Unter funktionellen Gruppen sollen solche chemischen Gruppen verstanden werden, die direkt, nach Aktivierung oder mittels Spacersystemen zu einer Anbindung des Hirudins geeignet sind, d. h. zum Beispiel Amino-, Hydroxyl-, Thiol-oder Carboxylgruppen.

Die Verwendung von Polymeren als Biomaterialien fur medizinische Anwen- dungen ist bekannt. Wenn diese Materialien in den direkten Kontakt mit Blut kommen, z. B. als Stents, Gefäßprothesen, Katheter, Dialysemembranen, künstliche Herzklap- pen oder Herzen oder auch als chirugisches Nahtmaterial, tritt das Problem der Thrombusbildung auf. Es ist auch bekannt, dass durch die Immobilisierung von biolo- gisch aktiven, antithrombogen wirkenden Substanzen auf der Oberfläche die Hämokompatibilität verbessert werden kann. Ein solcher Thromobogeneseinhibitor, Heparin, wird seit langem in der klinischen Praxis zur Behandlung von Erkrankungen des Gerinnungssystems eingesetzt. Der therapeutische Gebrauch ist oft von Nebeneffek- ten, wie übermäßig verlängerten Gerinnungszeiten begleitet. Heparin und Heparinderi- vate wurden bereits vielfach an Polymeroberflächen immobilisiert, um so die Haro- kompatibilität der medizinischen Gegenstände zu verbessern und die systemisch ver- abreichte Menge an Heparin zu reduzieren. Es ist bekannt, dass die Immobilisierung eines solchen Thrombogeneseinhibitors nach unterschiedlichsten Methoden erfolgen kann. Neben vornehmlich auf adsorptiver Immobilisierung beruhenden Methoden haben sich in zunehmendem Malte Methoden durchgesetzt, die auf eine kovalente Anbindung des Thrombogeneseinhibitors auf der Polymeroberfläche abzielen. Derartige Verfahren sind z. B. aus der US-PS 4,613,665 bekannt. Neben der weitverbreiteten Verwendung von Spacersystemen als bivalente Verbinder zwischen Oberfläche und Thrombo- geneseinhibitor, wird z. B. in der EP-PS 081 853 die Verwendung von Heparin- Albumin-Konjugaten zur Immobilisierung vorgeschlagen.

Eine alternativ zu Heparin verwendbare Substanz ist das Hirudin, ein natürlich vorkommender Thrombogeneseinhibitor, der aus den Köpfen von Blutegeln extrahiert wird und mittlerweile auch rekombinant zur Verfügung steht. Hirudin ist der stärkste bekannte Thrombininhibitor mit einer Komplexbildungskonstanten von ca. 10-'2 mol/1 und besitzt im Vergleich zu Heparin eine Reihe von Vorteilen. So ist die antithrombo- gene Wirkung von Heparin an die Anwesenheit von Antithrombin III oder von Heparin- cofaktor Il gebunden. Auch wird Heparin durch Plättchenfaktor 4 in seiner antithrom- bogenen Wirkung inhibiert. Neben einer verlängerten Blutung bewirkt Heparin nicht selten Thrombozytopenia. Hirudin zeigt keinen dieser Effekte und besitzt daru'beur hin- aus eine stärker antithrombogene Wirkung als Heparin. AuBerdem verringert Hirudin im immobilisierten Zustand die Adhäsion von Thrombozyten sowie die Thrombozyten- aktivierung durch Thrombin. Weiter vermag Hirudin Thrombin in seiner Wirkung, mitogen auf Fibroplasten, aktivierend auf Endothelzellen und chemotaktisch auf Mono- zyten und Leucozyten zu wirken, zu blockieren. Letzteres ist in engem Zusammenhang mit den inflamatorischen Effekten, die bei der Implantation von Biomeaterialien häufig zu beobachten sind, zu sehen. Hirudin besitzt also eine Reihe von günstigen Eigen schaften, die es als eine dem Heparin potentiel überlegene Substanz zur Immobilisie- rung auf Biomaterialoberflächen für den Blutkontakt erscheinen lassen. So ist aus der EP-A1 0 357 242 bekannt, dass Hirudin durch Anbindung an eine Grundbeschichtung auf Polymeroberflächen immobilisiert werden kann. Allerdings hat sich gezeigt, dass durch die darin vorgeschlagene unselektive Anbindung von Hirudin an Oberflachen dessen thrombozytenabweisende und Thrombogenese inhibierende Aktivität stark ver- ringert wird.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Immobili- sierung des Hirudin zu schaffen, bei dem die thrombozytenabweisende und/oder Thrombogenese-inhibierende Wirkung weitgehend erhalten bleibt und außerdem einen geeigneten Thrombogeneseinhibitor auf Hirudin-Basis zu schaffen.

