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Die Erfindung betrifft freigelegte reife Embryonen von Nutz¬ pflanzen als Aufnahmesystem für fremde genetische Informa¬ tion in Form von DNA oder RNA. Ferner betrifft die Erfindung offengelegte reife Embryonen von Nutzpflanzen mit einem Ge- 10 halt an eingeschleuster fremder genetischer Information,

Verfahren zur Herstellung der genannten Embryonen und ihre Verwendung zur Regenerierung und Züchtung von transgenen Nutzpflanzen.

15 Agrobacterium tu efaciens als gut untersuchtes und einfach zu handhabendes Gentransfersystem, in der Hauptsache für di- cotyle Pflanzen, ist bisher auf nur wenige monocotyle Pflan¬ zen angepaßt worden. Ein direkter Gentransfer auf Pflanzen, d.h. ein Gentransfer ohne bakterielle oder virale Vektoren

20 ist daher eine alternative Transfor ationsmethode und könnte . für Pflanzen, die schlechte Wirte für Agrobacterium darstel¬ len, zu größerer Bedeutung gelangen. Gerade zu diesen Pflan¬ zen zählen viele wirtschaftlich bedeutsame und gentechnolo¬ gisch bisher kaum handhabbare Nutzpflanzen, insbesondere die

25 Getreidepflanzen und Leguminosen.

Etabliert ist der Einsatz von Protoplasten als Objekt für den direkten Gentransfer. Dies gilt auch für Protoplasten von Getreidepflanzen. Bisher ist es aber nur in Ausnahme- 30 fällen gelungen, Getreideprotoplasten zu reifen Pflanzen zu regenerieren. Deshalb uß weiter nach alternativen Wegen gesucht werden.

Mit der Arbeit von De la Pena et al., Nature 325 (1987) 35 274-276, ist ein neuer Weg des direkten Gentransfers auf eine Nutzpflanze erstmals erfolgreich eingeschlagen worden. Plasmid-DNA wurde in junge Roggenähren etwa 2 Wochen vor der

Meiose injiziert. In der Fl-Generation wurden transformierte Pflanzen selektiert. Außer dieser Methode wurden auch Metho¬ den beschrieben, denen die Inkubation verschiedener Explan- tate mit nackter DNA gemeinsam ist.

Die Behandlung von Pollen, Samen, Keimlingen oder multizel¬ lulären Strukturen höherer Pflanzen mit fremder DNA ist be¬ reits bekannt, wird aber wegen des Fehlens eingehender Be¬ weise kontrovers diskutiert.

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Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues System zum Einschleusen fremder genetischer Information in Nutzpflanzen, insbesondere in Getreidepflanzen und in Legu¬ minosen, bereitzustellen. rε

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

20 Gegenstand der Erfindung sind somit freigelegte reife Em¬ bryonen von Nutzpflanzen als Aufnahmesystem für fremde gene¬ tische Information in Form von DNA oder RNA.

Embryonen reifer Samen sind in der Lage während der Quel— 25 lung, im isolierten Zustand oder im Samen (beispielsweise mechanisch freigelegt) , fremde genetische Information aufzu¬ nehmen. Diese "fremde genetische Information" kann sowohl DNA als auch RNA sein, die sich selbst repliziert und infek¬ tiös ist oder stabil in das Genom integriert ist. In glei- 30 eher Weise werden Viroide oder Viren vom Begriff "fremde ge¬ netische Information" erfaßt. Als "fremde genetische Infor¬ mation" wird auch eine genetische Information bezeichnet, die natürlich in der Nutzpflanze vorkommt, jedoch zur Erzie¬ lung phänotypischer Veränderungen zusätzlich in weiteren Ko- 35 pien in"die Nutzpflanze eingebracht wird, beispielsweise können auf diesem Weg natürlich in der Nutzpflanze vorkom¬ mende Gene amplifiziert werden. Neben Embryonen reifer Samen

ist es aber auch möglich, in einen samenruheähnlichen Zu¬ stand überführte, so atische Embryonen oder künstliche Samen (artificial seeds) einzusetzen.

Gegenstand der Erfindung sind ferner offengelegte reife Em¬ bryonen von Nutzpflanzen mit einem Gehalt an eingeschleuster fremder genetischer Information in Form von DNA oder RNA.

Die Begriffe "offengelegt", "freigelegt" und "isoliert" sind hier folgendermaßen definiert:

Als offengelegte Embryonen werden erfindungsgemäß Embryonen bezeichnet, deren Samenschale zumindest teilweise entfernt ist, so daß der Embryo für eine fremde genetische Informa- tion in Form von DNA oder RNA zugänglich wird. Der Begriff offengelegte Embyonen ist somit als Oberbegriff zu ver¬ stehen.

Bevorzugte Ausführungsfonri _ß n der erfindungsgemäßen offenge- legten Embryonen mit einem Gehalt an fremder ^" genetischer In¬ formation sind isolierte Embryonen und freigelegte Em¬ bryonen.

