Doxaminol enthaltendes Arzneimittel zur Beeinflussung der Blutrheologie.

Doxaminol _/ dessen chemische Bezeichnung N- ethyl-N-/2- (6,11 )-dihydrodibenz/b,§7oxeρin-11-yl)ethyl7-1-amino-3- phenoxy-propanol- (2) lautet, ist eine bekannte Substanz, die auf die ß-Rezeptoren wirkt und das Herzzeitvolumen erhöht. Sie ist Gegenstand der DE-PS 23 35 943. Struktur¬ analoge Verbindungen mit den gleichen Eigenschaften sind in der DE-PS 1 568 145 beschrieben, wobei auch aufgeführt ist, daß die angegebene Wirkung durch eine Entleerung venöser Blutspeicher zustande kommt.

Dies ist eine Wirkung, die für die Behandlung der Hypotonie (niedriger Blutdruck) und orthostatischer Beschwerden (insbe- sondere Blutdruckabfall bei Übergang aus der horizontalen in die vertikale Position) genutzt werden kann.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Doxaminol die Rheologie (Fließeigenschaften) des Blutes beeinflußt. Dies hat zur Folge,- daß zu der oben genannten Indikation der orthostatischen Beschwerden bzw. Hypotonie die Indikationen, akute und chronische, periphere, koronare und cerebrale Durchblutungsstörungen hinzukommen.

Ausserdem kommt hinzu, daß Doxaminol aufgrund von Unter¬ suchungen zur Behandlung weiterer Krankheitsbilder, die mit einer Herabsetzung der Fließeigenschaften des Blutes verbun¬ den sind, geeignet ist. Hierzu gehören die Polycytemia vera, aber auch die coronare Herzerkrankung, insbesondere dann,

1 wenn die Fließeigenschaften des Blutes z.B. aufgrund einer verringerten Erythrozytenverformbarkeit bzw. einer erhöhten Plasmaviskosität verschlechtert sind.

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Versuchsbericht

Bei einer Reihe von Erkrankungen, insbesondere bei peripheren und cerebralen Durchblutungsstörungen, sind die Fließeigen-

10 Schäften des Blutes verschlechtert. Dies gilt vor allem für d Verformbarkeit der Erythrozyten. Da für die Passage der Erythrozyten durch das Kapillarsystem eine gute Verformbar¬ keit Voraussetzung ist, kommt es bei Durchblutungsstörungen aufgrund der verschlechterten Verformbarkeit und des zudem

15 wegen der Durchblutungsstörung verminderten Perfusionsdrucks einer starken Herabsetzung der Sauerstoffversorgung des Ge¬ webes. Es ist daher ein wichtiges Ziel der Behandlung solcher Erkrankungen, Substanzen zu suchen, die die Verformbarkeit der Erythrozyten verbessern.

20

Die Verformbarkeit der Erythrozyten wird heute üblicherweise in sogenannten Filtrationstests gemessen. Dabei wird eine Suspension von Erythrozyten durch ein Filter geschickt, das Poren besitzt, die einen Durchmesser haben, der dem kleiner

25 Kapillaren entspricht. Eine Substanz, die die Verformbarkeit der Erythrozyten verbessert, muß auch gleichzeitig die Passag der Erythrozyten durch diese Filterporen und damit die Fil- trierbarkeit der Erythrozytensusperision erhöhen.

30 in einem Versuchsmodell wurde nun untersucht, inwieweit

Doxaminol und auch WW 241, die aus der DE-PS 15 68 145 be¬ kannte N-Methyl-freie Doxaminol-Verbindung, in Suspensionen von Humanerythrozyten die Verformbarkeit verändern. Die Humanerythrozyten stammen von Patienten mit peripheren und r-~~ cerebralen Durchblutungsstörungen.

Methode :

Patienten einer Angiologischen Klinik mit gesicherter peri- pherer bzw. cerebraler Durchblutungsstörung wurde im Rahmen der ohnehin für die Routineuntersuchung durchzuführenden

