本発明における核酸とは、増幅が望まれる� ��酸であって、増幅反応において鋳型となり� ��るものであれば、特に限定されるものでは� ��い。DNAであってもよく、RNAであってもよく� ��RNAから逆転写酵素を用いて合成されたcDNAで あってもよい。また、ヒト等の生物由来のも のであってもよく、合成されたものであって もよい。 
 本発明における試料とは、核酸を含有する� ��料であれば、特に限定されるものではない� ��、夾雑物としてのタンパク質を含むもので� ��ってもよい。例えば、血液や体液等の生体� ��料、培養細胞や培養液等の培養物等がこれ� ��含まれる。

 本発明の酵素含有カプセルは、融点が60~95� �の非タンパク質性物質を含む皮膜により、� �熱性酵素を封入したことを特徴とするもの� �ある。なお、本発明におけるカプセル(皮膜) の融点とは、カプセルが加熱処理によって溶 解する時の温度を意味し、非タンパク質性物 質とは、タンパク質分解酵素により分解され ない物質、すなわちタンパク質分解酵素耐性 を有する物質を意味する。
 本発明の酵素含有カプセルは、耐熱性酵素� ��、非タンパク質性物質を皮膜成分とするカ� ��セルの内部に封入された状態である。した� ��ってこの状態で本発明の酵素含有カプセル� ��添加した試料に対してタンパク質分解酵素� ��よるタンパク質分解処理を行っても、本発� ��の酵素含有カプセルに含有されている耐熱� ��酵素を分解や失活させることがない。つま� ��、本発明の酵素含有カプセルにおいて、カ� ��セルは、耐熱性酵素をタンパク質分解酵素� ��影響から保護する保護膜の役割を果たすも� ��である。また、皮膜となる非タンパク質性� ��質の融点を60~95℃としているため、本発明� �酵素含有カプセルは、加熱により溶解させ� �ことができる。このため、該タンパク質分� �処理後、該試料を加熱することで該タンパ� �質分解酵素を失活させるとともに、皮膜に� �り保護されていた耐熱性酵素をカプセルか� �容易に放出させることができる。放出され� �耐熱性酵素は、試料中の核酸増幅反応に用� �ることができる。

 本発明の酵素含有カプセルの皮膜成分は� ��融点が60~95℃であり、かつ、非タンパク質� �物質であれば、特に限定されるものではな� �。融点が60~95℃であることにより、カプセル の溶解時に、通常用いられるタンパク質分解 酵素を失活させることができる。また、核酸 の増幅方法が、RNAを鋳型とするNASBA法のよう� ��、二本鎖核酸を一本鎖核酸にする変性工程� ��を含まない方法である場合には、融点が60~7 0℃のカプセルであることが好ましい。耐熱� �の条件が緩和され、本発明の酵素含有カプ� �ルに含有させ得る耐熱性酵素の種類が増え� �ためである。より好ましくは、本発明の酵� �含有カプセルにおける非タンパク性物質は� �タンパク質分解酵素耐性を有する、生分解� �プラスチックである。更に好ましくは当該� �分解性プラスチックは、脂肪族ポリエステ� �又はその共重合体である。更に好ましくは� �該脂肪族ポリエステル又はその共重合体は� �融点60℃のポリカプロラクトン、又は融点95� ��のポリブチレンサクシネートアジペートで� ��る。 また、本発明の酵素含有カプセルの� �プセル成分の種類や濃度等は、使用するタ� �パク質分解酵素や耐熱性酵素の種類等を考� �して、所望の融点を得られるように、適宜� �定することができる。該カプセル成分は、� �種類の非タンパク質性物質からなるもので� �ってもよく、二種類以上の非タンパク質性� �質の混合物からなるものであってもよい。

 本発明の酵素含有カプセルにおいては、� ��熱性酵素が、不凍性溶媒に溶解させた状態� ��カプセルに封入されていることが好ましい� ��不凍性溶媒に溶解させることにより、カプ� ��ル内部の耐熱性酵素の酵素活性を損なうこ� ��なく、本発明の酵素含有カプセルを0℃以下 で保存することができるためである。ここで 、不凍性溶媒とは、氷点下でも凍らない溶媒 を意味する。該不凍性溶媒は、通常酵素等の 保存に用いられている溶媒であれば、特に限 定されるものではなく、耐熱性酵素の種類等 を考慮して適宜決定することができる。該不 凍性溶媒として、例えば、グリセロール、エ チレングリコール、ジエチレングリコール、 ポリエチレングリコール等がある。

