B e s c h r e i b u n g

Die Erfindung betrifft einen Expressionsvektor zur regulierbaren Expression von Fremdgenen in Prokaryonten.

Zur Expression von Proteinen in Prokaryonten benötigt man Expressionsvektoren. Derartige Vektoren müssen außer dem Gen des zu exprimierenden Proteins noch Regu- lationssequenzen enthalten, welche die Transkriptions¬ und Translationsprozesse in der zur Proteinproduktion verwendeten Zelle ermöglichen. Derartige Regulations¬ sequenzen stammen - sofern in Prokaryonten exprimiert werden soll - aus Prokaryonten und enthalten beispiels¬ weise Sequenzen von Promotoren, Operatoren und riboso- alen Bindungsstellen, üblicherweise werden derartige Regulationssequenzen in einem Vektor, z. B. dem Plasmid pBR322 und dessen Derivaten, dem Gen vorgeschaltet. Diese Vektoren enthalten dann neben den vorher beschrie¬ benen Regulationssequenzen auch noch einen Replikations- ursprung und einen Marker zur Selektion des Plasmids, z. B. Tetrazyklinresistenz, Ampicillinresistenz, Cana- ycinresistenz und andere.

Die DNA-Einheit, die von der DNA-abhängigen RNA-Polyme- rase erkannt und in Messenger-RNA übersetzt wird, be¬ zeichnet man als Transkriptionseinheit. Eine solche Transkriptionseinheit besteht aus Erkennungssequenzen für die DNA-abhängige RNA-Polymerase, ErkennungsSequen¬ zen für die Initiation der ribosomen Funktion (Shine- Dalgarno-Sequenz) , dem Startkodon ATG, einem Stopkodon und Terminationssequenzen, an denen die Transkription beendet wird. Bestimmte Gene, nämlich solche, deren

ERSATZBLATT

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Genprodukte nicht im Cytoplas a lokalisiert bleiben, sondern in das Periplasma bzw. in die äußere Membran sekretiert werden, können daneben noch andere Erkennungs¬ sequenzen enthalten. Eine solche Erkennungssequenz zur Exkretion von Proteinen nennt man Signalsequenz. Eine Signalsequenz enthält charakteristische geladene Seg¬ mente, hydrophobe Bereiche und hydrophile Bereiche und eine Signalsequenz-Spaltstelle (siehe überSichtsartikel Mechanismus of Protein Localisation, Microbiol. Reviews 1983, 47. Seite 314-344).

An einen Expressionsvektor werden demnach folgende Anforderungen gestellt:

a) er muß einen starken Promotor enthalten, c) Fusionen mit Fremdgenen sollten leicht durchführ¬ bar sein und d) der Promotor incl. eines anschließenden Fremdgen¬ abschnitts sollte geeignet sein, eine Lokalisation des Proteins sowohl -im Cytoplasma als auch im Periplasma bzw. im Medium zu ermöglichen.

Es ist bekannt, daß der Umfang der Expression des Fremdgens wesentlich vom Promotor abhängt. Um zu beur¬ teilen, ob ein bestimmter Promotor für die Expression von Fremdgenen besonders geeignet ist, kommt es aller¬ dings nicht alleine auf die Menge des pro Zelle produ¬ zierten Fremdproteins an, sondern sehr oft ist es auch wünschenswert, daß das Genprodukt nicht während der gesamten Wachstumsphase, sondern nur über einen bei¬ stimmten Zeitraum - vorzugsweise der späten Wachstums¬ phase - synthetisiert wird. Dies ist vor allen Dingen bei der Expression von Genprodukten, die, wenn sie in großer Menge vorhanden sind, entweder für die Zellen

toxisch sind oder das Wachstum der Zellen hemmen, wünschenswert. Daher ist es oft erforderlich, die Aktivität eines Promotors zu Beginn der Fermentations¬ phase zu unterdrücken, so daß zunächst eine umfang¬ reiche Biomasse produziert wird. Anschließend sollte durch geeignete Maßnahmen der Promotor stimuliert werden und die Expression des Fremdgens erfolgen können.