Blutabnahme zusätzlich 20 ml Blut/Patient für die Untersuchun auf Erythrozytenverformbarke.it abgenommen. Durch Vorlage von Heparin wurde eine Gerinnung des Blutes verhindert. Spät¬ estens 2 h nach der Abnahme wurde das Blut zentrifugiert, die Erythrozyten wurden mit einer isotonen Pufferlösung zwei¬ mal gewaschen und dann in dieser Pufferlösung suspendiert. Dabei wurde ein Hämatokrit von 3 % eingestellt. Diese Suspen¬ sion wurde in mehreren Proben aufgeteilt, diese Proben wurden dann entweder eine der beiden oben genannten Substanzen zugef oder in der Kontrolle nur das Lösungsmittel für diese Substan zen. Nach _< einer 30minütigen Inkubation bei 37°C wurden die Proben in einer speziellen Einheit filtriert. Die Filtration erfolgte durch sogenannte Nukleoporefilter, deren Porenweite einheitlich 5 mcm beträgt. Gemessen wurde die durch das Filte hindurchgelaufene Suspensionsmenge als Funktion der Zeit. Aus diesen Daten wird eine sogenannte Flußkonstante berechnet. Di Flußkonstante gibt im Prinzip die Geschwindigkeit des Erythro zytenflusses durch das Nukleoporefilter während der ersten Phase der Filtration an. Sinddie Erythrozyten schlechter ver- formbar, so hat diese Flußkonstante einen kleineren Zahlenwer Im Extremfall wird diese Flußkonstante 0, dies erhalten wir z.B. dann, wenn die Verformbarkeit der Erythrozyten total auf gehoben wird, etwa durch Einwirken hoher Konzentrationen von Milchsäure.

Die Untersuchungen wurden an 10 Blutproben von 10 verschieden

Patienten durchgeführt. Doxaminol und WW 241 wurden in den Konzentrationen 10 —7 und 10—6 mol/1 getestet. Diese Konzen¬ trationen entsprechen in etwa den Konzentrationen, die im Blut nach therapeutischen Dosen von diesen beiden Substanzen zu erwarten sind.

Tabelle 1

Kontrolle Doxaminol Doxaminol WW 241 WW 241 Kontroll Patientenblut 10~ ⁷ mol/1 10 ^~6 mol/1 1θ ^"7 mol/1 1θ ^"6 mol/1 Blut von

16,5 + 4,1 19,2 + 3,7 20,0 + 2,8 16,3 + 5,0 17,1 + 4,3 21,2 +

Einfluß von Doxaminol und WW 241 auf die Flußkonstante von Erythrozytensuspensionen

Angegeben sind Mittelwerte + Standardabweichung aus n = 10 Versuchen

WW 241 = ^N - 2- ⁽ 6,11 ⁾ - ^d ihydrodibenz/b,e7oxepin-11-yl)ethyl7-1-amino-3-phenoxy -propanol-(2)

bedeutet signifikanter Unterschied (p<0,05) gegenüber der Kontrolle Patientenblut

Ergebnisse:

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt. Man er-

—6 —7 kennt, daß die Flußkonstante sowohl durch 10 als auch 10 m Doxaminol erniedrigt wurde. Test auf Signifikans mit Hilfe des Wilcoxon-Paartestes ergab, daß die Effekte statistisch signifi kant sind. Dagegen führte W _ 241 zu keiner statistisch signi¬ fikanten Beeinflussung der Flußkonstanten. Interessant ist auc ein Vergleich der für Patientenblut erhaltenen Flußkonstanten mit der Flußkonstanten, die wir in einer Versuchsreihe er¬ hielten, die mit Blut von gesunden freiwilligen Spendern durch geführt wurde. Die Flußkonstante ist bei Verwendung von Pa¬ tientenblut signifikant niedriger als bei Verwendung von Pro¬ bandenblut. Dies bestätigt einmal mehr die bereits in der Li- teratur zitierten Befunde, wonach Patientenblut verringerte Erythrozytenverformbarkeiten hat. Doxaminol verändert die Filtrierbarkeit des Patientenbiutes so, daß dieses sich an¬ nähernd so verhält, wie das Blut gesunder Personen.

In einer anderen Untersuchung, die an Patienten durchgeführt wurde, wurde Doxaminol mit einem Placebo verglichen, um den Einfluß auf die Fließeigenschaften des Blutes zu beobachten.

Versuchsbeschreibung

10 Patienten mit Blut, dessen Viskosität erhöht war, und einer verminderten Filtrierbarkeit des Blutes, wurden ausgewählt. 50 mg Doxaminol sowie Placebo wurden per os den 10 Patienten in einem Doppelblindversuch appliziert. Die Patienten nahmen das Arzneimittel bzw. das Placebo am Morgen. Blutproben wurden 30, 60 und 90 Minuten nach Einnahme der Mittel aus den Armvene entnommen.

Die Blutproben wurden mit K -EDTA 10 % (2 mg/ml Blut) unge¬ rinnbar gemacht und die Gesamtblutviskosität und Filtrierbar¬ keit gemessen.

