La présente invention concerne un dispositif de préparation et/ou de traitement d'un échantillon oioi ogique .

Un tel dispositif est destiné notamment à être utilisé dans le cadre de l'automatisation de protocoles biologiques, notamment de protocoles biologiques complexes .

A titre d'exemple non limitatif, un tel dispositif peut être appliqué à la détection de pathogènes ou des molécules, acides nucléiques ou protéines, d'un pathogène.

Un tel protocole biologique doit être réalisé de préférence dans un dispositif consommable à faible coût, lié au module de détection, et qui est changé entre chaque test. Ce consommable peut être inséré dans un appareil de traitement contenant les composants coûteux, par exemple des composants mécaniques ou optiques.

Différentes techniques sont utilisées pour automatiser des protocoles biologiques complexes, tels que protocoles de tests logiques, également appelés immunoessais , à partir d'un échantillon de quelques millilitres. Dans tous les cas, la présence de plusieurs réactifs nécessite l'existence de différentes chambres de stockage et d'au moins une chambre de réaction. Des moyens permettant le déplacement des fluides sont également nécessaires.

Un premier dispositif connu, utilisé notamment par la société Genpoint et mettant en œuvre un robot de préparation commercialisé par la société Tecan, comprend des moyens de déplacement en trois dimensions d'une oipetLe et une plaque présentant une pluralité de puits, les puits contenant soit un réactif, soit un échantillon.

La pipette est déplacée au dessus de la plaque de façon à être positionnée dans un puits afin de prélever une quantité de réactif, puis positionnée dans le puits contenant l'échantillon afin de délivrer la quantité de réactif dans ce puits, ceci de façon successive pour cnaque réactif.

Des moyens additionnels nécessaires au déroulement des réactions, en particulier des moyens de chauffage ou de capture magnétique peuvent être disposés sous la plaque.

Un tel dispositif présente l'inconvénient d'utiliser des moyens mécaniques de précision pour le déplacement de la pipette qui présentent une structure complexe et sont difficilement transportables.

Pour éviter les contaminations entre tests il a donc été envisagé de réaliser des tests unitaires dans des dispositifs hermétiques, à usage unique.

Ainsi les documents US-B-6, 878, 540, US-B-6, 440, 725 et US-B-6, 881, 541 décrivent des dispositifs comportant une cartouche à usage unique comprenant un ensemble de chambres ou réservoirs destinés à recevoir notamment un échantillon, des fluides de lavage, d'élution, des réactifs, les chambres ou réservoirs étant reliés par un ensemble de canaux. Ces dispositifs comprennent également une puce microfluidique . Le mouvement des fluides entre les différentes chambres et réservoirs est assuré par l'intermédiaire de l'ensemble de canaux sous l'effet de pompes et de moyens de contrôle de flux de type soupapes ou diodes fluidiques. Une des utilisations de ces dispositifs est la réalisation du traitement d'un échantillon fluidique pour extraire et amplifier des acides nucléiques, notamment par PCR.

Le document US-B-6, 734 , 684 décrit pour sa part également une cartouche à usage unique comprenant un ensemble de chambres et de réservoirs. Dans le cas de ce document, une chambre de traitement unique est utilisée qui peut être mise en communication fluidique avec d' autres chambres ou réservoir de façon sélective par l'intermédiaire de canaux ménagés dans un organe rotatif.

Ces solutions permettent effectivement de diminuer les contaminations , mais impliquent la mise en place d'une structure de communication fluidique entre les chambres et de déplacement qui reste complexe .

Le document US-B-6 , 964 , 862 décrit un dispositif comprenant un élément à usage unique présentant des chambres séparées par des parois permettant une communication fluidique au-dessus d'une pression déterminée . Chaque chambre est remplie avec un fluide spécifique avant fermeture. La mise en communication des fluides contenus dans deux chambres voisines est réalisée par pression mécanique sur l'une des deux chambres, qui provoque l'apparition d'une ouverture dans la paroi de sépara t ion .

Ce dernier dispositif permet de simplifier la réalisation de la communication entre les chambres, et permet également de limiter la contamination entre tests.

Etant donné la miniaturisation des dispositifs mentionnés ci -dessus, les quantités de liquides utilisées présentent des volumes de plus en plus petits. Ces quantités deviennent si faibles que l' utilisation de contenants à usage unique avec des réactifs intégrés est renoue difficile. En effet, pour des raisons de coûts, les matières utilisées pour la réalisation des chambres ou des réservoirs sont produites à partir de matières plastiques basiques et bon marché, comme les polyoiéfines . Ces matériaux ne permettent pas d'obtenir une étanchéité de longue durée et présentent de mauvaises propriétés barrière sans traitement adéquat. Ainsi, une diffusion peut avoir lieu à travers les parois. Ii s'ensuit notamment des changements de concentration des réactifs dus à 1 ' évaporation du solvant. Une telle évaporation peut être négligée dans le cas de quantités de plusieurs centaines de μΐ, mais ne peut pas être négligée dans le cas de volumes de réactifs inférieurs à 50 μΐ, surtout lors d'incubations élevées et durant des temps importants (plusieurs heures).

Cela signifie qu'il convient de ne placer les réactifs dans le dispositif que juste avant leur utilisation.

Etant donné la miniaturisation des dispositifs mentionnés ci-dessus, la taille des dispositifs eux-mêmes se réduit. On peut estimer que la taille limite pour permettre une manipulation aisée est de l'ordre de 10 mm. Un opérateur ne peut assembler ou manipuler des éléments de cette taille étant donné le temps qui lui serait nécessaire pour chaque opération et le risque de pertes de parties du dispositif. Il est plus pratique d'utiliser des ensembles de dispositifs jetables comprenant jusqu'à plusieurs centaines de dispositifs. Un appareil automatique prendra en charge la manipulation des disposa tifs jetables à usage unique.

Il est à noter enfin que les dispositifs sont assemblés à partir de plusieurs éléments provenant de différents fabricants. Il convient donc que la structure de ces dispositifs soit adaptée pour un assemblage qui doit être automatisé étant donné les tolérances imposées qui sont de l'ordre de la dizaine de ]im.

Il est donc souhaitable de fournir un dispositif de petite taille pouvant aisément être rempli et utilisé par un appareil automatique. Cet appareil doit également être peut coûteux, facile à fabriquer tout en permettant des performances satisfaisantes.

La Demanderesse a déjà déposé une demande de brevet française le 5 novembre 2008, sous Le numéro de dépôt 08/06169, qui a pour but de résoudre tout ou partie des inconvénients mentionnés ci-dessus.

A cet effet, cette demande a pour objet un dispositif de préparation, de traitement et/ou d'analyse d'un échantillon biologique comprenant une base et un tiroir, mobile en translation par rapport à la base, comprenant un ensemble de chambres de stockage et /ou réactionnelles destinées à recevoir un fluide, les chambres étant séparées par des parois de façon à constituer un ensemble de chambres adjacentes, le tiroir comprenant en outre une surface de contact sur laquelle débouchent des premiers moyens de mise en communication fluidique reliés au volume interne des chambres, la surface de contact du tiroir étant positionnée en regard d'une surface de contact de la base comprenant au moins une position au niveau de laque lie sont disposés des seconds moyens de communication fluidique reliés à des moyens de détection.

Malgré le fait que cette invention réponde aux inconvénients susmentionnés, elle présente d' autres désavantages qui sont les suivants :

Elle ne permet pas de réaliser des procédés complexes, tels que ceux nécessitant un prétraitement de l'échantillon d'intérêt. C'est par exemple le cas en biologie moléculaire, où il est important de pouvoir iyser les cellules afin de rendre les acides nucléiques qu'elles contiennent accessible à d'autres traitement (amplification détection notamment) .

La liaison entre le tiroir, partie dite mobile, et la base, partie dite fixe, s'effectue par l'intermédiaire d'au moins deux joints d' étanchéité particulièrement sophistiqués puisque en une autre matière que la base ou le tiroir et positionnés de manière concentrique par rapport à l'ouverture pour le passage de l'échantillon.

Enfin s'il y a étanchéité aux liquides, il n'y a toutefois pas d' étanchéité aux gaz.

La présente invention a pour but de résoudre tout ou partie des inconvénients mentionnés ci-dessus.

A cet effet, la présente invention a pour objet un dispositif de préparation, de traitement et/ou d'analyse d'au moins un liquide, préfèrent! ellement un échantillon biologique, comprenant :

- un support réactionnel, ayant un ensemble d'au moins deux chambres, cet ensemble comprenant :

o au moins un canal central comprenant :

· d'une part, une canalisation interne permettant de relier l'une à l'autre les chambres de façon à constituer un ensemble de chambres adjacentes, et

• d'autre part, une canalisation externe permettant de relier la canalisation interne débouchant vers l'extérieur, et o au moins un canal débouchant par chambre, situées sensiblement en amont et en aval de chaque chambre, dit canal amont et canal aval,

- un tiroir, mobile en translation par rapport au support réactionnel, entre au moins deux positions, et ayant, pour chaque position, au moins trois moyens de commande aptes à coopérer à la fermeture et/ou à l'ouverture des canaux débouchants, pour mettre en communication fluidique (moyen de commande ouvert) ou non (moyen de commande fermé) le volume interne des chambres avec l'extérieur du dispositif.