Zu diesem Zwecke bekannte Promotoren sind beispiels¬ weise der lac-Promotor, der trp-Promotor und der ^-P--Promotor. Für eine großtechnische Produktion von heterologen Proteinen sind diese Promotoren jedoch nicht gut geeignet. Für den lac-Promotor ist bekannt, daß dieser durch Glucose abgeschaltet wird, jedoch nicht vollständig genug, um die Synthese von "toxi¬ schen" Proteinen zu verhindern. Auch der trp-Promotor ist kein für die großtechnische Produktion besonders ^" gut geeigneter Promotor. Abgesehen davon, daß die Verwendung von hohen Tryptophankonzentrationen zur Repression die Fermentation wesentlich verteuert, hat sich gezeigt, daß Tryptophan keine vollständige Repres¬ sion ermöglicht, so daß auch hier während der Anfangs¬ phase der Fermentation eine störende Expression erfol¬ gen kann. Auch der λ-P _τ -Promotor ist für eine großtech- nische Fermentation nicht geeignet. Der Repressionsme¬ chanismus erfolgt hier durch die Bindung eines thermo- labilen Repressors an einen hinter dem Promotor befind¬ lichen Operator bei 32°C. Durch Temperaturerhöhung auf 42°C wird der Repressor inaktiviert, wodurch die Trans¬ kription ermöglicht wird. Für eine Großproduktion, welche mit Fermentationsvolumina von 50 oder 100 ³ verbunden ist, ist eine derartige Temperaturerhöhung mit großen Schwierigkeiten verbunden. Darüberhinaus hat

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sich gezeigt, daß die Induktion des ^-P_-Promotors in einer frühen Wachstumsphase erfolgen muß, so daß die für eine biotechnologische Großproduktion notwendige Biomasse nicht erreicht werden kann.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die vorstehend geschilderten Schwierigkeiten zu beseitigen und einen Expressionsvektor zur regulierbaren Expres¬ sion von Fremdgenen in Prokaryonten bereitzustellen. Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch einen Expressionsvektor, der aus einem DNA- ektor besteht, . der als Regulationssequenz die Promotor/Operator-Region und die Initiationsstelle der Translation des mgl-Operons enthält. Dieser Expressionsvektor enthält wenigstens ein Fremdgen, das unter der Expressionskontrolle der gl-Operon-RegulationsSequenzen steht, wobei die Expres¬ sion über den mgl-Promotor positiv oder oder negativ reguliert werden kann. Das Fremdgen kann aber auch erst später eingesetzt werden.

Der im erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthaltene mgl-Promotor ist ein Teil des mgl-Operons, welches neben dem Promotor noch 4 Strukturgene, mglA, mglB, mglE und mglC enthält, die der Kontrolle des mgl-Promo- tors unterliegen. Hierbei kodiert das mglB-Gen für ein Galactosidase-Bindungsprotein von 33.000 Dalton, mglA, mglC und mglE kodieren jeweils für membrangebundene Proteine. Vom gl-Operon werden somit Proteine expri- miert, die für den Transport von Galactose aus dem Medium in die Bakterienzelle verantwortlich sind.

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Vektors kann das mgl-Operon prinzipiell aus dem Genom einer Zelle, die in der Lage ist, von außen zugeführte Galactose zu ver¬ werten, beispielsweise aus Salmonella typhimurium, DSM 554 oder aus E. coli, MC 4100 (DSM 4090) (J. Biol. Chem. 25 _ (1983) 10853-10855, J. Bacteriol. 153. (1983) 408-415) isoliert werden.

Die Isolierung des mgl-Operons aus Sal onella typhi u- rium kann erfindungsgemäß so erfolgen, daß die genomische DNA mit EcoRI gespalten und ein 6,3 kb großes Fragment isoliert wird, welches in üblicher Weise kloniert und anschließend exprimiert werden kann (vgl. hierzu J. Bacteriol. 163, 37-85, 1985, sowie die dort zitierte Literatur) . Aus dem in dieser Literaturangabe zitierten Plasmid pNM 506 kann durch Spaltung mit EcoRI und Ba HI ein ca. 900 bp großes Fragment herausgespalten und isoliert werden. Von der DNA-Sequenz dieses Fragments wurde unmittelbar nach der EcoRI-Erkennungssequenz beginnend die Sequenz bestimmt (Fig. 1) . An Position 705 bis 707 befindet sich das Startkodon ATG. Fünf Nukleotide davor liegt die als Shine-Dalgarno-Sequenz erkennbare Nukleotidabfolge GGAG. Dieses Fragment ent¬ hält den mgl-Promotor, der jedoch nur einen Teil dieser DNA-Sequenz darstellt.

