Herkömmliche Enzymimmunoassays beruhen auf der Ver- wendung von Enzymen, z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Galaktosidase etc. und den entspre- chenden Substraten als Detektionssysteme. Dabei wird das Enzym an einen der Reaktionspartner, beispiels- weise einen Antikörper gekoppelt und damit die Spezi- fität von immunologischen Reaktionen mit einer enzy-

fität von immunologischen Reaktionen mit einer enzy- matischen Reaktion kombiniert. Der enzymgekoppelte Reaktionspartner bindet beispielsweise spezifisch dicht oder über weitere Mediatoren, beispielsweise Antikörper, an das zu erfassende Antigen, Hapten oder den zu erfassenden Antikörper und wird dadurch immo- bilisiert. Nach Auswaschen der nichtimmobilierten Re- aktionspartner wird Substrat zugegeben, so daß die enzymatische Reaktion gestartet wird, wobei in her- kömmlicher Weise aus dem Substrat mittels der enzyma- tischen Reaktion ein photometrisch oder fluorome- trisch nachzuweisendes Reaktionsprodukt erzeugt wird.

Als Reaktionspartner werden dabei häufig monoklonale Antikörper eingesetzt, die hochspezifisch für die nachzuweisende Substanz oder den nachzuweisenden Or- ganismus sind. Enzymimmunoassays können dabei als kompetitive und nichtkompetitive Tests in den ver- schiedensten Kombinationen durchgeführt werden.

Üblich ist es heutzutage, Enzymimmunoassays als Fest- phasen-Immunotests durchzuführen, beispielsweise als ELISA.

Die vorliegende Erfindung geht dabei aus von herkömm- lichen Enzymimmunoassays (EIA) oder enzymgekoppelten Immunoassays (ELISA), bei denen ein Farbnachweis zur Quantifizierung oder Erfassung eines Analyten in ei- ner Probe angewendet wird. Dieser Farbnachweis wird gewöhnlicherweise mit einem optischen Detektor durch- geführt.

Figur 1 zeigt ein Beispiel für den Aufbau und die Durchführung eines derartigen EIA. Als erstes wird ein Antigen Ag an einer Mikrotiterplatte 1 immobi- lisiert, das spezifisch einen gesuchten Antikörper Ab

binden kann. Daraufhin wird auf die Mikrotiterplatte 1 eine zu untersuchende Probe gegeben, die gegeben- enfalls Antikörper Ab als Analyt enthält. Dieser bin- det dann an das immobilisierte Antigen Ag und wird dadurch selbst immobilisiert. Die Probe wird darauf- hin ausgewaschen, so daß nur die immobilisierten An- tigene Ag und Antikörper Ab auf der Mikrotiterplatte verbleiben. In einem dritten Schritt wird ein weite- rer Antikörper Ab-Enz auf die Mikrotiterplatte gege- ben, der seinerseits spezifisch an den Antikörper Ab bindet und an den ein Enzym gekoppelt ist. Dieses En- zym ist dabei so gewählt, daß es bei Zugabe eines be- stimmten Substrates eine Farbreaktion auslöst. Die Intensität der Farbreaktion hängt dabei proportional von der Menge an immobilisiertem Enzym ab, die wie- derum der Menge an Antikörper Ab entspricht. Als En- zyme kommen dabei beispielsweise herkömmlicherweise alkalische Phosphatase oder Wasserstoffperoxidase zum Einsatz. Für diese Enzyme sind aus der Literatur ver- schiedenste Substrate bekannt.

Um die Farbreaktion der Enzyme zu stoppen, wird ge- wöhnlich nach einer gewissen Reaktionszeit nach der Zugabe von Substrat die Farbreaktion mittels einer stark sauren oder basischen Lösung gestoppt. Darauf- hin kann die optische Dichte bei bestimmten Wellen- längen, die Absorptionsbanden des Substrates bzw. des Produktes entsprechen, gemessen werden und so die Menge an Antikörper Ab bestimmt werden.

Es sind auch elektrochemische Immunoassays bekannt, bei denen Einmal-Elektroden mit hierfür speziellen Enzymen und Meditatoren als Einheit kombiniert wer- den. Nachteilig daran ist, daß nach jedem Test die gesamten Elektroden zu entsorgen sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nunmehr ausgehend von den herkömmlichen Enzymimmunoassays, bei denen eine Farbreaktion optisch detektiert wird, ein Verfahren anzugeben, bei denen unter Verwendung dieser herkömmlichen Enzymimmunoassays auf nichtop- tische Weise ein Analyt in einer Probe erfaßt und quantifiziert werden kann.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren durch Anspruch 1 sowie durch die Vorrichtung nach Anspruch 7 gelöst.

Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung wer- den in den abhängigen Ansprüchen gegeben.

Ausgehen von den oben beschriebenen herkömmlichen En- zymimmunoassays, die ein Enzym einsetzen, das unter Zugabe eines Substrates eine Farbreaktion auslöst, wurden diese Enzymimmunoassays erfindungsgemäß da- durch weiterentwickelt, daß Elektroden in die Probe eingebracht werden und die Probe elektrochemisch ver- messen wird. Grundlage für diese Möglichkeit ist da- bei die Erkenntnis, daß der Schritt, mit dem die En- zymtätigkeit beendet wird (Zugabe einer sauren oder basischen Lösung) lediglich die Enzyme deaktiviert, jedoch die bereits eingefärbten Substrate (reduziert bzw. oxidiert) nicht zerstört. Dadurch kann deren Re- dox-Zustand zur Messung verwendet werden.

Denn die quantitative Farbentwicklung erfolgt auf- grund eines Elektronentransfers zwischen den Substra- ten. Dies bedeutet, daß die Farbreaktion durch das Enzym mittels Oxidations-und Reduktionsreaktionen der Substrate erfolgen. Abweichend von herkömmlichen Enzymimmunoassays kann nunmehr jedoch die Menge an oxidiertem und reduziertem Substrat elektrochemisch bestimmt werden. Diese Menge an oxidiertem und redu-

ziertem Substrat ist proportional der optischen Dich- te bei der entwickelten Farbe der Enzymreaktion. Es ist daher bei herkömmlichen Farb-Enzymimmunoassays nicht nur möglich, die Farbreaktion des Enzyms op- tisch zu erfassen sondern auch erfindungsgemäß durch ein elektrochemisches Verfahren den Analyten zu er- fassen und quantitativ zu bestimmen.

Vorteilhaft ist dabei insbesondere, daß die herkömm- lichen, bereits zur Verfügung stehenden optischen En- zymimmunoassays eingesetzt werden können, jedoch die Vermessung und Auswertung nicht optisch sondern elek- trochemisch erfolgt. So können sämtliche bereits er- hältlichen Enzymimmunoassays (EIA und ELISA) prob- lemlos eingesetzt werden. Insbesondere profitiert das elektrochemische Verfahren nach der Erfindung von der bereits weitgehenden Automatisierung (z. B. Mikroti- terplatten) herkömmlicher optischer Enzymimmunoas- says.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung, die sich zur Durch- führung des Verfahrens eignet, weist nunmehr minde- stens eine Elektrodeneinheit mit mindestens einer Ar- beitselektrode und mindestens einer Referenzelektrode auf sowie einen Potentiostaten zur Konstanthaltung des elektrischen Potentiales zwischen der Arbeitse- lektrode und der Referenzelektrode und zur Erzeugung eines elektrischen Ausgangssignales. Weiterhin weist diese Vorrichtung eine Spannungsversorgung für die Elektrodeneinheit auf.

Im Falle eines Enzymimmunotestes, der auf einer Mi- krotiterplatte durchgeführt wird, können entweder die Elektrodeneinheiten oder auch die Mikrotiterplatte selbst verschiebbar sein, um jeweils die Arbeitselek- troden in die einzelnen Näpfchen der Mikrotiterplatte

einzubringen und die Messung durchzuführen. Alterna- tiv können auch für jedes einzelne Näpfchen eine ei- gene Arbeitselektrode und eine Referenzelektrode in der Näpfchenanordnung einer Mikrotiterplatte entspre- chenden Abständen zur Verfügung gestellt werden.

Die Auswertung der Signale des Potentiostaten er- folgt, nach Wandlung in digitale Signale, vorzugs- weise mittels eines Mikroprozessors.

Im folgenden wird beispielhaft eine erfindungsgemäße Vorrichtung bechrieben.