Selon un mode de réalisation du dispositif, le support réactionnel est constitué de deux parties :

une base ayant des moyens permettant la mobilité du tiroir en translation, et

-un élément réactionnel comprenant les chambres et canaux.

Selon un autre mode de réalisation du dispositif, l'élément réactionnel est constitué de deux parties :

- une puce réact ionnelle , et

-une fenêtre de lecture permettant une détection au niveau de la puce.

Selon. encore un autre mode de réalisation du dispositif, chaque moyen de commande du tiroir comporte un moyen d'étanchéité apte à coopérer avec la surface de contact du support réactionnel au niveau de chaque position en translation.

Toujours selon un autre mode de réalisation du dispositif, l'ensemble des chambres, canaux et moyens de commande en relation fluidique sont alignés les uns par rapport aux autres pour chaque position en translation.

Selon encore un autre mode de réalisation du dispositif, et afin de permettre la séparation et 1' incubation d'un échantillon biologique liquide, le dispositif possède :

- deux chambres adjacentes :

• une première chambre de transfert, et

• une seconde chambre réactionnelle,

- et trois canaux débouchants :

• un premier canal en amont de la chambre de transfert,

• un second canal en aval de la première chambre de transfert et en amont de la seconde chambre réactionnelle, au niveau du canal reliant les deux chambres, et

• un troisième canal en aval de ladite chambre réact i cnnel le ,

coopérant avec plusieurs lignes de trois moyens de commande portes par le tiroir :

• un premier moyen en vis-à-vis du premier canal,

• un second moyen en vis-à-vis du second canal,

• un troisième moyen en vis-à-vis du troisième canal.

Selon une alternative de réalisation issue du précédent, au moins une des chambres comporte une zone de 1 ectu re .

Quelque soit le mode de réalisation ou l'alternative du dispositif, le tiroir comporte dans au moins une position un aimant apte à agir sur au moins une des chambres pour permettre la séparation de particules magnétiques présentes dans le liquide.

Selon un autre mode de réalisation du dispositif, la base, comporte dans au moins une position un aimant apte à agir sur au moins une des chambres pour permettre la séparation de particules magnétiques présentes dans le liquide .

La présente invention concerne également un appareil d'analyse apte à utiliser un dispositif, tel que décrit ci-dessus, qui comporte :

des moyens d'entraînement permettant le mouvement relatif du tiroir par rapport au support réactionnel, des moyens de transfert (ajout, retrait ou mouvement au sein du dispositif} de tout ou partie d'un liquide, tel qu'échantillon biologique à traiter ou liquide (s) nécessaire ( s) (liquide de lavage, d'élution) à la mise en oeuvre du procédé ci-après, et de mélange de ceux- ci, et

des moyens de commande aptes à permettre le bon fonctionnement et la bonne synchronisation des moyens d'entraînement, des moyens de transfert. Selon un mode de réalisation de l'appareil lorsque celui-ci est destiné à permettre l'incubation de l'échantillon biologique comprenant en plus des moyens de chauffage eux-mêmes fonctionnant sous le contrôle des moyens de commande.

Selon un autre mode de réalisation de l'appareil, celui-ci comprend, au niveau des moyens de transfert, un embout de pipette ou une aiguille apte à coopérer avec chacun des moyens de commande au niveau de chaque position.

L'invention propose aussi un procédé d'utilisation d'un dispositif, précédemment décrit, ou mettant en œuvre un appareil, tel que divulgué ci-dessus, dans lequel :

on introduit un liquide dans la première chambre en l'injectant dans le premier moyen de commande, en ouvrant le second moyen de commande et en fermant le troisième moyen de commande, et/ou

on introduit un liquide dans la première chambre en l'injectant dans le deuxième moyen de commande, en ouvrant le premier moyen de commande et en fermant le troisième moyen de commande, et/ou

on introduit un liquide dans la seconde chambre en l'injectant dans le deuxième moyen de commande, en ouvrant le troisième moyen de commande et en fermant le premier moyen de commande, et/ou

on introduit un liquide dans la seconde chambre en l'Injectant dans le troisième moyen de commande, en ouvrant le deuxième moyen de commande et en fermant le premier moyen de commande, et/ou

on introduit un liquide dans les première et seconde chambres en l'injectant dans le premier moyen de commande, en ouvrant le troisième moyen de commande et en fermant le deuxième moyen de commande, et /ou

on introduit un liquide dans les première et seconde chambres en l'injectant dans le troisième moyen de commande, en ouvrant le premier moyen de commande et en fermant le deuxième moyen de commande, et /ou on purge un liquide présent dans la première chambre en injectant ou en aspirant un fluide dans le premier moyen de commande, en ouvrant le deuxième moyen de commande et en fermant le troisième moyen de commande, et /ou

on purge un liquide présent dans la première chambre en injectant ou en aspirant un fluide dans le deuxième moyen de commande, en ouvrant le premier moyen de commande et en fermant le troisième moyen de commande, et /ou

on purge un liquide présent dans la première chambre en injectant ou en aspirant un fluide dans le troisième moyen de commande, en ouvrant le premier moyen de commande et en fermant le deuxième moyen de commande, et /ou

on purge un liquide présent dans la première chambre en injectant un fluide dans le premier moyen de commande, en ouvrant le troisième moyen de commande et en fermant le deuxième moyen ae commande, et/ou

- on purge un liquide présent dans la seconde chambre en injectant ou en aspirant un fluide dans le deuxième moyen de commande, en ouvrant le troisième moyen de commande et en fermant le premier moyen de commande, et /ou

- on purge un liquide présent dans la seconde chambre en injectant ou en aspirant un fluide dans le troisième moyen de commande, en ouvrant le deuxième moyen de commande et en fermant le premier moyen de commande, et /ou

- on purge un liquide présent dans _L ci SBConde chambre en injectant ou en aspirant un fluide dans le troisième moyen de commande, en ouvrant le premier moyen de commande et en fermant le deuxième moyen de commande, et /ou

on purge un liquide présent dans la seconde chambre en injectant ou en aspirant un fluide dans le premier moyen de commande, en ouvrant le troisième moyen de commande et en fermant le deuxième moyen de commande, et /ou

on purge un liquide présent dans les première et seconde chambres en injectant ou en aspirant un fluide dans le premier moyen de commande, en ouvrant le troisième moyen Ge commande et en fermant le deuxième moyen de commande, et /ou

on. purge un liquide présent dans les première et seconde chambres en injectant ou en aspirant un fluide dans le troisième moyen de commande, en ouvrant le premier moyen de commande et en fermant le deuxième moyen de commande, et /ou

on purge un liquide présent dans les première et seconde chambres en injectant ou en aspirant un fluide dans le deuxième moyen de commande, en ouvrant les premier et troisième moyens de commande, et/ou

on incube un liquide dans la première chambre en fermant les premier et second moyens de commande et en appliquant une source de chaleur à ladite première chambre, et /ou

on incube un liquide dans la seconde chambre en fermant les second et troisième moyens de commande et en appliquant une source de chaleur à ladite seconde chainbre , et /ou

on incube un liquide dans les première et seconde appliquant une source de chaleur auxdites première et seconde chambres, et /ou

on échantillonne un volume précis d'un liquide au niveau de la première chambre, tout d'abord, en ouvrant les premier et second moyens de commande, en fermant le troisième moyen de commande et en poussant, à l'aide d'un fluide, le liquide, via le premier moyen de commande, jusqu'à ce qu'il déborde au niveau du deuxième moyen, enfin en translatant le tiroir par rapport au support, et/ou

on échantillonne un volume précis d'un liquide au niveau de la chambre, tout d'abord, en ouvrant les premier et second moyens de commande, en fermant le troisième moyen de commande et en poussant, à l'aide d'un fluide, le liquide, via le second moyen de commande, jusqu'à ce qu'il déborde au niveau du premier moyen de commande, enfin en translatant le tiroir par rapport au support, et/ou

on échantillonne un volume précis d'un liquide au niveau de la seconde chambre, tout d'abord, en ouvrant les second et ^" Troisième moyens de commande, en fermant le premier moyen de commande et en poussant, à l'aide d' un fluide, le liquide, via le second moyen de commande, jusqu'à ce qu'il déborde au niveau du troisième moyen de commande, enfin en translatant le tiroir par rapport au support, et /ou

on échantillonne un volume précis d'un liquide au niveau de la seconde chambre, tout d'abord, en ouvrant les second et troisième moyens de commande, en fermant le premier moyen de commande et en poussant, à l'aide d'un fluide, le liquide, via le troisième moyen de commande, jusqu'à ce qu'il déborde au niveau du second moyen de commande, enfin en translatant le tiroir par rapport au support, et/ou

