Die vollständige molekulare Erschließung des Genoms des Menschen und klinisch relevanter Pathogene öffnet neue Wege in der Entwicklung von Therapeutika bzw. Prophylaktika gegen die Krankheiten des Menschen. So ist die Entschlüsselung des menschlichen Genoms for die nächsten Jahren angekündigt. Die Anzahl molekularvollständig charakterisierter pathogener Keime nimmt ständig zu. Das erklärte Ziel ist es nun, aus dem umfangreichen Datenmaterial solche Gene zu identifizieren, deren Produkte als potentielles Ziel für einen Wirkstoff in Frage kommen und somit for die Entwicklung eines spezifischen Wirkstoffs benutzt werden können. Dieses

Potential la (3t sich aus der Primärstruktur eines Gens nicht ableiten, sondern muß experimentell bestimmt werden.

Liegt die komplette genomische Sequenz eines Organismus vor, steht man vor dem Problem, die enorme Datenmenge für weiterführende biologische Analysen zugänglich zu machen. Der erste Schritt ist die Identifizierung aller auf dem Genom liegenden Gene. Dies geschieht in der Regel mit Hilfe computergestützter Suchprogramme, die mit einer gewissen Sicherheit potentielle Gene vorhersagen können. Auf diese Weise können Genkarten erstellt werden, die allerdings noch mit einer großen Ungenauigkeitbehaftet sind. Können die vom Suchprogramm ausgewiesenen Gene keinem bekannten Gen zugeordnet werden, muß die Funktionalität dieser hypothetischen Gene durch den physikalischen Nachweis der Genprodukte in der ursprünglichen Zelle nachgewiesen werden.

Eine andere Strategie, die ebenfalls auf der Anwendung spezieller Suchprogramrne beruht, ist auf die Identifizierung möglicher Genfamilien ausgerichtet, die mit speziellen biologischen Eigenschaften verknüpft sind, die wiederum aufgrund weiterer Annahmen als Wirkstoffziel in Betracht kommen. Die Suchkriterien sind auf charakteristische Strukturmerkmale ausgerichtet, die in der Regel von schon bekannten Genen abgeleitet wurden. Das Ergebnis einer solchen Suche kann, in Abhängigkeit von der Annäherung der Vorgaben zum wirklichen Zustand, eine hohe Trefferquote liefern. In der Regel ist die Ungenauigkeit dieser Verfahren jedoch relativ hoch, und die wirkliche biologische Eigenschaft des Gens bzw. dessen Genprodukts muß auf jeden Fall experimentell bestätigt werden.

Eine weitere Strategie erfaßt die Expressionsprodukte einer Zelle, wodurch die zum jeweiligen Entwicklungszustand aktiven Gene identifiziert werden können. Vergleicht man verschiedene Entwicklungszustände miteinander, kann auf diese Weise das Zusammenwirken der Gene abgeleitet werden und in einigen Fällen kann die biologische Funktion unbekannter Gene teilweise

entschlüsselt werden. Führt man entsprechende Vergleichsuntersuchungen mit Zellen durch, die ein pathologisches Erscheinungsbild haben, ist es sogar möglich auch krankheitsverursachende Gene zu identifizieren und diese als potentielle Wirkstoffziele für die Wirkstoffentwicklung einzusetzen.

Alle beschriebenen Verfahren dienen insbesondere dazu, bislang unbekannte Gene zu identifizieren und diesen mit Hilfe Computer-gestützter Datenvergleiche eine biologische Funktion zuzuordnen. Eine eindeutige Bewertung eines Gens bzw. Genprodukts hinsichtlich seines Potentials als Wirkstoffziel zu dienen und somit für die Entwicklung von Wirkstoffen herangezogen werden zu können, erfüllt jedoch keines der bekannten Verfahren.

Einige der wichtigsten Voraussetzungen für einen pathogenen Organismus, in einem Wirt zu überleben und sich zu vermehren, sind einerseits die Fähigkeit, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen, und andererseits die Fähigkeit zur Anpassung an einen ganz speziellen Lebensraum oder Nische.

Die dafür verantwortlichen Faktoren und Proteine sind somit in der Regel essentiell für den pathogenen Keim.

Es wäre von großem Vorteil, diese essentiellen Gene von Mikroorganismen zu identifizieren, um auf diese Weise die Mögtichkeit zur Herstellung von therapeutischen, präventiven oder/und diagnostischen Mitteln, z. B.

Antikörpern, Impfstoffen oder Inhibitoren der entsprechenden Polypeptide zu bekommen.

Ein Pathogen von besonderem medizinischen Interesse ist Helicobacter pylori. Dieser Keim ist ein Gram-negatives, spiralförmiges Bakterium mit hohem pathogenen Potential, das in den letzten Jahren verstärkt Resistenzen gegen eine Reihe therapeutisch relevanter Antibiotika entwickelt hat und somit von großer klinischer Bedeutung ist. Es zeichnet sich durch extrem hohe Beweglichkeit aufgrund seiner Flagellen und der

ungewöhnlichen Fähigkeit, im stark sauren Milieu (bis pH 1,5) des Magens überleben zu können, aus (Goodwin et al., 1989).

Obgleich das Auftreten von spiralförmigen Bakterien in der menschlichen Magenschleimhaut seit langem bekannt ist, weiß man erst seit der erfolgreichen Isolierung und Kultivierung dieses Bakteriums (Warren and Marshall 1983 ; Marshall et al., 1984) aus der Magenschleimhaut eines Patienten mit einem Magengeschwür (Ulcus ventriculi), daß es sich hierbei um pathogene Keime handelt. Die H. py/ori-Infektion zählt zu den häufigsten chronischen bakteriellen Infektionen des Menschen. Sie tritt weltweit auf, wobei ca. 50% der Bevölkerung mit diesem Bakterium infiziert sind.

Eine Infektion führt zwangsläufig zur Auslösung einer bakteriellen Gastritis (Typ-B Gastritis) beim Menschen. Ferner geht man davon aus, daß H. pylori auch eine ursächliche Rolle bei der Entstehung von Magen-und Zwölffingerdarmgeschwüren (Ulcus ventriculi und Ulcus duodeni) sowie bei einigen Formen des Magenkarzinoms (Adenokarzinom) spielt (Lee et al., 1993 ; Solnick und Tompkins, 1993). In zwei Studien von 1991 wurde eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der H. py/ori-Infektion und dem Auftreten des Magenkarzinoms (intestinaler Typ) gezeigt, wobei beide Studien zu dem Schluß kamen, daß ca. 60% aller auftretenden Magenkarzinome wahrscheinlich auf eine H. py/ori-lnfektion zurückzuführen sind (Parsonnet et al., 1991 ; Nomura et al., 1991). Auch die seltener auftretenden MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) Lymphome des Magens, die als Vorstufen von B-Zell-Tumoren des Immunsystems angesehen werden, sind vermutlich eine Folge der H. py/ori-Infektion. Eine Folge der Langzeitinfektion mit H. pylori ist die atrophische Gastritis, eine Degeneration der Schleim, Säure oder Pepsin produzierenden Zellen des Magenepithels, die als eine präkanzeröse Läsion angesehen werden muß.