Mit dem Begriff "isolierte Embryonen" werden Embryonen be¬ zeichnet, die vom Speichergewebe des Samens abgetrennt sind. Ein Verfahren zur Herstellung isolierter Weizenembryonen ist aus Johnston & Stern, Nature 179 (1957) , Seiten 160 bis 161, bekannt. Johnston & Stern beschreiben jedoch nicht die Ver¬ wendung solcher Embryonen zur Regenerierung und Züchtung transgener Nutzpflanzen. Mit dem Begriff "freigelegte Embryonen" werden Embryonen be¬ zeichnet, die sich noch im strukturellen Verband des Samens befinden und bei denen die Samenschale derart geöffnet ist, daß die fremde genetische Information in den Embryo gelangen kann. Die freigelegten Embryonen werden erfindungsgemäß be- sonders ^' bevorzugt, da sich ausgehend von freigelegten Em¬ bryonen bei άer Regenerierung und Züchtung transgener Nutz-

pflanzen eine noch höhere Ausbeute an regenerierten Pflanzen erzielen läßt, als mit isolierten Embryonen.

Der Zusammenhang der Begriffe "offengelegte", "freigelegte" und "isolierte" Embryonen kann also folgendermaßen ver¬ deutlicht werden:

Offengelegte Embryonen (Samenschale ist ganz oder teilweise entfernt)

Isolierte Embryonen Freigelegte Embryonen (Samenschale und Speichergewebe (Samenschale ist nur sind vollständig entfernt; vgl. geöffnet bzw. teil¬ Johnston und Stern) weise entfernt; erst¬ mals in dieser Erfin¬ dung beschrieben)

Erfindungsgemäß kann die fremde genetische Information ent- weder frei in den Zellen vorliegen, oder in das Genom der Zellen integriert sein. Eine in den Zellen der Embryonen frei vorliegende genetische Information könnte man auch als "gentechnologischen Pflanzenschutz" bezeichnen.

Offengelegte Embryonen können als Pforte für genetische In¬ formation dienen, die sich selbst vermehrt und in der Pflanze ausbreiten kann, mit dem Ziel, auf die ganze aus dem Embryo entstehende Pflanze überzugreifen bzw. diese zu in¬ fizieren.

Embryonen können für einen begrenzten Zeitraum das Genpro¬ dukt fremder genetischer Information herstellen, welches mit den heute üblichen Meßmethoden zu erfassen ist. Damit be¬ steht eine Alternative zur Messung der transienten Expres- sion chimärer Gene in den aufwendiger zu handhabenden Proto¬ plasten. Es ist eine gewebespezifische Expression zu erwar¬ ten, da es sich um ein vollständiges Gewebe handelt. Die

Spezifität der Expression läßt sich ferner durch Verwendung bestimmter Promotoren steuern.

Die erfindungsgemäßen offengelegten reifen Embryonen von Nutzpflanzen werden vorzugsweise durch mechanische Behand¬ lung des Samens erhalten. Durch das Entfernen z.B. durch Ab¬ schleifen der Samenschale im Bereich des Embryos, kann der Embryo freigelegt werden. Dabei erfolgt das Abschleifen der Samenschale derart, daß der Embryo für eine fremde gene- tische Information in Form von DNA oder RNA zugänglich wird, jedoch in seiner Keimfähigkeit nicht wesentlich beeinträch¬ tigt wird. Das erfindungsgemäße Abschleifen der Samenschale ist schonend für den Embryo und rasch durchführbar. Daher wird es erfindungsgemäß ermöglicht, in kurzer Zeit zahlrei- ehe Nutzpflanzen ausgehend von behandelten Embryonen zu züchten, die einen Gehalt an fremder genetischer Information aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von offengelegten reifen Embryonen von Nutzpflanzen mit ei¬ nem Gehalt an eingeschleuster fremder genetischer Informa¬ tion in Form von DNA oder RNA, bei den man offengelegte reife Embryonen von Nutzpflanzen mit einer wäßrigen Lösung der genetischen Information in Form von DNA oder RNA behan- delt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt der Wassergehalt der Embryonen höchstens etwa 20 Gew.-%.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens hat die wäßrige Lösung einen pH-Wert von 3 bis etwa 11.

Die erfindungsgemäßen offengelegten reifen Embryonen von

Nutzpflanzen sind hervorragend zur Regenerierung und Züch¬ tung transgener Nutzpflanzen geeignet. Insbesondere sind sie

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zur Regenerierung von Getreidepflanzen und Leguminosen ge¬ eignet. Die Regenerierung und Züchtung der transgenen Nutz¬ pflanzen ausgehend von den erfindungsgemäßen Embryonen kann in an sich bekannter Weise erfolgen.

Bei der Erarbeitung der erfindungsgemäßen Lösung wurden zunächst Experimente zur transienten Expression durchge¬ führt. Der Leitgedanke war dabei zunächst eine Expression bestimmter chimärer Gene für einige Tage (also transient) zu erreichen. Chimäre Gene sind in vitro zusammengefügte DNA- Bausteine,_ die ein funktionsfähiges künstliches Gen bilden und z.B. auf einem Plasmid lokalisiert sind. Die folgende Tabelle I zeigt darauf aufbauend die erfindungsgemäße Stra¬ tegie am Beispiel des Weizens.

Tabelle I

Transie_ι_e Expression chimärer Gene in isoliercen Weizenembrvonen

.