on échantillonne un volume précis d'un liquide au niveau des première et seconde chambres, tout d'abord, en ouvrant les premier et troisième moyens de commande, en fermant le deuxième moyen de commande et en poussant, à l'aide d'un fluide, le liquide, via le premier moyen de commande, jusqu'à ce qu'il déborde au niveau du troisième moyen de commande, enfin en translatant le tiroir par rapport au support, et/ou on échantillonne un volume précis d'un liquide au niveau des première et seconde chambres, tout d'abord, en ouvrant les premier et troisième moyens de commande, en fermant. le deuxième moyen de commande et en poussant, à l'aide d'un fluide, le liquide, via le Troisième moyen de commande, jusqu'à ce qu'il déborde au niveau du premier moyen de commande, enfin en translatant le tiroir par rapport au support, et/ou on effectue un mouvement de va-et-vient d'un liquide au niveau de la première chambre, tout d'abord, en l'injectant dans le premier moyen de commande, en ouvrant le deuxième moyen de commande et en fermant le Troisième moyen de commande, ensuite, en translatant le tiroir par rapport au support dans une position qui ferme le deuxième moyen de commande, et enfin en poussant, à l'aide d'un fluide, par le premier moyen de commande au moins une fois le liquide présent dans la première chambre vers ou dans la seconde chambre par compression de l'air emprisonné dans ladite seconde chambre, et /ou

on effectue un mouvement de va-et-vient d'un liquide au niveau de la première chambre, tout d'abord, en l'injectant dans le deuxième moyen de commande, en ouvrant le premier moyen de commande et en fermant le troisième moyen de commande, ensuite, en translatant le tiroir par rapport au support dans une position qui ferme le deuxième moyen de commande, et enfin en poussant, à l'aide d'un fluide, par le premier moyen de commande au moins une fois le liquide présent dans la première chambre vers ou dans la second chambre par compression de l'air emprisonné dans ladite seconde chambre , et/ou

on effectue un mouvement de va-et-vient d' un liquide au niveau de la seconde chambre, tout d'abord, en l' injectant dans le deuxième moyen de commande, en ouvrant le troisième moyen de commande et en fermant le premier moyen de commande, ensuite, en translatant le tiroir par rapport au support dans une position qui ferme le deuxième moyen de commande, et enfin en poussant, à l'aide d'un fluide, par le troisième moyen de commande au moins une fois le liquide présent dans la seconde chambre vers ou dans la première chambre par compression de l'air emprisonné dans ladite première chambre, et /ou

on effectue un mouvement de va-et-vient d'un liquide au niveau de la seconde chambre, tout d'abord, en l'injectant dans le troisième moyen de commande, en ouvrant le deuxième moyen de commande et en fermant le premier moyen de commande, ensuite, en translatant le tiroir par rapport au support dans une position qui ferme le deuxième moyen de commande, et enfin en poussant, à l'aide d'un fluide, par le troisième moyen de commande au moins une fois le liquide présent dans la seconde chambre vers ou dans la première chambre par compression de l'air emprisonné dans ladite première chambre .

Selon un mode de réalisation du procédé précédent, lorsque l'on purge, un liquide présent dans une ou les deux première et seconde chambres en injectant un fluide par un des moyens de commande et en l'évacuant par un des autres moyens de commande, cet autre moyen de commande est relié à un réservoir de collecte des surplus liquides via un canal.

La présente invention concerne enfin un procédé de séparation et d'incubation au sein d'un dispositif, tel que décrit plus haut, ou mettant en œuvre un appareil, selon les caractéristiques ci-dessus exposées, comprenant les étapes suivantes :

on introduit un liquide, contenant des acides nucléiques d' intérêt capturés sur des billes magnétiques, dans la première chambre en l'injectant dans le premier moyen de commande, tout en ouvrant le deuxième moyen de commande et en fermant le troisième moyen de commande, le surplus de liquide part dans un réservoir de collecte via un canal,

dans cette position un aimant est présent au voisinage de, préférentiellement sous, ladite première chambre, qui permet la capture des particules magnétiques et des acides nucléiques, on purge alors le liquide présent dans la première chambre en injectant de l'air dans le premier moyen de commande, tout en maintenant le troisième moyen de commande fermé, encore une fois le liquide qui restait part dans le réservoir de collecte on translate le tiroir vis-à-vis du support dans une position où il y a toujours un aimant au voisinage de, préférentiellement sous, la première chambre,

on échantillonne un volume précis d'un liquide d'éiution au niveau de la seconde chambre, les second et troisième moyens de commande étant ouverts et le premier moyen de commande étant fermé, et on pousse le liquide, via le troisième moyen de commande, jusqu'à ce qu'il déborde au niveau du deuxième moyen de commande, on translate le support vis-à-vis du tiroir dans une position où il y a toujours un aimant au voisinage de, préférentiellement sous, la première chambre,

on effectue un mouvement de va-et-vient dudit liquide d' éiurion, en le poussant et en relâchant par le troisième moyen de commande au moins une fois de la seconde chambre vers ou dans la première chambre par compression de l'air emprisonné dans ladite première chambre, les premier et second moyens de commande étant fermés, les acides nucléiques sont relargués dans le liquide d'éiution, tout en étant incubés entre 35 et

50°C, préférentiellement à sensiblement 40°C,

on translate le support vis-à-vis du tiroir, et

on incube ce liquide en maintenant fermé les moyens de commande et en appliquant une seconde source de chaleur à ladite seconde chambre, permettant l'hybridation des acides nucléiques sur la puce réactionnelle tout en incubant entre 40 et 80 °C, préférent ieliement à sensiblement 65 ^C C,

on. lave la seconde chambre et on effectue une lecture optique de l'hybridation des acides nucléiques sur ladite puce. L'invention sera mieux comprise à l'aide de la description détaillée qui est exposée ci-dessous en regard des figures annexées, à savoir :

La Figure 1 est une vue en perspective d'un premier dispositif selon l'invention vu de dessus.

La Figure 2 est une vue du dispositif identique à celle de la Figure 1 mais comportant en plus un incubateur .

La Figure 3 est une vue partielle du dispositif de la Figure 1, dans laquelle le tiroir a été retiré ; il n'y a donc plus que la base du dispositif portant une puce réactionnelle microfluidique rapportée qui soit présente.

La Figure 4 est une vue en coupe selon A-A de la Figure 1 à échelle agrandie par rapport à cette Figure 1.

La Figure 5 est une vue agrandie d'une partie de la coupe selon A-A de la Figure 1 ou de la puce réactionnelle de la Figure 4 à échelle agrandie par rapport à ces Figures 1 et 4.

La Figure 6 est une vue en coupe selon B-B de la Figure 5.

La Figure 7 est une vue du dessous du tiroir constituant une partie d' un dispositif selon l'invention.

La Figure 8 est une vue en coupe selon C-C de la Figure 7 à échelle agrandie par rapport à ladite Figure 7.

La Figure 9 est une vue en coupe d'un dispositif, selon l'invention, associant :

• une puce réactionnelle, portée par une base, non représentée sur cette figure, telle que présentée à la Figure 4, et

• un tiroir selon la Figure 8, dans un procédé de séparation et d' incubation, le dispositif étant dans une configuration en relation avec une première étape du procédé.

La Figure 10 est une vue en coupe identique à la Figure 9 dudit dispositif qui est dans une configuration en relation avec une deuxième étape du procédé.

La Figure 11 est une vue en coupe identique aux Figures 9 et 10 du dispositif qui est dans une configurâtion en relation avec une troisième étape du procédé.

La Figure 12 est une vue en coupe identique aux Figures 9 à 11 dudit dispositif qui est dans une configuration en relation avec une quatrième étape du p rocèdé .

La Figure 13 est une vue en coupe identique aux

Figures 9 à 12 du dispositif qui est dans une configuration en relation avec une cinquième étape du procédé.

La Figure 14 est une vue en coupe identique aux Figures 9 à 13, dudit dispositif qui est dans une configuration en relation avec une sixième étape du orocédé .

La Figure 15 est une représentation de la courbe de la dénaturât ion des acides nucléiques (notamment des brins d'ARN) à la chaleur à une température de 90°C du dispositif selon l' invention, avant l'incubation à 65°C.

La Figure 16 est une représentation de la mise en température du même dispositif mais pendant 3 heures, toujours pour démontrer la stabilité en température de n.ot. re invention.

Enfin la Figure 17 est une représentation de la mise en température dudit dispositif selon l'invention pendant 20 minutes . Dans la description détaillée qui va suivre des figures définies ci-dessus, les mêmes éléments ou les éléments remplissant des fonctions identiques pourront conserver les mêmes références de manière à simplifier la compréhension de l'invention.

La présente invention concerne un dispositif 1 destiné à permettre le traitement d'un échantillon biologique 2. Un tel dispositif 1 est bien représenté, par exemple, sur la Figure 1. Ce dispositif de traitement 1 comporte, d'une part, un support réactionnel 3 et, d'autre part, un tiroir 4. Sur cette Figure 1 on comprend que le tiroir 4 peut coulisser dans le support 3 selon la flèche Fl . Bien entendu un mouvement inverse peut également être envisageable, ou bien un mouvement conjoint des support 3 et tiroir 4. Pour permettre ce mouvement selon Fl, le support 3 est constitué de trois parties, non-référencées , une partie inférieure et deux parties supérieures se faisant face. Chacune des deux parties supérieures constitue avec la partie inférieure un épaulement qui crée une glissière 23. Le tiroir 4 comporte diverses canalisations qui permettent de relier des chambres non visibles sur cette figure, comme cela sera mieux expliqué ulté rieurement .