Die Aufgabe wird verfahrensgemäß dadurch gelöst, dass in einem der Immobili- sierung vorgeschalteten Behandlungsschritt die chemische und/oder räumliche Umge- bung von funktionellen Gruppen des Hirudins in Hinblick auf deren Immobilisierungs- selektivität verändert wird und dass nach der Immobilisierung die Veränderung der chemischen und/oder räumlichen Umgebung wieder aufgehoben wird.

Die Erfindung geht davon aus, dass eine der funktionellen Gruppen essentiel für die Thrombogenese-inhibierende Wirkung des Hirudins ist. Gleichzeitig reagiert die selbe funktionelle Gruppe hoch selektiv mit den üblichen Kopplungsreagenzien, die zur Immobilisierung des Hirudins an eine Oberfläche verwendet werden können. Ohne Änderung der chemischen und/oder räumlichen Umgebung von funktionellen Gruppen des Hirudins lässt sich Hirudin somit nicht unter Erhalt seiner Thrombogenese-inhibie- renden Aktivität immobilsieren. Es hat sich überraschen gezeigt, dass gemäß der Erfin- dung durch Veränderung der chemischen und/oder räumlichen Umgebung funktioneller Gruppen des Hirudins, d. h. durch Anderung ihres elektronischne und/oder ener- getischen Zustandes, ein metastabiles Hirudinderivat erzeugt wird, welches im Ver- gleich zum Hirudin eine veränderte Immobilisierungsselektivität der funktionellen Grup- pen bei einer nachfolgenden Immobilisierung zeigt. (Unter Immobilisierungsselektivität versteht man das Verhältnis, in dem die verfügbaren funktionellen Gruppen des Hiru- dins bei der Immobilisierung regieren.) Die Anbindung von Hirudin an Polymerober- flache erfolgt nunmehr über andere funktionelle Gruppen als dies bei einer direkten Immobilisierung von Hirudin der Fall wäre. Im Grunde ergibt sich also, dass durch den Vorbehandlungsschritt funktionelle Gruppen des Hirudins, welche fur die Bildung des Hirudin-Thrombin-Komplexes wesentlich sind, fur die Immobilisierungsreaktion zu- mindest partiel blockiert werden und dann nach Wiederherstellung ihrer chemischen und/oder räumlichen Umgebung fur die Bindung des Hirudins zum Thrombin zur Ver- ftigung stehen.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung wird daher vorgesehen, dass im vor- geschalteten Behandlungsschritt die chemische und/oder räumliche Umgebung unter Freihaltung eines Teils der funktionellen Gruppen verändert wird. Dieser frei gehaltene Teil der Gruppen steht dann fur die Bindung des Hirudins zum Thrombin zur Verfü- gung. Dabei hat sich herausgestellt, dass es besonders vorteilhaft ist, wenn die che- mische und/oder räumliche Umgebung unter Freihaltung von mehr als 50 % der funk- tionellen Gruppen verändert wird, wobei es sich vorzugsweise um Aminogruppen han- delt. Wesentliches Merkmal der Erfindung ist somit weiterhin, dass die erlauterte An- derung der chemischen und/oder räumlichen Umgebung reversibel erfolgt, d. h. dass sich die urspriingliche Umgebung der nicht zur Anbindung an die Polymreoberfläche benotigten funktionellen Gruppen des Hirudins nach Immobilisierung wieder herstellen last. Durch die vorgeschlagene Vorgehensweise wird somit erreicht, dass fur die Thrombinaktivität notwendige funktionelle Gruppen bei der Immobilisierung nicht ge- bunden werden und daher nach Immobilisierung fur Wechselwirkungen mit Thrombin zur Verfügung stehen. Dies bewirkt eine erhöhte antithrombogene und/oder thrombozy- tenabweisende Wirkung des an Oberflächen gebundenen Hirudins. Das erfindungs- gemme Verfahren zeigt somit einen Weg, dass funktionelle Gruppen des Hirudins, die aufgrund ihres chemischen Zustandes reaktionstragend sowohl bei der Immobilisierung als auch bei der Reaktion mit Thrombin sind, auch nach der Immobilisierung von Hiru- din an Polymeroberflächen für die Wechselwirkungen mit Thrombin zur Verfügung stehen. Erfindungsgemäß kann eine Anderung der chemischen Umgebung der funktio- nellen Gruppen des Hirudins durch eine chemische Reaktion des Hirudins mit Sub- stanzen unter Ausbildung einer kovalenten, nebenvalenten oder ionogenen Bindung erfolgen. Auch entspricht eine Änderung der chemischen Umgebung der funktionellen Gruppen des Hirudins unter dem Einfluss energiespendender Felder oder durch ther- mische oder fotochemische Behandlung oder Reaktion dem Wesen der Erfindung. Un- ter der Änderung der räumlichen Umgebung der funktionellen Gruppen des Hirudins soll erfindungsgemäß die Anderung der Primar-, Sekundar-, Tertiar-oder Quartarstruk- tur des Hirudins, z. B. durch Änderung des umgebenden Mediums, durch Oxidations- oder Reduktionsreaktionen, durch thermische oder fotochemische Behandlung oder durch den Einfluss energiespendender Felder, verstanden werden. Ausdrücklich ent- spricht auch eine Veränderung der räumlichen Umgebung der funktionellen Gruppen des Hirudins in Verbindung mit einer Anderung ihrer chemischen Umgebung dem Wesen der Erfindung. Im Sinne der Erfindung ist sowohl die Immobilisierung auf ei- nem Polymer, das freie funktionelle Gruppen besitzt oder auf dem solche durch Ober- flächenmodifizierung erzeugt worden sind, als auch die Immobilisierung auf einem Metall, einer Keramik oder einem sonstigen nicht-polymeren Substrat, das als Folge einer Polymerbeschichtung freie funktionelle Gruppen besitzt, möglich.