 本発明の酵素含有カプセルに含有される� ��熱性酵素は、特に限定されるものではない� ��、核酸の増幅に用いられる酵素であること� ��好ましい。本発明における核酸の増幅は、� ��ましくは試料中の核酸を鋳型とし、ヌクレ� ��チドの相補性を用いて塩基鎖を伸長するこ� ��により、該試料中の核酸を増幅する方法で� ��る。該方法として、例えば、PCR(Polymerase Cha in Reaction)法、NASBA(Nucleic acids Suquence Based Am plification)法、LAMP(Loop mediated isothermal amplifica tion)法(例えば、特許文献11参照)、ICAN(Isothermal  and Chimeric primer-initiated Amplification of Nuclei c acids)法(例えば、特許文献12参照)等がある� �

 本発明における核酸の増幅に用いられる� ��熱性酵素(以下、核酸増幅用耐熱性酵素とい う)は、通常60℃以上の温度条件下における核 酸増幅反応に用いられる耐熱性酵素であれば 、特に限定されるものではない。該核酸増幅 用耐熱性酵素として、例えば、耐熱性DNAポリ メラーゼ、耐熱性RNAポリメラーゼ、耐熱性RNA ヌクレアーゼ等がある。また、本発明の酵素 含有カプセルに含有される耐熱性酵素の濃度 は、該耐熱性酵素の種類や酵素活性等を考慮 して、適宜決定することができる。

 本発明の酵素含有カプセルは、耐熱性酵� ��の酵素活性を損なうことなく、カプセル内� ��に封入することができる方法であれば、い� ��れの方法を用いても製造することができる� ��例えば、特許文献13(カプセル化におけるま� ��はそれに関する改良)において開示されてい る方法を用いることにより、本発明の酵素含 有カプセルを製造することができる。また、 本発明の酵素含有カプセルの形状や大きさは 、反応容器中に添加し得る形状等であれば、 特に限定されるものではない。

 本発明の酵素含有カプセルは、含有する� ��熱性酵素の活性を損なわない限り、耐熱性� ��素以外の耐熱性物質を含有することができ� ��。例えば、本発明の酵素含有カプセルが、� ��酸増幅用耐熱性酵素を含有する場合には、� ��酸の増幅に用いるための他の試薬等を含有� ��ることができる。特に、核酸の増幅に用い� ��ためのヌクレオチドやプライマーを含有す� ��ことが好ましい。ヌクレオチド等を予め耐� ��性酵素と共にカプセルに含有させておくこ� ��により、別途分注する操作を省略すること� ��できるためである。

 本発明の核酸の増幅キットは、本発明の� ��素含有カプセルと、タンパク質分解酵素と� ��有することを特徴とする。該タンパク質分� ��酵素は、非耐熱性酵素であれば、特に限定� ��れるものではなく、通常タンパク質の分解� ��用いられるいずれの酵素であってもよい。� ��タンパク質分解酵素は、酵素活性における� ��適温度が60℃未満の非耐熱性酵素であるこ� �が好ましく、プロテイナーゼKであることが� ��に好ましい。タンパク質分解酵素活性に優� ��ており、かつ汎用されており、入手が容易� ��あるためである。

 本発明の核酸の増幅キットはさらに1又は 複数の核酸増幅反応用容器を含み、当該容器 のそれぞれの内部に、上記タンパク質分解酵 素によるタンパク質分解反応や、上記酵素含 有カプセルに含有されている耐熱性酵素によ る酵素反応において必要な試薬等を有してい てもよい。例えば、該タンパク質分解酵素は 、酵素反応用緩衝液に溶解した状態でキット に含ませることができる。該酵素反応用緩衝 液は、タンパク質分解反応と、該耐熱性酵素 による酵素反応の双方に適した緩衝液である ことが好ましい。タンパク質分解反応終了後 、反応溶液のpHや塩濃度等を新たに調整する� ��となく、該耐熱性酵素による酵素反応を行� ��ことができるためである。タンパク質分解� ��応に適した緩衝液の組成と、該耐熱性酵素� ��よる酵素反応に適した緩衝液の組成が、大� ��く異なる場合には、緩衝液の組成を調整す� ��ための塩類等を含有するカプセルを調製し� ��該カプセルを、酵素含有カプセルと共に、� ��ンパク質分解酵素を含有する酵素反応用緩� ��液に添加しておくことにより、タンパク質� ��解反応終了後、反応溶液の調整操作を省略� ��ることができる。なお、酵素含有カプセル� ��の耐熱性酵素の酵素活性を損なうおそれが� ��さい場合には、緩衝液調整のための塩類等� ��酵素含有カプセルに含有させることもでき� ��。 