On s'aperçoit également que le support 3 comporte un certain nombre d' éléments sur la face supérieure de sa plaque inférieure consistant notamment en des rainures 25 qu i facilitent le glissement selon Fl et le contact entre support 3 et tiroir 4.

La Figure 2 est identique à la Figure 1, mais dans celle-ci un élément rapporté a. été ajouté. Il s'agit d'un incubateur 17 qui permet au dispositif d'incuber l'échantillon biologique 2 lorsque celui-ci est présent au sein du dispositif 1. De plus d'autres éléments sont également référencés sur cette Figure 2. Il s'agit notamment du réservoir amont 19 et du réservoir aval 20 de collecte des surplus liquides, de l'évent 21 présent entre les réservoirs 19 et 20 et l'extérieur. Il y a donc sur cette figure deux évents, un à gauche et un à droite associé chacun à un des deux réservoirs 19 et 20. Enfin, la Figure 2 comporte des trous d' indexation 18 qui sont positionnés entre deux canaux à savoir le canal amont 10 et le canal aval 11, qui seront. mieux définis u 1 térieurement .

Bien entendu ces trous d' indexation 18 pourraient être positionnés ailleurs sur la carte ou être inutiles du fait de l'utilisation d'un moteur pas à pas dont l'avancé correspond à la distance entre deux canaux par exemple 10 aai acents .

Dans un autre mode de réalisation qui sera ultérieurement mieux décrit ces trous d' indexation 18 peuvent également être remplacés par des aimants qui ont une certaine fonction dans le cadre du procédé d'utilisation du dispositif 1.

La Figure 3 présente une partie seulement du dispositif 1 à savoir le support réactionnel 3. Dans ce mode de réalisation, on voit mieux la structure à trois éléments dudit support 3 à savoir la plaque inférieure et les deux éléments supérieurs, non-référencés , qui grâce à des épaulements constituent avec cette plaque inférieure les deux glissières 23. On remarque également la présence d'un élément rapporté, dit élément réactionnel ou puce réactionnelle 15, qui est mis ie) en place au sein du support 3 sur la partie supérieure de la plaque inférieur de ce lui. -ci .

Cette puce 15 est avantageusement fixée par collage, ou même simplement clipsée ou posée, sur la face supérieure 15 de la base 14 du support 3.

La fabrication du support 3 peut être réalisée par injection plastique, notamment à partir d'un matériau unique. Différents matériaux peuvent être utilisés pour le support 3 qui doivent présenter de préférence les propriétés suivantes :

une bonne planéité, c'est-à-dire pas de retrait excessif ou de déformation pendant l'éjection de la pièce du mou J e ,

- une surface lisse, et

- une bonne résistance mécanique pour maintenir fermement le tiroir 4 contre la surface de contact de la base .

La position du point d'injection doit être choisie de façon à permettre une planéité et un remplissage satisfaisant. En outre, la conception de la base doit prendre en compte la déformation sous la contrainte due au montage du tiroir 4. Le support 3 peut être réalisé par exemple en polycarbonate (PC), polystyrène (PS) , poiyméthacryiate de méthyle (PMMA), polyetherimide (PEI) , polyéthylène téréphtalique (PET), polyéthylène naphtalate (PEN) , acrylonitr iie-butadiène-styrène (ABS) , styrène- acryionitrile (SAN) .

Le tiroir 4 est également une pièce en plastique injecté qui peut être réalisée de deux façons différentes, avec une injection simple ou une double injection de deux matières différentes . L' infection simple permet une réalisation plus facile et moins coûteuse, la co-injection permet d'améliorer la robustesse de l'ensemble.

Le tiroir 4 fabriqué dans un matériau unique, peut être réalisé à partir de différents polymères, comme notamment les polymères thermoplastiques ou les élastomères thermoplastiques .

Le tiroir 4, non représenté sur les figures, est réalisé dans une seule matière, ce qui permet bien entendu de simplifier sa fabrication.

Selon une variante de réalisation du tiroir 4, représenté sur les figures, celui-ci 4 comprend deux parties constituées par deux matériaux distincts, la partie qui constitue le corps dudit tiroir comprenant un matériau plus rigide que celui constituant les moyens de commande .

La base 14 du support 3 est particulièrement lisse pour permettre la bonne translation selon Fl du tiroir 4. On note également sur cette surface 14 du support 3 la présence de rainures 25 sur ladite surface de contact 13 permettant le passage des moyens de commande 12, 22 et 32.

La Figure 4 est une représentation en coupe selon Ά-Α de la Figure 1. Dans un souci de simplification, le support réactionnel 3 est monobloc dans ce mode de réalisation. De plus, l'élément réactionnel 15 est un élément rapporté. Cet élément rapporté est donc collé au sein du support 3, néanmoins il est visible depuis l'extérieur par l'intermédiaire d'une fenêtre de lecture 30 qui correspond à une zone de lecture 16 de l'élément réactionnel 15. Le tiroir 4 dans cette vue en coupe comporte donc trois moyens de commande référencés depuis la gauche vers la droite 12, 22 et 32. Ces moyens de commande 12, 22 et 32 coopèrent avec la puce réactionnel 15.

On remarque à cet effet que la surface inférieure du tiroir 4 comporte trois excroissances qui s'étendent vers le bas au niveau des moyens de commande 12, 22 et 32. En fait, les moyens de commande 12, 22 et 32 correspondent directement aux canalisations externes 9 et aux canaux amont 10 et 11 de la puce réaccionnelle 15, et peuvent être mus en translation selon Fl au niveau des rainures 25.

Cette puce réactionneile 15 est par exemple bien décrite sur la Figure 5, qui représente un grossissement, de ladite puce 15 présente sur cette Figure 4. Dans ce cas, on note la présence de trois canaux reliant la cavité interne non-référencée sur cette figure vers la partie supérieure de ladite puce 15. Il s'agit de la canalisation externe 9 du canal amont 10 et du canal aval 11.

II est à noter également que la fenêtre de lecture 30, bien représentée sur la Figure 4, correspond à une fenêtre de lecture 31 de l'élément 15, comme cela est bien représenté sur la Figure 5.

On comprend mieux la structure de cette puce 15 selon une vue en coupe selon B-B de la Figure 5. En fait sur la Figure 6, la canalisation externe 9 permet de relier une canalisation interne 8 et débouchant vers l'extérieur. Cette canalisation interne 8 permet de relier deux chambres 5, à gauche, et 6, à droite. La chambre 5 comprend également sur sa gauche un canal amont 10 qui relie ladite chambre 5 vers 1 ' extérieur . De la même manière la chambre 6 comporte un canal aval 11 qui relie ladite chambre 6 vers l'extérieur. Ce sont donc ces canaux 9, 10 et 11 de la puce 15, et donc du support 3, qui correspondent aux moyens de commande 12, 22 et 32 du tiroir 4. Il est a noter que l'ensemble de canalisations interne 8 et externe 9 situé entre les deux chambres 5 et 6 de l'élément réactionnel 15 constituent, le canal centrai 7, comme cela est bien représenté sur la Figure 6.

Au niveau de la fenêtre de lecture 31 de l'élément 15, la puce réact ionnell e 29 est présente ce qui permet d' avoir un contact ne serait ce qu'optique avec l'intérieur de la chambre réactionnelie 6. Cette puce réactionnelle 29 comporte donc une zone de lecture 16.

La Figure 7 représente une vue plus précise du tiroir 4. Elle présente verticalement cinq rangées de trois moyens de commande 12, 22 et 32. Chacun de ces groupes de trois moyens de commande correspond à une étape du procédé qu'on souhaite réaliser. On remarque d'ores et déjà sur cette Figure 7 que les moyens de commande 12, 22 et 32 peuvent avoir trois configurations différentes en fonction de la symbolique utilisée à savoir un rond blanc, un rond blanc avec un petit rond blanc à l'intérieur ou enfin un rond blanc avec un petit rond noir intérieur. Ces utilisations seront mieux explicités en relation avec la Figure 8 un peu plus tard.

On note également la présence des trous d' indexation 18 au niveau de chaque rangée verticale de moyens de commande. Encore une fois ces trous d'indexation 18 peuvent également servir à l'aimantation en renfermant chacun un petit aimant.

Tous les canaux qui relient les moyens de commande 12, 22 et 32 avec les réservoirs amont 19 ou aval 20 sont référencés 24, il s'agit de canaux d'évacuation de surplus liquides vers ces réservoirs 19 et 20. Bien entendu pour que ceci soit efficace, les réservoirs 19 et 20 communiquent également vers l'extérieur à l'aide d'un évent 21 que ce soit pour le réservoir 19 ou pour le réservoir 20 vers l'extérieur.

