[001 ] A presente invenção refere-se a um sistema de cultura celular dinâmico, em que os compartimentos superior e inferior de uma placa de cultura são separados por uma membrana semipermeável, de maneira a separar os poços dos compartimentos superior e inferior que cultivam diferentes tipos de células perfundidas em diferentes meios de cultura, as perfusões dos diferentes tipos de célula sendo realizadas simultaneamente e independentes entre si nos respectivos poços, de maneira a mimetizar um microambiente renal.

Descrição do Estado da Técnica

[002] Os rins filtram aproximadamente 180 litros de fluido por dia, são altamente vascularizados e regulam eletrólitos, o balanço ácido-básico e a pressão arterial para manter a homeostase corpó- rea. São órgãos, portanto, extremamente complexos, nos quais as células epiteliais tubulares estão em contato com as células endote- liais, mas separadas por uma membrana semipermeável, a membrana basal tubular. Estas interações são também observadas nos glomérulos, nos quais os podócitos são separados do endotélio pela membrana basal glomerular. Desta forma, desenvolver técnicas que ajudem a melhor entender a fisiologia deste órgão é essencial para abrir novas possibilidades de tratamento de doenças renais, como a insuficiência renal crónica (IRC).

[003] A IRC afeta milhares de pessoas no mundo, independente- mente de género, raça e idade. Os tratamentos atuais incluem a diálise e o transplante renal. No caso da diálise, os eventos cardiovasculares e infecciosos continuam a impactar a sobrevida dos pacientes, apesar dos avanços tecnológicos. Em relação ao transplante renal, a baixa disponibilidade de doadores frente ao número crescente de pessoas com IRC e a sobrevida estável do órgão transplantado em longo prazo nos últimos anos, apesar dos inúmeros avanços na utilização dos imu- nossupressores, correlaciona-se também com a menor sobrevida do paciente em comparação com a população geral.

[004] Uma abordagem para tentar entender melhor o microambi- ente renal e suas interações é através da engenharia de tecidos, a qual representa uma plataforma promissora para obtenção de células com maior capacidade regenerativa e também de estruturas semelhantes a tecidos/organoides que podem ser transplantados em diferentes modelos animais inicialmente. E, em um futuro, as estruturas renais obtidas com um sistema dinâmico de cultura celular poderão ser utilizadas em seres humanos para retardar a progressão da IRC, tanto durante o período de tratamento conservador quanto para pacientes evoluindo com perda da função renal após o transplante renal.

[005] Assim sendo, é evidente que existe uma grande necessida- de de melhor compreender o microambiente renal e de desenvolver novas plataformas para tal.

[006] Dois tipos básicos de culturas de células são encontrados no estado da técnica: o sistema estático e o sistema dinâmico. O sistema de cultura celular estático é realizado em recipientes plásticos e tem sido utilizado por muito tempo para expansão de diferentes tipos celulares com finalidade terapêutica. Já o sistema de cultura celular dinâmico, também chamado de sistema de cultura celular de perfusão, tem trazido também resultados promissores.

[007] As culturas estáticas podem ser macroscópicas ou micros- cópicas (também denominada cultura celular microfluídica) [Halldors- son et al. (2015) , Biosens Bioeleltron. 63: 218-231 ]. As vantagens típicas das culturas macroscópicas são bem estabelecidas: (a) materiais plásticos já previamente conhecidos, como o poliestireno; (b) mensu- ração padronizada de pH, C0 ₂ e 0 ₂ ; (c) protocolos já bem estabeleci- dos, incluindo meios de cultura, co-cultura celular, etc; (d) padroniza- ção e disponibilidade de vários ensaios já testados; (e) capacidade de ampliar um único experimento. Por outro lado, a cultura celular micro- fluídica apresenta também várias vantagens promissoras, como (a) flexibilidade no design do dispositivo; (b) flexibilidade dos experimentos; (c) necessidade do uso de pequena quantidade de células e reagentes para os experimentos; (d) estabelecimento de experimentos com células únicas ou ensaios clonogênicos; (e) possibilidade de análise em tempo real dos experimentos (por exemplo, realizar imunofluorescência e levar diretamente ao microscópio de fluorescência; acoplamento de biossensores para detecção dos parâmetros celulares fisiológicos); (f) possibilidade de realização de cultura de perfusão; (g) realização de cocultura; (h) alta capacidade de paralelização dos dispositivos.

[008] No entanto, vários desafios existem tanto para a cultura macroscópica (superfícies de cultura rígidas, arquitetura fixa dos dis- positivos, necessidade de altas concentrações de reagentes, dificuldade de geração de gradientes químicos e de perfusão, utilização de meio estático de cultura e análise apenas dos resultados finais dos experimentos) quanto para a microfluídica (protocolos não padronizados, novas superfícies para cultivo celular, como silicone, entendimento da mudança na superfície e comportamento celular, utilização de pequenos volumes e estabelecimento do design dos chips e sua complexidade de manejo) [Mehling et al. (2014), Curr Opin Biotechnol. 25: 95- 102].

[009] Por outro lado, os sistemas de perfusão utilizados em cultu- ra celular têm sido largamente utilizados para aplicações em engenharia de tecidos, uma vez que permitem aumentar a viabilidade, a morfologia e a funcionalidade celulares. Tais sistemas são conhecidos como biorreatores. Vários modelos já foram propostos no estado da técnica, nos quais diferentes células foram utilizadas, associadas ou não a cul- tura em 3-D e mimetizando diferentes patologias [Piola et al. (2013), ScientificWorldJournal. 2013: 123974; Ferlin et al. (2014), Mol Pharm. 1 1 : 2172-2181 ; Haykal et al. (2014), Tissue Eng Part C Methods. 20: 681 -692; Bao et al. (2015), Virulence. 6: 265:273]. Tais sistemas podem ser também utilizados para testes toxicológicos e entendimento de diferentes vias de sinalização em células renais embrionárias, neo- natais e adultas quando submetidas a condições fisiológicas e a situações que mimetizam modelos de doenças renais criados in vitro.