 また、各核酸増幅反応用容器中には、一� ��タンパク質分解反応及びその後の核酸増幅� ��応に必要な量の酵素含有カプセル、タンパ� ��質分解酵素、及び酵素反応用緩衝液が含ま� ��ていることが好ましい。酵素含有カプセル� ��の分注操作を省略することができるためで� ��る。ここで、一の核酸増幅反応に必要な酵� ��含有カプセル量は、カプセル中の核酸増幅� ��耐熱性酵素の種類や濃度、溶媒の種類や容� ��、核酸増幅反応における反応溶液の容量等� ��考慮して、適宜決定することができる。反� ��溶液中に溶解したカプセルの皮膜成分や溶� ��が、核酸増幅反応に与える影響を抑えるこ� ��ができるため、酵素含有カプセルの容量は� ��核酸増幅反応時の反応溶液量の1/10以下であ ることが好ましい。

 本発明の酵素含有カプセル内の溶媒が、不� ��性溶媒である場合には、本発明の核酸の増� ��キットは、0℃以下で凍結した状態や、凍結 乾燥した状態で保存することができる。例え ば、本発明の核酸の増幅キットを0℃以下で� �結保存することにより、冷蔵保存する場合� �りも、酵素活性を損なうことなく、長期間� �存することができる。凍結した状態で保存� �る場合には、タンパク質分解酵素の酵素活� �を保護するため、凍結融解を繰り返さない� �とが好ましい。
 同様に、タンパク質分解酵素を、不凍性溶� ��に溶解させた状態で別途カプセルに含有さ� ��ることにより、タンパク質分解酵素の酵素� ��性をより効果的に保護することができる。� ��のようなタンパク質分解酵素を封入するカ� ��セルの皮膜成分は、カプセル内の溶媒や内� ��物に対して不溶性であり、融点が30~50℃で� �る非タンパク質性物質であることが好まし� �。カプセルの融点が30~50℃程度であること、 すなわち、封入されているタンパク質分解酵 素を用いたタンパク質分解処理に適した温度 以下であることにより、凍結保存時には、不 凍性溶媒に溶解させた状態を維持し、タンパ ク質分解処理に適した温度では、カプセルが 溶解し、タンパク質分解酵素を反応溶液中に 放出することができる。このような皮膜成分 として、例えば、3,6-アンヒドロガラクトー� �を含むガラクタンとグアーガムとデンプン� �混合物等がある(例えば、特許文献14参照)。
 例えば、本発明の核酸の増幅キットが、核� ��増幅用耐熱性酵素を含有する酵素含有カプ� ��ルを有する核酸の増幅キットである場合に� ��、酵素含有カプセルを内部に有する核酸増� ��反応用容器と、タンパク質分解酵素を含有� ��る酵素反応用緩衝液とを有するキットであ� ��ことが好ましい。該酵素反応用緩衝液が、� ��タンパク質分解酵素によるタンパク質分解� ��応と、該核酸増幅用耐熱性酵素による核酸� ��幅反応の双方に適した緩衝液であることが� ��より好ましい。さらに、核酸の増幅に用い� ��ためのヌクレオチドやプライマーを含むキ� ��トであることが特に好ましい。ヌクレオチ� ��やプライマーは、タンパク質分解酵素に耐� ��であり、かつタンパク質分解反応に特に影� ��しないため、酵素反応用緩衝液に含有させ� ��いてもよく、酵素含有カプセルに含有させ� ��いてもよい。その他、タンパク質分解酵素� ��カプセルに含有させる場合には、ヌクレオ� ��ドやプライマーは、タンパク質分解酵素と� ��じカプセルに含有させていてもよい。

