Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um método de diagnóstico de doenças infecto-parasitárias por citometria de fluxo para diagnóstico simultâneo de patologias utilizando marcação fluorescente diferencial de agentes biológicos, tais como células e patógenos de interesse, com substâncias fluorescentes. De uma forma geral, o método de diagnóstico consiste em realizar a marcação fluorescente dos agentes biológicos com concentrações gradativas de substâncias fluorescentes, e analisar o perfil de reatividade de anticorpos IgGl presentes em soro de pacientes contra os referidos agentes biológicos.

A presente invenção proporciona ainda um kit de diagnóstico contendo as preparações dos agentes biológicos marcados com concentrações gradativas de substância fluorescente; preparação de anticorpo anti-IgGl humano biotinilado; reagente fluorescente para revelação do anticorpo anti-IgGl humano; amostras de soro de indivíduos controle negativo; amostras de soro de indivíduos controle positivo; uma solução para _. lavagem das placas e diluição das amostras; uma solução fixadora para preparação para leitura no citômetro de fluxo; placas de 96 poços e adesivos de vedação.

Fundamentos da Invenção

A reatividade laboratorial de amostras de soros de pacientes portadores de algumas doenças pode muitas vezes ser muito semelhante. Isto é devido, principalmente, ao compartilhamento antigênico entre os agentes relacionados à etiologia dessas doenças. Nestes casos, métodos de diagnóstico sorológicos convencionais apresentam como principal desvantagem a baixa especificidade, contribuindo para resultados falso-positivos e dificuldades no diagnóstico sorológico diferencial e confirmatório da doença .

Por exemplo, o diagnóstico laboratorial da doença de Chagas, sobretudo na fase crónica da infecção, baseia-se na utilização de métodos sorológicos para detecção de anticorpos anti-T. cruzi. Segundo o Consenso Brasileiro em Doença de Chagas (Consenso Brasileiro em Doença de Chagas - Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde, Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. VOL. 38: SUPLEMENTO III, 2005), os testes sorológicos de escolha para o diagnóstico da doença são: Hemaglutinação Indireta (HAI) , a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e o Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) . Estes testes, conhecidos como convencionais, são comumente utilizados no diagnóstico da doença de Chagas em laboratórios clínicos e na triagem sorológica em bancos de sangue. Quando aplicados em conjunto apresentam alta sensibilidade, entretanto, devido ao grande compartilhamento antigênico entre parasitos pertencentes à família Tripanosomatidae, como é o caso da Leishmania spp., os métodos sorológicos convencionais apresentam como principal desvantagem a baixa especificidade, contribuindo para resultados falso- positivos e dificuldades no diagnóstico sorológico diferencial da doença de Chagas e das leishmanioses (Marchi et al, 2007). Este problema assume proporções ainda maiores quando projetado na realidade de regiões co-endêmicas para doença de Chagas e leishmanioses, que vem alcançando dimensões globais em decorrência dos processos de migração populacional e mudanças ambientais.

A aplicação de dois testes de princípios distintos para diagnóstico da infecção pelo T. cruzi em Bancos de Sangue, conforme preconizado pelo Ministério da Saúde Brasileiro permitiu a almejada diminuição da transmissão da doença de Chagas por transfusão sanguínea, por outro lado surgiu um novo problema, relacionado com o aumento do número de pacientes com resultados sorológicos inconclusivos ou não-negativos . Sendo assim, um dos maiores problemas na triagem sorológica para doença de Chagas em doadores de sangue é a alta frequência de reações não- negativas ou indeterminadas, o que faz com que muitos indivíduos sadios sejam rotulados como portadores de uma doença grave, além de promover um significativo descarte desnecessário de unidades de sangue nos hemocentros e importantes perdas financeiras para o sistema de saúde.

Em busca na literatura científica, pode-se observar a dificuldade em se eliminar reações cruzadas em análises de imunofluorescência por citometria de fluxo entre tripanosomatídeos quando esta técnica é aplicada para o diagnóstico da infecção por T. cruzi ou para o diagnóstico de alguma espécie de Leishmania sp., não existindo qualquer descrição de diagnóstico das três patologias simultaneamente pela metodologia de imunofluorescência por citometria de fluxo. Desta forma, fica clara a necessidade de uma solução técnica que possibilite a utilização da citometria de fluxo, técnica de alta sensibilidade e especificidade, para o diagnóstico simultâneo de patologias nas quais os anticorpos específicos que devem ser detectados são direcionados a alvos, ou agentes biológicos, morfologicamente semelhantes.

