Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
DRUG WITH ANTIVIRAL ACTIVITY (VARIANTS)
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/159836
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to the field of organic chemistry and medicine, and more particularly to synthetic substances of the pyrimidine series, namely 2-chloro-5-phenyl-5H-pyrimido[5',4':5,6]pyrano[2,3-d]pyrimidine-4-ol derivatives, having antiviral activity. Claimed are a drug with antiviral activity against HIV infection and hepatitis B virus, containing 2-chloro-5-phenyl-5H-pyrimido[5',4':5,6]pyrano[2,3-d]pyrimidine-4-ol derivatives of the general formula shown, where: X is selected from the group: Н, NO2, Hal, ОМе; R1 is selected from the group: Сl, ОН; and R2 is selected from the group: Cl, SH, ОН; and a drug with antiviral activity against HIV infection, containing a 2-chloro-5-phenyl-5H-pyrimido[5',4':5,6]pyrano[2,3-d]pyrimidine-4-ol derivative of the general formula shown, where: X is selected from the group: Н, NO2, Hal, ОМе; R1 is selected from the group: Cl, ОН; and R2 is selected from the group: Cl, SH, ОН in combination with a reverse transcriptase inhibitor selected from Retrovir, or in combination with a protease inhibitor selected from Lopinavir, in an effective amount. The result is an effective drug with antiviral activity.

Inventors:
TETS, Viktor Veniaminovich (ul. Lensoveta, 27 kv. 9, St.Petersburg 6, 196066, RU)
TETS, Georgy Viktorovich (ul. Pushkinskaya, 13 kv. 4, St.Petersburg 0, 191040, RU)
KRASNOV, Konstantin Andreevich (ul. Zheleznovodskaya, 40 kv. 2, St.Petersburg 5, 199155, RU)
Application Number:
RU2016/000197
Publication Date:
October 06, 2016
Filing Date:
April 06, 2016
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
TETS, Viktor Veniaminovich (ul. Lensoveta, 27 kv. 9, St.Petersburg 6, 196066, RU)
TETS, Georgy Viktorovich (ul. Pushkinskaya, 13 kv. 4, St.Petersburg 0, 191040, RU)
International Classes:
C07D491/147; A61K31/513; A61K31/519; A61P31/12; A61P31/14; C07D239/10; C07H19/073
Foreign References:
RU2188201C22002-08-27
RU2246496C12005-02-20
US4578380A1986-03-25
Other References:
See also references of EP 3315501A4
Attorney, Agent or Firm:
TESLIUK, Tatiana Pavlovna (a/ya 146, St.Petersburg, 7, 192007, RU)
Download PDF:
Claims:
Формула изобретения

1. Лекарственное средство с противовирусной активностью в отношении ВИЧ инфекции и вируса гепатита В, представляющее собой производные 2-хлор-5-фенил-5Н-пиримидо[5',4' :5,6]пирано [2,3-с1]]1иримидин-4-ола общей формулы:

X выбран из группы: Н, N02, Hal, ОМе;

R1 выбран из группы: С1, ОН;

R2 выбран из группы: CI, SH, ОН.

2. Лекарственное средство с противовирусной активностью в отношении ВИЧ инфекции, содержащее производное 2-хлор-5- фенил-5Н-пиримидо[5',4' :5,6]пирано[2,3-с1]пиримидин-4-ола общей формулы:

где: X выбран из группы: Н, N02, Hal, ОМе; Rl выбран из группы: С1, ОН;

R2 выбран из группы: CI, SH, ОН

совместно с ингибитором обратной транскриптазы, выбранным Ретровира, или с ингибитором протеазы, выбранным Лопинавира, взятых в эффективном количестве.

Description:
Лекарственное средство с противовирусной активностью

(варианты) Область техники

Изобретение относится к области органической химии и медицины, конкретно - к синтетическим веществам пиримидинового ряда - производным 2-хлор-5-фенил-5#- пиримидо[5',4' :5,6]пирано[2,3-(1]пиримидин-4-ола, обладающим противовирусной активностью.

Изобретение может быть использовано для лечения заболеваний, вызванных вирусами иммунодефицита и другими ретровирусами, вирусами гепатита В, а также для аналогичных целей в ветеринарии. Заявленное средство может применяться как в индивидуальном виде, так и в комбинации с другими препаратами и фармацевтическими добавками.