Nach der oralen Aufnahme gelangen die Bakterien zunächst in das extrem saure Magenlumen (pH 1 bis 2). Dort wird durch die Produktion des Enzyms

Urease, das zur Spaltung des vorhandenen Harnstoffs und damit zur lokalen Neutralisierung des sauren pH-Wertes im Magen führt, was das Überleben der Bakterien ermöglicht. Mittels chemotaktischer Orientierung und flagellenabhängiger Motilität bewegen sich die Keime dann in die Bicarbonat-gepufferte SchleimschichtderAntrum-Region des Magens, ihren eigentlichen natürlichen Habitat. Dort befinden sie sich in einer einzigartigen ökologischen Nische, die aufgrund der Säurebarriere nur für wenige konkurrierende Bakterienarten zugänglich ist. Vermutlich orientieren sich die Bakterien an den pH-Gradienten zwischen Lumen (pH 1-2) und Epithelzelloberflache (pH 6-7), um zum Epithel zu gelangen. Durch ihre spiralige Form, ihre Beweglichkeit im viskosen Schleim, die Produktion von Mukus-modifizierenden Enzymen und schließlich durch eine mikroaerophile Lebensweise sind diese Keime optimal an die Lebensbedingungen in diesem Habitat angepaßt. Sie halten sich meist in den tiefen Krypten der Antrum- Region auf, wo sie vor äußeren Einflüssen wie z. B. Säure, Pepsin aber auch vor Medikamenten zu ihrer Eradikation, wie z. B. Antibiotika, geschützt sind.

Ein Teil der Bakterienpopulation (ca. 20%) ist eng mit Epitheizellen assoziiert, vor allem mit Schleim produzierenden Zellen. Unter der Voraussetzung einer gastralen Metaplasie, d. h. der säureinduzierten Ausbildung von gastralem Epithel im Duodenum, kommt es auch zur Kolonisierung metaplastischer Areale im Zwölffingerdarm, wodurch die Voraussetzungen zur Entstehung des Zwölffingerdarmgeschwürs (Ulcus duodeni) geschaffen sind. Durch ihre Fähigkeit zur Adhärenz wird vermutlich eine komplette Ausscheidung der Helicobacter mit dem abgestoßenen Schleim verhindert, so daß die Bakterien für Jahre, Jahrzehnte oder gar lebenslang persistieren können (chronische Infektion).

Bevor die Existenz und die Bedeutung des H. pylori für die Ulkuserkrankungen bekannt waren, wurden diese durch sog. Antazida, oder H2-Rezeptorantagonisten behandelt. Dabei handelt es sich um Substanzen, welche die Säuresekretion der Magenparietalzelle inhibieren. Unter dem Einfluß dieser Arzneimittel kommt es zwar zumeist zur Abheilung von

Geschwüren, da jedoch eine der Ursachen dieser Geschwüre, nämlich die H. py/ori-Infektion, damit nicht eliminiert wird, kommt es in den meisten Fällen nach kurzer Zeit zu einem erneuten Auftreten der Ulzeration (Rezidiv).

Eine weitere, häufig bei Ulzerationen angewandte Therapie ist die Wismut- Behandlung. Verschiedene Wismut-Salze (CBS, BSS) haben einen bakteriziden Effekt auf H. pylori. Ein bedeutender Nachteil dieser Therapieform ist jedoch, daß eine totale Eradikation des Keims nur in einem sehr geringen Prozentsatz der Fälle erreicht wird (8 bis 32%). Wie bei der Behandlung mit Antazida kommt es nur zu einer vorübergehenden Suppression des Keims, und nach Absetzen der Behandlung erfolgt in den meisten Fällen wieder ein Aufflackern der Infektion. Ein weiterer Nachteil der Wismut-Behandlung ist, daß eine langer dauerende Therapie mit hohen Dosen zu einer Akkumulation dieser Substanz in der Leber, Niere und dem Nervensystem führt und beträchtliche neurologische Nebenwirkungen hat (Malfertheiner, 1994).

Seit der Erkenntnis, daß es sich bei den gastroduodenalen Ulkuserkrankungen um Infektionskrankheiten handelt, werden zur Behandlung nun auch Antibiotika eingesetzt. Die Monotherapie mit verschiedenen Antibiotika (Amoxicillin, Nitrofuran, Furazolidin, Erythromycin und dergleichen) stellte sich jedoch als nicht zufriedenstellend heraus, da es auch hier nur bei 0 bis 15 % der Zellen zur kompletten Eradikation der Keime kommt. Die bisher erfolgreichste Behandlung wird zur Zeit durch eine Kombination eines Säureblockers (Ompeprazol) mit einem Antibiotikum (Amoxicillin) erreicht, die zu Eradikationsraten bis zu 80% führen kann (Malfertheiner, 1994). Auf die Dauer ist eine Antibiotikabehandlung zur Eliminierung von H. pylori jedoch nicht erfolgversprechend, da aufgrund der unvollständigen Eradikation des Keims mit einer raschen Resistenz- entwicklung der Bakterien gegen Antibiotika gerechnet werden muß.

Das zunehmende Auftreten von Antibiotika-Resistenzen und die eingeschränkten Behandlungsoptionen, die in der Regel beträchtliche unerwünschte Nebenwirkungen haben, macht das Auffinden neuer Therapieformen und dabei insbesondere die Identifizierung neuer Wirkstoffe notwendig, vor allem Impfstoffe, die sowohl zur prophylaktischen, als auch therapeutischen Behandlung von Helicobacter-Infektionen verwendet werden können. Von besonderem Interesse ist auch die Darreichungsform, da der Wirkstoff im Magen, d. h. in einem extrem sauren Milieu wirksam sein muß. Verbindungen mit Protonenblockern, die z. B. vor der Verabreichung des prophylaktischen oder therapeutischen Wirkstoffs gegeben werden, können hierbei von großem Nutzen sein.

Die molekulare Grundlage für persistierende, chronische Helicobacter- Infektionen ist bislang noch nicht geklärt. Es konnte gezeigt werden, daß die Faktoren Urease, Beweglichkeit und Adhärenz essentielle Eigenschaften des Bakteriums sind, die gastrische Mukosa kolonisieren zu können.

Obgleich der Wirtsorganismus unter normalen Bedingungen nicht in der Lage ist, mit einer H. py/ori-Infektion fertig zu werden, zeigte sich im Tiermodell, daß die Urease, ein essentieller Virulenzfaktor von H. pylori, ein hohes Potential als Vakzin besitzt (US-Patentanmeldung US-SN-07/970,006 "Urease-based Vaccine Against Helicobacter Infection).

Diejenigen Komponenten jedoch, die dafür verantwortlich sind, daß das Pathogen das Immunsystem des Wirtes umgehen kann, sind bisher noch unbekannt.

Pathogene Organismen im Allgemeinen haben eine Vielzahl von Strategien entwickelt, im Wirt über einen langen Zeitraum vom Immunsystem unbehelligt persistieren zu können (Haas und Göbel, 1992 ; Finlay und Falkow, 1997). Ein Mechanismus, der zum Überleben in lebensfeindlichem Milieu dient, ist die Ausbildung einer Überdauerungsform.

Im Falle von H. pylori sind in der Literatur kokkoide Formen als potentielle Überdauerungsformen mehrfach beschrieben, ihre klinische Bedeutung ist allerdings umstritten. Kokkoide Formen könnten für eine ex vivo Überdauerung eine große Rolle spielen. Hinsichtlich der in vivo Überdauerung wurde gezeigt, daß kokkoide Formen bevorzugt durch ein ungünstiges Milieu wie z. B. einen hohen 02-Partialdruck oder subletale Gaben von Antibiotika (Wismut-Subcitrat, Erythromycin, Amoxicillin, Metronidazol) induziert werden (Donelli et a/., 1998 ; Bode et a/., 1993 ; Sorberg et a., 1996 ; Berry et a/., 1995).

Einige Forscher gehen davon aus, daß diese kokkoiden Bakterien lebensfähig, aber nicht kultivierbar sind (VNC, viable but non-culturable).

Eaton und Mitarbeiter erhielten eine erfolgreiche Infektion von Mini- Schweinchen mit vegetativen (spiraligen) H. pylori, während kokkoide Formen in diesem Modell keine Infektion zeigten (Eaton et a., 1995). Der direkte Nachweis von kokkoiden Formen im menschlichen Magen wurde von Chan et al. anhand von Magengewebeschnitten aus Biopsiematerial erbracht. In 82.8 % (53/64) der untersuchten Biopsieproben konnten die Autoren kokkoide Formen von H. pylori nachweisen (Chan et al, 1994).