La coupe C-C de la Figure 8 montre la nature des moyens de commande 12, 22 et 32 au niveau de la troisième ligne des moyens de commande de la Figure 7, ce qui correspond à une troisième étape.

On remarque que le moyen de commande 12 est percé d'un trou traversant (un rond blanc avec un petit rond noir intérieur) permettant la continuité fluidique comme cela sera mieux décrit en Figures 9 à 14.

Le moyen de commande 22 quant à lui est dans le cas de ligure présenté complètement étanche et ne permet aucun passage de liquide 2 (un rond blanc) .

Le troisième moyen de commande 32, quant à lui, comporte un trou borgne (un rond blanc avec un petit rond blanc intérieur) qui permet d'augmenter le volume mais sans permettre l'évacuation de liquide 2.

La Figure 9 présente une manière dont le tiroir 4 et la puce réactionnelle 15 peuvent coopérer ensemble pour pouvoir gérer la fluidique du dispositif 1. Il s' agit ici de la première position. De ce fait, les moyens de commande vont prendre les références 12P1, 22P1 et 32P1. Cette position Pl correspond sur la Figure 7 à l'alignement vertical des trois moyens de commande 12, 22 et 32 situés le plus à droite de cette figure.

Dans ce mode de réalisation, le moyen de commande 12P1 est un trou traversant qui correspond au canal amont 10 de la chambre 5, ce qui permet à l'échantillon biologique 2 de pénétrer, selon F2 , à l'intérieur de ladite puce réactionnelle 15. Le liquide 2 va pouvoir continuer son chemin au sein de ladite puce 15 par l'intermédiaire de la canalisation interne 8 puis de la canalisation externe 9 ; canalisation externe 9 qui coopère quant à elle avec le moyen de commande 22P1 ce qui permet la sortie du liquide se 1on F3.

Il faut noter que le volume d'échantillon 2 n'est pas important : le liquide contenant des billes magnétiques passe des moyens de commande 12 à 22. Toutes les billes sont capturées dans la puce 15 lors du passage du liquide

2 en formant un amas 27. Ceci permet de faire une concen t ra t: ion .

On remarque également qu'au sein de la chambre 5 le liquide 2 va passer devant un ^" aimant 26 situé en position inférieure de la puce réactionnelle 15. Cet aimant 26 permet la capture de particules magnétiques. Dans cette configuration la chambre 6 ainsi que le canal aval 11 ne sont pas remplis de liquide 2 car le moyen de commande 32P1 est constitué d'un élément étanche qui ne permet aucun passage de liquide 2.

Il est à noter que la surface de contact 13 du support

3 et donc, dans le cas présent, de la puce réactionnelle 15 est le plus lisse possible pour ne pas endommager les moyens de commande 12, 22 et 32 lorsque le coulissement selon Fl est réalisé.

La Figure 10 correspond à la même configuration que la Figure 9, c'est-à-dire que les moyens de commande 12P1 et 22P1 sont des prolongements des canaux 10 et 9, le moyen de commande 32P1 étant un élément qui cloisonne le canal aval 11. Dans ce mode de réalisation la poussée selon F4 qui est. similaire à F2 est effectuée par un fluide qui a tendance à pousser le liquide à l'extérieur selon F5. Ce fluide est un gaz, préfèrentiellement de l'air, ou un liquide, préfèrentiellement de l'huile, non miscible avec le liquide 2, quel qu'il soit (échantillon biologique, tampon d'élution ou autres)

Etant. donné que le liquide 2 est constitué de particules magnétiques comportant des acides nucléiques qui ont été fixés selon la technique décrite dans le brevet EP-B-0.389.063 , un agglomérat 27 de particules magnétiques et d' acides nucléiques est présent au niveau de l'aimant 26. La chambre 6 reste vide.

Selon la Figure 11, le tiroir 4 est translaté selon Fl par rapport au support 3. Bien entendu ce mouvement peut être le fait soit du mouvement du tiroir 4 par rapport au support 3 fixe, soit par déplacement du support 3 mobile par rapport au tiroir 4 fixe, ou encore, par un mouvement relatif du tiroir 4 par rapport au support 3, les deux étant mobiles.

Dans cette configuration les moyens de commande sont modifiés et deviennent des moyens de commande 12P2, 22P2 et 32P2. Le moyen de commande 22P2 est sensiblement identique au 22P1 précédemment décrit, c'est-à-dire qu'il s' agit d'un trou traversant qui correspond à la canalisation 9. Dans ce cas, par contre, le moyen de commande 12P2 est un moyen de commande qui est étanche aux liquides, alors que le moyen de commande 32P2 est un élément qui est identique au moyen de commande 22P2, à savoir qu'il permet le passage d'un fluide selon F6 à l'intérieur du canal aval 11 et à la chambre réactionnelle 6. Le liquide 2 peut alors continuer sa migration vers la canalisation interne 8 puis la canalisation externe 9 pour ressortir selon F7 au niveau du moyen de commande 22P2. Dans ce cas, l'agglomérat 27 de particules magnétiques et d'acides nucléiques est toujours présent en face d'un aimant 26 qui est situé sous la chambre 5. Ce liquide 2 est préférentiellement une solution d'élution qui permet d'extraire les acides nucléiques présents sur des particules magnétiques recouvertes de silice, ce qui est le cas ici et comme cela est notamment décrit dans le brevet EP-B-0.389.063.

La Figure 12 présente une troisième position et donc configuration des moyens de commande 12P3, 22P3 et 32P3. Dans ce cas le moyen de commande central 22P3 est fermé alors que le troisième moyen 32P3 est muni d'un trou traversant. De l'autre côté le premier moyen de commande 12P3 est équipé d'un trou borgne qui est connexe avec le canal amont 10, ce qui permet d'augmenter le volume d'air au niveau de la chambre 5. De ce fait lorsqu'un fluide agit selon F8 ou F9 sur le liquide d'élution 2, celui ci va pouvoir se déplacer selon F10 ou Fil au sein des chambres 5 et 6, afin de permettre audit liquide 2 d'effectuer un mouvement de va-et-vient au sein de la puce réactionneile 15. Concernant le mouvement de va-et-vient, lorsque l'air dans le moyen de commande 32P3 revient à pression atmosphérique, le liquide revient automatiquement en position dans la chambre 6 permettant la mise en présence des acides nucléiques et la puce réactionneile 29. Ceci sera facilité par la présence d'air au sein du premier moyen de commande 12 P3 qui sera comprimé et détendu en fonction de la force appliquée par le fluide selon F8 ou F9. Cette configuration permet le passage et le retour un certain nombre de fois du liquide d'élution 2 au niveau de l'agglomérat de particules magnétiques et d'acides nucléiques 27, le but étant de permettre le détachement des acides nucléiques et la reprise de ceux-ci Dans la Figure 13, les trois moyens de commande 12P4, 22P4 et 32P4, selon ce quatrième mode de configuration, sont tous les trois étanches. Dans cette position, le liquide 2 est revenu dans sa position initiale, c'est-à- dire que l'air emprisonné au niveau de la chambre 5 est retourné dans sa position initiale puisqu'il n'y a plus de pression selon F8 ou F9. C'est dans cette position que l'incubateur 17, décrit en Figure 2, va permettre de chauffer la chambre 6, et éventuellement la. chambre 5, afin d'incuber ledit liquide 2.

Dans la chambre 5, on réalise une première incubation à 40"C pendant 5 minutes. Dans la chambre 6 se déroule la seconde incubation à 65 °C pendant 16 heures précédée d'une dénaturation à 90 °C pendant quelques minutes.

Une autre différence est bien entendu que l'agglomérat présent au niveau de la chambre 5 en face de l'aimant 26 est un agglomérat 28, qui n'est constitué plus que de particules magnétiques, les acides nucléiques ayant été en très grande partie, voire en totalité, repîris par le liquide d'élution 2.

Enfin, la Figure 14 montre que, dans cette cinquième configuration, le moyen de commande 12P5 est fermé, le moyen de commande 22P5 est ouvert et permet l'arrivée d'un fluide selon F12. Et enfin le troisième moyen de commande 32P5 est également ouvert pour permettre l'évacuation du liquide d' élution 2 selon F13. Dans ce cas de figure, il est bien évident que les acides nucléiques ont été capturés par des acides nucléiques de capture, dites sondes de détection, fixés sur la puce réact ionnelle 29. Il y aura donc hybridation entre la puce réactionnelle 29 de capture et les acides nucléiques, qui étaient présents dans le liquide biologique de départ 2. De ce fait, on pourra, à l'aide de la fenêtre 31, effectuer une lecture au sein de la puce réactionnelle 15 pour savoir si il y a eu ou non hybridation. Bien entendu, cette puce réactionnelle 29 peut comporter un ou plusieurs spots permettant l'analyse de la présence de un ou plusieurs types d'acides nucléiques d'intérêt.