Предшествующий уровень техники

Как известно, многие производные пиримидина обладаю! выраженной биологической активностью и участвуют в процессах жизнедеятельности организмов. Производные пиримидина являются нуклеиновыми основаниями (урацил, тимин, цитозин), витаминами (тиамин, фосфотиамин), коферментами (кокарбоксилаза), регуляторами роста (оротовая кислота) и т.д. [Data for Biochemical Research (3rd ed), R. M. C. Dawson, D. C. Elliott, W. H. Elliott, К. M. Jones (Clarendon Press, 1986].

Особый интерес представляют системы, в которых пиримидиновый цикл аннелирован другими гетероциклами. К ни относятся пурины, входящие в состав нуклеиновых кислот (аденин, гуанин), фолиевая кислота, АТФ, птерины, флавины, многие другие природные вещества и их синтетические аналоги.

Из синтетических производных пиримидина широкое использование в медицине приобрели замещенные барбитуровые и 2-тиобарбитуровые кислоты. Данные о биологической активности разнообразных производных 5-илиденбарбитуровых кислот суммированы в обзоре [2- Sans R.G., Chosas M.G. // Pharmazie, 1988, Bd 43, N 12, S. 827-829], где отмечены антиконвульсантное, антимикробное, спазмолитическое, жаропонижающее, противоопухолевое действие этих веществ.

Высокая биологическая активность обнаружена также у аннелированных производных пиримидина, например, у пиразоло[3,4- ]пиримидинов, полученных конденсацией 6-гидразиноурацилов с изо(тио)цианатами [3- Naka Т., Nagaoka А., Furukawa Y., заявка ЕПВ No. 237289 (1987)], 5-деазафлавинов [4- Yoneda F., Sasaki Т., Патент Японии, М кл.С 07D 471/04, No 03 81276, заявлена 24.08.1989 (89/218146), опуб. 05.04.1991 ], производных пирроло[2,3^]пиримидинов [5- Quijano M.L., Nogueras M, Melguizo M., Alvarez de Cienfuegos G., Melgarejo M., Sanches A. // Nucleosides & Nucleotides, 1989, Vol. 8, N 8, P. 1519- 1528], пирано[2,3^]пиримидинов [6- Ahluwalia V.K., Batla R., hurana A., Kumar R. // Indian J. Chem. , 1990, Vol. 29B, N 12, P. 1 141 ] и пиримидо[4,5-с]пиридазинов [7- Billings B.K., Wagner J. A., Cook F.D., Castle R.N. // J.Heterocycl. Chem., 1975, Vol. 12, N 6, P. 1221-1224]. Перечисленные соединения обладают пестицидным, противоопухолевым, антимикробным, иммуносупрессивным, ноотропным, антигипертензионным и антиаллергическим действием.

Приведенные выше материалы свидетельствуют о перспективности поиска новых фармацевтических препаратов среди производных пиримидина.

В то же время известны лишь несколько примеров образования пирано[2,3-^ :6,5-^ ']дипиримидиновой системы, в частности, при взаимодействии барбитуровых кислот с 3- ацилхромонами [8- Eiden F., Schikorr W. // Arch. Pharm., 1972, Bd 305, N 3, S. 187- 193] [ 9- Stone K.M., Wittington W.L., Treatment of genital gerpes, Rev. of Infect. Dis., 1990, 12, Supl. 6, Р.610-619]. Об их биологической активности сведений нет. Как было отмечено выше, соединения, содержащие фрагмент пиримидиндиона, обладают разнообразной биологической активностью. Однако эффективность многих из изученных веществ недостаточно высока, многие из них токсичны и обладают побочными эффектами. Кроме того, у бактерий, вирусов и опухолевых клеток очень быстро вырабатывается устойчивость к существующим преиаратам[ 10- Stone .M., Wittington W.L., Treatment of genital gerpes, Rev. of Infect. Dis., 1990, 12, Supl. 6, Р.610-619].

Прототипом изобретения выбран препарат, Ралтегравир (Raltegravir) ингибитор интегразы, N-(2 - (4 - (4- флюоробензилкарбамоил)-5-гидрокс и- 1 -метил-6-оксо- 1 ,6- дигидропиримидин-2-ил) пропан-2-ил), общей формулы

(http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/201 1/022145s018 lbl.pdf).

