oliv braun grün blaugrün blau weibliche negativ unreifer halb reifer reifer Drogen- völlig reifer überre Fruchtstände Drogenhanf oder Drogen-Hanf Hanf Drogen-Hanf Drogen- reifer EU- Industrie-Hanf (Felina 34) normale Blätter negativ Industrie-Hanf Drogen-Hanf Drogen-Hanf Drogen-Hanf Drogen- von jungen oder alten, männlichen oder weiblichen Pffanzen Cannabis negativ sehr wenig THC wenig THC mittelmäßig THC sehr viel THC alt Präparate Cannabinoid- negativ vorwlegend CBO CBD und THC vorwiegend THC sehr viel THC THC und Gehalt Verhältnis CBD- negativ > 2:1 2:1 <2:1 <1:>1 THC und THC

Die mit den angefärbten Verfahren erreichbaren unteren Nachweisgrenzen sind für CBD = 0,04 mg, THC = 0,02 mg und CBN = 0,02 mg.