Es hat sich gezeigt, dass die Umsetzung des Hirudins mit 2- (Methylsulfo- nyl) ethyl-N-succinimidyl-carbonat bei pH 3 bis 8 in besonderem Mabre dazu geeignet ist, die chemische Umgebung der funktionellen Gruppen des Hirudins derart zu ver- ändern, dass eine im Hinblick auf eine spätere Verfügbarkeit der fur die Wechselwir- kungen des Hirudins mit Thrombin notwendigen funktionellen Gruppen optimale Immo- wird.bilisierungsselektivitäterreicht Erfindungsgemäß ist zur Wiederherstellung der Thrombinaktivität des Hirudins nach Immobilisierung jede Behandlung geeignet, die die vor der Immobilisierung durchgefuhrte Anderung der chemischen und/oder räumlichen Umgebung wieder auf- hebt. Im Falle der Anderung der chemischen Umgebung durch 2- (Methylsulfonyl) ethyl- N-succinimidyl-carbonat hat sich die Wiederherstellung der chemischen Umgebung durch Inkubation mit basischer wässriger Lösung, inbesondere durch Inkubation mit wässriger Piperidinlösung, als besonders geeignete Methode herausgestellt. Diese Methode ist weiterhin besonders schonend gegen Hirudin, die Bindung zwischen Hiru- din und der Polymeroberfläche sowie gegen die meisten in der Medizintechnik einge- setzten Polymere.