PRINCIPES ET CONDITIONS DE FONCTIONNEMENT

Informations complémentaires à ce qui a été décrit ci- dessus :

Le principe du dispositif 1, selon l'invention, est de faire glisser des moyens de commandes, dits joints, 12, 22 et 32, sur la puce réactionnelle d'hybridation 15 durant le protocole. Pour chaque étape du protocole il y a trois joints : un par trou dans la puce 15. Soit le joint est bouché et la vanne est fermée, soit le joint est percé et la vanne est ouverte. L'injection par les joints ouverts se fait par étanchéité élastique entre le moyen d'injection (un cône de pipette associé à une pipette par exemple) et le joint élastique. Les joints sont répartis sur un tiroir 4 plastique de manière à reproduire les étapes du protocole. La partie des joints qui appuie sur la puce est plus épaisse que la carte plastique pour assurer une bonne étanchéité.

Les liquides 2 sont injectés à l'aide d'un cône présent au niveau d'une pipette (opération manuelle) ou d'un instrument (opération automatique) .

Le tiroir mobile 4 glisse dans le support 3 entre plusieurs positions successives (tolérance de position est de : +/- 0,4 mm) . Les joints sont en contact uniquement avec la puce 15, mais pas avec le reste dudit support 3. Le volume de cette puce 15 est de l'ordre de 1 pL.

Dans un autre mode de réalisation du dispositif 1, celui- ci porte une puce réact ionnelle d'hybridation 29, incluse dans une puce plastique ou une puce en verre de marque Micronit© 15, et un incubateur 17.

Les aimants 26 ont un diamètre de 1,5 mm, une longueur de 3 mm et sont intégrés dans une partie fixe sous la puce 15. Ils sont constitués de néodyme-fer-bore d'une rémanence d'environ 1,2 Tesla.

Les dimensions complètes dudit dispositif 1 sont de 10 cm en longueur par 4,5 cm en largeur et 2 cm de hauteur et respectivement de 5,5 cm par 3,5 cm et de 0,5 mm de hauteur pour le tiroir 4. Ces valeurs ont été choisies pour faciliter la fabrication et l'utilisation mais pourraient être facilement modifiées que ce soit à la hausse ou à la baisse.

Le volume du liquide d'hybridation et d' élution doit permettre un remplissage complet de la chambre 6. Le volume de chaque chambre est compris entre 0,1 et 100 μΐ, préférentieiiement entre 0,1 et 10 μΐ et encore plus préférentieilement entre 0,1 et 1 μΐ. En fait une chambre est d'un volume de 0,25 pL, 0,5 à 0,8 ]xL de tampon d'hybridation est introduit. Bien entendu, le volume exact est défini durant la translation selon Fl .

De plus, l'air est injecté avec un embout de pipette et la pression nécessaire peut être contrôlée manuellement ou automatiquement pour permettre le transfert de liquide 2. La pression est constante durant toute l' élution, soit 5 minutes à 40°C.

Puce plastique : La puce 15 est usinée dans du PMMA ou du PTFE. Les canaux font 500 μιτι de large et 200 μπι de haut. Le volume d'hybridation est de l'ordre de 1 pL. La longueur, la largeur et l'épaisseur de ladite puce 29 est de 18 mm, de 4 mm et de 450 pm . Plus précisément en ce qui concerne l'épaisseur, le corps (partie haute) et le couvercle (partie basse) ont une épaisseur comprise entre 30 à 400 pm, préférentiellement une épaisseur de 170 à 400 pm au niveau des zones de lecture.

Les canaux sont fermés par un film adhésif ARseal™ (Réf. : DEV-90404 de la société Adhesive Reseach - Glen Rock, PA, USA) de 150 pin d'épaisseur.

A noter que pour faciliter le collage de l'adhésif sur la puce 15, il faut chauffer la puce et l'adhésif à une température voisine de 75°C.

Puce verre Micronit :

Cette puce de dimension identiques à la précédente a deux chambres 5 et 6. La chambre 5 permet la capture des billes .magnétiques et a des dimensions qui sont comparables à et compatibles avec celles des aimants 26 (D : 1,5 mm, L : 3 mm) . Cette puce 29 a été fabriquée par la société Micronit (Enschede, Pays-Bas) .

Matériaux utilisés ou utilisables :

La puce 29 a été décrite ci-dessus en plastique PMMA ou en verre, mais elle pourrait tout aussi bien être en silicium, en métal ou en tout type de plastique dur et imperméable aux gaz et aux liquides, comme par exemple le Téflon. Il est préférable de chanfreiner la puce 15, notamment en verre, par exemple sur une surface abrasive type papier de verre, pour favoriser le glissement selon Fl sans déchirement des joints sur l'arête de la puce.

Le dispositif 1 est usiné dans du PolyMéthyl MétAcrylate, dit PMMA.

Les j oints d' étanchéité sont moulés dans du silicone B.A.û. de chez Plastiform (Réf. : 310 120 15N, Thise, France) ou en caoutchouc butyl ou polyisobutylène, dit Butyl Rubber. Ceux-ci débordent par rapport à la surface de contact d'une hauteur comprise entre 100-300 \im.

EXEMPLES

EXEMPLE 1 : Mise en pression d'un segment liquide (puce plastique ou verre) :

A - Objectif :

L'objectif est de contrôler la position du segment liquide lors d'une mise en pression de 10 minutes. L'indicateur est le bon retour en position initiale du liquide.

B - Tests :

Le dispositif 1 est mis en configuration de la Figure. 11, c'est-à-dire moyen de commande 12P2 fermé et moyens de commande 22 P2 et 32P2 ouverts. La chambre d'hybridation 6 est remplie en excès par un liquide 2. Ledit dispositif 1 est alors translaté selon Fl dans la configuration de la Figure 12, c'est-à-dire moyen de commande 32P3 ouvert et moyens de commande 12P3 fermé par trou borgne et 22P3 fermé. La puce 15 est mise sous pression grâce à une pompe reliée à un cône inséré dans le joint ouvert. La pression est réglée à 1 bar (relatif à Patm) et contrôlée au manomètre (Keller 70621) à intervalles réguliers.

Le liquide migre de la chambre d'hybridation jusqu'au milieu de la chambre de capture.

C - Résuitats :

Cette expérience a été réalisée trois fois. Durant 10 minutes aucun mouvement du segment liquide n'est constaté. Lorsque la pression est relâchée, le segment liquide revient en position initiale (contrôle visuel) . Une dizaine de mise en pression à 1 bar et relâchement de quelques secondes n'influe pas sur la position finale du segment liquide. Ceci a été réalisé sans mouvement du dispositif selon Fl entre les mises en pression.

La pression limite est déterminée en augmentant régulièrement la pression ^" jusqu'à apparition d'une fuite. Le dispositif 1 a une pression limite supérieure à 4 bars, c'est-à-dire sans fuite lors de la mise en pression sur le réseau d'air comprimé. Les résultats sont identiques que la puce soit en plastique ou en verre.

EXEMPLE 2 : Gestion des fluides (puce plastique ou verre) :

A - Objectif:

L' objectif est de tester les fonctions de base du dispositif 1, à savoir et notamment l' étanchéité des joints, l'écoulement, la facilité d' utilisation, etc.

B - Tests__:

Différentes configurations ont été testées : - remplissage d'un canal,

- glissement selon Fl du dispositif 1 après remplissage d' un canal,

- remplissage de l'autre canal alors que le premier est remp] :i , et

- vidange d'un canal et chambre associée.

C - Résultats :

Le remplissage d'un canal (deux moyens de commande ou deux vannes ouvertes et un (e) fermé (e) ) est très aisé. Le cône s'insère facilement et crée une liaison parfaitement étanche . Le liquide ressort par l'autre vanne ouverte. Le segment liquide ne bouge pas (contrôle visuel) lorsque le tiroir 4 mobile change de position. Il est ainsi possible de remplir le second canal sans modifier la position du premier segment liquide. La vidange des canaux se fait en faisant circuler de l'air,

EXEMPLE 2 : Incubation de 16 heures à 65°C (puce plastique ou verre) :

A_-_ Objectif :

L'incubation à l'intérieur d'une puce plastique est 1/ étape critique du protocole. Ainsi il peut y avoir différentes difficultés qui apparaissent .

Tout d'abord des problèmes liés à la puce, au niveau de l'adhésif, du plastique et des diamètres des trous . De plus à long terme (durée supérieure à 5-7 heures) , il peut y avoir une absorption ou une évaporation via l' adhésif ou la puce elle-même. Enfin, des bulles peuvent naître du Les problèmes liés aux joints également peuvent apparaître. A court et long termes, il peut y avoir des fuites ou évaporations au niveau des trois joints. 3 - Tests : Matériaux et méthodes

Pour cette étude nous avons utilisé :

- une caméra (par exemple Sony Handycam) pour enregistrer les incubations de 16 heures et plus.

- un incubateur EasyQ réglé pour obtenir une température de 65 °C au niveau de la puce pour les puces plastiques. l'incubateur intégré au dispositif selon l'invention pour les puces Micronit©.