A literatura aponta a tecnologia "Luminex" (Bonetta, L., Flow Cytometry smaller and better. Nature Methods 2(10): 785-795, 2005) que também utiliza um sistema de marcação gradativa com fluorocromos como facilitador para realização de análises múltiplas em uma plataforma única de reação de imunofluorescência por citometria de fluxo. Entretanto, o sistema LUMINEX se diferencia da metodologia triplex por utilizar microesferas marcadas gradativamente com fluorocromos ligadas a anticorpos ou antígenos, não preconizando a marcação gradativa diretamente no agente biológico alvo da reatividade dos anticorpos, como é o caso da metodologia Triplex. Além disso, não se observa ensaios com a metodologia Luminex, utilizando microesferas fluorescentes ligadas a constituintes antigênicos derivados de patógenos, especificamente antígenos excretados ou secretados (ES-Antígenos ) bem como antígenos seletivos da membrana plasmática de patógenos livre de contaminação com antígenos derivados de outros compartimentos celulares, o que pode ser alcançado com a metodologia Triplex. Além disto, na invenção aqui descrita a marcação pode ser feita de forma direta utilizando o parasita completo, de forma que a diversidade antigênica disponível para contribuir para a detecção é maior.

A metodologia triplex possui ainda o potencial de incorporar a modalidade "multiplex" com a inserção de novos alvos antigênicos, permitindo assim a detecção simultânea da reatividade de anticorpos IgGl contra outros patógenos como por exemplo Taquizoitos de Toxoplasma gondii, espiroqueta de Treponema pallidum e mesmo células alvo infectadas com vírus HTLV. Estas representam uma aplicação prática da metodologia triplex em ensaios de triagem em bancos de sangue.

O elevado número de reações não conclusivas reforça a necessidade real e urgente do desenvolvimento de testes sorológicos mais específicos ou de exames confirmatórios práticos e rápidos, passíveis de serem introduzidos nas rotinas dos laboratórios clínicos e nos serviços de hemoterapia, reduzindo o descarte desnecessário de bolsas de sangue e a dificuldade na condução de doadores com reações indeterminadas.

Sumário da Invenção

A presente invenção se refere a um método de diagnóstico por citometria de fluxo para diagnóstico simultâneo de doenças infecto-parasitáriasutilizando marcação fluorescente diferencial de agentes biológicos, tais como células e patógenos de interesse morfologicamente semelhantes, capazes de serem discriminados por marcação diferencial com substâncias fluorescentes. De uma forma geral, o método de diagnóstico consiste em realizar a marcação fluorescente dos agentes com concentrações gradativas de substâncias fluorescentes, e analisar o perfil de reatividade de anticorpos IgGl presentes em soros de pacientes contra os referidos agentes biológicos. A revelação é realizada por anticorpos anti-IgGl conjugados a um fluorocromo que é detectado por canal de fluorescência do citômetro de fluxo distinto daquele aplicado para discriminação dos agentes biológicos alvo dos anticorpos.

Após a marcação dos agentes biológicos, as amostras são analisadas em um citômetro de fluxo. Os agentes biológicos serão discriminados por serem marcados com concentrações gradativas de substância fluorescente, pois assim são identificados diferencialmente mesmo exibindo padrões morfométricos semelhantes. A análise da reatividade de anticorpos é feita inicialmente pela seleção da população de interesse através dos parâmetros tamanho, granulosidade e fluorescência. Posteriormente, é feita a detecção dos anticorpos ligados a cada população de interesse especifica pela leitura da fluorescência emitida pelo sistema de revelação de anticorpos IgGl em canal de fluorescência distinto, o que revela o percentual de alvos fluorescentes positivos. 0 percentual de alvos fluorescentes positivos não deve ultrapassar 2% no controle negativo, de forma que o deslocamento do percentual determina os soros positivos para cada patologia.

Os resultados são avaliados a partir de um algoritmo dessincronizado que permite concluir sobre a reatividade sorológica das amostras. No algoritmo adotado é realizada a pesquisa concomitante de anticorpos IgGl específicos para diferentes agentes biológicos em uma mesma amostra de soro.

0 método proposto pela presente invenção utiliza agentes biológicos que uma vez marcados com diferentes concentrações de fluorocromo, são combinados em plataforma única, possibilitando análise simultânea de diferentes anticorpos em soros de pacientes em um único teste de imunofluorescência, empregando citometria de fluxo como método de segregação da amostra e amplificação dos sinais de fluorescência nas etapas de leitura.