Figur 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Elektrodeneinheit 2, die in ein Näpfchen einer Mikrotiterplatte paßt. Weiterhin weist diese Vorrich- tung einen Potentiostaten 3 zur Erzeugung des Reduk- tions/Oxidationspotentiales und zur Erzeugung eines Ausgangssignales eine Spannungsversorgung 4 für den Potentiostaten einen Analog/Digitalwandler 5 sowie einen Mikroprozessor 6 auf.

Zur Messung werden nun die Elektroden der Elektroden- einheit in ein Näpfchen einer Mikrotiterplatte einge- führt und der bei einem konstanten Reduktions/Oxi- dations-Potential erzeugte Strom gemessen. Dieser ist proportional zu der Menge an oxidiertem bzw. redu- ziertem Farb-Substrat und damit proportional zu der Menge an zu erfassendem Analyten. Diese amperometri- sche Analyse wird ebenfalls, wie bei der optischen Erfassung, unmittelbar nach der Beendigung der enzy- matischen Reaktion mittels einer sauren bzw. alkali- schen Lösung durchgeführt.

Der Potentiostat 3 erzeugt analoge Signale und gibt diese an den Analog/Digital-Wandler 5 aus, der die

analogen Signale in digitale Signale wandelt und die- se an den Mikroprozessor 6 ausgibt, wo eine Auswer- tung und Darstellung der Daten erfolgt.

Figur 3 zeigt ein typisches Signal einer amperomet- rischen Messung wie oben beschrieben. Dieses Signal wurde mit einer Mikrotiterplatte gemessen, die mit einer Meerrettich-Peroxidase beschichtet war. Es han- delt sich daher nicht um ein eigentliches enzymge- koppeltes Immunoassaysystem, zeigt jedoch die Anwend- barkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens für Enzym- immunoassaysysteme.

Für die Messungen aus Fig. 3 wurden Proben mit unter- schiedlichen optischen Dichten hergestellt. Hierzu wurde eine Mikrotiterplatte, die mit verschiedenen Konzentrationen einer Meerrettichperoxidase beschich- tet. Daraufhin wurde eine Farbreaktion mit einer Sub- stratlösung durchgeführt, wie im folgenden beschrie- ben : a. Es wurden verschiedene Konzentrationen von Meer- rettichperoxidaxelösung auf einer Mikro- titerplatte hergestellt durch Reinverdünnung mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.0). Nach Inku- bation für 30 min bei Zimmertemperatur wurde die Platte dreimal mit dem Phosphatpuffer gewaschen. b. Um die Farbreaktion durchzuführen wurde die mit Meerrettichperoxidase beschichtete Mikrotiter- platte mit einer Lösung von 3,3'-, 5,5'- Tetra- methylbenzidin (TMB) behandelt, die auf herkömm- liche Weise hergestellt wurde. Nach Inkubation für 30 min wurde die Reaktion mit 2 M schwef- liger Säule gestoppt. Die optische Dichte wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, wozu

ein ELISA-Lesegerät verwendet wurde.

Nachdem die optische Dichte gemessen wurde, wurde dieselbe Probe einer elektrochemischen Messung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen. Das Po- tential zwischen der Arbeits-und der Referenz- elektrode wurde mittels eines Potentiostaten auf 0,45 V gehalten. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde das Si- gnal von den Elektroden für 100 s für jede einzelne Probe bei Zimmertemperatur bestimmt. Vor und nach je- der Messung wurde die Basislinie (BL) durch Eintau- chen der Elektrode in TMB-Lösung bestimmt, die mit 2 M schwefliger Säule behandelt wurde. Da die Proben- lösung auf der Elektrode die TMB-Lösung für die Grundlinienmessung kontaminieren könnte, wurde die Elektrode mehrfach mit destilliertem Wasser gespült, bevor sie in die TMB-Lösung eingetaucht wurde.

Der erste Teil (0-100 s) und der dritte Teil (200- 300 s) des Gesamtsignals entsprechen der Grundlinie, die bei einer nichtgefärbten Substratlösung gemessen wird. Der zweite Teil des Signals (100-200 s) zeigt eine signifikante Änderung gegenüber der Grundlinie, die einer Farbreaktion des Substrates entspricht.

Dieser zweite Teil des Signals wurde in einer gefärb- ten Lösung erhalten, die eine optische Dichte von 0,52 aufwies.