[0010] Os documentos WO2015142462, US20150252328, US20130084632 e US20090053752 se referem a cultivos celulares di- nâmicos que aceitam o cultivo de diferentes tipos celulares em série ou em paralelo no intuito de mimetizar microambientes in vivo em modelos in vitro.

[001 1 ] Todavia, não se observa no estado da técnica uma cultura celular que mimetize o microambiente renal de modo a se obter células com maior capacidade regenerativa e também tecidos/organoides que podem ser transplantados em diferentes modelos animais ou em seres humanos para retardar a progressão da IRC.

Objetivos da Invenção

[0012] Um primeiro objetivo da presente invenção é produzir célu- las infundidas ou tecidos implantados com melhores funções morfológicas e funcionais de modo a servirem de modelo para estudos de lesões renais.

[0013] Um segundo objetivo da presente invenção é mimetizar o microambiente renal para o estabelecimento do modelo de doenças renais in vitro e para a geração de células/tecidos para o tratamento de doenças renais.

[0014] Um terceiro objetivo da presente invenção é mimetizar o compartimento da vasa recta, representado pelas células endoteliais e epiteliais.

[0015] Um quarto objetivo da presente invenção é permitir estudos da morfologia e função celulares, do nicho de células- tronco/progenitores renais e geração de células e tecidos para infusão/implante em animais.

[0016] Um quinto objetivo da presente invenção é permitir estudos da disfunção das células mesangiais em meio hiperglicêmico para mi- metizar a nefropatia diabética e os efeitos das células mesenquimais neste cenário.

[0017] Um sexto objetivo da presente invenção é cultivar células- tronco/progenitoras específicas do tecido renal em desenvolvimento.

[0018] Um sétimo objetivo da presente invenção é o nicho de tais células, permitindo a manutenção das propriedades cardinais das mesmas, como clonogenicidade, autorrenovação, multipotencialidade e potencial regenerativo, e, assim, possibilitar estudos de lesões renais.

Breve Descrição da Invenção

[0019] Os objetivos da presente invenção são alcançados por meio de um sistema de cultura celular dinâmico compreendendo uma placa de cultura, a placa de cultura sendo dotada de um compartimento superior e de um compartimento inferior, o compartimento superior sendo dotado de ao menos um poço superior e o compartimento inferior sendo dotado de ao menos um poço inferior, em que o ao menos um poço superior é separado do ao menos um poço inferior por meio de uma membrana semipermeável, o ao menos um poço superior recebendo ao menos um meio de cultura de células superior e cultivando em seu interior um primeiro tipo de célula, o primeiro tipo de célula sendo perfundido pelo ao menos um meio de cultura de células superior, o ao menos um poço inferior recebendo ao menos um meio de cultura de células inferior e cultivando em seu interior um segundo tipo de célula, o segundo tipo de célula sendo perfundido pelo ao menos um meio de cultura de células inferior, as perfusões dos primeiro e segundo tipos de célula sendo realizadas simultaneamente e independentes entre si.

[0020] Os objetivos da presente invenção também são alcançados por meio de um sistema de cultura celular dinâmico compreendendo um chip PDMS, um chip PDMS sendo dotado de uma camada superior e de uma camada inferior, em que a camada superior é dotada de ao menos um micro canal superior e a camada inferior é dotada de ao menos um micro canal inferior, os ao menos um micro canal superior e inferior sendo separados por meio de uma membrana semipermeável, o ao menos um micro canal superior recebendo ao menos um meio de cultura de células superior e cultivando em seu interior um primeiro tipo de célula, o primeiro tipo de célula sendo perfundido pelo ao menos um meio de cultura de células superior, o ao menos um micro canal inferior recebendo ao menos um meio de cultura de células inferior e cultivan- do em seu interior um segundo tipo de célula, o segundo tipo de célula sendo perfundido pelo ao menos um meio de cultura de células inferior, as perfusões dos primeiro e segundo tipos de célula sendo realizadas simultaneamente e independentes entre si.

Breve Descrição dos Desenhos

[0021 ] A presente invenção será, a seguir, mais detalhadamente descrita com base em um exemplo de execução representado nos desenhos. As Figuras mostram:

[0022] Figura 1 - é uma ilustração do sistema de cultura celular dinâmico com placa de cultura e bombas peristálticas em uma configu- ração preferencial da presente invenção;

[0023] Figura 2 - é uma ilustração de poços superior e inferior que recebem os meios de cultura superior e inferior para perfusão de um primeiro e de um segundo tipo de células, estas sendo separadas por uma membrana semipermeável em uma configuração preferencial da presente invenção; [0024] Figura 3 - é uma ilustração do chip PDMS do sistema de cultura celular dinâmico com chip PDMS e bombas-seringa em uma configuração alternativa da presente invenção;

[0025] Figura 4 - é uma vista superior do chip PDMS do sistema de cultura celular dinâmico com chip PDMS e bombas-seringa em uma configuração alternativa da presente invenção. A Figura mostra em detalhes a camada superior, o ao menos um micro canal superior e a cul- tivação do primeiro tipo de célula perfundido pelo ao menos um meio de cultura de células superior;

[0026] Figura 5 - é uma vista inferior do chip PDMS do sistema de cultura celular dinâmico com chip PDMS e bombas-seringa em uma configuração alternativa da presente invenção. A Figura mostra em detalhes a camada inferior, o ao menos um micro canal inferior e a culti- vação do segundo tipo de célula perfundido pelo ao menos um meio de cultura de células inferior;

[0027] Figura 6 - é uma vista superior do sistema de cultura celular dinâmico com chip PDMS e bombas-seringa em uma configuração alternativa da presente invenção. A Figura mostra em detalhes a conexão fluídica entre o chip PDMS com as bombas-seringa e primeiro, se- gundo, terceiro e quarto reservatórios através das entradas superior e inferior e saídas superior e inferior.