Von Cao et al. wurde ein monoklonaler Antikörper zum spezifischen Nachweis von kokkoiden H. pylori im Gewebeschnitt benutzt. Auch hier wurden neben den vegetativen Formen in 100 % der Antrumbiopsien (9/9) H. pylori kokkoide Formen nachgewiesen (Cao et a/., 1997).

Die Bindung an Epithelzellen und die Fähigkeit zur Signaltransduktion (IL-8- Induktion, Rearrangement des Zytoskeletts, Bindung von Plasminogen, Laktoferrin und Vitronectin auf der Bakterienoberfläche) scheint bei kokkoiden Formen vergleichbar zu den vegetativen Formen erhalten zu sein (Khin et a/., 1996 ; Segal et al., 1996).

Die oben genannten Experimente deuten auf eine Bedeutung kokkoider Formen für die Überlebensfähigkeit von Helicobacter in ungünstigem Milieu

hin. Daher ist die Identifizierung von Genen, die mit der Entstehung dieser Form und Reaktivierung in die vitale Form zusammenhängen, for die Entwicklung neuer Wirkstoffe von größtem Interesse.

Neben Helicobacter pylori können auch andere Helicobacter Spezies den Magen des Menschen kolonisieren wie z. B. H. heilmannii und H. felis.

Diesbezüglich konnte gezeigt werden, daß auch Hheilmannii mit krankhaften Ulkuserkrankungen in Zusammenhang gebracht werden kann.

Die ursächliche Übertragung findet wahrscheinlich von Haustieren auf den Menschen statt. Bislang wurde der im Menschen häufig vorkommende H. pylori in den Verdacht gebracht, bei der Entstehung von Magenkrebs eine Rolle zu spielen. Mittlerweile gibt es klinische Daten, die diesen Zusammenhang anzweifeln. Besonders werden diese Zweifel durch neuere Daten von Helicobacter heilmannii unterstützt, die diesem ein größeres kanzerogenes Potential beimessen und dessen Bedeutung bei der Entstehung des gastrischen MALT Lymphoms hervorherben (Regimbeau et a/., 1988).

Wird das bisher Gesagte zusammenfassend betrachtet, ist es klar, daß ein Bedürfnis nach neuen Therapieformen für die Bekämpfung bakterieller Krankheitserreger, insbesondere nach Impfstoffen und Inhibitoren von essentiellen Genen bzw. deren Expressionsprodukten besteht. Die zunehmende Resistenzentwickung gegen eine Vieizahl bewährter Medikamente erfordert eine kontinuierliche Versorgung mit neuen Wirkstoffen. Dieser steigende Bedarf an neuen Wirkstoffen kann nur gedeckt werden, wenn neue Wirkstoffziele identifiziert und diese zur Entwicklung neuer Wirkstoffe herangezogen werden. Essentielle Gene stellen für die Wirkstoffentwicklung ein ideales Ziel dar, da sie für das Überleben des Krankheitserregers notwendig sind.

Die Identifizierung essentieller Gene von Helicobacter, insbesondere von H. pylori bzw. heilmannii und von möglichen Helicobacter

Überdauerungsformen zur Entwicklung und Optimierung neuer therapeutischer, präventiver und/oder diagnostischer Mittel, wie z. B.

Impfstoffe und pharmakologischer Wirkstoffe stellt daher ein Ziel der Erfindung dar. Im Vordergrund steht das Auffinden essentieller mikrobieller Gene, wobei auch homologe Proteine verschiedener pathogener Keime identifiziert werden können. Mit Hilfe eines Wirkstoffs könnten dann wie bei den klassischen Antibiotika mehrere pathogene Keime gleichzeitig eliminiert werden. Bei Helicobacter stehen insbesondere Gene im Vordergrund, die lebensnotwendige Funktionen im Infektionsprozeß erfüllen, sowie Gene, die an der Entwicklung. und Reaktivierung von kokkoiden Formen beteiligt sind.

Von besonderem Interesse sind hierbei essentielle Gene, die für sekretierte Genprodukte kodieren, da diese für immunologische und pharmakologische Wirkstoffe aufgrund ihrer exponierten Lokalisation besonders gut erreicht werden können und daher gute Kandidaten zur Wirkstoffentwicklung sind.

Weiterhin von Interesse sind essentielle Gene, die für Genprodukte kodieren, die an der Entwicklung und der Aufrechterhaltung von Überdauerungsformen beteiligt sind. Eine weitere Aufgabe ist das Auffinden essentieller mikrobieller Gene, wobei auch homologe Proteine verschiedener pathogener Keime identifiziert werden können. Mit Hilfe eines Wirkstoffs könnten dann wie bei den klassischen Antibiotika mehrere pathogene Keime gleichzeitig eliminiert werden.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zum Nachweis, zur Therapie oder/und zur Prävention von mikrobiellen Infektionen, das die folgenden Schritte umfaßt : (A) Identifizieren von essentiellen Genen und den entsprechenden Polypeptiden durch Herstellung gendefizienter Mikroorganismen durch konditionale Antisense-Hemmung (CAI) oder/und subtraktive Rekombinations-Mutagenese (SRM) und Bestimmung der Lebens-und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen in einem Testsystem.

(B) Identifizieren von spezifischen Wirkstoffen, welche gegen die essentiellen Polypeptide gerichtet sind und die Inaktiviertung der Mikroorganismen oder verwendeter Mikroorganismen herbeiführen.

(C) Testen der identifizierten Wirkstoffe auf ihre Anwendbarkeit als Bestandteile von diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mitteln, (D) Formulieren der anwendbaren Wirkstoffe als diagnostische, präventive oder/und therapeutische Mittel.

Das hier dargestellte Verfahren befaßt sich mit der Identifizierung essentieller Gene und deren Verwendung zur Entwicklung neuer Wirkstoffe.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Verfahren zum Identifizieren von essentiellen mikrobiellen Genen, das die folgenden Schritte umfaßt : (i) Herstellen von gendefizienten Mikroorganismen, (ii) Bestimmen der Lebens-oder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen aus (i), (iii) Identifizieren eines proteinkodierenden Abschnitts einer mikrobiellen DNA-Sequenz, in der die gendefizienten Mikroorganismen defiziert sind und (iv) Charakterisieren derjenigen DNA-Abschnitte, die essentiel für die Überlebensfähigkeit sind.

CAI ist die Abkürzung für nconditional antisense inhibition", d. h. konditionale Antisensehemmung. Es handelt sich hierbei um ein Verfahren, welches weiter unten näher beschrieben ist.

SRM steht für"subtractive recombination mutagenesis", d. h. subtraktive Rekombinationsmutagenese und ist ebenfalls unten beschrieben.

Der Ausdruck"gendefizient", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß der defiziente Organismus nicht in der Lage ist, ein oder mehrere seiner Genprodukte herzustellen oder deren Funktion zu nutzen. Die Herstellung des entsprechenden Genprodukts kann einerseits durch Mutagenese des entsprechenden Gens verhindert werden, oder es kann eine Inhibition während der Expression stattfinden, z. B. durch Antisensenukleinsäuren.

Eine Mutagenese kann dazu eingesetzt werden, ein Gen in dem Genom des Mikroorganismus zu mutieren, oder dazu, ein mutiertes Gen in den Mikroorganismus einzubrigen, wobei man sich auch die homologe Rekombination zunutze machen kann.

Ein proteinkodierender Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz ist beispielweise ein Gen oder ein Teil eines Gens das/der die Expression eines Polypeptids erlaubt.

Der Begriff"essentielles Gen"bedeutet ein Gen, das für ein Genprodukt kodiert, ohne welches ein Organismus nicht überlebensfähig ist oder nur beschränkt überlebensfähig ist. Essentielle Gene können in zwei Klassen unterteilt werden : obligat essentielle und fakultativ essentielle Gene. Ein obligat essentielles Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder die Vermehrung eines Organismus unter allen Umständen unabdingbar ist.