ReDroduzier arkeic

Mechanismus er _ Oocimierung der

DN ^' -Aufnahme D A-Expression

TranscormacLon

Nachfolgend werden experimentelle Ergebnisse beschrieben, angefangen von der Beobachtung einer gelegentlichen Expres¬ sion eines Chimären Gens, über die Suche nach reproduzierba- ren Bedingungen, dem Versuch einer Klärung des Mechanismus der DNA-Aufnahme, verknüpft mit dem Streben nach einer Opti¬ mierung der Expression, bis hin zu Experimenten, aufbauend

auf den gewonnenen Erkenntnissen, die zu transient oder sta¬ bil transformierten Pflanzen führen können. Das bedeutet, daß aus den behandelten Embryonen auch Pflanzen regeneriert werden können, die selbst oder deren Nachkommen transfor- miert sind, also fremde genetische Information enthalten, die gegebenenfalls in ihrem Genom integriert ist. Die Rege¬ neration der behandelten Embryonen erfolgt nach üblichen Verfahren, nämlich beispielsweise durch Kultur auf gewöhnli¬ chen Nährböden nach Kallusinduktion, Induktion somatischer Embryogenese oder unter Ausnutzung der natürlichen Nähr¬ stoffreserven des Samens.

Die in Tabelle I oben verwendeten Begriffe werden nachfol¬ gend erläutert.

Reproduzierbarkeit

In den ersten Experimenten mit Weizenembryonen lagen die Hauptschwierigkeiten in .der Reproduzierbarkeit. Zunächst waren mit 15 mg"isolierten Embryonen gelegentlich NPT II

Signale beobachtet worden. Erst die Erhöhung der Embryomenge auf 300 mg ergab reproduzierbare, wenn auch in der Intensi¬ tät unterschiedliche NPT II Signale (Fig. la) . Diese Schwan¬ kungen können als experimentelle Abweichungen angesehen wer- den, aber auch als eine verschieden starke DNA-Aufnähme und DNA-Expression einzelner Embryonen.

Abgesehen von der Tatsache, daß die NPT II Signale in drei identisch angelegten, aber unabhängig voneinander durchge- führten Experimenten gefunden wurden, müssen diese Daten doch kritisch betrachtet werden. Endogene Signale können ausgeschlossen werden, da in keinem Fall NPT II Aktivität in Extrakten von Embryonen ohne DNA-Behandlung gefunden wurden. Kontaminationen in Form von Bakterien oder Pilzen als Ursa- ehe für die beobachteten NPT II Signale können weitgehend ausgeschlossen werden. Gegen Bakterien wurde ClaforarlS/dem Medium zugesetzt und Pilze waren während der Kultur nicht

sichtbar. Traten dennoch Pilzkontaminationen im Laufe der

Kultur auf, so wurden diese Teile verworfen. Weiterführende Versuche mit Fungiziden oder Sterilisierung der Embryonen, um Langzeitkulturen anzulegen, schlugen fehl. Statt dessen wurde auf eine Kultur von angeschliffenen Samen ausgewichen. Werterhin zeigten Kontrollexperimente mit Endospermstücken (berechnet auf gleiches Frischgewicht nach der Kultur) keine NPT II Aktivität.

Mechanismus der DNA-Aufnahme

Nachdem die Reproduzierbarkeit erwiesen war, stellten sich die in enger Wechselwirkung stehenden Fragen nach dem Mecha¬ nismus der DNA-Aufnahme und der Optimierung der NPT II EX- pression. Zwei Barrieren muß die DNA überwinden, um zunächst einmal das Cytoplasma zu erreichen: Zellwand und Plasma¬ lemma.

Die Wanderung von DNA-Molekülen durch Zellwände scheint un- möglich, es sei denn, der trockene Embryo weist gewisse Be¬ sonderheiten auf. Carpita et al., Science 205 (1979), 1144- 1147, bestimmten die Porengröße in Zellwänden von Acer pseudoplatanus Suspensionskulturzellen mit 3,8 bis 4 nm. Das entspricht einer freien Permeabilität für Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1300 bis 1600 und im Ver¬ gleich dazu für ein globuläres Protein bis zu 17000 d bei entsprechendem Molekülradius. Das aber dürfte viel zu klein sein für das Durchschlüpfen eines Plasmids von 4,15 kb (2,7 x 10 ⁶ d) . Wieso kann aber dennoch transiente Expression in Embryonen beobachtet werden? Der Vergleich von Suspen¬ sionskulturzellen mit den "plasmareichen und zartwandigen Zellen" eines Embryos ist nur mit Einschränkungen erlaubt. So befinden sich Suspensionskulturzellen nicht in einem geordneten Zellverband und ihr Zellwandaufbau dürfte von dem der Embryonen verschieden sein. Zudem können die Quellungs¬ vorgänge die ^' Penetrierfähigkeit von Makromolekülen beein-

flussen, was letztlich zu den oben angedeuteten Besonderhei¬ ten des trockenen Embryos zu zählen ist.

Ein anderer Weg der DNA durch die Zellwand könnte über Ver- letzungen des Embryos als Folge der Isolierung (Fig. lb) oder des Anschleifens führen.