[0028] Figura 7 - é uma vista inferior do sistema de cultura celular dinâmico com chip PDMS e bombas-seringa em uma configuração alternativa da presente invenção. A Figura mostra em detalhes a cone- xão fluídica entre o chip PDMS com as bombas-seringa e primeiro, segundo, terceiro e quarto reservatórios através das entradas superior e inferior e saídas superior e inferior.

[0029] Figuras 8A a 8C - são ilustrações da evolução da proliferação das células MDCK durante 24 horas no sistema de cultura estática do estado da técnica; [0030] Figuras 9A e 9B - são ilustrações da proliferação das células MDCK após 48 horas e 96 horas no sistema de cultura estática do estado da técnica;

[0031 ] Figuras 10A e 10B - são ilustrações da proliferação das cé- lulas MDCK após 48 horas e 96 horas no sistema de cultura celular dinâmico em uma configuração preferencial da presente invenção; e

[0032] Figura 1 1 - são ilustrações da proliferação das células MDCK por 5 dias no sistema de cultura celular dinâmico em uma configuração alternativa da presente invenção.

Descrição Detalhada das Figuras

[0033] A fim de contornar os problemas enfrentados nas soluções do estado da técnica, a presente invenção foi desenvolvida. Como comentado anteriormente, a presente invenção se refere a um sistema de cultura celular dinâmico 1 para cultura de tipos de células perfundidas em diferentes meios de cultura de maneira simultânea e independente nos respectivos poços, de maneira a mimetizar o microambiente renal. O presente sistema de cultura celular dinâmico 1 sendo utilizado com uma placa de cultura 100 e bombas peristálticas 200 ou com chips de PDMS e bomba-seringa, tais concretizações sendo descritas em maio- res detalhes abaixo.

Sistema de cultura celular dinâmico 1 com placa de cultura 100 e bombas peristálticas 200

[0034] Observa-se que a Figura 1 ilustra o sistema objeto da presente invenção em sua configuração preferencial e os elementos que o compõem, sendo estes uma placa de cultura 100, primeiro, segundo, terceiro e quarto reservatórios 31 a 34, tubulações e bombas peristálticas 200.

[0035] Em uma configuração preferencial, a placa de cultura 100 é um recipiente confeccionado a partir de vidro ou plástico com diferen- tes tipos de geometria, sendo especialmente utilizada para cultura ce- lular. A placa de cultura 100 objeto da presente invenção é dotada de uma pluralidade de poços do tipo Corning ^® , o número de poços variando de acordo com a placa de cultura 100 utilizada. Na presente invenção, placas disponíveis comercialmente Corning ^® são utilizadas. Em geral, as placas de cultura 100 disponíveis comercialmente têm 6, 12, 24 ou 96 poços. Cumpre destacar, no entanto, que o número de poços não representa um caráter limitativo da presente invenção, de maneira que a placa de cultura 100 poderia ter um único poço.

[0036] Fazendo referência à Figura 1 da presente invenção, pode ser notado que a placa de cultura 100 é dotada de um compartimento superior 10 e de um compartimento inferior 20, os compartimentos 10, 20 sendo formados a partir da introdução de insertos nos poços da placa de cultura 100. Os insertos utilizados são do tipo Transwell ^® disponíveis comercialmente. Observa-se a partir da Figura 1 que, após a formação dos compartimentos 10, 20, uma pluralidade de poços superiores 10 e uma pluralidade de poços inferiores 40 também são formados. A fim de separar cada poço da pluralidade de poços superiores 30 do respectivo poço da pluralidade de poços inferiores 40, cada um dos insertos é dotado de uma membrana semipermeável 50 (Figura 2).

[0037] Preferencialmente, a membrana semipermeável 50 é confeccionada a partir de policarbonato. Cumpre destacar, no entanto, que o tipo de membrana não representa um caráter limitativo da presente invenção. Alternativamente, a membrana semipermeável 50 poderia ser confeccionada a partir de membranas biocompatíveis, membranas de celulose ou membranas sintéticas como polissulfona, poliamida, po- liacrilonitrila (PAN) e poli meti Imetacri lato (PMMA), desde que estas alternativas tenham características similares ao policarbonato.

[0038] Nesta configuração preferencial, observa-se que cada poço da pluralidade de poços superiores 30 recebe ao menos um meio de cultura de células superior 60 e cultiva em seu interior um primeiro tipo de célula 80, o primeiro tipo de célula 80 sendo perfundido pelo ao menos um meio de cultura de células superior 60. De maneira similar, observa-se que cada poço da pluralidade de poços inferiores 40 recebe ao menos um meio de cultura de células inferior 70 e cultiva em seu interior um segundo tipo de célula 90, o segundo tipo de célula 90 sendo perfundido pelo ao menos um meio de cultura de células inferior 70. O uso da membrana semipermeável 50 permitindo que as perfusões dos primeiro e segundo tipos de célula 80, 90 sejam realizadas simultaneamente e independentes entre si.

Configuração com um único poco superior 30 e com um único poco inferior 40

[0039] Em uma configuração onde a placa de cultura 100 tem apenas um único poço superior 30 e um único poço inferior 40, observa-se que o único poço superior 30 será conectado fluidamente aos primeiro e terceiro reservatórios 31 , 33 e o único poço inferior 40 será conectado fluidamente aos segundo e quarto reservatórios 32, 34.

[0040] Preferencialmente, o terceiro reservatório 33 é conectado fluidicamente a uma bomba peristáltica 200, que é conectada fluidica- mente ao único poço superior 30. Este último, por sua vez, é conectado fluidicamente a uma outra bomba peristáltica, que é conectada fluidicamente ao primeiro reservatório 31 . Observa-se assim que o ao menos um meio de cultura de células superior 60 é propulsionado do terceiro reservatório 33 para o primeiro reservatório 31 através das bombas peristálticas 200.