Erfindungsgemafi sind alle Substanzen zur Anderung der chemischen und/oder räumlichen Umgebung der funktionellen Gruppen des Hirudins geeignet, die die Immo- bilisierungsselektivität des Hirudins ändern und bei denen die durch sie bewirkte Anderung der chemischen und/oder räumlichen Umgebung durch Immobilisierung wieder hergestellt werden kann. Insbesondere sind Substanzen geeignet, die folgenden Substanzklassen zugeordnet werden können : 1-Chlorameisensäurealkylester, vorzugs- weise 1-Chlorameisensäure (5-trisilylpropyl) ester, 1-Chlorameisensaurearylester, vor- zugsweise 9-Fluorenylmethyloxyzarbonylchlorid, 1-Azidoameisensäurealkylester oder -arylester, vorzugsweise 1-Azidoameisensaurebenzylester, Dialkyl-, Diaryl-oder Arylalkylcarbonate, Aryl-bzw. Alkyl (orthonitrophenyl) carbonate, vorzugsweise Isobu- tyl (orthonitrophenyl) carbonat oder Arylalkyl-oder Dialkyldicarbonate, vorzugsweise Diisobutyldicarbonat. Die Wiederherstellung der chemischen und/oder räumlichen Um- gebung kann erfindungsgemäß durch alle Methoden erfolgen, die ausreichend schonend gegenüber der Primar-, Sekundar-und Tertiarstruktur des Hirudins, der Bindung zwischen Hirudin und der Polymeroberfläche sowie gegenüber der verwendeten Poly- meroberfläche sind.

Besonders vorteilhaft ist es, die räumliche Umgebung durch Denaturierung des Hirudins zu verändern, wobei die Wiederaufliebung der Immobilisierung durch Um- setzung beispielsweise mit wässriger Piperidinlösung bei pH 6 bis 13 vorgenommen wird.

Überraschend hat sich weiterhin gezeigt, dass die chemische und/oder räumliche Umgebung durch Inkubation des Hirudins in einer wässrigen Mischung eines organi- schen Lösungsmittels, vorzugsweise Dimetylformamid, Dimethylsulfoxid, Isopropanol, Ethanol, Aceton, Diethylether, Hexan oder Tetrahydrofuran, verbunden mit der Zugabe von Reduktionsmitteln, vorzugsweise Mercaptoethanol, Cystein bzw. Cysteinreste tragenden Peptiden oder Proteinen, Glutathion, Dithiothreitol oder auch Natrum- tetrathionat, die chemische und/oder räumliche Umgebung der funktionellen Gruppen des Hirudins ebenfalls so verändert wird, dass diese veränderte Immobilisierungs- selektivität zeigen. Auch in diesem Fall wird eine Verschiebung der Reaktivitäten der funktionellen Gruppen des Hirudins bei der Immobilisierung beobachtet, die dazu führt, dass zumindestens partiel die Immobilisierung tuber andere funktionelle Gruppen als diejenigen, die zur Wechselwirkung mit Thrombin benötigt werden, erfolgt. Damit stehen weiterhin funktionelle Gruppen fur die Wechselwirkung mit Thrombin zur Ver- fügung.

In diesem Fall hat sich gezeigt, dass eine Wiederherstellung der chemischen und/oder räumlichen Umgebung der funktionellen Gruppen des Hirudins nach Immobi- lisierung durch Inkubation mit einer wässrigen Lösung, insbesondere wässrigen Puffer- systemen, wie z. B. einer 10% igen Natriumacetatlösung, erfolgt.

Überraschend hat sich weiterhin gezeigt, dass die metastabile Form durch Inku- bation des Hirudins unter reduktiven Bedingungen in einer wässrigen Mischung eines organischen Lösungsmittels, vorzugsweise Dimetylformamid, Dimethylsulfoxid, Isopro- panol, Ethanol, Aceton, Diethylether, Hexan oder Tetrahydrofuran erfolgt. Besonders vorteilhaft ist es, wenn ein Reduktionsmittel, wie z. B. Natriumetrathionat zur chemischen und/oder räumlichen Umgebung der funktionellen Gruppen des Hirudins herangezogen wird, sodass these Gruppen eine veränderte Immobilisierungsselektivität zeigen.

Zur Schaffung der reduktiven Bedingungen Mercaptoethanol, Glutathion, Cysto- rein, Cysteinreste tragendes Peptid oder Protein oder auch Dithiothereitrol zugegeben wird.