Im Gegensatz zu den bisher bekannten anderen Regulations¬ systemen kann der mgl-Promotor mit Glucose und anderen Katabolyt-reprimierenden Zuckern, wie z. B. Fructose oder Gluσose-6-phosphat, nahezu vollständig reprimiert werden. Mit der erfindungsgemäßen Verwendung des mgl-Pro- otors ist es also möglich, auf besonders einfache Weise die Genexpression zu steuern. Beispielsweise kann bei der Fermentation Glucose als C-Quelle in bestimmter Menge zugegeben werden. Nachdem die Glucose aufgebraucht ist, beginnt die Expression, wobei dann eine andere C-Quelle zugesetzt werden muß, die nicht Katabolit-repri- mierend wirkt (z. B. Glycerin oder Succinat) . Durch zu¬ sätzliche Zugabe von Fucose kann die Promotoraktivität noch weiter gesteigert werden. Die Repression durch Glucose macht etwa einen Faktor 100 aus.

Der DNA-Vektor, der dem erfindungsgemäßen Expressions¬ vektor zugrundeliegt, kann ein Plasmid, ein Phagengenom oder auch ein Shuttle-Vektor, der zur Expression in

grampositiven oder gramnegativen Bakterien, insbesonde¬ re in Enterobakterien, geeignet ist, sein. Als Expres- sionsvektoren sind die in den genannten Bakterien ver¬ mehrbaren Vektoren geeignet. Beispiele sind pBR-Vektoren wie pBR322, pUC-Vektoren wie pUC18 sowie die Phagen Lambda und M13 und ihre Derivate. Bevorzugt enthält der Expressionsvektor zur Insertion des zu exprimierenden Fremdgens einen Polylinker. Solch ein Polylinker wird nach bekannten Methoden hinter den RegulationsSequenzen in den Vektor eingebaut. Vorzugsweise wird ein Pol linker verwendet, der eine oder mehrere Restriktionsschnittstel¬ len enthält, die im verwendeten Plasmid oder im Phagenge- nom nicht oder selten vorkommen. Mit dem oder den entsprechenden Restriktionsenzymen wird der Vektor sodann geschnitten und das Fremdgen, welches entweder mit der gleichen Restriktionsendonuklease geschnitten ist oder dessen beide Enden in bekannter Weise so verändert wurden, daß sie ebenfalls zu der fraglichen Schnittstelle passen, einligiert.

Um die spätere Lokalisation des Genprodukts in der Wirtszelle von vorneherein zu bestimmen, kann zwischen die RegulationsSequenzen und das Fremdgen die DNA-Sequenz für ein Signalpeptid zwischengeschaltet werden. Bevor¬ zugt wird erfindungsgemäß die DNA-Sequenz für das Signalpeptid des mglB-Proteins, welches eine Lokalisation im Periplasma bewirkt, verwendet (J. Biol. Chem. 258 (1983) 10853-10855) . An seiner Stelle kann aber auch die DNA-Sequenz einer anderen bekannten Signalsequenz oder einer Konsensussequenz (Nature 321 (1986) , 706-708) verwendet werden. Solche Konsensussequenzen können durch Vergleich von bekannten Signalsequenzen unter¬ einander ermittelt werden. Ohne Signalpeptid verbleibt das Fremdgenprodukt im Cytoplasma.

Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung enthält ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor vorzugsweise die Sequenz, welche in Fig. 1 dargestellt ist und den mgl-Promotor umfaßt, oder eine Sequenz, die bei Standard¬ bedingungen damit hybridisiert. Dies kann auch eine im Vergleich zu der Sequenz der Fig. 1 verkürzte DNA-Sequenz sein, die aber noch den gesamten mgl-Promotor enthalten muß. Unter Standardbedingungen sind Hybridisierungsbedin- gungen zu verstehen, wie sie in T. Maniatis, Molecular Cloning CSH (1982) 383-389 beschrieben sind.