[0041 ] A propulsão do meio de cultura de células superior 60 tem por objetivo realizar a perfusão do primeiro tipo de célula 80 no meio de cultura de células superior 60.

[0042] De maneira similar, o segundo reservatório 32 é conectado fluidicamente a uma bomba peristáltica 200, que é conectada fluidica- mente ao único poço inferior 40. Este último, por sua vez, sendo conec- tado fluidicamente a uma outra bomba peristáltica 200, que é conectada fluidicamente ao quarto reservatório 34. Observa-se assim que o ao menos um meio de cultura de células inferior 70 é propulsionado do segundo reservatório 32 para o quarto reservatório 34 através das bombas peristálticas 200.

[0043] Cumpre destacar que o uso de bombas peristálticas não representa um caráter limitativo da presente invenção. Alternativamente, uma pressurização do sistema 1 pode ser feita, desde que esta alternativa seja capaz de fornecer uma pressurização equivalente àquela fornecida pelas bombas peristálticas.

[0044] A propulsão do meio de cultura de células inferior 70 tem por objetivo realizar a perfusão do segundo tipo de célula 90 no meio de cultura de células inferior 70.

[0045] Observa-se que, preferencialmente, o sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células superior 60 é oposto ao sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células inferior 70.

[0046] Alternativamente, o sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células superior 60 poderia ser o mesmo da propul- são do ao menos um meio de cultura de células inferior 70. Neste caso, o sentido de propulsão de uma das bombas peristálticas 200 ou o sentido da pressurização do sistema 1 teria que ser alterado adequadamente.

[0047] Cumpre destacar que os sentidos da propulsão devem ser selecionados para se atingir a melhor mimetização do microambiente renal. Mais especificamente, o presente sistema 1 é utilizado para testes toxicológicos e entendimento de diferentes vias de sinalização em células renais, embrionárias, neonatais e adultas quando submetidas a condições fisiológicas e a situações que mimetizam modelos de doen- ças renais in vitro. Configuração com uma pluralidade de poços superiores 30 e com uma pluralidade de poços inferiores 40

[0048] Em uma configuração onde a placa de cultura 100 tem uma pluralidade de poços superiores e inferiores 30, 40, os poços da plura- lidade de superiores 30 são conectados fluidicamente e em série com os poços superiores adjacentes e os poços da pluralidade de inferiores 40 são conectados fluidicamente e em série com os poços inferiores adjacentes.

[0049] Tal como ilustrado na Figura 1 , observa-se que, nesta con- figuração, o primeiro poço da pluralidade de poços superiores 30 e o primeiro poço da pluralidade de poços inferiores 40 são conectados fluidicamente e respectivamente ao primeiro reservatório 31 e ao segundo reservatório 32 através das bombas peristálticas 200. As conexões fluídicas entre os poços superiores e inferiores 30, 40 intermediá- rios, isto é, aqueles compreendidos entre os primeiros e últimos poços superiores e inferiores 30, 40, são realizadas através da conexão fluí- dica por tubulações e por bombas peristálticas, conforme ilustrado na Figura 1 . Os últimos poços das pluralidades de poços superiores e inferiores 30, 40 são conectados fluidicamente e respectivamente ao ter- ceiro reservatório 33 e ao quarto reservatório 34 através das bombas peristálticas 200.

[0050] Em conformidade com as conexões fluídicas acima, observa-se que o primeiro reservatório 31 é configurado para receber do primeiro poço da pluralidade de poços superiores 30 o ao menos um meio de cultura de células superior 60 propulsionado ao longo dos poços superiores da pluralidade de poços superiores 30. O segundo reservatório 32 é configurado para fornecer o ao menos um meio de cultura de células inferior 70 ao primeiro poço da pluralidade de poços inferiores 40. O terceiro reservatório 33 é configurado para fornecer o ao menos um meio de cultura de células superior 60 ao último poço da pluralidade de poços superiores 30. O quarto reservatório 34 é configurado para receber do último poço da pluralidade de poços inferiores 40 o ao menos um meio de cultura de células inferior 70 propulsionado ao longo dos poços inferiores da plura- lidade de poços inferiores 40.

[0051 ] Observa-se assim que os ao menos um meio de cultura de células superior e inferior 60, 70 são propulsionados, respectivamente ao longo dos poços da pluralidade de poços superiores e inferiores 30, 40 através de bombas peristálticas 200. O ao menos um meio de cultu- ra de células superior 60 sendo propulsionado do terceiro reservatório 33 para o primeiro reservatório 31 e o ao menos um meio de cultura de células inferior 70 sendo propulsionado do segundo reservatório 32 para o quarto reservatório 34 através das bombas peristálticas 200.

[0052] Cumpre destacar que o uso de bombas peristálticas 200 não representa um caráter limitativo da presente invenção. Alternativamente, uma pressurização do sistema 1 pode ser feita, desde que esta alternativa seja capaz de fornecer uma pressurização equivalente àquela fornecida pelas bombas peristálticas 200.

[0053] As propulsões dos meios de cultura de células superior e inferior 60, 70 têm por objetivo realizar as perfusões dos primeiro e segundo tipos de célula 80, 90 nos meios de cultura de células superior e inferior 60, 70.

[0054] Observa-se que, preferencialmente, o sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células superior 60 é oposto ao sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células inferior 70.

[0055] Alternativamente, o sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células superior 60 poderia ser o mesmo da propulsão do ao menos um meio de cultura de células inferior 70. Neste ca- so, os sentidos de propulsão das bombas peristálticas 200 nos poços superiores 30 ou nos poços inferiores 40 teriam que ser alterados adequadamente. De maneira similar, sendo utilizada uma pressurização do sistema 1 , o sentido desta teria que também ser alterado adequadamente.