Препарат ингибирует каталитическую активность ВИЧ интегразы - фермента, участвующего в репликации вируса. Ингибирование интегразы предотвращает ковалентное введение генома ВИЧ в геном клетки хозяина на ранних стадиях развития инфекции. Недостатки прототипа связаны с быстро возникающей резистентностью вирусов к данному препарату, что обусловливает его невысокую эффективность.

Раскрытие изобретения Задачей настоящего изобретения является создание эффективного лекарственного средства с противовирусной активностью. Согласно изобретению по варианту 1 поставленная задача решается путем синтеза лекарственного средства с противовирусной активностью в отношении ВИЧ инфекции и вируса гепатита В, представляющего собой производные 2-хлор-5-фенил-5Н-пиримидо[5 , ,4' :5,6]пирано[2,3-с1]пиримидин-4- ола общей формулы:

X выбран из группы: Н, N0 2 , Hal, ОМе;

R1 выбран из группы: О, ОН;

R2 выбран из группы: CI, SH, ОН;

Согласно изобретению по варианту 2 поставленная задача решается путем синтеза лекарственного средства с противовирусной активностью в отношении ВИЧ инфекции, содержащего производное 2-хлор-5-фенил-5Н- пиримидо[5',4' :5,6]пирано[2,3-ё]пиримидин-4-ола общей формулы:

где: X выбран из группы: Н, N0 2 , Hal, ОМе;

R1 выбран из группы: С1, ОН;

R2 выбран из группы: CI, SH, ОН

совместно с ингибитором обратной транскриптазы, выбранным из Ретровира, или с ингибитором протеазы, выбранным из Лопинавира, взятых в эффективном количестве.

Изобретение распространяется на все пространственные изомеры заявляемых веществ, все их таутомерные формы, а также соли.

Заявителю не известны какие-либо источники информации, в которых бы содержались сведения об идентичных технических решениях, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного изобретения условию патентоспособности «Новизна» («N»).

Заявителем не выявлены какие-либо источники информации, содержащие сведения о влиянии признаков изобретения на достигаемый вследствие их реализации технический результат. Это, по мнению заявителя, свидетельствует о соответствии данного технического решения условию патентоспособности «Изобретательский уровень» («IS»).

Краткое описание чертежей

В дельнейшем изобретение поясняется подробным описанием примеров его осуществления без ссылок на чертежи.

Лучший вариант осуществления изобретения Для решения поставленной задачи наиболее предпочтительны производные заявленного вещества, указанные в таблице 1.

Синтез заявленного лекарственног о средства

Производные 1 -7 заявленного вещества синтезируют в 2 этапа в соответствии со схемой 1.

Схема 1

Для получения заявляемых веществ вначале синтезируют промежуточные вещества - соли производных бис-[5-(2- сульфгидрил-4,6-дигидроксигексаг дропиримидо)]фенилметана из соответствующих ароматических альдегидов и 2-тиобарбитуровой кислоты в присутствии основания (Base) - триэтиламина или пиридина. Затем обработкой промежуточных соединений хлорокисью фосфора синтезируют заявленные вещества.

Заявленное вещество получают следующим образом.

Для получения производного 1 в колбу вместимостью 500 мл помещают 14.4 г (0.1 моль) 2-тиобарбитуровой кислоты, приливают 150 мл воды и нагревают смесь до 90-95 °С. Затем к горячему раствору при перемешивании приливают 5.01 (0.05 моль) триэтиламина в 7 мл спирта, и нагревают еще 1 мин до полного растворения. Затем раствор снимают с нагрева и быстро, при перемешивании, приливают раствор 7.55 г (0.05 моль) 4-нитробензальдегида в 25-30 мл горячего спирта. Реакционную смесь перемешивают без нагревания 5 мин и оставляют при 15-20 °С на 3-4 ч. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают небольшим количеством воды и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 24 г промежуточного вещества - триэтиламмониевой соли бис-[5-(2-сульфгидрил-4,6-дигидрокси гексагидропиримидо)]4- нитрофенилметана в виде кристаллического порошка кремового цвета, Т разл. 240 °С.