- de l'eau colorée pour les premières expériences puis du tampon d'hybridation Agilent (Réf. 2x Hi-RPM Hybridizat ion Buffer 5190-0403, Santa Clara, CA, USA) colorée pour la va l .i da t i on .

C - Tests : Travaux sur la puce en plastique

Liste des adhésifs donnant des résultats acceptables:

- ARseal™ DEV-90404 - 100 pm COP Carrier, Coated with Silicone PSA 50 pm, et

- ARseal™ DEV-90697 - 50 μιη PP, Coated with Silicone PSA. Ces deux adhésifs conviennent pour le scellement des puces plastiques (scellement à chaud) .

La puce peut être en téflon (PTFE) afin de limiter l'absorption et l' évaporation à travers la puce.

Les trous traversant la puce font 200-300 μπι afin de limiter le contact liquide-joint .

Ces conditions sont suffisantes pour réaliser une puce plastique étanche dans les conditions standard d ' hybridation. D-Tests: Travaux sur les joints

D 1 propriété des matériaux pour les j oints: Les tableaux ci-dessous décrivent les propriétés de perméabilité et d'absorption en eau de différents polymères.

Les tests d'incubation ont d'abord été réalisés sur patins en silicone pour des raisons de facilité de fabrication malgré leurs mauvaises propriétés physiques. Nous utilisons des joints en caoutchouc butyl, matériau qui est l'un des plus étanches .

Tableau 2 : Perméabilité aux gaz pour des polymères dans le secteur médical (1) H ₂ 0 en cm ' . mni/nf . j our . atm

Tous les gaz sont exprimés en g.mm/m". jour

Tableau 3 : Perméabilité aux gaz de matériaux

E - Tests : Incubation dans puce plastique

E1 _ - _Différrents matériaux:

Différents matériaux ont été testés pour les joints. Le protocole expérimental est une incubation pendant plusieurs heures à 65 °C dans un dispositif dont les joints de l'étape d'incubation ont été modifiés. Une pièce, non représentée sur les Figures, qui compresse les joints peut être vissée sur la partie fixe du dispositif, ce qui améliore l'étanchéité du système.

La première étape est une incubation d'eau colorée dans tout le composant. En cas de succès, la seconde étape est une incubation de tampon d'hybridation légèrement coloré dans la moitié de la puce (même protocole) .

La. perte en liquide est proche de 1 μΐ, sur les 2 \iL initiaux. Au démontage, on observe que le joint a pris la forme de la puce; (trous et rugosité de surface) .

La perte est estimée à 46% en 16 heures d'incubation.

Soit une fuite de 1 pL en 16 heures ce qui correspond à une cuite de 0,33 pL par joint et par incubation.

E2 _ - Patins en D.A.V (silicone ) Variante du

B . A .D :

Après 4 heures, on voit clairement que du liquide disparait au niveau des joints. Or les joints sont pressés fortement sur la surface. Après 6 heures, il y a un peu d'évolution. Enfin après 21 heures et compte tenu du temps écoulé il y a eu peu d'évolution de 1 ' évaporation .

La perte est estimée à 35% en 21h00, soit 27% en 16 heu res .

E_3__ Tests __dans __des capillaires scellés : estimaot n de la _ perte liquide dans un joint de silicone_ :_

Deux capillaires en verre (diamètre intérieur 500 um, c'est-à-dire équivalent au diamètre du trou de la puce plastique) sont remplis de colorant et scellés aux extrémités avec un noint silicone B.A.D et une colle époxy, qui sert de référence.

Après une semaine d' incubation à une température comprise entre 65 et 70°C, le volume évaporé dans le capillaire avoisine les 2 μL. Ce résultat représente une évaporation moyenne de 0,1 μL par trou et par incubation de 16 heures. La perte due au joint ne devrait donc pas excéder 0,3 μL durant les incubations sur puces plastiques, car il y a trois trous dans la puce réactionneile .

Avec des tests sur 70 heures sur 5 mm de capillaire, un volume de 1 μL est évaporé. Ceci confirme la valeur de 0,34 pL de perte par incubation par joint silicone. Ce matériau est donc peu intéressant.

E4 - joints en caoutchouc naturel (Natural

Rubber NR) :

La perte est estimée à 19 % en 16h00.

Le joint inférieur est défaillant, suite peut-être à un arrachement lors du déplacement de la partie mobile. La fuite constatée peut en être la conséquence. Ce matériau est sensible au cisaillement (déchirement) .

E_5 _ -_Patins en caoutchouc butyl (Butyl Rubber) : l ^ere expérience :

Ce matériau est plus étanche que le silicone testé ρrécédemment .

La perte en liquide est estimée à 24% sur 22 heures. Soit 17 % sur 16 heures d'incubation.

2 ^eme expérience :

Pour cette expérience, le diamètre des trous de la puce a été modifié.

Les trous de la puce font 200 pm de diamètre au lieu de 500 um précédemment.

/Aucune fuite ou évaporation n'est constatée. La première et.ape est va1 idée .

3 ^eme expérience :

Une sonde de température a été rajoutée sous la puce (perçage de la partie fixe du dispositif) afin de contrôler la température durant toute l'incubation.

Aucune évaporation n'apparaît Durant les 15 premières heures. A 16 heures, on aperçoit un début de fuite qui grandit régulièrement mais qui reste inférieure à 5% du volume.

experxence : On utilise uniquement un demi segment liquide (1 pL) avec le tampon d'hybridation.

Celui-ci est coloré afin de pouvoir visualiser la progression du segment liquide.

Aucune fuite n'est constatée. Le caoutchouc butyl est un matériau qui convient pour l'étape d'incubation.

Les joints du dispositif sont donc de deux matériaux différents a savoir : silicone pour les étapes fluidiques et caoutchouc butyl pour l'étape d'incubation.

5 ^ème expérience :

On a répété la manipulation précédente. La conclusion est identique. L' incubation a été étendue jusqu'à 87 heures afin d'estimer les limites du système.

F - Tests : Incubation dans puce en. verre

L'étape d'incubation dans la puce Micronit© est critique car le volume d'hybridation est de 250 nL (volume d'une demi. -chambre ) .

L'incubateur est intégré dans l'embase du dispositif. Le temps de montée en température est de l'ordre de 15 minutes . Le passage de l' incubation en puce plastique à une puce en verre ne pose pas de problème majeur. La réduction du volume d'incubation de 1 pL à 0,25 uL n' impacte pas les résultats.

Le choix du matériau pour le joint pour l'incubation est le caoutchouc butyl, couplé à un diamètre de trou de la puce microfluidique de 200 pm, il assure une excellente étanchéité à 65°C sur des durées supérieures à 17 heures . Ce matériau n'est pas obligatoire . Dans le cas d' une fabrication en série, d'autres matériaux injectables, connus de l'homme du métier, pourraient être EXEMPLE 3 : Pré-incubation à 90 °C : A - Objectif :

Dans une des étapes des opérations, il est prévu une montée en température à 90-95°C avant l'incubation proprement dites à 65°C. Cette étape suivie d'une incubation de 24 heures à 65°C a été réalisée (Figure 15).

B — Tests :

On remplit ia moitié de la puce avec du tampon d'hybridation en respectant le protocole (étape représentée aux Figures 11 et 12) . La puce est fermée (étape représentée à la Figure 13) pour incubation.

L'incubateur est préréglé pour chauffer la puce à 90°C. Une fois la température atteinte l'incubateur est réglé à 65 °C. La puce redescend donc doucement en température à 65 °C pour l'incubation.

C - Résultats :

Ni mouvement liquide, ni évaporation n'ont été détectés après 24 heures d'incubation.

EXEMPLE 4 : Intégration de l'incubateur au dispositif

L' incubateur a été calibré pour que la température soit d'environ 65°C dans la puce microfluidique . Pour ce faire deux sondes thermiques sont placées dans une fausse puce microfluidique ■ en plastique. Les Figures 16 et 17 montrent : Figure 16 la stabilisation en empérature avec un écart type de 0,1 C (moyenne 63,5°C) sur 3 heures, et

Figure 17 la mise en température du dispositif de test en 20 minute s .

EXEMPLE 5 : Capture en flux de particules magnétiques :

A - Objectif :

L' objectif est de caractériser l'efficacité de la capture en flux des billes magnétiques dans le composant micro f 1 uidique .

B - Tests

Concernant la solution, présente dans le dispositif, la théorie et la pratique montrent que des aimants ayant des dimensions de l'ordre du millimètre sont suffisamment grands pour capturer de petites particules magnétiques d'une taille ou diamètre de 0,1 à plusieurs μπι, présentes dans une chambre mrcrofluidique , tant que la distance entre aimant; et chambre est. inférieure à 400 μπι. Dans le cas de notre dispositif, la puce réactionnelle 15 à un couvercle de verre d'une épaisseur de 170 pm et l'aimant est de 3 mm de long et 1,5 mm de diamètre. Néanmoins, la vitesse du flux doit être inférieure à 10 pL/min pour permettre une capture efficace d'au moins 90% des part icules magnétiques .