Substâncias fluorescentes de acordo com a presente invenção incluem corantes fluorescentes ou fluorocromos selecionados dentre Alexa-fluor, Isotiocianato de Fluoresceina, Chicago Sky Blue, Rodamina, Ficoeritrina, Alloficocianina .

O método da presente invenção pode ser usado para a diferenciação de uma série de patógenos, assumindo, inclusive uma modalidade Multiplex, incorporando o diagnóstico de outras doenças infecto-parasitárias como toxoplasmose, sífilis, HIV, HTLV-1 e HTLV-2 no mesmo kit onde o usuário poderá selecionar quais agentes serão testados em uma determinada reação, de acordo com a amostra em questão e o tipo de triagem a ser feita.

A presente invenção proporciona ainda um kit de diagnóstico contendo as preparações dos agentes biológicos (no caso exemplificado os parasitos marcados com concentrações gradativas de substância fluorescente) , preparação de anticorpo anti-IgGl humano biotinilado, reagente fluorescente para revelação do anticorpo anti-IgGl humano, amostras de soro de indivíduos controle negativo, amostras de soro de indivíduos controle pool positivo, , uma solução para lavagem das placas e diluição das amostras, uma solução fixadora para preparação para leitura no citômetro de fluxo, placas de 96 poços e adesivos de vedação. [

Em uma modalidade preferida, a invenção apresenta um método para diagnóstico da Doença de Chagas e Leishmanioses . Mais particularmente, a presente invenção se refere a um método para diagnóstico sorológico de Doença de Chagas, Leishmaniose Tegumentar e Leishmaniose Visceral empregando a imunofluorescência por citometria de fluxo. O método da presente invenção consiste na pesquisa simultânea de anticorpos IgGl anti-Leishmania chagasi, anti-Trypanosoma cruzi e anti-Leishmania amazonensis ou Leishmania braziliensis.

O método de diagnóstico por citometria de fluxo da presente invenção é aqui denominado de FC-Triplex-IgGl .

Com o método da presente invenção é possível diagnosticar simultaneamente três patologias através da marcação gradativa dos alvos (patógenos) com corantes fluorescentes. O método da invenção permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente à população mista de tripanosomatídeos e análise do perfil de reatividade de IgGl, através da determinação do PPFP (percentual de parasitas fluorescentes positivos) em relação à fluorescência do marcador empregado no anticorpo anti-IgGl. Para a interpretação dos resultados o método FC- Triplex-IgGl propõe a utilização de um algoritmo dessincronizado para a análise da reatividade sorológica das amostras .

Uma das vantagens da presente invenção é que a partir do método aqui proposto é possível excluir indivíduos portadores de Leishmaniose Visceral e Leishmaniose Tegumentar na triagem sorológica para Doença de Chagas em bancos de sangue e tecidos, em vista da alta frequência de reações não-negativas ou indeterminadas.

Breve Descrição das Figuras

Os aspectos da presente invenção serão agora descritos a título de exemplo com referência aos desenhos que a acompanham, nos quais:

A Figura IA é uma representação esquemática da reação de imunofluorescência indireta por citometria de fluxo, na qual os parasitos são marcados com Isotiocianato de Fluorosceína (FITC) e os anticorpos anti-IgG biotinilados são conjugados ao Alexa Flúor647.

A Figura 1B é uma representação esquemática da sequência de análises dos dados obtidos por citometria de fluxo da reação representada na Figura IA.

A Figura 2A é uma representação esquemática da reação de imunofluorescência indireta por citometria de fluxo, na qual os parasitos são marcados com Isotiocianato de Fluorosceína (FITC) e os anticorpos anti-IgG biotinilados são conjugados ao SAPE.

A Figura 2B é uma representação esquemática da sequência de análises dos dados obtidos por citometria de fluxo da reação representada na Figura 2A.

A Figura 3 mostra o algoritmo do teste sorológico CF- Triplex-IgGl para a detecção de anticorpos IgGl anti-Z. chagasi, anti-T. cruzi e anti-L. amazonensís ou L. braziliensis, simultaneamente. As Figuras 4A e 4B mostram a reatividade de IgGl anti- tripanosomatideos marcados com FITC e revelados com anticorpos anti-IgG conjugados ao SAPE em soros individuais de pacientes portadores de Leishmaniose Visceral (LV) , doença de Chagas (CH) , Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e indivíduos não infectados.