Das bedeutet, daß nur an verletzte Stellen grenzende Zellen fremde DNA aufnehmen können und für die Expression verant- wortlich sind, es sei denn, es erfolgt eine Wanderung der DNA-Moleküle von Zelle zu Zelle durch Plasmodesmen.

Die zarten Zellwände embryonaler Zellen während der Quellung oder die Verletzungen sind mögliche Ursachen die bestehende Barriere Zellwand zu passieren. Das Plasmalemma ist damit aber noch nicht überwunden. Es ist allgemein bekannt, daß DNA die Zellmembran nicht passieren kann. Chemische Agen¬ zien, Elektropulse oder beides, zusammen werden erfolgreich eingesetzt, um die Kontrollfunktion des Plasmalemma zu umge- hen und transiente Expression in Protoplasten zu erreichen. Erfindungsgemäß (Fig. la und 2) wurde gezeigt, daß auch ohne solche Hilfsmittel eine transiente Expression vorhanden ist, aber beispielsweise mit DMSO verstärkt werden kann. Der trockene Embryo scheint daher über besondere Eigentümlich- keiten zu verfügen. Daß das frühe Stadium der Quellung kri¬ tisch ist, belegen sowohl Studien der Ultrastruktur, als auch Beobachtungen zur Permeabilität.

Eine DNA-Aufnähme, gemessen als NPT II Expression, erfolgt am besten in trockene Embryonen mit einem Wassergehalt von höchstens etwa 20 Gewichtsprozent. Je weiter die Quellung fortgeschritten ist, desto geringer fällt die Expression aus (Fig. 2) . Dies steht in Einklang mit der möglichen Rekonsti- tution der Zellmembran. Ebenso entspricht der Einfluß von DMSO dieser Vorstellung, indem es die Membranrekonstitution oder allgemein die Membranpermeabilität beeinflussen könnte (Fig. 3) .

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Optimierung der NPT II-Expression

Nach den Untersuchungen zum Mechanismus der DNA-Aufnahme, galt das Hauptinteresse der Optimierung der NPT II Ex¬ pression, um mit den erreichten Verbesserungen Versuche zur stabilen Transformation unternehmen zu können.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß DMSO, bei Weizen- embryonen im Optimum 20 %, einen fördernden Einfluß (Fig. 3, Mitte) auf. die NPT II Expression hat.

Zwei weitere Experimente führten zu verbesserten Bedingungen für transiente Expression. Anstatt 300 mg trockener Embryo- nen pro Versuch (Fig. la und 2) einzusetzen, konnten nach der Verwendung von DMSO zumindest gleiche Ergebnisse mit 150 mg Embryomaterial erzielt werden (Fig. 3 oben) . Die Reprodu¬ zierbarkeit wurde sogar bis 30 mg Embryonen nachgewiesen, allerdings mit viel schwächeren Signalen. Eine Verbesserung brachte der Einsatz von 100 μg Plasmid DNA (Fig. 3, unten).

Die Figuren zeigen:

Figur 1: (a) Ergebnis eines NPT II-Tests: C = Kontrolle, mit pRTlOOneo stabil transformierter Tabak-Kallus; Spur

1 = transient pRTlOOneo exprimierende Tabakproto¬ plasten; Spuren 2 bis 5 = keimende Weizenembryonen, Material von 300 mg gequollenen trockenen Embryo¬ nen, ohne DNA-Behandlung (Spur 2) und mit je 50 μg pRTlOOneo in 15 mM NaCL und 1,5 mM Trinatriumcitrat inkubiert (Spuren 3 bis 5) ; * = unspezifische pflanzliche Aktivität; Km = Kanamycinphosphat (Reaktionsprodukt der Neomycinphosphotransferase "NPT II") .

(b) Isolierte, trockene Weizenembryonen der 0,71 mm Fraktion. Dieses Material wurde zur transienten

Expression eingesetzt und besteht aus mehr oder weniger vollständigen Embryonen, Embryostücken und wenigen Endospermstücken. Die Pfeile weisen auf Verletzungen an den Embryonen hin.

(c) Abbau der Plasmid-DNA nach verschiedenen Inkubationszeiten (in Stunden) mit Weizenembryonen (links) und Stabilität der DNA bei Abwesenheit von Embryonen (rechts) .

Figur 2: Ergebnis eines NPT II-Tests, durchgeführt mit kei¬ menden Weizenembryonen (Doppelproben) . Spuren 1 und 2 = Embryonen, die zunächst 30 Minuten mit DNA-Lö-. sung (100 μg Plasmid DNA pro Milliliter, 15 mM NaCl,- 1,5 mM Trinatriu citrat) , dann 30 Minuten mit

15 mM NaCl und 1,5 mM Trinatriumcitrat (ohne DNA) behandelt worden waren; Spuren 3 und 4 = Embryonen, die in umgekehrter Reihenfolge inkubiert wurden, ^♦ zuerst mit Lösung ohne DNA, dann mit DNA-Lösung, C = positive Kontrolle; * = unspezifische pflanzliche

Aktivität; Km = Kanamycinphosphat.