Les particules magnétiques de capture ont démontré avec le dispositif selon l'invention une capture efficace. Avec une vitesse de flux de 5 pL/min, et pour trois expériences différentes, l'efficacité de la capture a été de 95, 96 and 97 %, pour des particules magnétiques de 200 nm de diamètre amino Adembeads [Réf. AMINO-ADEMBEADS 200 nm, Ademtech, Pessac, France] (1,6 pL dans 50 pL de tampon de capture) . Afin de comparer, un rendement supérieur à 95% a été obtenu avec un protocole manuel.

EXEMPLE 6 : Agitation :

A - Objectif :

II est possible pour améliorer encore les performances qu'une agitation soit nécessaire durant l'incubation. Elle doit aider la diffusion et la répartition des ARN dans 1 ' échan t: il ion . B - Test : Agitation par ultrasons en bain ultrasonique

T./ objectif à terme est de pouvoir réaliser l'agitation durant l' hybridation par ultrason. En première intention, nous avons testé le mélange de deux colorants dans un bain à ultrasons .

Le premier segment d'une puce plastique 1 pL est rempli d'eau coloré (1 pL) et le second d'eau sans colorant (1 |jL) . L'ensemble est scellé dans un joint silicone identique aux joints du dispositif.

Un premier assemblage est. placé dans le bain à ultrason. Le mélange est visuellement réalisé en 1 à 2 minutes.

Un second assemblage est laissé à température ambiante hors du bain. Le mélange est donc uniquement le fait d'une simple diffusion. Après 17 heures, la couleur de la puce n'est pas homogène même si le colorant est présent dans toute la puce. C - Test : Agitation par ultrasons en capillaire

Un capillaire en verre, d'un diamètre de 520 μπι, est couplé à un transducteur ultrason commandé par un générateur en fréquence. On observe la dispersion de billes magnétiques préalablement attirées par un aimant. La. fréquence est de 50-150 kHz.

Cette technique semble efficace bien que cette expérience ne permette pas de conclure (test en capillaire et non en puce, transducteur piézoélectrique au contact du capillaire et non déporté dans l'incubateur) . Elle a l'avantage d'être facile à mettre en oeuvre en comparaison d'autres solutions telles qu'une sonde SAW (Surface Acoustic Wave) Advalytix (Réf. SlideBooster SB450, Munich, Allemagne). L'intégration de cette solution peut être faite en intégrant simplement un élément piézoélectrique au bloc d'incubation.

La redispersion d'un culot de billes magnétiques dans un capillaire en verre grâce à des ultrasons est donc possible. Le temps de redispersion est inférieur à 5 secondes .

D - Test : Agitation thermique

Une moitié du dispositif est remplie avec de l' eau colorée et la seconde avec de l'eau. On observe un étalement lent de la coloration. Cette technique est peu efficace.

EXEMPLE 7 : Intégration du dispositif dans un instrument :

A - Validation du dispositif : utiiisation purement La gestion des fluides du dispositif se fait par étanchéité entre un cône, ou embout de pipette, et un joint souple. La plupart des types de cônes sont compatibles avec le dispositif actuel. L'ensemble des étapes d'hybridation peut donc être réalisé à la main par un technicien formé.

L'étape la plus critique est la capture des particules magnétiques. Si la capture est en flux, il faut un dispositif simple, de type seringue du BioAnalyser d' Agitent (Bioanalyzer 2100, Santa Clara, CA, USA) : basé sur une résistance fluidique définie couplée à un volume d'air sous pression) qui permet de faire circuler S ' échantillon de départ à environ 5 pL/min dans le dispositif et ce quel que soit le volume de l'échantillon. L'hybridation peut être faite en étuve.

Les avantages de ce dispositif sont d'être :

- très simple,

- très peu coûteux,

- avec un risque d'erreur de pipetage limité,

- parfaitement adapter à un besoin de quelques tests par jour.

Les inconvénients sont de :

- nécessite un opérateur à plein temps pour les phases de préparation, et

d'avoir un incubateur, un agitateur et un lecteur extérieurs au système ou qu'il faut intégrer en plus.

B_ Validation du dispositif : système semi- autornât ique

Dans cette version seules les étapes de pipetage sont prises en charges par le système. L'incubateur, l'agitateur et le lecteur sont extérieurs au système. L' instrument est basé sur un bras pour pipeter à deux axes Y/Z qui prend et dépose des cônes, aspire les réactifs et les éjecte dans le dispositif. Après chaque étape, un bras ou une table un axe décale le dispositif et les réactifs d'un cran. L'appareil de pipetage a ainsi accès à de nouveaux cônes et de nouveaux réactifs.

Dans le cadre de l'automatisation du dispositif selon l'invention, des avantages particuliers existent qui sont

- d'être peu coûteux (pas d'incubateur ni de lecteur),

- d'être de faible encombrement, et

- de simplifier le travail du technicien.

Par contre les inconvénients sont, qu'il y a :

peu de valeur ajoutée par rapport à la solution manue 1 ] e ,

- nécessité de la présence d'un opérateur pour les étapes d' incubation et de lecture,

- un temps et un coût de développement important, et

- une conception de consommables dédiés en plus.

C - Validation du dispositif : système haute cadence Cette configuration d' instrument gère le pipetage, le déplacement des dispositifs d'une zone de stockage vers la zone fluidique puis vers les incubateurs et le lecteur. Tout est: géré par un unique bras robot faisant office de moyen de pipetage. Ce genre de déplacement dans un instrument existe déjà pour des formats microplaques. 1/ instrument est donc basé sur des plateformes à trois axes existantes, tels que Hamilton (Réf. : Starlet, Hamilton Robotic, Bonaduz GR, Suisse), Tecan (Mânnedorf, L'agitateur et le lecteur optique sont également développés spécifiquement .

Le technicien insère des racks d'échantillons, de réactifs, de cônes et dispositifs selon l'invention dans la machine. Si le temps de manipulation des fluides est de une heure par test, il y a environ une autonomie de 15 tests pour que la machine puisse fonctionner toute la nuit sans nécessiter de recharge.

Dans ce cas les avantages sont que :

- la solution est intégrée,

- l'utilisateur remplit la machine deux fois par jour, et

- le dispositif est basé sur une plateforme existante.

REFERENCES

Dispositif de préparation, de traitement et/ou d'analyse

Echantillon biologique ou tout autre liquide

Support réactionnel du dispositif 1

Tiroir du dispositif 1

Chambre de transfert du support 3

Chambre réact ionnelle du support 3

Canal central

Canalisation interne reliant les deux chambres 5 et 6 Canalisation externe reliant la canalisation interne 8 et débouchant vers l' extérieur

Canal amoint de la chambre 5 débouchant vers l'extérieur Cariai aval de la chambre 6 débouchant vers l'extérieur Moyen de commande coopérant avec le canal débouchant 10 Surface de contact du support 3 où débouchent les canaux 9, 10 et 11

Base du support 3

Elément réactionnel ou puce réactionnelle du support 3

Zone de lecture de la chambre 6

Incubateur

Trou d'indexation ou position de l'aimant

Réservoir amont de collecte des surplus liquides

Réservoir aval de collecte des surplus liquides

Event entre les réservoirs 19 et 20 et l'extérieur Moyen de commande coopérant avec le canal débouchant 9 Glissières permettant la translation du tiroir 4 par rapport au support 3

Canaux d' évacuation des surplus liquides vers les réservoirs 19 et 20

Rainure dans la surface de contact 13 permettant le passage des moyens 12, 22 et 32

Aimant

Agglomérat de particules magnétiques et d'acides nucléi ques

Agglomérat de particules magnétiques 29 - Puce réactionnelle de l'élément 15

K) - Fenêtre de lecture de la base 14

31 - Fenêtre de lecture de l'élément 15

32 - Moyen de commande coopérant avec le canal débouchant 11 Fl - Mouvement de translation du tiroir 4 par rapport au

support 3

F2 - Introduction d'un échantillon biologique 2 au niveau du moyen de commande 12 P1

F3 - Sortie d'échantillon 2 sous l'action de F2 au niveau du

Introduction d'air au niveau du moyen de commande 12P1 Sortie d'échantillon 2 sous l'action de F4 au niveau du moyen de commande 22P1

Introduction de liquide d'élution 2 au niveau du moyen de commande 32 P2

Sortie du liquide 2 sous l'action de F6 au niveau du moyen de commande 22P2

Introduction d'air au niveau du moyen de commande 32P3 Sortie d'air au niveau du moyen de commande 32P3

Mouvement aller du liquide 2 dû au mouvement F8 créant un va et vient avec F9

Mouvement retour du liquide 2 dû au mouvement F9 créant le va et vient avec F8

Introduction d'air au niveau du moyen de commande 22P5 Sortie du liquide 2 sous l'action de F12 au niveau du moyen de commande 32 P5

Position de départ du tiroir 4 par rapport au support 3 Position du tiroir 4 par rapport au support 3 après une première translation

Position du tiroir 4 par rapport au support 3 après une seconde translation

Position du tiroir 4 par rapport au support 3 après une troisième trans1at i on

Position d'arrivée du tiroir 4 par rapport au support 3 après une dernière translation