Ein fur die Verbesserung der Hämokompatibilität von chirurgischem Naht- material oder anderen medizinischen Gegenständen geeigneter Thrombogeneseinhibitor besteht aus einem fur die Immobilisierung von deren Oberfläche geeignetem Hirudin, wobei gemdb der Erfindung dieser Thrombogeneseinhibitor gekennzeichnet ist durch ein Hirudinderivat und einen Nachbehandler aus wassriger Piperidinlosung mit pH 6 bis 13 besteht. Es versteht sich, dass der Nachbehandler im Nachhinein eingesetzt wird, um die Immobilisierung wieder aufzuheben. Ein derartiger Thrombogeneseinhibitor steht in Form eines Derivates zur Verfügung, das auf einfache Art und Weise mit dem zu behandelnden Nahtmaterial bzw. anderen medizinischen Gegenständen in Kontakt gebracht werden kann, um dann die gezielte und gewünschte Wirkung zu entfalten, d. h. nach wie vor stehen funktionelle Gruppen zur Verfügung, die fur die Thrombin- aktivität oder fur die thrombozytenabweisende Wirkung benötigt werden. Damit ist sichergestellt, dass das Hirudin seine vorteilhaften Wirkungen entfaltet.

Besonders vorteilhaft ist ein Thrombogeneseinhibitor bei dem das Hirudinderivat ein [2- (Methylsulfonyl) ethyl-oxy-carbonyllx-Hirudin und eine wässrige Mischung mit pH 3 bis 8 ist, wobei x = 1-3 sein kann.

Als besonders zweckmäßig hat sich ein Thrombogeneseinhibitor herausgestellt, bei dem das Hirudinderivat aus r-Hirudin, einem zehnfachen Überschuss 2-(Methylsul- fonyl) ethyl-N-succinimidyl-carbonat und 20 ml 0,1 m Natriumacetat-Lösung, vorzugs- weise mit pH 5,9 besteht, wobei es wiederum zweckrndbig ist, dass der Nachbehandler eine zehnprozentige wässrige Piperidinlösung bei pH 6 bis 13 ist.

Abb. 1 : Thrombinaktivität nach Immobiiisiensng von r-Hirudin bzw. des metastabilen r-Hirudinderivat an EDC aktiviertem Polyurethan in Abhängigkeit von der Volumenkonzentration (n > 6) Abb. 2 : Thrombinaktivität nach Immobilisierung von r-Hirudin bzw. des metastabilen r- Hirudinderivat an HDI-aktiviertem Hydroxymethyl-ppx in Abhängigkeit von der Volumenkonzentration (n > 6) ; Proben, bei denen keine Gednnung zu beobachten ist, werden auf 90 s normlert Abb. 3 : TAT-Gehalt in Blutplasma (n = 3) von Hydroxymethyl-ppx-beschichteten Edelstanlfolien nach Immobilisierung des metastabilen Hirudinderivates im Vergleich zur beschichteten und unbeschichteten Edeistahloberfläche, Werte ReferenzoberflächeGlaszur Abb. 4 : Flureszenzaufnahmen der adharierten Thrombozyten an der Hydroxymethyl-ppx- beschichteten Edelstahifolie nach Umsetzung mit HDI und Immobilisierung des metastabilen r-Hirudinderivates (rechts) bzw. unmodifiziert (links), Balken 20 zm Beispiel 1 : <BR> <BR> 100 mg r-Hirudin wurden mit zehnfachem Überschuß an 2- (Methylsulfonyl) ethyl-N- succinimidyl-carbonat (Fluka) in 20 ml 0,1 m Natriumacetat-Lösung bei pH = 5.9 in einem Glasreaktor inkubiert. Die Reaktion wurde nach 30 min mit zehnprozentiger Essigsäure abgestoppt und das so erzeugte metastabile Hirudinderivat durch Kombination von Gelpermeationschromatographie und Ionenaustauschchromato- graphie gereinigt. Zur Aktivierung und Oberflächenfunktionalisierung eines Polyetherurethans wurde eine Argonplasmabehandlung (Mikrowelle, gepulstes Plasma, 30 s, 2000 W) eingesetzt. Die derart aktivierten Polymerfolien wurden mit einer 5 % igen wässrigen Acrylsäurelösung unter Verwendung von UV-Strahlung (Excimer, 308 nm) über einen Zeitraum von 10 min pfropfcopolymerisiert. Nach Reinigung der pfropfcopolymeriserten Oberflächen wurde 1 h bei 4°C mit EDC (pH 4,8) aktiviert.