Nicht dargestellte Messungen ergaben, daß die elek- trochemische Analyse der Enzymreaktion im Bereich op- tischer Dichten zwischen 0 und 3 elektrische Signale ergibt, die proportional zu der optischen Dichte sind. Damit eignen sich die elektrochemischen Signale in gleicher Weise wie die optischen Signale eines En- zymimmunoassays zur Bestimmung und Quantifizierung eines Analyten.

Eine derartige elektrochemische Bestimmung eines En- zymimmunoassays wird nun in Fig. 4 dargestellt. Hier- zu wurde ein im Handel erhältlicher EIA-Typ Diagno- stik-Kit für den HIV-Virus (AIDSDIA 1/2, hergestellt von Dong-A Pharmaceutical Co. Ltd. in Seoul, Korea) verwendet. Dabei wurden sämtliche experimentellen Schritte gemäß dem Protokoll dieses Kits durchge- führt. Eine negative und eine positive Kontrollprobe, die in dem Kit enthalten sind, wurden für den hier durchgeführten Test verwendet und es wurde eine vier- fache Probenerfassung durchgeführt, d. h. n = 4.

Die Messungen in Fig. 4 wurden für die optische Dich- te bei einer Wellenlänge von 450 nm durchgeführt. BL stellt in Fig. 4 die Grundline der Messung mit einer TMB-Lösung dar. Die drei Proben, die mit einer opti- schen Dichte von 0,05 bezeichnet sind, entsprechen den Negativkontrollproben, während die drei Proben mit einer optischen Dichte von 0,62,0,62 bzw. 0, 73 den Positivkontrollen entsprechen. Die durch- schnittliche optische Dichte der Grundlinien-Proben (n = 4) entsprach genau der optischen Dichte der Ne- gativkontrollproben.

Der Durchschnittswert der optischen Dichte gemessen bei 450 nm für die Negativkontrolle (n = 4) betrug 0,65 mit einer Standardabweichung von 0,05. Der Durchschnittswert der optischen Dichte für die Posi- tivkontrolle (n = 4) betrug 0,05 mit einer Stan- dardabweichung von 0. Werden die Richtlinien für die Interpretation des Ergebnisses gemäß dem verwendeten Kit berücksichtigt, so entsprechen diese Werte kor- rekten Ergebnissen für eine Negativkontrolle und eine Positivkontrolle.

Nach der Messung der optischen Dichte wurde die elek- trochemische Messung durchgeführt. Wie in Fig. 4 dar- gestellt, wird bei dem entsprechenden elektro- chemischen Signalen die entsprechende gemessene opti- sche Dichte der Probe angegeben, um den Vergleich zu erleichtern. Wie oben beschrieben, wurde die Grundli- nie mittels einer TMB-Lösung bestimmt, die durch 2 M schweflige Saure gequenscht wurde. Jede Messung wurde für 100 s bei Zimmertempertur durchgeführt. Der Un- terschied des elektrochemischen Signales zwischen ei- nem negativen Signal und einem positiven Signal ist in Fig. 4 offensichtlich groß genug, um eine richtige Bestimmung des Assay-Ergebnisses durchzuführen. Zwi- schen der Grundlinie BL und dem Signal der negativen Kontrollprobe besteht nur eine geringe Differenz.

Dies entspricht der Tatsache, daß die optische Dichte der Grundlinie BL identisch mit der optischen Dichte der Negativkontrolle, d. h. einer optischen Dichte von 0,05, bestimmt wurde. Die Fig. 4 zeigt also deutlich, daß eine elektrochemische Messung direkt auf herkömm- liche EIA-oder ELISA-Kits angewandt werden kann.

Zusammenfassend soll noch einmal festgestellt werden, daß bisherige elektrochemische Verfahren in Immuno- ssays im wesentlichen mit Elektroden arbeiteten, die fest gebundene Enzyme und Mediatoren aufwiesen und als Einmalelektroden bzw. Wegwerfelektroden verwech- selt werden. Demgegenüber gibt die vorliegende Anmel- ung ein Verfahren an, bei dem unmittelbar herkömiche EIA oder ELISA-Systeme elektrochemisch vermessen wer- den können. Anders gesagt können die gefärbten Sub- trate wie im Falle einer optischen Messung mittels einer elektrochemischen Methode erfaßt werden. Dies erfolgt vorteilhafterweise durch amperometrische Ver- fahren. Entscheidend bei dem vorgestellten Verahren ist dabei, daß herkömmliche EIA und ELISA-Systeme oh- ne jegliche Veränderungen angewandt werden können.