Demgegenüber kodiert ein fakultativ essentielles Gen für ein Protein, das lediglich unter bestimmten Bedingungen für das Überleben oder die Vermehrung des Organismus notwendig ist, wie z. B. die Fähigkeit des Organismus, innerhalb von kultivierten Säugerzellen oder im Tier zu überleben. In beiden Fällen wird das Überleben oder die Vermehrung des Organismus durch die Inaktivierung eines für ihn essentiellen Gens bzw. die Inhibierung eines für ihn essentiellen Genproduktes stark beeinträchtigt bzw. verhindert. Ist ein Bakterium nach der Inaktivierung eines bestimmten Gens nicht mehr überlebensfähig bzw. in der Vermehrung eingeschränkt, kann dies als erster Hinweis dafür gewertet werden, daß durch dieses Gen essentielle Eigenschaften vermittelt werden. Die Aussagekraft solcher

Befunde muß jedoch durch begleitende Kontrollexperimente untermauert werden, z. B. sollte eine solche letale Mutation in einem zweiten Schritt durch eine entsprechende Komplementation des Gens bzw. Genprodukts aufgehoben werden können. Obligat essentielle Gene sind demnach solche, deren Nichtexpression oder Nichtvorhandensein, z. B. durch Mutagenese oder Deletion dazu führt, daß der Organismus weder in natürlicher Umgebung, noch auf einem ideal auf die Bedürfnisse des Mikroorganismus abgestimmten Vollmedium lebensfähig ist. Ist ein Mikroorganismus in einem fakultativ essentiellen Gen defizient, ist er in der Regel auf einem solchen je nach Organismus definierten Vollmedium noch wachstumsfähig, kann jedoch in natürlicher Umgebung, d. h. in seinem natürlichen Wirt oder Zellen oder Gewebekulturen seines natürlichen Wirtes nicht mehr überleben.

Identifizieren von essentiellen Genen Durch das neue Verfahren können unabhängig von ihrer speziellen Funktion essentielle Gene von Mikroorganismen identifiziert werden. Bevorzugt wird dieses Verfahren zur Identifizierung von essentiellen Genen aus Helicobacter und verwandten Mikroorganismen eingesetzt.

In einem ersten Teilschritt wird das komplette Genom eines bakteriellen Krankheitserregers mit einem molekulargenetischen Ansatz nach essentiellen Genen durchsucht. Dieser Teilschritt erfordert keinerlei Kenntnisse über die Primärstruktur des Genoms bzw. individueller Gene, sondern erfolgt ausschließlich aufgrund biologischer Kriterien. lst ein Gen als essentielle Determinante identifiziert, wird dessen Identität ermittelt. Hierbei kann auf die ermittelten Rohsequenzdaten der genomischen Sequenzierungen zurückgegriffen werden. Anhand der ermittelten Gensequenz können z. B. isogene Varianten ermittelt werden bzw. ob sich das ermittelte Gen in einem Operon befindet, in dem sich möglicherweise weitere essentielle Gene befinden.

In einem zweiten Teilschritt werden die identifizierten Gene in spezielle genetische Systeme überführt, die dazu dienen die Gene bzw. deren Genprodukte einem direkten Wirkstoff-Screening zuzuführen und/oder die Gene bzw. Genprodukte dazu verwendet, bereits identifizierte Wirkstoffe weiter zu optimieren. Der wesentliche Vorteil des Gesamtverfahrens beruht auf der rasch aufeinanderfolgenden Ausführung des Gen-und Wirkstoff- Screenings in aussagekräftigen biologischen Systemen, so daß in relativ kurzer Zeit aus dem kompletten Gensatz eines pathogenen Mikroorganismus die potentiellen Wirkstoffziele identifiziert, produziert und diese direkt zum Wirkstoff-Screening bzw. Optimierung eingesetzt werden können.

Falls ein Mirkoorganismus untersucht wird, dessen Genom bereits sequenziert ist, kann die dentifizierung eines Gens oder Genabschnitts mit Hilfe von Datenbankanalysen erfolgen, wobei einem Sequenzabschnitt ein Leserahmen zugeordnet wird. Bevorzugt kann jedoch unabhängig vom Vorhandensein einer vollständigen Genomerzeugung eine beliebige Genbank einer Vorselektion unterzogen werden. Dabei kann bevorzugt die Vorselektion auf Gene durchgeführt werden, die für Polypeptide mit einer bestimmten Funktion kodieren, zum Beispiel mit Hilfe von Homologieanalysen. Die Vorselektion kann auch auf Gene durchgeführt werden, die nur in bestimmten Entwicklungsstufen exprimiert werden.

Im Rahmen des ersten Teilschritts kann durch Selektionsschritte eine starke Reduktion des zu untersuchenden Genmaterials erzielt werden. Z. B. durch einen Anreicherungsschritt für Gene, die für exportierte oder sekretierte Genprodukte kodieren. In diesem speziellen Verfahren werden die DNA- Abschnitte einer Genbank von einem Pathogen mutagenisiert, was beispielsweise durch Klonieren eines solchen DNA-Abschnitts in ein Plasmid, Transformation in einen bevorzugt heterologen Wirtsorganismus und anschließende Mutagenese erfolgen kann. Das daraus entstandene Expressionsprodukt kann dann nachgewiesen werden. Die Mutagenese kann beispielsweise durch Insertion einer Markersequenz erfolgen, welche bei

Expression der mutagenisierten Sequenz in einem Wirtsorganismus zu einem Fusionspolypeptid führt, auf das selektiert werden kann. Die Insertion der Markersequenz ist nicht auf Transposoninsertion beschränkt, sondern kann auch auf andere Art und Weise erfolgen, beispielsweise durch homologe Rekombination oder Infektion und Rekombination mit Hilfe von Bakteriophagen.

Die verwendete Markersequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung ist im aligemeinen ein Gen, das für ein Genprodukt kodiert, das eine Selektion auf diejenigen Wirtsorganismen erlaubt, welche diese Sequenz exprimieren. Im allgemeinen handelt es sich bei diesen Markersequenzen um Resistenzgene, die Resistenz gegen bestimmte Antibiotika verleihen, oder welche es dem Wirtsorganismus erlauben, in einem Selektionsmedium zu überleben und sich zu vermehren. Der Genmarker besitzt bevorzugt keine eigenen Expressionssignale, sondern ist direkt abhängig von einem vorgeschalteten Promoter, wie z. B. dem Transkriptionspromotor auf dem Promotersegment oder ein Promoter, der auf dem klonierten heterologen zu identifizierenden DNA-Fragment liegt. Alternativ zu Antibiotikaresistenz-Markersequenzen können auch Enzyme als Genmarker eingesetzt werden. In diesen Fällen wird die erfolgreiche Insertion durch eine bestimmte biochemische Reaktion, wie z. B. eine Farbreaktion, angezeigt, welche die manuelle Isolierung des entsprechenden Bakterienklons erlaubt.

Wenn die Markersequenz als Fusionsprotein mit dem Expressionsprodukt des inserierten DNA-Fragments exprimiert wird und eine Selektion wie oben beschrieben durchgeführt wird, kann DNA-Material aus den selektierten Bakterienklonen isoliert werden und die DNA-Sequenz, die für das Fusionsprodukt kodiert, nach bekannten Verfahren bestimmt werden. Dies erlaubt die Zuweisung eines Leserahmens zu dem zu identifizierenden DNA- Fragment. Es ist dann möglich, Vergleichsstudien mit allgemein verfügbaren DNA-Sequenzdatenbanken durchzuführen, um die Identität des

identifizierten Gens abzuklären und gegebenenfalls Hinweise auf eine biologische Funktion zu erlangen.