[0056] Cumpre destacar que os sentidos da propulsão devem ser selecionados para se atingir a melhor mimetização do microambiente renal. Mais especificamente, o presente sistema 1 é utilizado para testes toxicológicos e entendimento de diferentes vias de sinalização em células renais, embrionárias, neonatais e adultas quando submetidas a condições fisiológicas e a situações que mimetizam modelos de doenças renais in vitro.

Sistema de cultura celular dinâmico 2000 com chips de PDMS e bom- ba-seringa 201

[0057] Observa-se que as Figuras 6 e 7 ilustram o sistema 2000 objeto da presente invenção em sua configuração alternativa e os elementos que o compõem, sendo estes um chip PDMS 1000, primeiro, segundo, terceiro e quarto reservatórios 310, 320, 330 e 340, tubulações e bombas-seringa 201 .

[0058] Nesta configuração, o chip PDMS 1000 é um chip confecci- onado a partir de um material elastômero similar ao silicone (PDMS - polydimethylsiloxane). No caso do PDMS, observa-se que este tem 2 grupos metil ligados ao silicone ((CH ₃ ) ₂ Si-0), tal material sendo largamente utilizado para criação de dispositivos microfluídicos devido ao baixo custo, facilidade de ser moldado, permeabilidade a gases, trans- parência ótica e biocompatibilidade.

[0059] Como pode ser observado a partir das Figuras 3 a 7, o chip PDMS 1000 no presente sistema 2000 é dotado de uma camada superior 300 e de uma camada inferior 400, estas sendo, respectivamente, dotadas de ao menos um micro canal superior e inferior 301 , 401 . Ao confeccionar o chip PDMS 1000, o usuário deve escolher o número desejado de micro canais superiores e inferiores 301 , 401 dependendo do tipo de aplicação. Cumpre destacar, no entanto, que o número de micro canais 301 , 401 não representa um caráter limitativo da presente invenção, de maneira que o chip PDMS 1000 poderia ser confecciona- do para apresentar um único micro canal superior 301 e um único micro canal inferior 401 .

[0060] Cumpre destacar que os micro canais 301 , 401 são utilizados da mesma maneira que os poços superiores e inferiores 30, 40 do sistema 1 anteriormente descritos. Em outras palavras, os micro canais 301 , 401 também têm por objetivo o cultivo simultâneo e independente de diferentes tipos de células perfundidos em diferentes meios de cultura celular, assim como os poços superiores e inferiores 30, 40 do sistema 1 . Como bem ilustrado nas Figuras 3 a 7, observa-se que uma membrana semipermeável 500 é também utilizada, assim como no sis- tema 1 , para separar cada micro canal superior 301 do respectivo micro canal inferior 401 .

[0061 ] Preferencialmente, a membrana semipermeável 500 é confeccionada a partir de policarbonato. Cumpre destacar, no entanto, que o tipo de membrana não representa um caráter limitativo da presente invenção. Alternativamente, a membrana semipermeável 500 poderia ser confeccionada a partir de membranas biocompatíveis, membranas de celulose ou membranas sintéticas como polissulfona, poliamida, po- liacrilonitrila (PAN) e poli meti Imetacri lato (PMMA), desde que estas alternativas tenham características similares ao policarbonato.

[0062] Nesta configuração preferencial e tal como ilustrado nas Figuras 4 a 7, observa-se que cada micro canal superior 301 recebe ao menos um meio de cultura de células superior 600 e cultiva em seu interior um primeiro tipo de célula 800, o primeiro tipo de célula 800 sendo perfundido pelo ao menos um meio de cultura de células superior 600. De maneira similar, observa-se que cada micro canal inferior 401 recebe ao menos um meio de cultura de células inferior 700 e cultiva em seu interior um segundo tipo de célula 900, o segundo tipo de célula 900 sendo perfundido pelo ao menos um meio de cultura de células inferior 700. O uso da membrana semipermeável 500 permitindo que as perfusões dos primeiro e segundo tipos de célula 800, 900 sejam realizadas simultaneamente e independentes entre si.

Configuração com um único micro canal superior 301 e com um único micro canal inferior 401

[0063] Em uma configuração onde o chip PDMS 1000 tem apenas único micro canal superior 301 e um único micro canal inferior 401 , ob- serva-se que o único micro canal superior 301 será conectado fluidamente aos primeiro e terceiro reservatórios 310, 330 e o único micro canal inferior 401 será conectado fluidamente aos segundo e quarto reservatórios 320, 340.

[0064] Preferencialmente, o terceiro reservatório 330 é conectado fluidicamente a uma bomba-seringa 201 , que é conectada fluidicamen- te ao único micro canal superior 301 . Este último, por sua vez, sendo conectado fluidicamente ao primeiro reservatório 310. Observa-se assim que o ao menos um meio de cultura de células superior 600 é pro- pulsionado do terceiro reservatório 330 para o primeiro reservatório 310 através da bomba-seringa 201 .

[0065] A propulsão do meio de cultura de células superior 600 tem por objetivo realizar a perfusão do primeiro tipo de célula 800 no meio de cultura de células superior 600. As Figuras 6 e 7 mostram em deta- lhes as conexões fluídicas no sentido da propulsão acima descrita.

[0066] De maneira similar, o segundo reservatório 320 é conectado fluidicamente a uma bomba-seringa 201 , que é conectada fluidicamente ao único micro canal inferior 401 . Este último, por sua vez, sendo conectado fluidicamente ao quarto reservatório 340. Observa-se assim que o ao menos um meio de cultura de células inferior 700 é propulsio- nado do segundo reservatório 320 para o quarto reservatório 340 através da bomba-seringa 201 .