Die aktivierten Folien wurden nachfolgend mit einem metastabilen Hirudinderivat 24 h bei pH 3, umgesetzt. Anschließend wurde die Oberfläche fünfmal mit tensidhaltigem Phosphatpuffer gewaschen und mit zehnprozentiger Piperidinlösung 2 h inkubiert. Die Thrombinaktivität des nach diesem Verfahren immobilisierten Hirudins ist in Abb. 1 im Vergleich zu direkt immobilisiertem Hirudin angegeben.

Beisoiel 2 : 100 mg r-Hirudin wurden mit zehnfachem 10berschuB an 2- (Methylsulfonyl) ethyl-N- succinimidyl-carbonat (Fluka) in 20 ml 0,1 m Natriumacetat-Losung bei pH = 5,9 in einem Glasreaktor inkubiert. Die Reaktion wurde nach 30 min mit zehnprozentiger Essigsäure abgestoppt und das so erzeugte metastabile Hirudinderivat durch Kombination von Ionenaustauschchromato-und graphie gereinigt.

Zur biologisch aktiven Beschichtung einer Edelstahlplatte wurde zunächst in einem Vorbehandlungsschritt das Dimere [2,2]-Hydroxymethyl-paracyclophan bei 700 °C und 30 Pa gespalten und anschliebend durch Abk-ftWung auf etwa 120 °C auf der Edelstahlplatte abgeschieden (Hydroxymethyl-ppx). Dann wurde das Hirudinderivat unter Verwendung von Hexamethylendiisocyanat als Spacer an die Oberflache gebunden. Die beschichtete Metallplatte wurde dazu in einer etherischen Hexamethylendiisocyanat-Losung 12 h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit Ether extrahiert. Dann wurde die Probe für 24 h mit einer Lösung des metastabilen Hirudinderivates bei 4 °C versetzt. Anschließend wurde die Oberfläche fiinfinal mit tensidhaltigem Phosphatpuffer gewaschen und dann mit zehnprozentiger wäßriger Piperidinlösung für vier Stunden inkubiert. Abschließend wurde die Oberfläche erneut fünfmal mit tensidhaltigem Phosphatpuffer gewaschen.

Die TT-Gerinnungszeit (Abb. 2) zeigt bei der Verwendung des metastabilen r-Hirudinderivates bereits bei einer Volumenkonzentration von 1,05 nmol/ml einen hohen Wert von (40,5 7,2) s. Ein Anstieg der Hirudinkonzentration in Lösung von 10,5 nmol/ml auf 21 nmol/ml bewirkt keine signifikante Verlängerung der TT-Zeit.

Bel einer Volumenkonzentrafion von 42 nmol/ml wird sämtliches Thrombin aus der Lösung entfernt, so daß keine Gerinnung mehr zu beobachten ist. Alle Experimente, bei denen keine Gerinnung stattfindet, werden auf eine Gerinnungszeit von 90 s normiert.

Anhand ausgewählter Hämokompatibilitätsparameter werden Hinweise darauf erhalten, wie sich mit r-Hirudin ausgerüstete Oberflächen im Blutkontakt verhalten. Es erfolgte eine Bewertung hinsichtlich der das Komplementsystem aktivierenden Wirkung einer Hydroxymethyl-ppx beschichteten Edelstahloberfläche.