Затем в колбу вместимостью 200 мл помещают 100 мл хлорокиси фосфора, нагревают до кипения и к кипящей жидкости при перемешивании добавляют 10 г полученного выше промежуточного вещества (триэтиламмониевой соли бис-[5-(2- сульфгидрил-4,6-дигидроксигексаг дропиримидо)]-(4-нитрофенил) метана), и продолжают перемешивать при интенсивном кипячении с обратным холодильником 30-50 мин до полного растворения осадка, после чего кипятят еще 1 ч. После этого реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и при активном перемешивании, порциями вливают в 350 г толченого льда. Скорость прибавления смеси регулируют так, чтобы температура массы была не выше 15 °С. После прибавления всей смеси продолжают перемешивать массу, постепенно доводя ее до температуры 20 °С, а при достижении заданной температуры добавляют к смеси еще 50 г льда, удерживая температуру в пределах 20-35 °С. После завершения экзотермической реакции разбавляют смесь водой до конечного объема 1 л, выделившийся белый осадок фильтруют и промывают водой до слабокислой реакции смывов (рН 4-5). Далее, сырой осадок переносят в колбу, добавляют 200 мл воды, 5 г трис- оксиметиламинометана (ТРИС) и перемешивают без нагревания до полного растворения осадка. Полученный раствор фильтруют от инородных частиц. К фильтрату добавляют 100 мл водного раствора уксусной кислоты 1% до рН 7 и выдерживают 30 мин, а выделившийся осадок отделяют и отбрасывают. К полученному фильтрату добавляют 100 мл раствора уксусной кислоты 1 % до рН 5 и выдерживают 1 ч, сформировавшийся осадок фильтруют, промывают водным раствором уксусной кислоты 0.1 %, зате чистой водой и сушат в вауум-эксикаторе над КОН при температуре до 30 °С. Получают 3.5 г производного 1 заявляемого вещества в виде стеклообразного продукта коричневого цвета. Выход 40 % от теории.

Примечание. По аналогичной методике при использовании соответствующих альдегидов (бензальдегида, 3-хлорбензальдегида и 4-метоксибензальдегида) получают производные 5, 6 и 7. Выход продуктов указан в таблице 2, характеристики и данные элементного анализа - в таблицах 3 и 4.

Для получения смеси производных 1 , 2 и 3 в колбу вместимостью 200 мл помещают 100 мл хлорокиси фосфора и нагревают до кипения. Затем в кипящую жидкость при перемешивании добавляют 10 г полученного выше промежуточного вещества (соли бис-[5-(2-сульфгидрил-4,6- дигидроксигексагидропиримидо)]-( 4-нитрофенил)метана) и продолжают перемешивать при интенсивном кипячении с обратным холодильником 30-50 мин до полного растворения осадка, после чего кипятят еще 1 ч. После этого реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и при активном перемешивании, порциями вливают в 350 г толченого льда. Скорость прибавления смеси регулируют так, чтобы температура массы была не выше 15 °С. После прибавления всей смеси продолжают перемешивать массу, постепенно доводя ее до температуры 20 °С, а при достижении заданной температуры добавляют к смеси еще 50 г льда, удерживая температуру в пределах 20-35 °С. После завершения экзотермической реакции, разбавляют смесь водой до конечного объема 1 л. Выделившийся белый осадок фильтруют через бумажный фильтр и тщательно промывают водой до слабокислой реакции смывов (рН 4-5). Далее, сырой осадок переносят в колбу, добавляют 200 мл воды, 5 г трис- оксиметиламинометана (ТРИС) и перемешивают без нагревания до полного растворения осадка и получения раствора с рН 8-9. Полученный раствор разбавляют водой до конечного объема 400 мл и фильтруют от инородных частиц. Затем к полученному фильтрату медленно, при перемешивании, добавляют 50 мл водного раствора, содержащего 5 мл уксусной кислоты до рН 3. Выпавший густой осадок выдерживают 30 мин и фильтруют, тщательно промывают осадок на фильтре водным раствором уксусной кислоты 0.1 %, затем чистой водой и сушат на воздухе при температуре не выше 40 °С. После сушки получают 6 г стеклообразного продукта коричневого цвета, представляющего собой смесь производных 1 , 2 и 3 заявляемого вещества в соотношении (%) 40:30:20, соответственно. Суммарный выход около 80 % от теории. Для получения целевого продукта, а именно 2-хлор-8- сульфгидрил-5-(4-нитрофенил)-5Н-пир имидо[5',4' :5,6]пирано[2,3- о! |пиримидин-4,6-диола (производное 2) в колбу вместимостью 200 мл помещают 100 мл хлорокиси фосфора и нагревают до кипения. Затем в кипящую жидкость при перемешивании добавляют 10 г полученного выше промежуточного вещества (соли бис-[5-(2- сульфгидрил-4,6-дигидрокси-гексаг идропиримидо)]-(4- нитрофенил)метана) и продолжают перемешивать при интенсивном кипении до полного растворения осадка (30-50 мин). После этого реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и при активном перемешивании, порциями вливают в 250 г толченого льда, регулируя скорость прибавления смеси так, чтобы конечная температура массы составляла 50-60 °С. После завершения экзотермической реакции осадок фильтруют через бумажный фильтр и тщательно промывают водой. Далее, сырой осадок переносят в колбу и растворяют в 200 мл воды с добавкой 5-6 мл аммиака 25%. Полученный раствор фильтруют от инородных частиц и фильтрат подкисляют водным раствором уксусной кислоты 5% до рН 5. Выпавший осадок отделяют и отбрасывают, а фильтрат подкисляют НС1 до рН 1 и выдерживают 1 ч при 20 °С. Выделившийся осадок фильтруют, промывают на водой и сушат в вауум-эксикаторе над КОН при температуре до 30 °С. После сушки получают 1.35 г производное 2 в виде светло-желтого кристаллического порошка. Выход 19 % от теории.