 本発明の核酸の増幅方法は、本発明の酵� ��含有カプセルを用いる核酸の増幅方法であ� ��ば、特に限定されるものではない。増幅対� ��となる試料中にタンパク質が存在しない場� ��や存在する場合のそれぞれにおいても利用� ��ることができる。前者の場合、核酸増幅用� ��応容器内に、本発明の酵素含有カプセル、� ��幅対象の核酸を含む試料、並びに適宜、反� ��基質、プライマー、及び酵素反応用緩衝液� ��導入する工程を行い、次いで当該容器内で� ��酸の増幅反応を行う工程を組み合わせるこ� ��で、核酸を増幅することができる。より具� ��的には、前記核酸の増幅反応を行う工程が� ��前期酵素含有カプセルの皮膜を、60℃~100℃� ��温度、0~15分間で溶融させ、ついで、55℃~100 ℃の温度で核酸の増幅反応を行う工程とする ことができる。一方、増幅対象となる試料中 にタンパク質が存在する場合には、本発明の 核酸の増幅方法により、容易かつ簡便に、試 料中のタンパク質を失活させた後に、該試料 中の核酸を増幅することができる。例えば、 以下のようにして、タンパク質と核酸を含有 する試料中の核酸を増幅することができる。

 まず、工程(a)として、タンパク質及び核� ��を含有する試料、本発明の酵素含有カプセ� ��、タンパク質分解酵素、並びに、適宜、反� ��基質、プライマー、及び酵素反応用緩衝液� ��混合し、反応溶液を調製する。この時、核� ��の増幅に用いるためのヌクレオチドや核酸� ��増幅に用いるためのプライマー等の、タン� ��ク質分解反応のみならず、その後の核酸増� ��反応において必要な試薬を全て添加するこ� ��が好ましい。全工程に必要な試薬を予め添� ��し、混合することにより、途中の工程で試� ��を添加する操作が不要となり、操作の利便� ��や迅速性を向上させ、コンタミネーション� ��二次感染のおそれを低減することができる� ��なお、ヌクレオチドやプライマーは、反応� ��液中に添加して溶解させてもよく、酵素含� ��ゲルに核酸増幅用耐熱性酵素と共に含有さ� ��た状態で添加してもよい。また、酵素反応� ��緩衝液、ヌクレオチド、プライマー等のタ� ��パク質分解反応や核酸増幅反応に用いられ� ��試薬は、特に限定されるものではなく、通� ��核酸の増幅を行う場合に用いられるものを� ��通常用いられる量で用いることができる。

 次に、工程(b)として、工程(a)において得� ��れた反応溶液を、30℃~60℃の温度で0~15分間� ��熱する。該タンパク質分解酵素を用いたタ� ��パク質分解処理に適した温度に該反応溶液� ��加熱することにより、該試料に含まれてい� ��タンパク質を効果的に分解することができ� ��。このとき、該タンパク質分解酵素は、非� ��ンパク質性物質(融点が30~50℃)を皮膜成分と するカプセルに含まれるものとすることがで きる。この場合、工程(b)の温度処理により該 皮膜成分が溶解し、該タンパク質分解酵素が 、該試料中のタンパク質に作用する。例えば タンパク質分解酵素として、プロテイナーゼ Kを用いる場合には、前記工程(a)において得� �れた反応溶液を、45~55℃に加熱することが特 に好ましい。プロテイナーゼKの酵素活性を� �く維持できるためである。

 タンパク質分解反応終了後、工程(c)とし� ��、工程(b)において得られた反応溶液を、60~1 00℃の温度で0~15分間加熱する。該加熱処理に より、該酵素含有カプセルを溶解させ、核酸 増幅用耐熱性酵素を該反応溶液中に放出させ ることができる。また、該加熱処理により、 タンパク質分解酵素は変性し、失活するため 、放出された核酸増幅用耐熱性酵素は、分解 されることなく、核酸の増幅に用いることが できる。さらに、該加熱処理により、該試料 に含まれている非耐熱性タンパク質も変性さ せることができる。つまり、本発明の核酸の 増幅方法においては、核酸増幅反応における 主要な阻害要因である試料中のタンパク質を 、酵素処理と加熱処理により、非常に効果的 に失活させることができる。

 さらに、工程(d)として、工程(c)において� ��られた反応溶液を用いて、核酸の増幅を行� ��ことにより、該試料中の目的の核酸を増幅� ��ることができる。核酸の増幅は、該核酸増� ��用耐熱性酵素を用いて、通常行われている� ��法により、行うことができる。また、核酸� ��幅反応における反応条件等は、増幅の目的� ��ある核酸の長さやプライマーの種類等を考� ��して、適宜決定することができる。