Als Standard wurde Cuprophan sowie die Edelstahloberfläche verwendet. Die erfindungsgemäß mit r-Hirudin ausgerüstete Oberfläche verursacht keine iibermabige Produktion des Faktors Casa, die eindeutig unterhalb der der Cuprophanoberfläche liegt. Eine vermehrte Komplementaktivierung infolge der Immobilisierung kann daher ausgeschlossen werden. r-Hirudin komplexiert spezifisch das Gerinnungsenzym Thrombin ; dauber hinaus sind im Gegensatz zu Heparin, das beispielsweise die Thrombozytenaggregation fördern kann, keine weiteren Wechselwirkungen mit plasmatischen oder zellulären Blutbe- standteilen bekannt. Aus diesem Grund sind zur Bewertung der in nitro- Hämokompatibilität von immobilisiertem Hirudin Verfahren wichtig, die eine erfassen.biomaterialinduzierteThrombingeneration Zur Bestimmung der Thrombingeneration wurde der Thrombin/Antithrombin-Komplex (TAT) im direkten Kontakt mit Blutplasma bestimmt. Abb. 3 zeigt den TAT-Gehalt von erfindungsgemäß immobilisiertem r-Hirudin im Vergleich zu den Referenzoberflachen Glas, Hydroxymethyl-ppx und Edelstahl. Der fiir Glas ermittelte Mittelwert wird auf 100 % gesetzt, alle anderen Ergebnisse werden relativ dazu angegeben. Während die Hydroxymethyl-ppx-Beschichtung der Edelstahloberfläche mit (22,5 # 1,4) % des Wertes fiir Glas im Vergleich zur Edelstahloberfläche ((36, 2 # 6,8) %) keine signifikante Veranderung nach sich zieht, verringert sich der TAT- Wert nach erfmdungsgemdber hnmobilisierung von r-Hirudin auf (2,9 # 0,8) % des Referenzwertes.

Diese Meßreihe bestätigt die Ergebnisse des TT-Assays und zeigt dariiber hinaus, da (3 auch die Biomaterial-induzierte Thrombingenerafion durch eine erfindungsgemiibe Immobilisierung von r-Hirudin praktisch vollständig unterbunden werden kann.

Ein weiterer wesentlicher Parameter bei der Einschätzung der Hiimokompatibilitiit eines Biomaterials ist die Adhasion von Thrombozyten an der Oberfläche. Da den Thrombozyten als wichtige Mediatoren und Aktivatoren plasmatischer und zellulärer Vorgänge eine Schlüsselrolle im Biomaterialkontakt zukommt, sollte neben der Quantifizierung adhärenter Zellen auch die Bewertung ihrer Zellmorphologie erfolgen.

Abgekugelte Thrombozyten gelten als wenig oder nicht aktiviert, wahrend weit ausgebreitete, flache Zellen aktiviert sind und bereits einen Grof3teil ihrer Inkremente veräußert haben. Abb. 4 zeigt repräsentative Flureszenzaufnahmen der Hydroxymethyl-ppx-beschichteten Edelstahlfolie, an die das metastabile r-Hirudin immobilisiert wurde (rechts). Zum Vergleich wird die Hydroxymethyl-ppx- beschichtete Edelstahlfolie (links) gegeniibergestellt. Die Untersuchung der Thrombozytenadhäsion wurde mit thrombozytenreichen, humanen Blutplasma durchgefiihrt Das auf der linken Seite dargestellte Hydroxymethyl-ppx zeigt eine verhältnismäßig dichte Belegung mit Thrombozyten, die teilweise abgerundet sind. Daneben finden sich aber auch flach ausgebreitete, aktivierte Zellen. Das erfindungsgemäß immobiliserte r-Hirudin bewirkt eine drastische Verringerung der Thrombozytenadhäsion. Neben Bereichen, an denen sich iiberhaupt keine Zellen befmden, fmden sich vereinzelt adharente Thrombozyten, die abgekugelt und somit nicht oder nur wenig aktiviert sind. Die hier vorgestellte Hämokompatibilitätsuntersuchung der Hydroxymethyl-ppx-beschichteten Metall- oberflächen, an die r-Hirudin durch Anwendung der Schutzgruppentechnik unter Erhalt seiner biologischen Aktivität gebunden wurde, läßt sich wie folgt zusammenfassen: 1. Eine übermäßige Aktivierung des Komplementsystems nach der Immobilisierung des Thrombininhibitors r-Hirudin kann ausgeschlossen werden.

2. Die Biomaterial-induzierte Thrombingeneration kann durch die erfindungsgemäße r-Hirudinnahezuvollsändigverhindertwerden.Immobilisierungvo n 3. Die Adhasion von Thrombozyten wird durch die erfindungsgemäße Immobilisierung von r-Hirudin drasfisch reduziert, die wenigen adhdrenten Zellen sind abgekugelt und daher nichet aktiviert.