Для получения заявляемого производного, а именно 2,6,8- трихлор-5-(4-нитрофенил)-5//-пиримид о[5',4' :5,6]пирано[2,3- с!]пиримидин-4-ола (производное 3) в колбу вместимостью 200 мл помещают 100 мл хлорокиси фосфора и нагревают до кипения. Затем в кипящую жидкость при перемешивании добавляют 3 г полученного выше промежуточного вещества (соли бис-[5-(2- сульфгидрил-4,6-дигидрокси-гексаг идропиримидо)]-(4- нитрофенил)метана) и продолжают перемешивать при интенсивном кипении 2 ч. После этого из смеси отгоняют в вакууме не менее 70 мл хлорокиси фосфора при температуре бани до 90 °С и остаток охлаждают до комнатной температуры. Затем реакционную смесь при активном перемешивании, порциями вливают в 150 г толченого льда, регулируя скорость прибавления смеси так, чтобы температура массы не превышала 15 °С. После завершения экзотермической реакции осадок фильтруют через бумажный фильтр и тщательно промывают водой. Далее, сырой осадок переносят в колбу, добавляют 100 мл воды, 2 г трис- оксиметиламинометана (ТРИС) и перемешивают без нагревания до полного растворения осадка и получения раствора с рН 8-9. Полученный раствор фильтруют от инородных частиц и фильтрат подкисляют водным раствором уксусной кислоты 1 % до рН 7. Выпавший осадок фильтруют, тщательно промывают на водой и сушат в вауум-эксикаторе над КОН при температуре до 30 °С. После сушки получают 0.56 г производного 3 заявляемого вещества в виде стеклообразного продукта светло-коричневого цвета. Выход 27 % от теории.

Для получения целевого продукта, а именно 2-хлор-5-(4- нитрофенил)-5//-пиримидо[5',4' :5,6]пирано[2,3- 1]пиримидин-4,6,8- триола (производное 4) в колбу вместимостью 200 мл помещают 100 мл хлорокиси фосфора и нагревают до кипения. Затем в кипящую жидкость при перемешивании добавляют 10 г полученного выше промежуточного вещества (соли бис-[5-(2- сульфгидрил-4,6-дигидрокси-гексаг идропиримидо)]-(4- нитрофенил)метана) и продолжают перемешивать при интенсивном кипении до полного растворения осадка (30-50 мин). После этого реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и при активном перемешивании, порциями вливают в 250 г толченого льда, регулируя скорость прибавления смеси так, чтобы конечная температура массы составляла 50-60 °С. После завершения экзотермической реакции смесь перемешивают при 50 °С в течение 8 ч. Затем охлаждают смесь до комнатной температуры, осадок фильтруют через бумажный фильтр и тщательно промывают водой. Далее, сырой осадок переносят в колбу и растворяют в 200 мл воды с добавкой 5-6 мл аммиака 25%. Полученный раствор фильтруют от инородных частиц и фильтрат подкисляют водным раствором уксусной кислоты 5% до рН 5. Выпавший осадок отделяют и отбрасывают, а фильтрат подкисляют НС1 до рН 1 и выдерживают 1 ч при 20 °С. Выделившийся осадок фильтруют, промывают водой, затем спиртом, эфиром и сушат на воздухе при комнатной температуре. Получают 2.4 г производного 4 заявляемого вещества в виде бесцветного кристаллического порошка. Выход 34 % от теории.