Figur 3: Ergebnisse von NPT II-Tests, durchgeführt mit kei¬ menden Weizenembryonen: (oben) NPT II-Signale als Funktion der Embryomenge, unter Verwendung von 20 % DMSO und 50 μg DNA wäh¬ rend der Inkubation; (Mitte) 150 mg Embryonen be¬ handelt mit 50 μg DNA unter Zugabe von verschie¬ denen DMSO Konzentrationen; (unten) NPT II-Expres- sion in Abhängigkeit von der Plasmid Konzentration unter Einsatz von 150 mg Embryonen und 20 % DMSO. C = positive Kontrolle; nur NPT II-Signale sind ge¬ zeigt.

Figur 4: (a) : Konstruktionsweg der Kassette pRTlOO. Neben den ^' Pfeilen sind die zur Clonierung verwendeten, in den einzelnen Schemata nur die wichtigsten Restrik-

tionsschnittstellen angegeben. Au üllreaktionen von 5*- und Entfernen von 3'-überhängenden Enden erfolgten mit Klenow-Polymerase. Die intergenische Region des CaMV Isolats Cabb B-D wurde als EcoRI Subclon in fd 11-6 von Volker Matzeit (1982; Di¬ plomarbeit an der Universität zu Köln) erhalten. Ausgehend von diesem Clon wurde das Poly-A Signal (schraffiert) als Hphl-Rsal-Fragment in die Hindi- Schnittstelle von pUC18 (Yanisch-Perron et al. , Gene 33 (1985) , 103-119) ligiert, der Promotor

(punktiert) wurde als Hphl-HincII Fragment in die HincII-Schnittstelle von pUC19 cloniert. An¬ schließend wurde er unter Umkehr der Orientierung mit seiner abgeschnittenen Pstl-Schnittstelle in die aufgefüllte Xhol-Schnittstelle eines pUC19-De- rivats, dessen Smal- und Kpnl-Schnittstellen durch Xhol- und Ncol-Schnittstellen ersetzt sind, u clo- niert. Nach dem Deletieren der Xbal-Schnittstelle wurden Promotor und Poly-A Signal abschließend über Seal und SstI zu pRTlOO kombiniert. -

(b) DNA Sequenz der Kassette in pRTlOO. Die Poly¬ linkerSequenzen sind durch Kleinbuchstaben gekenn¬ zeichnet, die CaMV-Sequenzen durch Großbuchstaben. Markiert sind die TATA Box (unterstrichen) , der vermutliche Transkriptionsstart (__ ) , das ATG in der Ncol Schnittstelle, der Polyadenylierungsbefehl (unterstrichen) und das vermutliche Transkriptions¬ ende ( —/ ) .

Figur 5: Schematische Übersicht der Konstruktion pRTlOOneo. Aus pUC18kan#4 wurde das NPT II-Gen als Sall-Frag- ent herausgeschnitten und in pUR250 (Rüther, Nucl. Acids Res. 10 (1982) , 5765-5772) subcloniert. Ein etwa 180 bp großes Pstl-Fragment mit dem 5'-Ende des NPT II-Gens wurde dann aus diesem Intermediat entfernt und in ein pUC18-Derivat ohne Hindlll-

_ Schnittstelle cloniert. In diesen Clon konnte nach

Hindlll-Spaltung, Auffüllreaktion und Ligation mit einem 8 bp großen Linker eine Ncol-Schnittstelle und damit ein ATG-Codon eingefügt werden. Aus

- letzterem Clon wurde abschließend das 5'-Ende des

NPT II-Gens als Ncol-Pstl-Fragment herausgeschnit¬ ten und zusammen mit dem 3 '-Ende des NPT II-Gens als Pstl-Xbal-Fragment in pRTlOO, geschnitten mit Ncol und Xbal, cloniert.

Material und Methoden:

Molekularbiologische Analysen wurden gemäß Maniatis et al. (1982 ) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, durchgeführt.

Chimäre Gene

Erfindungsgemäß wurde als Modell das Plasmid pRTlOOneo mit dem vom Cauliflower Mosaik Virus (CaMV) 35S Promotor ge¬ steuerten Neomycinphosphotransferase II-Gen (NPT II) als chimärem Marker-Gen verwendet. Die Konstruktion ist in den Figuren 4 und 5 detailliert beschrieben. Figur 4a veran¬ schaulicht die Konstruktion des Expressionsvektors pRTlOO, der den 35S Promotor aus CaMV (Isolat Cabb B-D) und das zu¬ gehörige CaMV-Polyadenylierungssignal trägt. Figur 4b zeigt die Clonierungsschritte, die zu pRTlOOneo geführt haben. Es konnte gezeigt werden, daß die für transiente Studien einge¬ setzten Plasmide (fremde genetische Information) unabhängig von ihrer Konformation sowohl in den verschiedenen circulä- ren Formen als auch in linearer Form verwendet werden kön¬ nen. Fremde genetische Information bedeutet DNA oder RNA, die selbstreplizierend und infektiös ist oder die stabil ins Genom integriert ist.

Andere Plasmide, die bezüglich der vorgegebenen Fragestel¬ lung zu gleichen Resultaten führen, sind z.B. pCAP212

(Veiten und Schell, ; Nucl. Acids Res. 13 (1985) , 6981-6997) oder Derivate von pDH51, wie pEP9 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986), 5857-5868).