Durch technische und weitere Ergänzungen der beiden unten dargestellten Verfahren, CAI und SRM, kann eine zielgerichtete Reduktion des Probenvolumens erreicht werden. Dabei handelt es sich ebenfalls um vorgeschaltete Selektionsverfahren, die auf bestimmte Gengruppen abzielen, z. B. der Einsatz subtraktiver Genbanken von pathogenen und apathogener Vertretern. Hierbei werden pathogenitätsvermittelnde Genbereiche angereichert. Derartige Subtraktionsverfahren können auch angewendet werden, um für bestimmte Organismen spezifische Gene zu identifizieren, beispielsweise durch einen Vergleich und Subtraktion der Genomen von H. pylori und Hheilmannii.

In weiteren Verfahren können z. B. Gengruppen identifiziert werden, die nur in einem bestimmten Entwicklungsschritt exprimiert werden.

Hervorzuheben ist beispielsweise das Array-Verfahren, bei dem die einzelnen Genproben des Pathogens rasterförmig auf einen Träger aufgebracht werden. Die einzelnen Auftragspunkte sind bekannt, so daß bei einer positiven Hybridisierungsreaktion mit den entwicklungsspezifischen Transkriptionsprodukten oder cDNAs oder subtraktiven cDNAs oder Fragmente davon, die jeweiligen Gene identifiziert und anschließend kloniert werden können. Andere Verfahren, die entwicklungsspezifische Gengruppen erfassen, sind vergleichende Proteom-und Differential-Display-Analysen.

Um herauszufinden, ob es sich bei den identifizierten Gensequenzen um essentielle Gene handelt, werden Mikroorganismen hergestellt, welche in den Sequenzen defizient sind, welche den identifizierten Gensequenzen entsprechen. Die defizienten Mikroorganismen werden dann auf verschiedenen Wachstumsmedien bzw. Zellkulturen oder im Tiermodell oder im natürlichen Wirt getestet, und die defizienten Gene können dann je nach

Wachstumsfähigkeit einer Kategorie der nicht essentiellen, obligat essentiellen oder fakultativ essentiellen Gene zugeordnet werden.

Auf die Bedeutung von Genen, welche die Entwicklung aus der vitalen in die Überdauerungsform und umgekehrt steuern, ist bereits eingangs hingewiesen worden. Es ist daher besonders bevorzugt, eine Vorselektion auf solche Gene durchzuführen. Im Weiteren können Verfahren wie CAI oder SRM angewendet werden und die gendefizienten Mikroorganismen dann auf bestimmten Nährmedien untersucht werden, welche den Übergang von der einen in die andere Form auslösen. Bei Helicobacter ist insbesondere das Schivo-Medium bevorzugt, welches die Reaktivierung der kokkoiden Form in die vitale spiralige Form ermöglicht.

Die Erzeugung von defizienten Mikroorganismen kann auf mehrere Arten erfolgen.

Es stehen eine Reihe von molekulargenetischen Verfahren zur Verfügung, das Genom eines bakteriellen Pathogens so zu mutagenisieren, daß von jedem Gen eine Mutante zur Verfügung steht. Die gängigste Mutagenesemethode beruht auf der Inaktivierung von Genen, z. B. durch zufällig im Genom inserierende Transposons, die über entsprechende Marker selektioniert werden. Für dieses Verfahren bestehen zahireiche Variationen, die auf verschiedene Organismen angewendet werden können. (Joyce und Grindley, 1984 ; Akerley, et a/., 1998). Mit Hilfe der inserierten Transposons äßt sich auch das mutagenisierte Gen im Genom genau lokalisieren.

Hat man eine Genmutante mit einem nachweisbaren biologischen Effekt erzeugt, z. B. ein vermindertes Wachstum der Zellen in einem bestimmten Milieu, so muß in einem zweiten Schritt die eindeutige Kopplung des Gens bzw. des Genprodukts mit dieser Eigenschaft nachgewiesen werden. Dies geschieht in der Regel durch Komplementationsexperimente. In diesem Fall

wird in den Organismus mit der spezifischen Genmutante das ursprüngliche Gen eingebracht und exprimiert. Kann über diesen Weg die ursprüngliche Eigenschaft des Organismus regeneriert werden, ist der notwendige Beweis erbracht. Allerdings faßt sich dieses Verfahren nicht bei der Charakterisierung von Letalmutanten anwenden, d. h. bei Mutanten obligat essentieller Gene. Einen Ausweg bietet die Verwendung konditionaler Mutationen zur Komplementation. Z. B. lassen sich durch chemische Mutagenese des untersuchten Gens temperatursensitive Mutanten erzeugen, die das Genprodukt bei der normalerweise optimalen Wachstumstemperatur in eine inaktive Zustandsform bringen und bei niedrigeren Temperaturen ein biologisch aktives Genprodukt hervorbringen (Das, et a/., 1976 ; Harris, et a/., 1992 ; Hou, et a/, 1994 ; Polissi and Georgopoulos, 1996). In einem anderen praktizierten Ansatz werden die wildtypischen Komplementationen durch exogene Substanzen, sogen.

Induktoren, gesteuert. Ãœber diese Induktoren wird die Expression des komplementierenden Gens eingeschaltet, das auf einem Episom in die genspezifische Mutante eingebracht wird und nach Induktion das fehlende Genprodukt ersetzt (Murphy, etal., 1995-. Chow and Berg, 1988 ; Arigoni, et a/., 1998).

Die genannten Verfahren sind sehr zeitaufwendig und werden nur for die Untersuchung individueller Gene oder begrenzter genomischer Abschnitte eingesetzt. Verfahren, die eine durchgängige Charakterisierung des vollständigen Genoms eines ausgewählten Pathogens nach dem beschriebenen Schema ermöglichen, sind bislang nicht bekannt.

Die nachfolgend beschriebenen neuen genetischen Verfahren, die Konditionale Antisense-Hemmung (CAI) und die Subtraktive Rekombinationsmutagenese (SRM) erfüllen diese Anforderungen. Beide Verfahren können zur Identifizierung essentieller Gene eingesetzt werden, wobei sich das CAI-Verfahren besonders for die Identifizierung obligat

essentieller Gene eignet und das SRM-Verfahren für fakultativ essentielle Gene.

Das CAI-Verfahren beruht auf der konditionalen Hemmung der Translation von einem oder mehreren Genen, die auf einem klonierten Genomfragment (welches dann als Matrize oder Template dient) liegen und über ein Plasmid im zu untersuchenden Keim propagiert werden. Im Vergleich zu konventionellen Verfahren bleibt die genomische Struktur des zu untersuchenden Keims unverändert, d. h. im Originalzustand. Im zu untersuchenden Keim wird die Hemmung der Translation durch die konditional induzierbare Synthese spezifischer Antisense-RNA (asRNA) ausgelöst, die das komplette klonierte Genomfragment umfaßt, inklusive der auf dem Genomfragment lokalisierten Gene. Die Antisense- Nukleinsäuresequenzen können dann im Mikroorganismus in großen Mengen synthetisiert werden und binden an die ursprüngliche mRNA, wobei diese mRNA nicht mehr translatiert werden kann und somit dem Expressionsapparat entzogen wird. Die Folge ist, daß entweder kein Genprodukt oder nur geringe Mengen davon gebildet werden. Die Synthese der asRNA unterliegt der Kontrolle durch einen Promoter (asPromoter), dessen Aktivität konditional, durch definierte, externe Signale gesteuert wird. Diese konditionale Inhibition der Expression eines Gens oder Operons erfolgt somit über die Regulation der Synthese der asRNA durch den induzierbaren asPromoter. Zum Nachweis, daß ein Gen bzw. Operon, wie- im vorliegenden Fall, für das Überleben und die Vermehrung des Organismus unter bestimmten Bedingungen essentiel ist, wird die Überlebens-und Vermehrungsrate eines Klons, in dem die Synthese der asRNA induziert ist, mit seiner Überlebens-/Vermehrungsrate bei nicht induzierter asRNA Synthese verglichen. Ist die Überlebens-/Vermehrungsrate des Klons bei Induktion der asRNA Synthese vermindert, so handelt es sich bei dem inhibierten Gen bzw. Operon um ein (obligat oder fakultativ) essentielles Gen. Diese Wachstumsanalysen können automatisiert durchgeführt werden, so daß eine sehr große Anzahl von Genen innerhalb kurzer Zeit untersucht

werden können. Aus diesen Klonen wird das Plasmid isoliert und die DNA- Sequenz des klonierten Genomfragments, das als Template für die asRNA Synthese dient, bestimmt und in Folge die Struktur des essentiellen Gens ermittelt.