Das Expressionsprodukt eines anschließenden Fremdgens ist dann im Cytoplasma lokalisiert. Wird .eine Exkretion ins Periplasma gewünscht, so wird gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform die mgl-B-Signalsequenz, die im unteren Teil der Fig. 1 dargestellt ist (Signal¬ sequenz des mglB-Proteins) an die vorherige Sequenz angeschlossen.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind die Plasmide Ml3mgl506 und M13mglEcoK, die eine ein ca. 900 bp EcoRI/BamHI-Frag ent des Plas ids pNM506 (Fig. 1) ent¬ sprechende DNA-Sequenz sowie im Falle von Ml3mglEcoK zusätzlich eine Polylinkersequenz (4x EcoK-Cassette, Nucleic Acids Research 13, (1985), 8561-71) insertiert in die doppelsträngige, replikative Form des Phagen Ml3mpl8 (Sequenz in Gene 33 (1985) , 103-119 beschrieben) enthalten. Erfindungsgemäß wird das Plasmid M13mgl506 hergestellt, indem man eine dem EcoRI/BamHI-Fragment des Plasmids pNM506 entsprechende DNA-Sequenz in die ebenfalls mit EcoRI und Ba HI geschnittene doppelsträn¬ gige replikative Form des Phagen Ml3mpl8 einligiert. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Plasmids M13mglEcoK beinhaltet das Einligieren

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einer dem EcoRI/BamHI-Fragment des Plasmids pNM506 entsprechenden DNA-Sequenz zusammen mit einer dem BamHI/EcoRI-Fragment aus dem Plasmid M13K11 entsprechen¬ den DNA-Sequenz, die vier EcoK-Schnittstellen enthält (4x EcoK-Cassette, Nucleic Acids Research 13, (1985), 8561-71) , welche die Durchführung einer Deletionsmuta- genese erleichtert, bei der ein Fremdgen direkt hinter die Operonsequenz eingebracht werden kann (Methods Enzymol. 100 (1983), 468-500,° Nucleic Acids Res. 1 (1982) , 6487-6500) und als Polylinker zur Insertion eines beliebigen Fremdgens fungieren kann, in die mit EcoRI gespaltene replikative Form des Phagen M13mpl8.

Die erfindungsgemäße Verwendung einer Regulationsse¬ quenz des mgl-Operons ermöglicht die durch Katalyt-repri- mierende Zucker, wie z. B. Glucose, regulierbare Expres¬ sion von Fremdgenen, wodurch es möglich wird, auch im großtechnischen Umfang sogar für die exprimierende ^" Zelle toxische Genprodukte herzustellen, indem die Ex¬ pression nur im späten Wachstumszyklus nach Entfernung oder Fermentation des Zuckers ermöglicht wird. Es ist dabei auch möglich, die spätere Lokalisation des Genpro¬ dukts im voraus zu bestimmen, wobei eine Lokalisation im Periplasma oder sogar Abgabe des Genprodukts ins Medium durch den oben erläuterten Aufbau des erfindungs¬ gemäßen Expressionsvektor vorherbestimmt werden kann, z. B. durch Verwendung eines Prokaryonten, der Substan¬ zen ins Medium abgeben kann, beispielsweise grampositive Bakterien oder E. coli Mutanten, wie sie z. B. in FEMS Microbiol. Lett. 51 (1979) 411-416 oder J. Bact. 145 (1981) 1351-1358 beschrieben sind. Dadurch wird die

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Notwendigkeit eines Zellaufschlusses vermieden und er¬ möglicht, bei für die Wirtszelle nicht toxischen Gen¬ produkten die Produktion fortlaufend weiterzuführen, wobei das Produkt laufend aus dem Medium gewonnen werden kann.

B e i s p i e l 1

Isolierung der gl-Promotor-Operratorregion.

Aus dem Plasmid pNM506 (J. Bacteriol. 163 (1985) ,

37-45) wird durch Spaltung mit EcoRI und Ba HI ein 897 Basenpaar großes Fragment gewonnen (Fig. 1) .

Dieses Fragment enthält die Promotor-Operator-Region des mgl-Operons. Es wird in die doppelsträngige repli¬ kative Form des Phagen M13mpl8 (Sequenz vgl. Gene 33 '(1985) 103-119), die ebenfalls mit EcoRI und BamHI gespalten wurde mit Hilfe von T4 DNA-Ligase einligiert (Fig. 2) . Das entstehende Plasmid trägt die Bezeichnung M13mgl506.