Gewebekultur und Transformationsmethoden

Die Versuche wurden in der Regel mit ungeheiztem Sommerwei¬ zen—Samen durchgeführt. Es kann aber auch Samen anderer Ge¬ treide verwendet werden wie Winterweizen, Sommergerste, Win— tergerste Sommerroggen, Winterroggen, Triticale, Hafer,

Mais, Reis, und Sorghum oder anderer Nutzpflanzen, wie Erbse, Bohne, Sojabohne, Psophocarpus.

Der Begriff "reifer Samen" oder kurz "Samen" beschreibt ein der Verbreitung und der Arterhaltung dienendes Organ der hö¬ heren Pflanze, das aus dem Keimling (Embryo) , dem Nährgewebe

(Endosperm) und einer mehr oder weniger festen Samenschale

(Testa) besteht.

Die Isolierung von Embryonen durch mechanische Einwirkung erfolgt gemäß der Vorschrift von Johnston und Stern (Nature 179 (1957), 160 - 161) mit Ausnahme der Verwendung von Trockeneis: 650 g Weizensamen in 130 g Portionen wurden 10 Sekunden in einem 1 1 Behälter bei geringster Geschwindig- keit mittels Waring Blendoι_£/zerkleinert. Die zerschlagenen Körner wurden mit Prüfsieben (1,6 mm; 1,0 mm; 0,5 mm Ma- εchenweite) fraktioniert. Die 1,6 mm Fraktion wurde dreimal in gleicher Weise behandelt. Kleie- oder Spelzenanteile wur¬ den mit hilfe eines Gebläses entfernt und die Embryonen vom Endosperm durch Flotieren mit Cyclo- hexan/Tetrachlorkohlenstoff getrennt. Tabelle I gibt die em¬ pirisch bestimmten Mischungsverhältnisse von Cyclohexan mit Tetrachlorkohlenstoff zur Embryo-Endospermtrennung für die einzelnen Getreide wieder. Abschließend wurden mehr oder we- niger vollständige Embryonen mittels Sieb (0,71 mm- aschen¬ weite) von Embryobruchstücken abgetrennt. Diese 0,71 mm

I T

Fraktion ist in Figur lb wiedergegeben . Die Ausbeute an Em¬ bryonen entspricht für Sommerweizen etwa 40 % .

Tabelle II

Cyclohexan/Tecrachlorkohlensto.f Mischungsverhältnisse zur Trennung von Embryonen und Endosperm verschiedener Getreide

Getreide Anteile Anteile Tecra- Bemerkungen

Cyclohexan chiorkohlenstoff

So-Weizen 100 250

Wi- veizen 100 250

So-Gerste 100 250

Wi-Gersta 100 250

Wi- Roggen. ^• 100 300

Triticale 100 330

S ier 100 250

Mais 100 200 schlechte Trennung

Reis 100 250 ^'

Sorghum L00 200

Die DNA-Behandlung von Weizenembryonen in ihrer optimierten Form gestaltete sich wie folgt: 150 mg isolierte Embryonen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur in 500 μl eines Inkuba¬ tionspuffers aus

200 μg Plasmid DNA ( = 73 pM) 15 mM NaCl

1,5 mM Trinatriumcitrat 20 % DMSO aufgefüllt mit Wasser auf einen Milliliter

inkubiert. Auf einem Filter auf festem MS Medium (Murashige und Skoog, Plant Physiol. 15 (1962), 473-497) ohne Hormone mit 100 μg Claforan ausplattiert, erfolgte die Kultur der Embryonen bei 24°C, 12 Std. Photoperipde und 600 lux. Nach etwa 3 Tagen Kultur wurden die Embryonen auf Genexpression untersucht.

Versuche am Embryo im Samen

Neben isolierten Embryonen wurden auch Embryonen im Weizen- samen mit DNA behandelt. Dazu wurde zunächst der Embryo durch vorsichtiges Abschleifen des Perikarps freigelegt und dann mit 2 bis 3 μl des vorstehenden Inkubationspuffers be¬ feuchtet. Sofort oder nach dem Antrocknen wurden die so be¬ handelten Samen zum Studium der transienten Expression ent- weder auf feuchtem Filterpapier kultiviert oder für die sta¬ bile Transformation auf Erde ausgelegt. Letztere wurden in Multitopfplatten (96 Töpfe) bei etwa 2 °C im Gewächshaus 4 Tage mit einer Folie abgedeckt und anschließend mit Erde übersiebt.

Enzvmtest Verfahren

NPT-Test (Reiss et al. , Gene 30 (1984), 211-218; Schreier et al., EMBO J. 4 (1985) _r 25-32; modifiziert)

Der NPT-Test wurde unter Verwendung von 100 μCi [ ³² P ^~ -ATP] pro Test und einigen Abwandlungen der Probenaufbereitungen durchgeführt: Die gekeimten Embryonen wurden in 2 ml Extrak¬ tionspuffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 und 5 % ß-Mercapto- äthanol) auf Eis in einem Mörser zerkleinert. Das Homogenat wurde anschließend 60 Minuten bei 100000 x g zentrifugiert und NPT II aus dem überstand bei 50 % (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ gefällt (Zentrifugationen 9000 x g, 15 Min., 4°C) . NPT II kann durch Ammoniumsulfat oberhalb 30 % ausgefällt werden. Bei einem Wert von etwa 45 % ist NPT II nicht mehr im überstand zu finden. Das Proteinsediment wurde vorsichtig mit 250. μl Extraktionspuffer gewaschen und dann in 50 μl Puffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8; 5 % ß-Mercaptoäthanol, 10 % Glycerin und 0,025 % Bromphenolblau) gelöst.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Transiente Expression in isolierten Weizenembrvonen