Ein für das CAI-Verfahren geeigneter Plasmidvektor ist in Abbildung 1 dargestellt. Er enthält ein genomisches oder subgenomisches DNA-Fragment aus dem zu untersuchenden Mikroorganismus unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters (Pi) und weiteren üblichen Expressionssignalen sowie ein mRNA-stabilisierendes Element, so daß das DNA-Fragment in Form von Antisense RNA (asRNA) exprimiert werden kann und eine lange biologische Aktivität hat. Ein geeigneter Promoter ist z. B. der Tet-Promoter.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert der CAI-Vektor zusätzlich ein Gen für ein regulatorisches Protein, welches den Promoter reguliert, in diesem Fall, z. B. den Tet-Repressor, welcher durch ein exogenes oder extrazelluläres Signal, wie z. B. Tetrazyklin, gesteuert werden kann. Der CAI-Vektor der besonderen Ausführungsform von Abbildung 1 enthält weiterhin ein oder mehrere selektionierbare Markergene sowie zwei Replikationsursprünge (ori), einen für den zu untersuchenden Mikroorganismus (hier als Pathogen bezeichnet) und einen weiteren für einen üblichen Klonierwirt z. B. E. coli. Mit Hilfe solcher CAI-Vektoren können aus ganzen mikrobiellen Genomen Antisense-Bibliotheken erstellt werden.

Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung eines bevorzugten CAI- Verfahrens. Von einem CAI-Plasmid, das kleine Fragmente einer genomischen Bank des zu untersuchenden Mikrooganismus enthält, wird asRNA von einem induzierbaren Promoter (Pi) aus, unter Kontrolle eines extrazellulären Signals synthetisiert (siehe Abb. 1). Die asRNA hybridisiert sequenzspezifisch mit der mRNA desjenigen Gens, das dem klonierten DNA Fragment auf dem CAI Plasmid entspricht. Durch die Bildung des asRNA- mRNA Hybrids wird die Translation dieser mRNA reduziert oder verhindert.

In Folge entsteht ein defizienter Mikroorganismus, der nicht in der Lage ist,

das betreffende Genprodukt zu bilden. Handelt es sich um das Produkt eines essentiellen Gens, dessen Bildung inhibiert wird (A), ist die Lebensfähigkeit des entsprechenden Klons eingeschränkt oder verhindert. Die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus wird im folgenden anhand seiner Lebens-oder Überlebens-oder Vermehrungsrate in einem definierten biologischen System bestimmt. Bei nicht erfolgender Induktion der asRNA Synthese (B), oder wenn das CAI-Plasmid das Fragment eines nicht- essentiellen Gens enthält (C), ist der Klon des Mikroorganismus normal lebens-und vermehrungsfähig.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen des CAI-Verfahrens werden ganze Antisense-RNA-Plasmidbanken aus genomischen Fragmenten des zu untersuchenden Mikroorganismus analysiert (siehe Abbildung 3). Eine genomische Bank mit CAI-Plasmiden (siehe Abb. 1) wird in den zu untersuchenden homologen Mikroorganismus unter nicht-induzierenden Bedingungen übertragen und die plasmidtragenden Klone über einen plasmidkodierten Marker selektioniert. Die Lebensfähigkeit der einzelnen Klone, die jeweils ein bestimmtes CAI Plasmid aus der Genbank erhalten, wird anschließend anhand ihrer Vermehrungsrate unter induzierten bzw. nicht induzierten Bedingungen (+ und-in der Abbildung), bezogen auf die asRNA Synthese, im direkten Vergleich untersucht. In Klonen, die sich unter asRNA induzierenden Bedingungen kaum oder nur langsam vermehren, wird die Translation von mindestens einem essentiellen Gen verhindert. Aus diesen Klonen werden die CAI-Plasmide isoliert. Die essentiellen Gene werden durch Sequenzierung der genomischen Fragmente in den isolierten CAI-Plasmiden identifiziert.

Dieser Ansatz la (3t sich auch bevorzugt mit einem subtraktiven Verfahren kombinieren (SCAI), von dem eine Ausführungsform zur Veranschaulichung in Abb. 4 dargestellt ist. Eine genomische Bank mit CAI-Plasmiden (siehe Abb. 1 und 3) wird in den zu untersuchenden, homologen Mikroorganismus übertragen und die entstehenden individuellen Klone werden als bakterielle

CAI-Bank in einem Pool zusammengefaßt. Dieser Pool wird zur Selektion in zwei identische Gruppen (den Driver-und den Tester-Pool) aufgespalten.

Der Ausdruck"Driver"wird hierbei für denjenigen Pool von bakteriellen Klonen verwendet, der so behandelt wird, daß der induzierbare Promoter aktiviert wird und asRNA vom CAI-Vektor exprimiert. Der"Tester."-Pool enthält einen identischen Satz Klone mit CAI-Plasmiden, der jedoch unter nicht-induzierenden Bedingungen gehalten wird und somit Wildtyp- Eigenschaften besitzt.

In der Regel wird der"Driver"-Pool zur Selektion (z. B. im Tier) eingesetzt, während der"Tester"-Pool unbehandelt aufbewahrt wird. Es können aber auch beide Gruppen einer Selektion unterzugen werden, wobei lediglich der "Driver"-Pool durch Gabe des Signals (z. B. Tetrazyklin) induziert wird.

Klone, in denen durch die Expression einer bestimmten asRNA die Translation eines essentiellen Gens gehemmt wird, gehen während der Selektion aus der Gruppe verloren. Nach angemessener Zeit werden die überlebenden Klone beider Gruppen wiedergewonnen und die CAI-Plasmide aus den Klonen beider Gruppen isoliert. Die klonierten genomischen Fragmente werden anschließend über PCR amplifiziert, wobei Oligonukleotid Primer verwendet werden, die mit Vektorsequenzen seitlich der klonierten genomischen Fragmente hybridisieren. Diejenigen amplifizierten DNA Fragmente, die Teile von essentiellen Genen darstellten, werden durch subtraktive Hybridisierung (siehe Abb. 8) angereichert und isoliert.

Ein erfindungsgemäß für einen CAI-Vektor geeigneter Promoter ist beispielsweise der Tet-Promoter, dessen Aktivität über ein regulatorischen Protein (in diesem Fall den Tet-Repressor) gesteuert werden kann und durch ein extrazelluläres Signal (Tetracyclin) induziert werden kann. Weitere induzierbare Promoteren sind im Stand der Technik bekannt.

Antisense-RNA stabilisierende Elemente sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und brauchen hier nicht näher erläutert zu werden.

Der hohe Wirkungsgrad des CAI Verfahrens bei der Inaktivierung von Einzelgenen in einem Organismus ergibt sich aus der überlappenden Klonierung kleiner genomischer Fragmente und der damit einhergehenden Synthese unterschiedlicher asRNA Abkömmlinge für einen bestimmten Genbereich. Auf diese Art wird die Wahrscheinlichkeit, eine asRNA zu erhalten, welche die Translation des gesuchten Zielgens effizient inhibiert, stark erhöht. Derartige Untersuchungen können auf das komplette Genom eines Pathogens ausgerichtet werden, was die Überprüfung einer sehr großen Anzahl individueller genomischer Fragmente erforderlich macht. Hier sind apparative Hilfsmittel (Roboter) von Vorteil, um einen hohen Probendurchsatz zu erzielen. Allerdings können in diesen Fällen nur bestimmte Zustände untersucht werden, z. B. das Wachstum der Zellen in einem bestimmten Medium.