In analoger Weise wird ein gleichwertiges Plasmid her¬ gestellt, in dem das Plasmid pUC18 (Fig. 7) ebenfalls mit EcoRI und BamHI geschnitten wird und dort das genannte Fragment eingesetzt wird (Fig. 3) .

Diese beiden Vektoren dienen als Quelle für das DNA- Fragment mit mgl-Promotor und gegebenenfalls zusätzlich mit mgl-B-Signalsequenz zur Konstruktion von Vektoren die unter Kontrolle des mgl-Promotors Fremdgene expri- mieren können.

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B e i s p i e l 2

Konstruktion eines Universal-Vektors mit mgl-Promotor, in den Fremdgene eingebaut werden können.

Ein DNA-Fragment aus M13K11, das vier EcoK-Schnittstel- len und an den Enden eine BamHI- und eine EcoRI-Schnitt¬ stelle trägt (4x EcoK-Cassette) (beschrieben in Nucleic Acids Research 13, (1985), 8561-71) wird zusammen mit dem EcoRI, BamHI-Fragment aus pNM506 (Beispiel 1) in einen mit EcoRI gespaltenen Vektor M13mpl8 ligiert. Hierbei entsteht der Vektor Ml3mglEcoK (Fig. 4) . Dieser Vektor besitzt eine Polylinkerregion mit den Schnittstellen Kpnl, Sacl, Hindlll, SphI, PstI, Sall und Xbal, in die beliebige Fremdgene eingesetzt werden können.

B e i s p i e l 3

Vektor zur Expression von Endo-ß-N-acetylglucosamini- dase H (Endo H)

Der durch die Schnittstellen EcoRI und Sall definierte N-terminale Teil des Endo H-Gens (Fig. 8, Länge 609 bp) (Journal of Biological Che istry 259, (1984) 7577-7583) wird aus dem Plasmid pEH 7* isoliert.

Das aus Ml3mgl506 (Beispiel 1) durch Schnitt mit BamHI und Sall erhaltene Fragment, das oben beschriebene EcoRI-Sall-Fragment sowie die .in Beispiel 2 beschrie¬ bene 4x EcoK-Cassette (als EcoRI-BamHI-Fragment) werden mit T4 Ligase ligiert, wobei die Konstruktion gemäß Fig. 5 entsteht.

Durch in vitro Mutagenese (Methods Enzymol 100 (1983) , 468-500; Nucleic Acids Res. IjO (1982), 6487-6500) mit einem synthetischen Oligonukleotid der Sequenz

5 ' CCCCTGCTTC ACCGGGGCCA TGGTAGCTCC GGTTTT 3 '

erhält man eine Fusion zwischen dem ATG des mgl-Promo- tors und dem N-terminalen Teil des reifen EndoH-Gens. Hierbei ist weder eine Signalsequenz von gl noch von EndoH enthalten. Die Klone, welche die gewünschte Dele- tion enthalten, werden über ein Screening mit dem oben beschriebenen radioaktiv markierten Oligonukleotid als Probe identifiziert. Von einem der durch dieses Screening identifizierten Klone wird die replikative DNA präpariert.

Diese DNA wird mit EcoRI und SphI gespalten. Das hierbei entstehende Fragment (750 Basenpaare) wird mit 'öine Sphl-BamHI-Fragment, welches den Rest des Endo H-Gens von SphI bis über das Ende des Gens (J. Biol. Chem. 259 (1984) 7577-7583) enthält, in einen mit EcoRI und BamHI gespaltenen PUCl3-Vektor (Sequenz Fig. 9) , ligiert. Hierbei entsteht ein Vektor, der das mgl-Promotor-Gen sowie das vollständige Gen von EndoH trägt (Fig. 6). Dieser Vektor wird mit pBT0103, bezeich¬ net.

Mit Hilfe dieses Plasmids kann Endoglycosidase H in E. coli HB101, DSM 1607, exprimiert werden. Die Expres¬ sion läßt sich durch Zugabe von Glucose steuern.

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T a b e l l e I

Anzucht von E. coli ^" HB101 mit Plasmid pBT0103 in LB-Medium (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl pro Liter) mit und ohne Glucose.