Die Gesamtblutviskosität wurde mit einem Kegel-Platte- 1 /4 LVT Microviscometer (Well Brookfield) bei 450 , 225 ,

- 1

90 und 45 sec Schergrad bei 37°C bestimmt.

Die Filtrierbarkeit des Blutes wurde mittels einer Filtrations¬ methode durch Nucleopore-Me brane (13 mm) mit 5 μm Poren bei einem Unterdruck von 20 cm H ₂ 0 und 37°C bestimmt.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse nach Placebo-Gabe sind in Tabelle 2, die nach Gabe von Doxaminol in Tabelle 3 aufgeführt.

60 Minuten nach Einnahme von 50 mg Doxaminol wurde eine signifikante Verbesserung der Filtrierbarkeit des Blutes er¬ reicht:. Nach 90 Minuten war der Effekt noch weiter ausgepräg

Zu den gleichen Zeitpunkten wurde eine signifikante Abnahme der Blutviskosität beobachtet, die bei niedrigstem Schergrad (45- sec ) ermittelt wurde.

Klinische Studien mit 100 mg Doxaminol zeigten einen noch stärkeren Effekt als 50 mg.

Tabelle 2

Ausgangswert 30' »t« 60 't« 90 »t»

Filtrierbarkeit 0.328+0.009 0.328+0.0031.3S 0.328+0.009 2.04 0.328+0.009 2.13

<V>

Hämatokrit 39.6+1.19 39.5+1.18 1.00 39.5±1.18 1.5 3V.5±1.13 1.15

( %)

Viskosität 450s ^"1 3.79+0.06 3.79+0.07 0.25 3.77+0.06 1.28 3.7 ±0.07 0.23 250 3.98+0.07 3.99+0.08 0.49 3.97±0.08 0.72 3.99+0.07 0.22

( ?s ) 90 4.38+0.09 4.38+0/10 0.04 4.35±0.12 0.75 4.33+0.11 1.42 45 4.78+0.12 4.80+0.14 0.66 4.77+0.13 0.16 4.75+0.12 0.68

t : Prüfgröße des t-Testes für gepaarte Daten (Test auf statische

Signifikanz)

Tabelle 3

Ausgangswert 30 ^! 't' 60« « 90' •t

Filtrierbarkeit 0.337±0.θ8 0.356+0.01 2.16 0.360+0.01 2.34 0.36S^0.0ι 3.84

< ^V DC>

Hämatokrit 39.7+1.20 39.3+1.35 0.87 39.2+1.39 1.16 39.3+1.14 0.96

Viskosität 450s ^""1 3.78+0.06 3.77+0.07 0.79 3.77+0,07 O.76 3.73±0.07 2.82

(cPs) 225 3.98+0.07 3.99±0.07 0.47 3.97+0.08 0.34 3.94±0.08 2.15

90 4.34+0.10 4.36+0.11 O.63 4.30+0.10 1.15 4.26+0.10 2.95

4 4.7I+O.I.3 4.72+0.15 0.28 4.65+0.14 1.17 4.58+0.14 2.20

tt =z P<o.θ5 = p<0.01

- y -

In-vivo Untersuchung zur antiischämischen Wirkung

Versuchsdurchführung

Klinische Untersuchungen, die besonders von EHRLY ausgeführt wurden, zeigen, daß bei Patienten mit peri- pherer arterieller Verschlußkrankheit der Gewebe-Sauer¬ stoff-Partialdruck als Ausdruck der nutritiven Durchblu¬ tung im ischämischen Muskel, verglichen mit einer gesun¬ den Extre ität, herabgesetzt ist. Für die Untersuchung von Substanzen auf antiischämische Wirkung ist es des¬ halb sehr vorteilhaft, ein Tiermodell zu verwenden, bei dem analog zur klinischen Situation eine Ischämie durch einen herabgesetzten Sauerstoff-Partialdruck signali¬ siert wird. Ein solches Tiermodell kann man durch eine Ligatur an der A. femoralis der Ratte erhalten. Aufgrund von Untersuchungen von Substanzen, von denen bekannt ist, daß sie klinisch wirksam sind (Verlängerung der schmerzfreien Gehstrecke), ist bekannt, daß die Verbes¬ serung der Durchblutung in der Mikrozirkulation bei diesem Tiermodell ebenso wie in der Klinik durch einen Anstieg des Gewebe-Sauersto -Partialdruckes angezeigt wird. Daraus läßt sich ableiten, daß das Tiermodell für Substanzuntersuchungen als sehr geeignet einzustufen ist. Es wurde daher verwendet, um herauszufinden, ob BM 10.188 im ischämischen Gewebe eine Verbeserung der Gewebeperfusion bewirkt.