Erste, nur gelegentlich auftretende NPT II-Signale wurden nach der Inkubation von 15 mg trockenen Weizenembryonen mit 100 μg DNA pro Milliliter in 15 mM NaCl und 1,5 mM Tri¬ natriumcitrat nach drei Tagen Kultur erhalten. Es galt zu beweisen, daß es sich nicht um ein Artefakt handelte:

In einer Versuchsreihe wurden unterschiedliche Mengen (15, 50, 100, 200, 300, 400 mg) an Embryonen in DNA-Lösung (100 μg Plasmid-DNA pro Milliliter, 15 mM NaCl, 1,5 mM Tri¬ natriumcitrat) gequollen und anschließend kultiviert. Dop- pelproben sollten zeigen, ab welcher Embryomenge regelmäßig und reproduzierbar NPT II-Signale auftreten. Zwei Signale wurden bei 200, 300 und 400 mg eingesetzter Embryonen fest¬ gestellt. Die Signale bei nur 200 mg waren jedoch noch recht schwach, so daß für weitere Experimente zunächst 300 mg Em- bryonen eingesetzt wurden.

Figur la zeigt das Ergebnis eines Experimentes von DNA-be- handelten Embryonen (Dreifachproben: Spur 3-5) im Vergleich zu extrahierten Embryonen ohne DNA-Behandlung (Spur 2) .

Sodann wurde untersucht, ob trockene Embryonen für eine DNA- Aufnahme erforderlich sind. Ein einfaches Experiment sollte den Vorgang der DNA-Aufnahme zeigen. 300 mg Embryonen wurden wie bisher zunächst 30 Minuten mit DNA-Lösung behandelt, dann aber zusätzlich 30 Minuten mit der DNA-freien Lösung.

Mit weiteren 300 mg Embryonen wurde umgekehrt verfahren. Zu¬ erst wurden sie mit Lösung ohne DNA und dann mit einer Lö¬ sung mit DNA inkubiert. Das Ergebnis (Doppelproben) ist in Figur 2 wiedergegeben. Nur trockene Embryonen sind in der Lage, DNA aufzunehmen und nach Kultur zu exprimieren. Außer¬ dem erfolgt die DNA-Aufnahme innerhalb der ersten 30 Min. der Quellung. Weitere Experimente haben gezeigt, daß die

DNA-Aufnahme innerhalb der ersten drei Minuten am höchsten ist- dann langsam abfällt und nach 15 Minuten weitgehend abgeschlossen ist.

Anschließend wurde untersucht, wie sich die Expression steigern läßt. Bisher war unklar, ob die gewählten Anfangs¬ bedingungen optimal waren. Die folgenden Versuche dienten der Klärung dieser Frage sowie einer generellen Verbesserung des Expressionssystems: Zunächst wurde DMSO getestet. Eine deutliche Steigerung der Expression mit zunehmender DMSO

Konzentration bis 20 % wurde festgestellt (Fig. 3) . Liegen die DMSO Konzentrationen bei 30 % oder höher, ist das Frischgewicht reduziert. Entsprechend sinkt die NPT II Expression. Nach diesem Ergebnis wurde die vorstehend beschriebene DNA-Lösung (100 μg Plasmid-DNA pro Milliliter, 15 mM NaCl, 1,5 mM Trinatriumcitrat) wie folgt modifiziert: 100 μg Plasmid-DNA pro Milliliter, 15 mM NaCl, 1,5 mM Tri¬ natriumcitrat, 20 % DMSO. Eine erneute Versuchsreihe mit verschiedenen Embryomengen ergab eine Reproduzierbarkeit der. NPT II-Signale bis 30 mg eingesetzter Embryonen und ver¬ gleichbar kräftige Signale bei 150 und 300 mg (Fig. 3, oben) . Somit wurde die Embryomenge auf 150 mg reduziert.

Mit den beiden geänderten Parametern wurde nun nach der DNA Konzentration gesucht, die maximale NPT II-Expression er¬ laubt. Der Vergleich von 25, 50, 100 und 200 μg Plasmid pro 0,5 ml Inkubationsansatz (150 mg Embryonen, Plasmid-DNA, 15 M NaCl, 1,5 mM Trinatriumcitrat, 20 % DMSO) zeigte die höchste Expression bei 100 und 200 μg DNA pro 0,5 ml (Fig. 3) . Damit war unter Verwendung von 100 μg Plasmid DNA pro 0,5 ml (bzw. 200 μg pro ml) dieser Parameter ins Optimum gerückt.

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Der optimale Inkubationsansatz bestand daher aus:

150 mg trockenen Weizenembryonen

T 100 μg Plasmid-DNA (36,5 mM)

15 mM NaCl

1,5 mM Trinatriumcitrat 20 % DMSO aufgefüllt mit Wasser auf 0,5 Milliliter.