Glucose Aktivität EndoH (U/1 Medium)

0 % ca. 10Q

0,1 % ca. 10

0,2 % 0

0,4 % 0

Analoge Ergebnisse werden erhalten, wenn anstelle von Glucose Glucose-6-phosphat verwendet wird.

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Vektor mit mgl-Promotor, mgl-Signalsequenz und Endo H-Gen

Das Plasmid pBT0103 (Beispiel 3) wird mit Ncol geschnit¬ ten und ein synthetischer Linker, der für das mgl-Signal- peptid kodiert (Fig. 1, Pos. 688-756) durch Ligation eingefügt, so daß ein korrektes Leseraster, sowie korrekte Prozessierung gewährleistet ist.

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Vektor mit mgl-Promotor und ß-Galactosidase-Gen ohne Signalsequenz.

Das Plasmid pBT0103 (Beispiel 3) wird mit Ncol/PstI gespalten und das hierbei entstehende 3,3 kb große Fragment isoliert.

Ein BamHI/Pstl-Fragment von ca. 5 kb des Plasmids pBT 117, DSM 3063 (beschrieben in EP 0 180 225 A2) , welches den größten Teil des lacZ-Gens enthält, wird präpariert und unter Verwendung eines synthetischen Linkers der Sequenz

5' C ATG GTT ACG GAT TGC TGC AGG TCG ACG 3"

IM lli III III IM IM IM II

3' CAA TGC CTA ACG ACG TCC AGC TGC CTA G 5"

Ncol PstI Sall BamHI

mit dem 3,3 kb-Fragment ligiert, wobei ein Plasmid er¬ halten wird, bei dem der Leserahmen des lacZ an das ATG des mgl-Gens fusioniert ist (pPZ07-mgllac, Fig. 10). Bei Einbringen dieses Plasmids in E. coli HB101, DSM 1607, wird eine Expression von ß-Galactosidase in die cytoplasmatische Fraktion der Zelle beobachtet, die Glucose-steuerbar ist (Tabelle II) .

Tabelle II

Stamm: ß-Galactosidase-Aktivität:

LB-Medium LB-Medium + 0,2 % Glucose

HB101 4900 4700

HB101 x pPZ07-mgllac 31400 1700

(Die ß-Galactosidase-Aktivitätsbestimmung wurde wie bei J.H. Miller (1972) Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben durchgeführt.)

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Expression der Pen-G-Amidase

Das gl-Expressionsplasmid wurde verwendet, um das periplasmatische Enzym Penicillin G-Amidase zu expri- mieren. Die Subklonierung und die DNA-Sequenz der Pen- G-Amidase sind in EP 0180225 A2 beschrieben. Die repli¬ kative Form des Phagen M13mgl506 (Beispiel 1) wurde mit Hindlll und BamHI gespalten. Die Hindlll-Schnittsteile wurde vor der Spaltung mit BamHI mit Polymerase I (Klenow-Fragment) und den 4 Desoxyribonukleotidtriphos- phaten glatt gemacht.

Aus dem Plasmid pBT212, DSM3058 (beschrieben in EP 0 180 225 A2), wurde durch Spaltung mit BamHI und Ahalll ein Fragment von ca. 800 bp isoliert. Dieses Fragment wird in den vorher beschriebenen und mit BamHI und Hindlll geöffneten Vektor M13mgl506 ligiert. Unter Verwendung des Oligonukleotids

5 ' ACTTGACGACTGCTCCGCGTGCGCGTGCGC 3 ^•

und der einzelsträngigen DNA des Phagen M13 kann nun eine Deletionsmutagenese durchgeführt werden. Einzel¬ heiten dieser Methode sind im Handbuch "Oligonukleotid- directed in vitro mutagenesis System" Amersham rpn 2322 beschrieben. Durch die Deletion entsteht eine exakte Fusion zwischen der mgl-Signalsequenz und dem Gen der

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Pen-G-Amidase in der Art, daß in dem Protein, welches aus der DNA übersetzt wird, Aminosäure 23 des mgl-Signal- peptids (Fig. 1) mit Aminosäure 27 der Pen-G-Amidase fusioniert ist. Die Klone, welche die gewünschte Deletion enthalten, werden über ein Screening mit dem oben beschriebenen, radioaktiv markierten Oligonukleotid als Probe identifiziert (vgl. Handbuch loc. cit) . Von einem der durch das Screening identifizierten Klone wird die replikative DNA präpariert (vgl. Handbook loc. cit. dort M13 cloning and sequencing) .