Исследование биологической активности заявленного лекарственного средства.

Пример 1. Определение анти-ВИЧ активности производных

1 -7 заявленного лекарственного средства.

Материалы и методы: Клетки. Использовали перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 г/мл гентамицина.

Вирусы. В качестве источника вируса использовали штамм

ВИЧ- 1 899А .

Препарат. Исследовали образцы препаратов, растворенные в диметилсульфоксиде.

Структура исследования:

Исследование цитотоксического действия препарата.

К клеткам добавляли исследуемый препарат в различных концентрациях. Инкубировали клетки при 37С° в атмосфере с 5% С0 2 и 98% влажности 5 дней. Учет результатов: определение жизнеспособности и количества клеток при помощи красителя.

Исследование противовирусного действия препарата.

К клеткам добавляли исследуемые препараты в различных дозах при одновременном инфицировании вирусом в дозе 0,01 ТЦИД 50 /клетка. Инкубировали культуры клеток при 37С° в атмосфере с 5% С0 2 и 98% влажности 5 дней. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью тетразолиевого красителя (метод МТТ) со спектрофотометрией и световой микроскопией: исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПД) и вирусиндуцируемого образования синцития (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).

Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия вируса определяли по формуле: A - В

% защиты x 100, где

К - В

Л число жизнеспособных клеток в опытной группе;

В - то же в инфицированной культуре (контроль вируса);

К- то же в неинфицированной культуре (контроль клеток).

Результаты исследования приведены в таблице 6.

Пример 2. Определение 50%-ой летальной дозы смеси производных 1 -1- 2 + 4 заявленного вещества (ЛД 50 ) при парентеральном (инъекционном) способе введения.

Определение показателей острой токсичности при парентеральном способе введения включало эксперименты на мышах массой 18-20 г, возраст 8-9 недель.

В опытах на грызунах для исследования каждой дозы использовались группы по 5 животных одного пола. Препараты растворяли в стерильной Н 2 0 и вводили в хвостовую вену (в/в).

Результаты: ЛД 50 смеси производных 1+2+4 составило 2000 - 2500 мг/кг.

Пример 3. Определение ЛД 50 смеси производных 1 + 2 1 5 при энтеральном способе введения.

Определение ЛД 5 о заявленного вещества при энтеральном способе введения.

Определение показателей острой токсичности при энтеральном способе введения включало эксперименты на мышах массой 18-20 г, возраст 8-9 недель.

В опытах на грызунах для исследования каждой дозы препаратов использовались группы по 5 животных одного пола. Препараты вводили внутрижелудочно (в/ж) в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Для этого их разводили в 1 % крахмальной слизи и полученную взвесь вводили животным.

Результаты: ЛД 50 смеси производных 1 +2+5 составило 12000 16000 мг/кг.

Пример 4. Определение ЛД 50 при внутривагинальном способе введения

Определение показателей острой токсичности при внутри вагинальном способе введения включало эксперименты па крысах массой 150-170 грамм, возраст 3-3,5 месяца. Суппозитории, содержащие 1000 мкг/суппозиторий J4 > 14, нарезались бритвой на полоски меньшего размера, удобные для вагинального введения. Введения препарата осуществляли на протяжении 12 часов с интервалами в 2 часа. Общая дозировка получаемая животным при введении, составила 2200 мкг/кг. Ни у одного из животных не отмечалось гибели и каких-либо признаков негативного воздействия препарата. Динамика массы тела во всех группах оставалась нормальной.

Пример 5. Совместное действие заявленного лекарственного средства и препаратов, используемых для лечения заболеваний, вызванных вирусами иммунодефицита человека.

Материалы и методы:

Использовали перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 мкг/мл гентамицина.

В качестве источника вируса использовали штамм ВИЧ-

1 S99A- Препарат. Исследовали образцы препаратов, растворенью в диметилсульфоксиде. В качестве антиретровирусного референс- препарата использовали препарат Ралтегравир (прототип).