As Figuras 5A e 5B mostram a reatividade de IgGl anti- tripanosomatídeos marcados com Alexa Flúor647 e revelados com anticorpos anti-IgG conjugados ao SAPE em soros individuais de pacientes portadores de Leishmaniose Visceral (LV) , doença de Chagas (CH) , Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e indivíduos não infectados.

As Figuras 6A e 6B mostram a estabilidade fluorimétrica das preparações de tripanosomatídeos ((T. cruzi, L. chagasi, L. amazonensis (ou L. brasiliensis ) ) marcados com sistema FITC e armazenados durante 1 ano em temperatura ambiente, 4°C e -20°C isoladamente ou em forma de mistura de parasitos.

As Figuras 7A e 7B mostram a estabilidade fluorimétrica das preparações de tripanosomatídeos ((T. cruzi, L. chagasi, L. amazonensis (ou L. brasiliensis) ) marcados com sistema ALEXA FLUOR 647 e armazenados durante 1 ano em temperatura ambiente, 4°C e -20°C isoladamente ou em forma de mistura de parasitos.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção se refere a um método de diagnóstico para a pesquisa simultânea de anticorpos IgGl anti-Trypanosoma cruzi, anti-Leishmania chagasi e anti- Leishmania amazonensis (ou Leishmania braziliensis) em plataforma única, por citometria de fluxo, aqui denominado Metodologia Triplex (FC-Triplex-IgGl) .

O método para diagnóstico diferencial da presente invenção consiste em método de imunofluorescência por citometria de fluxo empregando marcação gradativa e diferencial de agentes biológicos com substâncias fluorescentes compreendendo as seguintes etapas:

(a) marcação diferencial dos agentes biológicos com concentrações gradativas de substância fluorescente;

(b) preparo de uma suspensão mista dos agentes biológicos marcados na etapa anterior (a)

(c) incubação da suspensão mista dos agentes biológicos com diluições seriadas de soro humano inativado;

(d) incubação da suspensão obtida na etapa (c) com anticorpo anti-IgGl humano conjugado com biotina, na presença de estreptoavidina conjugada com substância fluorescente;

(e) incubação dos agentes biológicos obtidos na etapa (d) com solução fixadora para citometria;

(f) obtenção dos parâmetros tamanho, granulosidade e fluorescências durante análise das amostras dos agentes biológicos em equipamento de citometria de fluxo;

(g) análise do perfil de reatividade de IgGl, pela determinação do percentual de agentes biológicos fluorescentes positivos (PPFP) em relação à fluorescência do marcador empregado no anticorpo anti-IgGl; e,

(h) análise dos resultados empregando um algoritmo dessincronizado para a análise da reatividade sorológica dos soros em relação aos agentes biológicos. Em uma modalidade especifica, o método da invenção consiste numa reação de imunofluorescência indireta, por citometria de fluxo, realizada em uma suspensão líquida, que emprega em plataforma única formas epimastigotas do T. cruzi, formas promastigotas de L. chagasi e formas promastigotas L. amazonensis ou L. braziliensis, previamente fixadas e marcadas com concentrações gradativas do fluorocromo isotiocianato de fluoresceína - FITC (FL-1) ou do fluorocromo Alexa flúor647 (FL-4), para pesquisa simultânea de anticorpos IgGl anti-T. cruzi, anti- L. chagasi e anti- L. amazonensis ou L. braziliensis.

A invenção será agora descrita a partir de exemplos, os quais não devem ser considerados limitativos do seu escopo .

Exemplo 1 - Preparação das Amostras

População do estudo. Para o estabelecimento e padronização da metodologia CF-Triplex-IgGl foram utilizadas 80 amostras de soros pertencentes à soroteca do CPqRR/FIOCRUZ . As amostras de soros foram organizadas em quatro grupos: o grupo Pool NI foi constituído por uma mistura de 20 amostras de soros de indivíduos saudáveis, o grupo Pool CH por uma mistura de 20 soros de portadores de doença de Chagas, o grupo Pool LTA por uma mistura de 20 soros de portadores de Leishmaniose Tegumentar Americana e o grupo Pool LV constituído por uma mistura de 20 portadores de Leishmaniose Visceral.