Die DNA wird mit EcoRI und EcoRV gespalten und das ca. 1 kb große DNA-Fragment isoliert. Dieses DNA-Fragment wird in den mit EcoRI und EcoRV gespaltenen Vektor pBT212 ligiert und damit die kodierende Region der Pen-G-Amidase unter die Regulationskontrolle des mgl- Promotors gebracht.

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Expression und Sekretion Penicillin G Amidase (PenG) über mgl-Promotor und mgl-Signalpeptid

Das Plasmid pBTEl-11 (EP 0180225 A2, DSM 3061) enthält das PenG-Gen. Durch Spaltung mit den Restriktionsendo- nukleasen Clal und SphI kann ein 182 bp großes DNA-Frag¬ ment erhalten werden, das den N-terminalen Bereich des PenG-Gens einschließlich des Starts der reifen PenG umfaßt. Dieses Fragment wird in AccI-SphI gespaltenen Vektor M13mglEcoK (Fig. 4) einligiert. Durch In-vitro- Mutagenese, wie in Beispiel 3 beschrieben, mit einem synthetischen Oligonukleotid der Sequenz:

1 ACTTGACGAC TGCTCCGCGT GCGCGTG 27

erhält man eine Fusion zwischen dem Ende der mglB-Sig- nalsequenz und dem Start der reifen PenG. Die für das Signalpeptid der PenG kodierende Sequenz fehlt. Die Klone, welche die gewünschte Deletion enthalten, werden über ein Screening mit dem oben beschriebenen radioaktiv markierten Oligonukleotid als Hybridisierungssonde identifiziert. Von einem dieser Klone wird replikative, doppeisträngige DNA präpariert.

Diese DNA wird mit EcoRI und SphI gespalten. Das ent¬ stehende DNA-Fragment (812 bp) wird in EcoRI und SphI gespaltenes Vektorplasmid pUC18 einligiert. Nach Trans¬ formation von E.coli HB101 wird aus einem korrekten Klon Plasmid-DNA präpariert. Diese DNA wird mit SphI und Hindlll gespalten und mit einem DNA-Fragment von 3000 bp Größe ligiert, das aus pBTEl-11 durch Spaltung mit SphI und Hindlll gewonnen wurde und den fehlenden C-terminalen Bereich des PenG-Gens enthält.

Das dabei entstehende Plasmid, pPZ07-mglpenG (Fig. 11) enthält den für die reife PenG kodierenden Genabschnitt fusioniert an die mglB-Signalsequenz. Die Expression dieses Fusionsgens wird über den mgl-Promotor gesteuert und ist glukoseabhängig (Tabelle III) . Exprimierte PenG wird über das mglB-Signalpeptid in den periplasmatischen Raum ausgeschleust und dort zum aktiven Enzym prozes¬ siert.

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Tabelle III :

PenG Aktivität (mU/A 420 Zelldichte) :

Stamm: LB-Medium LB-Medium

+ 0,4% Glucose

HB101 x pUC18 n,

HB101 x pPZ07-mglpenG 20,9 0,8

HB101 x pBT El-11 1,7 n.b,

(Die PenG-Enzy aktivität wurde mit 2-Nitro-5-phenylacet- aminophenylessigsäure als Farbsubstrat, wie bei Kutzbach, C. und Rauenbusch, E. (1974), Hoppe-Seyler' s Physiol. Che . Bd. 354, 45-53 beschrieben, bestimmt.)

Zur Entfernung des in Plasmid pBT212 vorhandenen tac Promotors wird das Plasmid mit BamHI und EcoRI gespal¬ ten, die Enden mit DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) und den 4 Desoxyribonukleotidphosphaten glatt gemacht und religiert.

Die Expression der Pen-G-Amidase unterliegt in diesem Plasmid der Katabolit-reprimierbaren Kontrolle und wird mit Hilfe der mgl-B-Signalsequenz in das Periplasma ausgeschleust.