[0067] Cumpre destacar que o uso de bombas-seringa 201 não representa um caráter limitativo da presente invenção, de maneira que outros meios equivalentes possam ser utilizados, desde que realizem substancialmente a mesma função da bomba-seringa 201 .

[0068] A propulsão do meio de cultura de células inferior 700 tem por objetivo realizar a perfusão do segundo tipo de célula 900 no meio de cultura de células inferior 700. As Figuras 6 e 7 mostram em deta- lhes as conexões fluídicas no sentido da propulsão acima descrita.

[0069] Observa-se que, preferencialmente, o sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células superior 600 é oposto ao sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células inferior 700. As Figuras 6 e 7 mostram que os sentidos de propulsões são distintos.

[0070] Alternativamente, o sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células superior 600 poderia ser o mesmo da propulsão do ao menos um meio de cultura de células inferior 700. Neste caso, a bomba-seringa 201 teria que ser mudada de lugar, por exem- pio, ao invés dela ser conectada fluidicamente ao segundo reservatório 320 ou ao terceiro reservatório 330, esta poderia passar a ser conectada fluidicamente ao quarto reservatório 340 ou ao primeiro reservatório 310.

[0071 ] Cumpre destacar que os sentidos da propulsão devem ser selecionados para se atingir a melhor mimetização do microambiente renal. Mais especificamente, o presente sistema 2000 é utilizado para testes toxicológicos e entendimento de diferentes vias de sinalização em células renais, embrionárias, neonatais e adultas quando submetidas a condições fisiológicas e a situações que mimetizam modelos de doenças renais in vitro. Configuração com uma pluralidade de micro canais superiores 301 e com uma pluralidade de micro canais inferiores 401

[0072] Em uma configuração onde o chip PDMS 1000 tem uma pluralidade de micro canais superiores e inferiores 301 , 401 , os micro canais superiores 301 são conectados fluidicamente e em série entre si, da mesma maneira que os micro canais inferiores 401 são conectados fluidicamente e em série entre si.

[0073] A fim de receber e propulsionar os meios de cultura de células superior 600, o compartimento superior 300 é dotado de uma en- trada superior 302 e de uma saída superior 303. Da mesma maneira, o compartimento inferior 400 é dotado de uma entrada inferior 402 e de uma saída inferior 403, a fim de receber e propulsionar os meios de cultura de células inferior 700. Nesta configuração, as entradas superior e inferior 302, 402 ficam em extremidades opostas do chip PDMS 1000, de maneira que os meios de cultura de células superior e inferior 600, 700, que são inseridos nas entradas 302, 402 sejam propulsionados em sentidos opostos. Da mesma maneira, as saídas superior inferior 303, 403 ficam em extremidades opostas do chip PDMS 1000, de maneira que os meios de cultura de células superior e inferior 600, 700 saiam do chip PDMS 1000 em sentidos opostos.

[0074] Observa-se que a entrada superior 302 é conectada fluidicamente a bomba-seringa 201 , que está conectada fluidicamente ao terceiro reservatório 330. Mediante a propulsão da bomba-seringa 201 , o ao menos um meio de cultura de células superior 600 é inserido na entrada superior 302 e é propulsionado ao longo dos micro canais superiores 301 subsequentes até que chegue no último micro canal superior 301 , que está conectado fluidicamente à saída superior 303. Esta última é então conectada fluidicamente ao primeiro reservatório 310.

[0075] De maneira similar, pode ser notado que a entrada inferior 402 é conectada fluidicamente a bomba-seringa 201 , que está conec- tada fluidicamente ao segundo reservatório 320. Mediante a propulsão da bomba-seringa 201 , o ao menos um meio de cultura de células inferior 700 é inserido na entrada inferior 402 e é propulsionado ao longo dos micro canais inferiores 401 subsequentes até que chegue no últi- mo micro canal inferior 401 , que está conectado fluidicamente à saída inferior 403. Esta última é então conectada fluidicamente ao quarto reservatório 340.

[0076] Observa-se assim que os ao menos um meio de cultura de células superior e inferior 600, 700 são propulsionados, respectivamen- te ao longo dos micro canais poços superiores e inferiores 301 , 401 através de bombas-seringa 201 . O ao menos um meio de cultura de células superior 600 sendo propulsionado do terceiro reservatório 330 para o primeiro reservatório 310 e o ao menos um meio de cultura de células inferior 700 sendo propulsionado do segundo reservatório 320 para o quarto reservatório 340 através das bombas-seringa 201

[0077] Cumpre destacar que o uso de bombas-seringa 201 não representa um caráter limitativo da presente invenção, de maneira que outros meios equivalentes possam ser utilizados, desde que realizem substancialmente a mesma função da bomba-seringa 201 .

[0078] As propulsões dos ao menos um meio de cultura de células superior e inferior 600, 700 tendo por objetivo realizar as perfusões dos primeiro e segundo tipos de células 800, 900 nos meios de cultura de células superior e inferior 600, 700.

[0079] Observa-se que, preferencialmente, o sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células superior 600 é oposto ao sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células inferior 700.

[0080] Alternativamente, o sentido da propulsão do ao menos um meio de cultura de células superior 600 poderia ser o mesmo da pro- pulsão do ao menos um meio de cultura de células inferior 700. Neste caso, a bomba-seringa 201 teria que ser mudada de lugar, por exemplo, ao invés dela ser conectada fluidicamente ao segundo reservatório 320 ou ao terceiro reservatório 330, esta poderia passar a ser conectada fluidicamente ao quarto reservatório 340 ou ao primeiro reservató- rio 310.

[0081 ] Cumpre destacar que os sentidos da propulsão devem ser selecionados para atingir a melhor mimetização do microambiente renal. Mais especificamente, o presente sistema 2000 é utilizado para testes toxicológicos e entendimento de diferentes vias de sinalização em células renais, embrionárias, neonatais e adultas quando submetidas a condições fisiológicas e a situações que mimetizam modelos de doenças renais in vitro.