Methode

Bei 6 Ratten (Gewicht 450-550 g) wurde in kurzzeitiger Penthrane-Narkose auf der rechten Seite die A. femoralis zweifach ligiert. Anschließend wurde der Hautschnitt wie¬ der vernäht. Das gleiche geschah an 5 weiteren Ratten, die als Kontrolltiere dienten. Alle Tiere erholten sich problemlos von diesem Eingriff. Ab dem nächsten Morgen erhielten die Ratten der Substanzgruppe 2 x täglich

4 mg/kg BM 10.188 p.o. (Chargen-Nr. 809002 A), in

5 ml/kg 1 % Methylzellulose suspendiert, über einen

Zeitraum von 5 Tagen. Bei den Kontrolltieren wurde das gleiche Volumen, jedoch ohne Substanz, appliziert. An dem auf die letzte Substanzgabe folgenden Tag wurden jeweils alle Tiere einer Gruppe der Sauerstoff-Partial- druck essung unterzogen. Dabei erhielten die Ratten zur

Narkose je nach Größe 1,3-2 ml 5 % Thiobutabarbital

Γ Ό ~\ (Inaktin ). Dann wurde auf beiden Seiten der M. gastrocnemicus freigelegt und die Fascie sehr vorsichtig entfernt. Anschließend wurde auf den Muskel die Mehr- drahtoberflächenelektrode nach KESSLER, LÜBBERS ^2,3

(Bezugsquelle Fa. Eschweiler, Kiel) aufgesetzt.

Die Sauerstoffpartialdruckkurven, die von jedem einzelnen der 8 Drähte einer Elektrode registriert werden, kommen auf dem Monitor eines Com¬ puters zur Darstellung (Hard- und Software: Fa. Bruins Instruments, München). Für die Auswertung der dabei anfallenden Daten wurde die sogenannte Integral¬ methode verwendet. Darunter versteht man die Mittelung des Integrals unter jeder einzelnen der 8 Sauerstoff- partialdruckkurven über einen bestimmten, frei wählbaren Zeitraum. In unseren Versuchen betrug dieser 30 Minuten.

Neben dem Gewebe-Sauersto -Partialdruck wurde außerdem der Blutdruck (Dehnungsmeßstreifenaufnehmer von der Fa. Bell und Howell, Pasadena/Kalifornien) und die Herzfrequenz (Pulsfrequenzmeßgerät PFM 2 Mino, Fa. Michael Nowak, Berlin) mittels eines Katheters in der Carotis gemessen. Am Anfang und am Ende eines jeden Ver¬ suches wurde außerdem der arterielle pO-, pH und pC0 ₂ bestimmt. Um die Konstanz des Sauerstoffangebotes zu gewährleisten, wurden die Tiere beatmet (Ate fre- quenz = 55/min, P _{exspiratorisch} - ₂ ^~ 18 Vol.% und

^P exspiratorisch ^C0 2 ^{etwa 5 Vol>%} > registriert vom Atemgasanalysator Engström Eliza Duo, Schweden). Blut- durck, Herzfrequenz und P _β „ _C7 -, C0 ₇ wurden auf einem 4-Kanal-Schreiber der Fa. Schwarzer, München (Physio- polygraph Varioscript) , kontinuierlich registriert. Pro Tier dauerte ein solches Experiment etwa 1 Stunde.

Resultate

Aus Tab. 1 geht hervor, daß sich in der Kontrollgruppe die mittleren Gewebe-Sauerstoff-Partialdrucke in der linken und der rechten Wade signifikant unterscheiden. Man erkennt außerdem, daß unter dem Einfluß von BM 10.188 die mittleren pO^-Werte auf der ligierten Seite um etwa 4 mm Hg zunehmen, während am anderen, nicht ligierten Bein, eine Abnahme von etwa 12 mm Hg zu verzeichnen ist. Dies führt dazu, daß der signifikante Links-Rechts-Unterschied so deutlich verringert wird, daß statistisch im Rahmen der Streuung kein Unterschied mehr nachweisbar ist.

Welche hämodynamisehen Veränderungen die Gabe von. BM 10.188 bewirkt hat, ist in Tab. 2 dargestellt. Dem¬ nach tritt kein statistisch signi ikanter Effekt auf.