Durch den zusätzlichen Einsatzsubstraktiver Verfahrensschritte (Subtractive Conditional Antisense Inhibition, SCAI), kann die Anzahl der zu untersuchenden individuellen Klone bevorzugt stark reduziert werden.

Die Subtraktive Rekombinationsmutagenese (SRM) wird bevorzugt zur Identifizierung fakultativ essentieller Gene herangezogen. Im Unterschied zum CAI-Verfahren werden dauerhafte Genmutationen erzeugt, wobei die Anreicherung essentieller Gene über einen substraktiven Schritt erreicht wird. Die SRM Methode kann wie das CAI Verfahren mit kompletten oder partiellen Genbanken von pathogenen Mikroorganismen durchgeführt werden.

Das SRM Verfahren beruht auf der Inaktivierung einzelner Gene im Genom eines Pathogens durch vollständige Insertion eines bestimmten Suizidplasmids, das in dem zu untersuchenden Organismus nicht oder nur

unter bestimmten Bedingungen, wie z. B. permissiver Temperatur, replizieren kann, wobei dieses ein Teil einer Genbank ist. Die Insertion der Plasmide in das Genom erfolgt, durch homologe Rekombination. Die erfolgreiche Insertion wird durch Expression eines plasmidkodierten Antibiotikum- Resistenzmarkers angezeigt.

Eine bevorzugte Ausführungsform der SRM-Methode wird anhand der Abbildungen 5 bis 8 veranschaulicht.

In Abbildung 5 ist ein geeigneter SRM-Vektor dargestellt, der wie der CAI- Vektor ein genomisches oder subgenomisches DNA-Fragment des zu untersuchenden Mikroorganismus enthält, sowieeinen Replikationsursprung (ori) for einen Klonierwirt (z. B. E. coli), ein oder mehrere selektionierbare Markergene und einen weiteren konditional aktiven Replikationsursprung für den zu untersuchenden Mikroorganismus, z. B. einen temperatursensitiven Ursprung oder einen Ursprung, dessen Aktivität von einem in trans vorhandenen Replikationsfaktor abhängig ist und der zusätzlich in das System eingebracht werden kann. Dadurch, daß das SRM-Plasmid eine genomische Sequenz des zu untersuchenden Mikroorganismus enthält, kommt es bei Transfektion dieses Vektors in diesen Mikroorganismus zu einer homologen Rekombination, bei der das gesamte SRM-Plasmid in das genomische Gen des Mikroorganismus inseriert wird und das entsprechende Gen, falls es sich um ein solches handelt, inaktiviert. Dies führt zu einer Insertionsmutante. Geeignete induzierbare Replikationsursprünge sind, wie erwähnt, temperatursensitive oris oder solche, die durch einen Faktor gesteuert werden können, wie z. B. den RGK-Faktor pir oder den pWV Faktor repA, der in trans dem System zugeführt wird.

Die Insertion eines SRM-Plasmids (siehe Abb. 5) in das Genom des zu untersuchenden Mikroorganismus erfolgt über homologe Rekombination zwischen dem im Plasmid klonierten genomischen Fragment des Mikrooganismus und der komplementären, genomischen DNA Sequenz.

Nachdem das Plasmid in den entsprechenden Mikroorganismus überführt worden ist, werden unter nicht permissiven Bedingungen, d. h. bei inaktiver Replikation, diejenigen Klone über Selektion auf den plasmidkodierten Marker isoliert, in welchen das SRM-Plasmid in das Genom inseriert ist. Die Exzision des SRM-Plasmids erfolgt ebenfalls über homologe Rekombination.

Unter permissiven Bedingungen wird die Replikation des insertierten Plasmids eingeleitet, wodurch genügende Mengen an freiem Plasmid in den Zellen entstehen, so daß das Plasmid aus dem Klon wieder isoliert werden kann. Sofern die Insertion eines SRM-Plasmids in ein essentielles Gen stattgefunden hat-, wird die Lebensfähigkeit des betreffenden Klons eingeschränkt (A), während Mutanten in nicht-essentiellen Genen normal lebensfähig sind (B).

Ebenso wie beim CAI-Verfahren kann eine Bank von Insertionsplasmiden aus genomischen Fragmenten des zu untersuchenden Mikroorganismus in diesen Mikroorganismus übertragen werden und genomische Insertionsmutanten gebildet werden. Diese bevorzugte Ausführungsform des SRM-Verfahrens ist in Abbildung 7 dargestellt. Eine Bank von SRM- Plasmiden, die einzelne genomische oder subgenomische Fragmente enthalten, wird in den zu untersuchenden, homologen Mikroorganismus übertragen. Unter Bedingungen, welche die Plasmidreplikation nicht erlauben, wie z. B. bei nicht permissiver Temperatur, werden genomische Insertionsmutanten mit Hilfe eines plasmidkodierten Markers (siehe Abb. 5) selektioniert. In diesem Schritt können nur Insertionsmutanten überleben, die in einem nicht-oder fakultativ essentiellen Gen mutiert sind, da Mutanten eines essentiellen Gens nicht lebensfähig sind. Die individuellen Insertionsmutanten werden in einem Pool zusammengefaßt und dieser Pool anschließend in zwei identische Gruppen, den Driver-und den Tester-Pool, aufgeteilt. Der Driver-Pool wird selektioniert, z. B. durch die Infektion eines Tiers. Der Tester-Pool bleibt unbehandelt. Durch die Selektion gehen solche Klone aus dem Driver-Pool verloren, die eine Insertion in einem fakultativ essentiellen Gen (das für das Überleben und die Vermehrung unter den

Selektionsbedingungen notwendig ist) enthalten. Anschließend werden aus den überlebenden Klonen beider Pools, die in das Genom des Mikroorganismus inserierten Plasmide unter permissiven Bedingungen rezirkularisiert und zurückgewonnen. In dem Driver-Pool fehlen solche Plasmide, die Fragmente von fakultativ essentiellen Genen enthalten. Die in den SRM Plasmiden klonierten Fragmente werden in beiden Pools anschießend über PCR amplifiziert (siehe Abb. 4). Diejenigen amplifizierten DNA Fragmente, die Teile von fakultativ essentiellen Genen darstellen, werden durch genetische Subtrakion (siehe Abb. 8) angereichert und isoliert.

Eine besondere Ausführungsform, welche sich eine subtraktive Hybridisierung zur Anreicherung in Fragmenten essentieler Gene zunutze macht, ist in Abbildung 8 beispielhaft veranschaulicht.

A : PCR-basierte genetische Subtraktion. Die Tester DNA-Fragmente (siehe Abb. 4 und 7) werden mit einem Adapteroligonukleotid in solcher Weise ligiert, daß der Adapter nur mit einem der beiden DNA Stränge eines doppelsträngigen Tester DNA Fragments kovalent verbunden ist, was z. B. durch die Ligation eines doppelsträngigen, nicht phosphorylierten Adapters an die 3'-phosphorylierten DNA Fragmente der Tester DNA erreicht wird. Diese Tester DNA Fragmente werden dann mit einem molaren Überschuss an Driver DNA Fragmenten gemischt. Die Mischung wird denaturiert und langsam rehybridisiert. Anschließend werden überhängende Einzelstrangenden mit DNA Polymerase zum Doppelstrang aufgefüllt.

Die Produkte dieser Reaktion werden mittels PCR amplifiziert, wobei Oligonukleotid Primer verwendet werden, die den Adaptersequenzen entsprechen. Nur solche Tester DNA Fragmente, die nicht mit Driver DNA Fragmenten hybridisert haben, werden exponentiell amplifiziert somit angereichert und anschließend durch Klonierung isoliert.