Tipos de células

[0082] Tendo sido descritos o sistema 1 que faz uso da placa de cultura 100 e o sistema 2000 que faz uso de chip PDMS 1000, serão descritos abaixo os tipos de células que podem ser cultivadas de acordo com os ensinamentos da presente invenção.

[0083] Conforme descritivo anteriormente, os poços superiores 30 e os micro canais superiores 301 são configurados para receber um primeiro tipo de célula 80, 800, sendo estas células endoteliais da veia umbilical humana ou HUVEC {human umbilical vein endotelial cells; ATCC ^® CRL-1730). Por outro lado, os poços inferiores 40, 401 são configurados para receber um segundo tipo de célula 90, 900, sendo estas células epiteliais imortalizadas. Neste caso, os sistemas 1 e 2000 têm por objetivo mimetizar o microambiente renal, ou seja, o compartimento da vasa recta, representado pelas células endoteliais e epiteliais.

[0084] Como é conhecido, as células renais são encontradas em diferentes compartimentos, como os glomérulos que englobam os po- dócitos e as células mesangiais, e o compartimento túbulo-intersticial, incluindo as células do túbulo proximal {Human Renal Proximal Tubular Epithelial Celis ou TH1 , ATCC ^® PCS-400-010), células da alça de Hen- le, células da mácula densa, células do túbulo distai {Madin-Darby ca- nine kidney ou MDCK, ATCC ^® CCL-34) e células do dueto coletor {mouse inner medullary collecting duct-3 ou mlMCD3, ATCC ^® CRL- 2123).

[0085] Alternativamente, os poços superiores 30 e os micro canais superiores 301 podem receber células mesenquimais derivadas da medula óssea (CTM-MO) e os poços inferiores 40, 401 podem receber células mesangiais imortalizadas. Neste caso, os sistemas 1 e 2000 têm por objetivo permitir i) estudos da morfologia e função celulares, do nicho de células-tronco/progenitores renais e geração de células e tecidos para infusão/implante em animais e ii) estudos da disfunção das células mesangiais em meio hiperglicêmico para mimetizar a ne- fropatia diabética e os efeitos das células mesenquimais neste cenário.

[0086] Neste sentido, células-tronco/progenitoras específicas do tecido renal em desenvolvimento, preferencialmente células c-Kit+, podem ser cultivadas nos sistemas 1 e 2000 de forma a recapitular o nicho de tais células, permitindo a manutenção das propriedades cardi- nais das mesmas, como clonogenicidade, autorrenovação, multipoten- cialidade e potencial regenerativo, e, assim, possibilitar estudos de lesões renais.

Tipos de meios de cultura

[0087] Tendo sido descritos o sistema 1 que faz uso da placa de cultura 100 e o sistema 2000 que faz uso de chip PDMS 1000, serão descritos abaixo os tipos de meios de cultura utilizados para perfusão das células a serem cultivadas de acordo com os ensinamentos da presente invenção.

[0088] Conforme descrito anteriormente, o primeiro tipo de célula 80, 800 é perfundido por ao menos um meio de cultura de células su- perior 60, 600. Caso o primeiro tipo de célula 80, 800 seja células en- doteliais da veia umbilical humana ou HUVEC {human umbilical vein endotelial cells; ATCC ^® CRL-1730), estas deverão ser cultivadas no meio endotelial específico {Endothelial cell growth médium contendo fatores de crescimento determinados pelo fabricante, que incluem EGF, VEGF, IGF, bFGF, hidrocortisona, ácido ascórbico e heparina, Lonza) e subcultivadas na proporção de 1 :2 para 1 :3.

[0089] De maneira similar, o segundo tipo de célula 90, 900 é per- fundido por ao menos um meio de cultura de células inferior 70, 700. Caso o segundo tipo de célula 90, 900 seja células do túbulo proximal {Human Renal Proximal Tubular Epithelial Cells ou TH1 , ATCC ^® PCS- 400-010), células do túbulo distai {Madin-Darby canine kidney ou MDCK, ATCC ^® CCL-34) ou células do dueto coletor {mouse inner me- dullary collecting duct-3 ou mlMCD3, ATCC ^® CRL-2123), estas deve- rão ser cultivadas no meio DMEM {Dulbecco's Modified Eagle Médium - Gibco) com soro fetal bovino (Cultilab) a 10% e 100U/ml de penicilina com 100 g/ml de estreptomicina e Clonetics Renal Cell Growth Médium (REGM, Lonza) contendo soro a 5% e suplementos (EGF, hidrocortisona, epinefrina, insulina, triidrotironina, transferrina, gentami- cinin-amphotericin) e subcultivadas na proporção de 1 :5.

[0090] No caso do primeiro tipo de célula 80, 800 ser células me- senquimais derivadas da medula óssea (CTM-MO), estas deverão ser cultivadas no meio DMEM {Dulbecco's Modified Eagle Médium - Gibco) com soro fetal bovino (Cultilab) a 20% e 100U/ml de penicilina com 100 g/ml de estreptomicina.

[0091 ] No caso do segundo tipo de célula 90, 900 ser células me- sangiais imortalizadas, estas deverão ser cultivadas no meio DMEM {Dulbecco's Modified Eagle Médium - Gibco) com soro fetal bovino (Cultilab) a 10% e 100U/ml de penicilina com 100 g/ml de estreptomi- cina (Gibco) e subcultivadas na proporção de 1 :3 a 1 :5. Aplicações do sistema 1 com placa de cultura 100 e do sistema 2000 com chip PDMS 1000 e resultados práticos

[0092] Particularmente, a presente invenção propõe um sistema de cultura celular dinâmico que possui o objetivo de mimetizar o micro- ambiente renal.