Man erkennt jedoch, daß vor allem der systolische Blut' druck deutlich über dem Kontrollwert liegt. Weder die exspiratorischen Volumenanteile an 0 ₂ und C0 ₂ noch pH, p0 ₂ und pC0 ₂ im arteriellen Blut zeigen auffäl¬ lige Veränderungen. Alle genannten Parameter bewegen sich im Normbereich.

LITERATUR

(1) EHRLY, A. :

Verbesserung der nutritiven Durchblutung bei peripheren ischämischen Erkrankungen. VASA Suppl. ll_ _j _ 1 (1983)

(2) KESSLER, M.:

Possibilities of measuring oxygen pressure fields in tissue by multiwire platinum electrodes. Progr. resp. Res. 3_, 136-147 (1969)

(3) LÜBBERS, D. W.:

Principle of construction and application of various platinum electrodes.

Progr. Resp. Res. 3_, 136 (1969)

Tab. 1

Die Ergebnisse der Gewebesauerstoffpartial-Druckmessung im Rattenmodell mit der chronischen Ligatur.

BM 10.188: 4 mg/kg p.o. in Methylzelluloselösung suspendiert (6 Ratten)

Kontrollgruppe: Gleiches Volumen an Methylzelluloselösung (5 Ratten)

Tab. 2

Die hämodynamischen Meßergebnisse

Substanzgruppe: BM 10.188 p.o., suspendiert in Methylzelluloselösung (6 Ratten) Kontrollgruppe: Gleiches Volumen an Methylzelluloselösung (5 Ratten)

Ein statistischer Vergleich wurde mit dem zweiseitigen WILCOXON-U-Test (p 0,05) durchgeführt. Es trat keine Signifikanz auf.

BM 10.188 Kontrolle "

I

Ratte Nr. Herzfrequenz p ^" Herzfrequenz p

P≤yst. diast. syst . Pd,i.ast.. (Schläge/min) (mm Hg) (mm Hg) (Schläge/min) (mm Hg) (mm Hg)

1 370 165 135 430 140 110

2 320 170 135 380 140 115

3 340 160 125 425 180 145

4 170 195 150 325 125 95

5 330 165 130 360 145 120

6 260 160 125 - - -

298^73 169+13 133+9 384^44

* ^{" s} x 146+20 117+ 8

Gegenstand der Erfindung ist nun die neue Verwendung von Doxaminol oder seinen physiologisch verträglichen Salzen zur Beeinflussung der Fließeigenschaften des Blutes, insbe¬ sondere zur Behandlung von peripheren, coronaren und cere- bralen Durchblutungsstörungen.

Physiologisch verträgliche Salze lassen sich aus der freien Base mit Hilfe anorganischer oder organischer Säuren in be¬ kannter Weise herstellen.Doxaminol und ihre Salze können in flüssiger oder fester Form enteral und parenteral appliziert werden. Als Injektionsmedium kommt vorzugsweise Wasser zur Anwendung, welches die bei Injektionslösungen üblichen Zusätz wie Stabilisierungsmittel, Lδsungsvermittler oder Puffer ent¬ hält. Derartige Zusätze sind z.B. Tartrat- und Citratpuffer, Äthanol, Komplexbildner (wie Athylendiamin-tetraessigsäure und deren nichttoxische Salze) , hochmolekulare Polymere (wie flüssiges Polyäthylenoxid) zur Viskositätsregulierung.

Feste Trägerstoffe sind z.B. Stärke, Lactose, Mannit, Methyl- cellulose, Talkum, hochsidperse Kieselsäuren, höhermolekulare Fettsäuren (wie Stearinsäure) , Gelatine, Agar-Agar, Calcium- phosphat, Magnesiumstearat, tierische und pflanzliche Fette, feste hochmolekulare Polymere (wie Polyäthylenglykole) ; für orale Applikation geeignete Zubereitungen können gewünschten- falls Geschmacks- und Süßstoffe enthalten.

Die Dosierung kann von verschiedenen Faktoren abhängen, wie Applikationsweise, Spezies, Alter und/oder individuellen Zu¬ ständen. Bei Menschen von ca. 70 kg Körpergewicht ist normale weise von einer Dosis von 25 - 500 mg/Tag, vorzugsweise 50 - 200 mg/Tag, in 1 - 4 Einzeldosen auszugehen.

Arzneimittelformulierungen enthalten daher vorzugsweise 50 - 100 mg Wirkstoff.