Coleta e processamento das amostras. As amostras de soros foram inativadas a 56°C por 30 min e centrifugadas a 14.000 rpm, a 4°C durante 5 min para a remoção de partículas. Após centrifugação, o sobrenadante foi aliquotado e estocado a - 20°C até sua utilização nos ensaios de citometria de fluxo. No momento do uso, as amostras foram descongeladas, diluídas em solução salina tamponada com fosfato-PBS suplementado com 3% de soro fetal bovino (SBF - Sigma Co. USA) centrifugadas a 4°C, 14.000 rpm por 5 min e os sobrenadantes utilizados na citometria de fluxo (Cordeiro et al. , 2001) .

Cultivo das formas epimastigo as de Trypanosoma cruzi. As formas epimastigotas do T. cruzi foram obtidas a partir de cultura em meio liquido complexo liver infusion tryptose (LIT) e incubadas em estufa BOD (modelo 347) a temperatura de 28° C ± 1°C. A cada sete dias de cultivo foi realizado um repique de 1,0 x 106 parasitos/mL, e a cultura mantida em sucessivas passagens em meio LIT.

Cultivo das formas promastigotas de Leishmanla. amazonensis (ou Leishmanla brasiliensis) e Leishmanla chagas! . As formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) e L. chagasi foram obtidas a partir de cultura em meio ágar sangue, Novy-MacNeal-Nicolle associado ao meio LIT (NNN- LIT) e incubadas em estufa BOD (modelo 347) ± 1°C. A cada dois dias de cultivo foi realizado um repique de 5,0 x 106 parasitos/mL para o meio NNN-LIT ou para o meio NNN associado ao meio M199 (NNN- M199) . A cultura foi mantida em sucessivas passagens em meio NNN-LIT ou NNN-M199.

Preparo das formas epimastigotas de T. cruzi e das formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) e L. chagasi para os ensaios de imunofluorescência por citometria de fluxo. As formas epimastigotas de T.cruzi com sete dias de cultivo em meio LIT (Vitelli, 2007) e as formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) e L. chagasi com dois dias de cultivo em meio NNN-M199 foram transferidas separadamente para três tubos de polipropileno de 50mL (Falcon®) e homogeneizados em vórtex a baixa rotação (rotação 3) para desfazer os grumos. Em seguida, as suspensões foram submetidas a uma centrifugação diferencial (25°C, 200rpm por 10 minutos) para remoção de eritrócitos e parasitos mortos no sedimento. Para recuperação dos parasitos no sobrenadante, estes foram deixados em repouso por 30 minutos em temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram transferidos para outros tubo de polipropileno de 50mL e o sedimento foi desprezado. Em seguida, os parasitos foram lavados em PBS, por duas vezes, centrifugação a 4°C, 2500 rpm por 10 minutos. Os sobrenadantes foram desprezados e os sedimentos formados foram homogeneizados cuidadosamente e ressuspendidos em PBS. As suspensões de formas epimastigotas de T. cruzi e as formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) e L. chagasi foram ajustadas para 1,0 x 107 parasitos/mL em PBS e fixados em uma solução fixadora Macs Facs Fix (MFF) . Marcação diferencial das formas epimastigotas de T. cruzi e das formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) com isotiocianato de fluoresceina (FITC) . As suspensões de 1,0 x 107 parasitos/mL de epimastigotas de T. cruzi e de 1,0 x 107 parasitos/mL de promastigotas de L. amazonensis (ou L. brasiliensis) em PBS foram incubadas com diferentes concentrações de isotiocianato de fluoresceina- FITC (100μg/mL a 0,^g/mL) por 30 minutos, a 37°C, ao abrigo da luz. Após incubação os parasitos foram lavados PBS por centrifugação (4°C, 2.500rpm, lOmin) e incubados com PBS 10%SFB, por 30 minutos, a temperatura ambiente, para fixação do fluorocromo às proteínas dos tripanosomatídeos . Após incubação os parasitos foram lavados PBS por centrifugação (4°C, 2.500rpm, lOmin) . Os sobrenadantes foram desprezados e os sedimentos formados foram homogeneizados cuidadosamente e ressuspendidos em PBS. Ao final das etapas de lavagem, as formas epimastigotas e as formas promastigotas foram ajustadas para uma suspensão 5,0 x 10 ^b parasitos/mL em PBS 3% SFB para ensaios no citomêtro de fluxo.