Исследование противовирусного действия препарата (защита клеток).

К клеткам добавляли исследуемые препараты в различных дозах при одновременном инфицировании вирусом в дозе 0,01 ГЦИДзо/клетка. Инкубировали культуры клеток при 37С° в атмосфере с 5% С0 2 и 98% влажности 5 дней. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью тетразолиевого красителя (метод МТТ) со спектрофотометрией и световой микроскопией: исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПД) и вирусиндуцируемого образования синцития (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).

Результаты приведены в таблице 8.

Таким образом, можно сделать вывод о синергическом действии заявленного лекарственного средства при совместном использовании с препаратами, используемыми для лечения заболеваний, вызываемых вирусами иммунодефицита человека.

Пример 6. Влияние заявляемых соединений на репродукцию вируса Гепатита В (HBV).

Материалы и методы.

Клетки линии HepG2.2.15, инфицированные вирусом Гепатита В, выращивали на среде DMEM с добавлением 1 0% бычьей сыворотки при 5% С0 2 , 37 °С.

Анализ количества внеклеточной HBV ДНК. Через 5 дней инкубации HepG2.2.15 отбирали культуральную среду, центрифугированием отделяли клетки и выделяли ДНК по методу Klintschar и Neuhuber (Klintschar and Neuhuber, 2000). Количественное определение HBV проводили с использованием T-PCR.

Результаты приведены в таблице 9.

Полученные данные указывают, что заявленное лекарственное средство активно против вируса гепатита В. Промышленная применимость

Для реализации изобретения используются известные материалы и оборудование, что обусловливает, по мнению заявителя, соответствие изобретения критерию «Промышленная применимость» («IA»).

Таблица 1

Структура наиболее активных производных общей формулы заявленного лекарственного средства

Таблица 2

Выход и свойства производных 1 -7 заявляемого вещества

Таблица 3 анные спектров ПМР заявляемых веществ 1-7 (ДМСО- 6 , δ, м.д. , J, Гц)

Таблица 4

Данные элементного анализа заявляемых веществ

Найдено, % Вычислено, %

Бругго-формула

С Н N Hal С Н N Hal

1 44.01 1.79 17.05 17.1 1 C 15H7CI2N5O5 44.14 1.73 17.16 17.37

? 44.13 2.10 17.09 8.60 C, 5 H 8 C1N 5 0 4 S 44.40 1.99 17.26 8.74

.3 42.03 1.49 16.22 24.70 С 15 Н 6 С1з 5 04 42.23 1.42 16.42 24.93

4 46.04 2.15 17.88 8.96 C 15 H 8 C1N 5 0 6 46.23 2.07 17.97 9.10

5 49.47 2.34 15.25 19.30 C 15 H 8 C1 2 N 4 0 3 49.61 2.22 15.43 19.52

6 45.15 1.88 13.87 26.66 C i 5H 7 Cl 3 N 4 0 3 45.31 1.77 14.09 26.75

7 48.70 2.69 14.13 17.89 C 16 H 10 Cl 2 N 4 O 4 48.88 2.56 14.25 18.03

Таблица 5

Исследование противовирусной активности на модели клеток,

инфицированных ВИЧ-1

P T/RU2016/000197

Таблица 6

Определение ЛД 50 смеси производных 1+2+4.

Доза препарата Число живых Число погибших

(мг/кг) животных в группе животных в группе

0 5 0

250 5 0

500 5 0

1000 5 0

1500 5 0

2000 5 2

2500 5 3

3000 5 3

4000 5 5

5000 5 5

Таблица 7

Определение ЛД 50 смеси производных 1 +2+5

Доза препарата Число живых Число погибших

(мг/кг) животных в группе животных в группе

0 5 0

500 5 0

1000 5 0

2000 5 0

4000 5 0

6000 5 0

8000 5 0

12000 5 2

16000 5 2

24000 5 5 Таблица 8

роизводное 7 + PV 5 мкг/мл + 2,5 мкг/мл 100

Таблица 9

Изменение количества внеклеточной ДНК НВ V

Проба HBV Log 10 IU/ml

Контроль (необработанные клетки) 4,42 +/- 0,28

Производное 1 , 5 мкг/мл 2,58 +/- 0,33

Производное 2, 5 мкг/мл 2,65 +/- 0,19

Производное 7, 5 мкг/мл 2,74 +/- 0.25