Inkubiert man Embryonen mit diesem Inkubationspuffer so ist NPT II bereits nach 24 Stunden Kultur zuverlässig nachweisbar. Bei einer Kultur von 24, 48 und 72 Stunden zeigt sich eine stetige Zunahme der NPT II-Aktivität.

Beispiel 2:

Transiente Expression in Weizenembryonen am Samen

Es wurden Weizensamen verwendet, bei denen der Embryo durch Anschleifen freigelegt worden war. Die Weizensamen wurden mit DNA (gemäß den vorstehenden optimierten Bedingungen) be¬ handelt und 3 Tage angekeimt. Die Keimlinge wurden sodann isoliert und auf NPT II-Aktivität untersucht. Wie auch bei isolierten, behandelten Embryonen wurde NPT II nachgewiesen. Damit war gezeigt, daß auch einseitig behandelte Embryonen DNA aufnehmen und exprimieren.

Beispiel 3:

Transiente Expression in Getreideembrvonen

Mit den für Sommerweizen-Embryonen etablierten Methoden konnte eine transiente Expression auch in Embryonen von Win¬ terweizen, Sommergerste, Wintergerste, Roggen, Hafer, Mais, Reis und Triticale nachgewiesen werden.

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Beispiel 4:

T ^' rans-iente Expression in Leguminosenembrvonen 5

3OTT mg Gartenerbsen-, Feuerbohnen- und Saubohnenembryonen wurden in Analogie zu Weizenembryonen mit DNA inkubiert. Nach drei Tagen Kultur konnte NPT II-Aktivität nachgewiesen werden. 0

Beispiel 5:

Der Weg ins Gewächshaus

5 Kultur von angeschliffenen Samen in Erde

10 Weizensamen wurden wie unter "Material und Methoden" beschrieben angeschliffen und mit 2 μl Wasser an der Schliffstelle behandέlt. Sie wurden dann auf Einheits- 0 ^' erde/Sand (10/1) (im weiteren kurz als "Erde" bezeichnet) zur Keimung ausgelegt. Als Kontrolle wurden unbehandelte Samen ausgelegt. Die Keimung des angeschliffenen Materials erfolgte schneller als die der Kontrollen. Nach 3 Tagen aber zeigten letztere eine bessere Entwicklung. Weitere Beobach-

2.5 tungen ergaben, daß die angeschliffenen Embryonen teilweise Verletzungen an Coleoptile, Coleorhiza und darunterliegenden Geweben aufwiesen. Auch das Ausbleiben einer Keimung, ver¬ mutlich aufgrund von Schädigungen, mußte festgestellt werden. Es wurden jedoch insgesamt 8 Keimlinge mit kräftigem

30 Keimblatt von den angeschliffenen Samen erhalten.

Ein Anschlußversuch in Multitopf latten mit je 96 DNA-behan- delten, angeschliffenen Samen und 96 unbehandelten Kontrol¬ len wurde unternommen. Nach drei Wochen Kultur der im Ge— 35 ^' wächshaus bei 24°C auf Erde und mit Quarzsand abgedeckten

Samen, waren ^' 83 Kontrollpflanzen gekeimt, von den DNA-behan-

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delten Pflanzen jedoch nur 21. Das bedeutet eine Erfolgs¬ quote von etwa 23 % (Tabelle III) .

In einem weiteren Experiment wurden je 288 angeschliffene und DNA-behandelte Samen etwa 1-2 cm tief in die Erde ge¬ legt, auf Erde liegend mit Erde übersiebt bzw. nur auf Erde ausgelegt, vier Tage mit Kunststoffolie abgedeckt und dann übersiebt. Das Versuchsergebnis nach 3 Wochen geht ebenfalls aus Tabelle III hervor. Die höchste Keimrate wiesen die mit Folie abgedeckten Samen mit 63 % auf. Aufgrund dieses Resul¬ tats wurden in den folgenden Versuchen die angeschliffenen und behandelten Samen auf Erde ausgelegt und während der ersten vier Tage mit einer Folie abgedeckt. Danach wurden sie mit Erde übersiebt.

Tabelle III

Einfluß der Kulturbedingungen auf die Keimrate von angeschlif¬ fenen Weizensamen. Anzahl ausge- Anzahl ge- Keimungsrate variierter Parameter legter Samen keimter Samen

96 22 23 % Quarzabdeckung

96 83 86 % Kontrolle, Quarzabdec πg

288 49 17 % 1 bis 2 cm in Erde

288 71 25 % auf Erde, übersie c

288 181 63 % auf Erde, 4 Tage Foiisnab- deckung, dann (jbe.siebeπ

Von 11000 ausgelegten, angeschliffenen und DNA-behandelten Samen wurden ca. 4300 Pflanzen bis zur Samenreife herangezo¬ gen. Das geerntete Saatgut wurde unter Selektionsbedingungen, entsprechend dem Marker-Gen (z.B. Kanamycinresistenz durch NPT II) gekeimt, und die überlebenden Pflänzchen wurden sowohl auf das Genprodukt des Marker-Gens, als auch auf das Vorhandensein der zugegebenen DNA untersucht.