Exemplo 2- Estudos de anticorpos IgGl anti-suspensão mista de tripanosomatídeos fluorescentes pela Citometria de Fluxo

Para realização da reação de imunofluorescência indireta, por citometria de fluxo, uma suspensão mista, preparada conforme o Exemplo 1, com 50 L tripanosomatídeos constituída por formas promastigotas de L. chagasi, formas epimastigotas de T. cruzi e formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. braziliensis ) são incubadas com 50 L soro humano inativado, nas diluições 1:250 a 1:32.000 em PBS 3%SFB, por 30 minutos, a 37°C, ao abrigo da luz. Após incubação com o soro, os parasitos foram lavados duas vezes com 150 L de PBS 3% de SFB por centrifugação a 18 °C, 2.200rpm, lOmin, e o sobrenadante desprezado. Para revelação da ligação de IgGl na superfície dos parasitos, procede-se a incubação, por 30 minutos, 37°C, ao abrigo da luz, na presença de 50\iL de anticorpo monoclonal anti-IgGl humano conjugado com biotina, na diluição 1:6.400 em PBS-3% SFB na presença de 20 L de estreptoavidina conjugada ao Alexa flúor647, na diluição 1:1000 em PBS 3% SFB ou estreptoavidina conjugada a ficoeritrina (SAPE) , na diluição 1:400 em PBS 3% SFB - Figuras IA e 2A, respectivamente. Após a incubação os parasitos são novamente lavados duas vezes com 150μΙ de PBS-3% SBF por centrifugação a 18 °C, 2.200rpm, lOmin, e o sobrenadante desprezado. Os parasitos são então ressuspendidos com 200pL de solução fixadora para citometria - MFF e as amostras são mantidas a 4°C, ao abrigo da luz, até o momento da leitura no citômetro de fluxo (FACScalibur-Becton Dickinson) . O tempo máximo para a aquisição dos dados é de no máximo de 24 horas - Figura IA e 2A.

Para a análise dos dados, o primeiro desafio foi o estabelecimento de um sistema de análise seletiva das formas epimastigotas de T. cruzi e das formas promastigotas de Leishmania spp. A similaridade dos aspectos morfométricos dos tripanosomatideos, impediam sua seleção adequada, empregando por citometria de fluxo, apenas parâmetros de tamanho e granulosidade. Diante deste desafio, a solução proposta consistiu na utilização de um sistema de marcação gradativa de cada população de parasitos com fluorescência 1 (FL- 1) empregando isotiocianato de fluoresceina - FITC ou fluorescência 4 (FL- 4) empregando Alexa Flúor647, o que permitiu a discriminação de cada população de tripanosomatideos, que era distinta do sistema de fluorescência empregada para revelação da reatividade sorológica de IgGl após incubação dos parasitos com o soro humano. Conforme já descrito, para a avaliação da reatividade sorológica de IgGl anti- tripanosomatídeos, foram empregados os sistemas de revelação com estreptoavidina conjugada com Alexa Flúor647 (FL-4) ou com SAPE (FL-2), respectivamente - Figura 1 A e 2A.

Os tripanosomatídeos marcados com concentrações gradativas de fluorocromos , quando combinados em plataforma única apresentam em gráficos de tamanho versus granulosidade, uma distribuição característica e homogénea, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente à população mista de tripanosomatídeos de interesse (Rl) - Figura 1B e 2B.

Para avaliação dos parasitos marcados com FITC (FL-1) , utilizando gráficos dot plot de FL1 versus FL-4, os parasitos que não emitem FL-1 correspondem às formas promastigotas de L. chagasi, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R2). Os parasitos que apresentam baixa intensidade de fluorescência correspondem às formas epimastigotas de T. cruzi, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R3) . Por fim, os parasitos que apresentam alta intensidade de fluorescência corresponderam às formas promastigotas de L. amazonensis, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R4) - Figura 1B.

Os resultados das análises de FL-4 apresentados pelos tripanosomatídeos após incubação com os soros foram expressos sob a forma de percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) observados para cada teste individual com cada espécie de tripanosomatideos - L. chagasi, T. cruzi e L. amazonensis (ou L. brasiliensis) - em relação ao controle do conjugado. O PPFP foi determinado para cada amostra através do estabelecimento de um limiar de negatividade em função da curva de fluorescência obtida para o controle da ligação inespecifica do conjugado (Ml) para cada população de parasito selecionado. Para cada experimento foi estabelecido um limiar de reatividade de no máximo 2% de PPFP para o controle interno da reação (controle do conjugado) - Figura 1B.