[0093] Neste sentido, cumpre destacar que o desenvolvimento de uma plataforma para cultura celular dinâmica para crescimento de dois tipos celulares 80, 90, 800, 900 renais diferentes em poços 30, 40 (sistema 1 ) ou em micro canais 301 , 401 (sistema 2000) perfundidos si- multaneamente, porém independentes, conforme descrito nesta invenção, inclui vantagens técnicas significativas, a saber:

(i) recriação do microambiente renal com maior precisão, pois permite a comunicação parácri na/endócrina entre as células a partir, por exemplo, da secreção de fatores de crescimen- to/citocinas/microRNAs/microvesículas/exossomos. Neste contexto, tal plataforma favorece ainda a localização adequada das bom- bas/cotransportadores na face luminal ou basal dos túbulos renais, já que o microambiente renal está recapitulado in vitro, permitindo, portanto, o funcionamento adequado da fisiologia renal;

(ii) melhores taxas de proliferação e na manutenção da ar- quitetura e do citoesqueleto celulares, haja vista que a perfusão independente com meios diferentes permite o acréscimo de fatores de crescimento específicos para cada tipo celular. Similarmente, a concentração de soro fetal bovino também pode ser adaptada para cada tipo celular. Por exemplo, células endoteliais proliferam com mais eficiência quando cultivadas com VEGF {vascular endothelial growth fator) e com soro fetal bovino a 10%, enquanto que as células mesen- quimais proliferam com soro fetal bovino a 20% e não requerem fator de crescimento. Estes ajustes têm impactos não apenas na performan- ce das células (proliferação, manutenção da arquitetura, viabilidade, etc), mas também na otimização dos custos; e

(iii) a mimetização do sistema conhecido no rim como con- tracorrente, o qual é fundamental para a reabsorção de água e solutos através dos vasos sanguíneos e dos túbulos renais, além de permitir a diferença de gradiente entre os compartimentos tubular e vascular, que é também importante para a absorção de íons, proteínas e solutos ao longo de todos os compartimentos tubulares renais (túbulos proximais, túbulos distais, alças de Henle e duetos coletores), já que tal plataforma produz fluxo de meio de cultura em sentido contrário (bidirecional), preferencialmente.

[0094] Na presente invenção, o meio de cultura 60, 70, 600, 700, por exemplo, entraria em contato com o poço 30, 40 (sistema 1 ) ou micro canal 301 , 401 (sistema 2000) que contém as células podocitárias, passaria para o poço 30, 40 (sistema 1 ) ou micro canal 301 , 401 (sis- tema 2000) que contém as células do túbulo proximal ou mácula densa, depois para o poço 30, 40 (sistema 1 ) ou micro canal 301 , 401 (sistema 2000) que contém as células da alça de Henle e, assim sucessivamente. Este mecanismo recapitula as interações intra- e intercelula- res renais observadas in vivo.

[0095] Deste modo, com a presente invenção é possível analisar o comportamento e a biologia celulares, mimetizar o microambiente renal das células epiteliais/mesangiais/endoteliais, recriar diferentes cenários que existem in vivo (por exemplo, cultivar as células em um ambiente urêmico ou hiperglicêmico), coletar o meio de cultura para análi- se do secretoma destas células, de quimiotaxia/mig ração e de função vascular, realizar estudos metabolomicos de várias células ou single cell, analisar o transcriptoma celular, desenvolver plataformas de lab- on-a-chip, geração de sistemas biológicos automatizados de larga escala, realizar testes toxicológicos para drogas, estudar a biologia do nicho das células-tronco/progenitoras renais, desenvolver cultura em três dimensões (3D), biorreatores e engenharia de tecido, desenvolver organ-on-chip e produtos que podem ser usados nas terapias celulares/de tecido inicialmente em modelos animais de insuficiência renal aguda ou crónica e, posteriormente, para tratamento de doenças renais em seres humanos. Adicionalmente, há ainda a possibilidade de usar esta plataforma também para células de outros órgãos, como estômago, intestino, pâncreas, fígado, pele, dentre outros.

[0096] De modo a corroborar as aplicações apresentadas para a presente invenção, são apresentados abaixo resultados práticos refe- rentes ao estabelecimento do sistema de cultura celular dinâmica proposto.

[0097] Foram plaqueadas células MDCK {Madin-Darby canine kid- ney) e realizada perfusão com meio de cultura preestabelecido. Após o estabelecimento da cultura dinâmica com as células MDCK (velocida- de da bomba peristáltica 200 a 2ml/min, incubadora controlada a 37 , C0 ₂ 5% e 0 ₂ 21 %), foi realizada a comparação com as células MDCK em cultivo estático na placa de cultura 100 de poliestireno (Figuras 8A a 8C). Após 24 h (estática mostrada na Figura 8C), foi observado crescimento importante das células MDCK plaqueadas em uma densidade de 0,8 x 10 ⁶ células/poço e após 96h (estática na Figura 9B e dinâmica na Figura 9B) a diferença de crescimento foi nítida entre as duas plataformas, ressaltando que na cultura dinâmica (Figuras 10A e 10B) houve maior crescimento celular com formação de estruturas semelhantes a camadas de tecidos renais epiteliais, em comparação com a cultura estática (Figuras 9A e 9B). Após 6 dias de cultivo das células MDCK, a viabilidade das células foi 86% {versus 88% quando cultivadas na cultura estática).

[0098] Com relação aos chips PDMS 1000, foi realizado o plaque- amento das células MDCK em um dos micro canais dos chips (0,1 x10 ⁶ ) e a troca do meio diariamente por 5 dias (5μΙ), sendo observada proliferação das células de acordo com o tempo, apesar de serem observadas também algumas células mortas (Figura 1 1 ).

[0099] Tendo sido descrito um exemplo de concretização preferido, deve ser entendido que o escopo da presente invenção abrange outras possíveis variações, sendo limitado tão somente pelo teor das reivindicações apensas, aí incluídos os possíveis equivalentes.