Em seguida, empregando o mesmo marcador foram obtidos os valores de PPFP para amostra de soro avaliada. Para cada conjunto de ensaios, um novo marcador foi posicionado empregando o controle do conjugado daquele experimento. Esse tipo de parâmetro oferece algumas vantagens, como facilidade e rapidez para obtenção dos resultados e sua reprodutibilidade no que se referem a dados obtidos em análises inter laboratoriais ou em análises realizadas repetidas vezes - Figura 1B.

Para avaliação dos parasitos marcados com Alexa Flúor647 (FL-4), utilizando gráficos dot plot de FL-4 versus FL-2, os parasitos que não emitem FL-4 correspondem às formas promastigotas de L. chagasi, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R2). Os parasitos que apresentam baixa intensidade de fluorescência 4 correspondem às formas epimastigotas de T. cruzi, o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R3) . Por fim, os parasitos que apresentam alta intensidade de fluorescência 4 correspondem às formas promastigotas de L. amazonensis (ou L. braziliensis ) , o que permite o posicionamento de um marcador sobre a região correspondente a esta população (R4) - Figura 2B.

Os resultados das análises de FL-2 apresentados pelos tripanosomatideos após incubação com os soros foram expressos sob a forma de percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) observados para cada teste individual com cada espécie de tripanosomatideos - L. chagasi, T. cruzi e L. amazonensis (ou L. braziliensis) - em relação ao controle do conjugado. O PPFP foi determinado para cada amostra através do estabelecimento de um limiar de negatividade em função da curva de fluorescência obtida para o controle da ligação inespecifica do conjugado (Ml) para cada população de parasito selecionado. Para cada experimento foi estabelecido um limiar de reatividade de no máximo 2% de PPFP para o controle interno da reação (controle do conjugado) - Figura 2B.

Em seguida, empregando o mesmo marcador foram obtidos os valores de PPFP para amostra de soro avaliada. Para cada conjunto de ensaios, um novo marcador foi posicionado empregando o controle do conjugado daquele experimento. Esse tipo de parâmetro oferece algumas vantagens, como facilidade e rapidez para obtenção dos resultados e sua reprodutibilidade no que se referem a dados obtidos em análises inter laboratoriais ou em análises realizadas repetidas vezes - Figura 2B.

Para a interpretação dos resultados a FC-Triplex-IgGl propõe a utilização de um algoritmo dessincronizado para a análise da reatividade sorológica das amostras testadas com o objetivo de eliminar a reatividade cruzada no diagnóstico diferencial da doença de Chagas, leishmaniose tegumentar e leishmaniose visceral. No algoritmo adotado é realizada a pesquisa concomitante de anticorpos IgGl anti-L. chagasi, anti-T.cruzi e anti- L. amazonensis ou L. braziliensis em uma mesma amostra de soro. A interpretação segue alguns critérios que são descritos a seguir:

A primeira avaliação consiste na análise da reatividade de IgGl anti-L. chagasi na diluição do soro 1:32.000. Considerando o ponto de corte de PPFP=60%, dado um valor de PPFP≥60%, o resultado é considerado positivo para leishmaniose visceral. Dado um valor de PPFP<60%, o resultado é considerado negativo e segue-se para o próximo passo .

A segunda avaliação consiste na análise da reatividade de IgGl anti-T. cruzi na diluição do soro 1:2.000. Considerando o ponto de corte de PPFP=50%, dado um valor de PPFP≥50%, o resultado é considerado positivo para doença de chagas. Dado um valor de PPFP<50%, o resultado é considerado negativo e segue-se para o próximo passo.

A terceira avaliação consiste na análise da reatividade de IgGl anti-L. amazonensis (ou L. braziliensis) na diluição do soro 1:1.000. Considerando o ponto de corte de PPFP=60%, dado um valor de PPFP>60%, o resultado é considerado positivo para leishmaniose tegumentar. Dado um valor de PPFP<60%, o resultado é considerado negativo, o soro é classificado como não reativo para os tripanosomatideos e, portanto, o indivíduo não está infectado (Figura 3) .

A Tabela 1 apresenta os possíveis resultados das análises de fluorescência, expressos em PPFP, apresentados pelos tripanosomatídeos ( (L. chagasi, T. cruzi e L. amazonensis (ou L. braziliensis) ) considerando os pontos de corte de PPFP=60%, PPFP=50% e PPFP=60%, respectivamente, após incubação com o soro de paciente portador de LV, de paciente portador de DC, portador de LTA e indivíduo NI.

Tabela 1: Resultados possíveis da reatividade de IgGl anti- tripanosomatídeos em soros de pacientes LV (Leishmaniose Visceral), DC (Doença de Chagas), LTA (Leishmaniose

Tegumentar Americana) e NI (Não-Infectado) .

onde :

(+) representa resultado positivo da reatividade de IgGl (-) representa resultado negativo da reatividade de IgGl

(+/-) representa resultado positivo ou negativo da reatividade de IgGl

Os resultados, repetidos e confirmados, aplicando-se um sistema Triplex realizado com tripanossomatídeos marcados com concentrações gradativas de FITC (FL-1) e um sistema de revelação da reatividade de IgGl anti- tripanosomatídeos com Alexa Fúor647 (FL-4), mostraram um excelente desempenho para o diagnóstico sorológico diferencial da doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar. Utilizando-se 77 amostras de soros incluídas amostras de indivíduos controles negativo e de pacientes portadores de doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar, foi possível identificar o alto desempenho da metodologia, com 96,1% (74/77) e 94,7% (73/76) resultados corretos . No primeiro lote de parasitos de um total de 77 amostras testadas foram observados três resultados falso-negativos para leishmaniose tegumentar - Figura 4A. No segundo lote de parasitos de um total de 76 amostras testadas foram observados três resultados falso-negativos para leishmaniose tegumentar e um resultado falso-negativo de um indivíduo não infectado- Figura 4B.

Os resultados, repetidos e confirmados, aplicando-se um sistema Triplex realizado com tripanossomatídeos marcados com concentrações gradativas de Alexa Fúor647 (FL- 4) e um sistema de revelação da reatividade de IgGl anti- tripanosomatídeos com SAPE (FL-2), também mostraram um excelente desempenho para o diagnóstico sorológico diferencial da doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar. Utilizando-se 77 amostras de soros incluídas amostras de indivíduos controles negativo e de pacientes portadores de doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar, foi possível identificar o alto desempenho da metodologia, com 98,7% (75/76) de resultados corretos, no primeiro e no segundo lote de parasitos -Figuras 5A e BDe um total de 77 amostras testadas foi observado um resultado falso-negativo para doença de Chagas- Figuras 5A e B.

Exemplo 3- Estabilidade dos reagentes

A finalidade do Exemplo 3 foi confirmar a estabilidade da marcação dos parasitos com AlexaFlour-647 e com FITC durante um período de 12 meses e em três condições de armazenamento (temperatura ambiente, 4°C, -20°C) . Para a realização desses testes, os parasitos previamente marcados com os fluorocromos AlexaFlour-647 e FITC foram armazenados nas três temperaturas acima descritas por um período de 12 meses. A cada mês após o início do armazenamento, os parasitos foram levados ao citômetro de fluxo para a verificação da fluorescência. Além disso, a cada três meses foram realizadas sorologias com os parasitos armazenados em cada temperatura. Os resultados mostram que o perfil fluorimétrico de marcação com FITC foi estável nas 3 condições de armazenamento testadas (TA, 4°C e -20°C, sendo o melhor perfil obtido com parasitos armazenados a -20°C como mostrado na Figura 6A. O perfil fluorimétrico não possui estabilidade quando as preparações de parasitos são armazenadas em mistura preestabelecida em nenhuma das 3 condições de armazenamento testadas (TA, 4°C e -20°C) como mostrado na Figura 6B. Os resultados mostram que o perfil fluorimétrico de marcação com ALEXA FLUOR 647 foi estável nas 3 condições de armazenamento testadas (TA, 4°C e -20°C, sendo o melhor perfil obtido com parasitos armazenados a -20°C como mostrado na Figura 7A. O perfil fluorimétrico possui boa estabilidade, quando as preparações de parasitos são armazenadas em mistura pré- estabelecida apenas na condição de armazenamento a -20°C, havendo grande sobreposição na condição de armazenamento a TA como mostrado na Figura 7B.

Desta forma, a análise dos resultados da presente invenção mostra que o método da presente invenção (FC- Triplex-IgGl é uma nova ferramenta complementar aplicável ao diagnóstico sorológico diferencial da doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar.

Os inventores observaram uma melhor estabilidade da suspensão de parasitos armazenados isoladamente sob armazenamento a -20°C.

Desta forma, a presente invenção alcançou um de seus objetivos principais que é o diagnóstico sorológico diferencial de amostras de pacientes portadores de diferentes doenças infecciosas.