B : Genetische Subtraktion durch physikalische Abtrennung von biotinylierten DNA Fragmenten. Die Driver DNA Fragmente werden biotinyliert und anschließend im Überschuß mit Tester DNA Fragmenten gemischt, denaturiert und langsam rehybridisiert. Die biotinylierten Homo-Driver-Driver Doppelstränge und Heteroduplexe (Driver-Tester Doppelstränge) werden durch Extraktion mit Träger- gekoppeltem Streptavidin von den Tester-Tester Homoduplexen abgetrennt. Letztere werden durch Klonierung isoliert.

Die beispielsweise durch SRM erzeugten Insertionsmutanten werden in Tierversuchen oder Zell kultursystemen hinsichtlich ihrer veränderten biologischen Eigenschaften untersucht. Durch die gezielte Verwendung spezieller Wirtszellen, z. B. kultivierte Makrophagen oder Wirtsgewebe, z. B.

Milz, können Gengruppen selektiert werden, die essentielle Eigenschaften des Pathogens determinieren, z. B. die Besiedlung bestimmter Wirtszellen. Isoliert man die überlebenden Mutanten aus den Zellen, so fehlen die Mutanten essentieller Gene. Subtrahiert man aus der kompletten Genbank, die überlebenden Mutanten, so erhält man die Mutanten der essentiellen Gene.

Das CAI-bzw. das SRM-Verfahren ist eine sehr effiziente Methode zur ein- deutigen Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene. Da essen- tielle Gene ein natürliches Ziel für inhibierende Wirkstoffe darstellen, bieten die dargestellten Verfahren eine ideale Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe.

In den nachfolgend beschriebenen Verfahren werden die identifizierten Gene direkt zum Wirkstoff-Screening eingesetzt, wobei im Vergleich zu herkömm- lichen Verfahren, auf aufwendige Aufreinigungsschritte verzichtet werden kann. Im Mittelpunkt dieser Verfahren stehen bakterielle Trägerzellen, die zum Screening nach prophylaktischen und therapeutischen Wirkstoffen eingesetzt werden können.

Die hergestellten gendefizienten Mikroorganismen werden dann auf ihre Wachstumsfähigkeit oder ihre Überlebensfähigkeit getestet. Geeignete Testsysteme sind z. B. In-vitro-Systeme, Zellkultursysteme, Gewebekultur- systeme und Tiermodelle als natürliche Umgebung. Wird das Verfahren bei H. pylori angewandt, werden die Organismen einerseits auf einem sog.

Vollmedium angezüchtet, wobei das Vollmedium die bestmöglichen Voraus- setzungen für ein Wachstum für H. py/oriermöglicht. Gleichzeitig werden die defizienten H.pylori Organismen in einer Kultur gezüchtet, welche der natürlichen Umgebung von H. pylori möglichst genau entsprechen soll. Es werden hierzu einerseits Zellkulturen basierend auf Primärkulturen oder Zellinien aus gastrointestinalem Gewebe verwendet oder aber ausdifferen- ziertes Primärgewebe (Sphäroide) in Kulturmedium. Weitere Möglichkeiten zur Simulation der natürlichen Umgebung von H. pylori bestehen in der Verwendung von stimulierten Makrophagen, denn H. pylori besitzt die Fähigkeit, von diesen nicht aufgenommen und metabolisiert zu werden. Außerdem kann auch überprüft werden, ob die defizienten H. pylori Organismen in der Lage sind, sich in immundefizienten Mäusen über einen bestimmten Zeitraum zu etablieren.

Ist ein defizientes H. pylori Bakterium zwar in der Lage, auf Vollmedium zu überleben, wächst aber nicht in einer natürlichen Umgebung, wie oben beschrieben, so wird das in diesem Organismus defiziente Gen als fakultativ essentielles Gen bezeichnet.

Wenn der defiziente H. pylori Organismus in keinem der beiden Testlebens- räume überlebensfähig ist, so handelt es sich um ein obligat essentielles Gen.

Allgemein können essentielle Gene von Mikroorganismen einer dieser Kategorien zugeordnet werden.

Aus diesen Ergebnissen können dann die in mutierten oder/durch asRNA unterdrückten Sequenzen identifiziert und jeweils einer dieser beiden Kategorien zugeordnet werden, oder aber der Kategorie der nichtessentiellen Gene, wenn der gendefiziente Organismus keine Beeinträchtigungen in seiner Wachstumsfähigkeit zeigt.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein genetisches Verfahren zur Isolierung und Klonierung der identifizierten essentiellen Gene aus verschiedenen klinischen Helicobacter Isolaten bzw. aus heterologen pathogenen Keimen von klinischer Bedeutung bereitzustellen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt daher weiterhin die Schritte (v) Herstellen von Primern zur Amplifikation und Detektion von homologen Gensequenzen in heterologen Mikroorganismen (VI) Identifizieren der homologen Gensequenzen.

Eine bevorzugte Durchführung dieser weiteren Verfahrensschritte besteht darin, sogenannte Megaprimer von den identifizierten essentiellen Helicobacter-Genen mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) herzustellen, deren Sequenz direkt aus den entsprechenden Plasmiden der mutagenisierten DNA-Abschnitte abgeleitet werden kann. Diese Primer können dann verwendet werden, um die bereits identifizierten essentiellen Gene aus verschiedenen Helicobacter-Isolaten zu isolieren. Falls diese essentiellen Gene Entsprechungen in anderen Mikroorgansimen haben, können die Primer unter Umständen auch zur Isolierung dieser Gene aus von He/icobacterverschiedenen Mikroorgansimen verwendet werden. Weiterhin kann dann die genaue DNA-Sequenz der isolierten Gene und die Feststellung der Genvarianz innerhalb der verschiedenen Helicobacter-Isolate bzw. zwischen den verschiedenen Mikroorganismen bestimmt werden.

Bei der Herstellung der Megaprimer entstehen DNA-Fragmente mit variablen 3'-Enden. Aufgrund dieser Eigenschaft ist es möglich, die DNA-Fragmente zur Isolierung variabler, bzw. verwandter Gene mittels des beschriebenen PCR-Verfahrens einzusetzen.

Identifizieren von spezifischen Wirkstoffen Zur Identifizierung neuer immunologischer Wirkstoffe aus dem Pool der identifizierten essentiellen Gene eines Pathogens bzw. zur Weiterentwicklung dieser Wirkstoffe werden bakterielle Träger insofern sehr wirksam eingesetzt, da die identifizierten Gene direkt in diese Trägersysteme kloniert und dort exprimiert werden können. Das Wirkstoff-Screening erfolgt dann direkt mit Hilfe dieser rekombinanten, bakteriellen Träger. Als Träger werden bevorzugt attenuierte Bakterien, wie z. B. Salmonellen, verwendet, da diese über ein natürliches Potential zur Immunstimulanz verfügen. Werden diese attenuierten Bakterien als Träger bzw.

Produzenten für die identifizierten essentiellen Gene der pathogenen Keime verwendet und wird mit diesen Impfstämmen eine Immunisierung an einem Säugetier durchgeführt, so kann eine nachhaltige Immunantwort ausgelöst werden.

Mittlerweile sind die immunologischen Eigenschaften dieser bakteriellen Trägersysteme so weit verfeinert worden, da# eine gezielte Immunantwort ausgelöst werden kann (VanCott et al., 1998 ; Carrier-Patent EP9811 6827.

1). Diese Eigenschaft ist insofern bedeutsam, da die verschiedenen Krankheitserreger oftmals nur über einen bestimmten Zweig des Immunsystems wirksam bekämpft werden können. D. h. schutzvermittelnde Antigene lassen sich nur dann identifizieren, wenn sie dem Immunsystem in der richtigen Form präsentiert werden. Nur wenn der verwendete Träger mit einem wirksamen Antigen beladen wurde, kann es zu einer Schutzwirkung kommen. Aufgrund der vielfältigen immunologischen Eigenschaften bakterieller Trägersysteme und deren Überlegenheit gegenüber herkömmlichen synthetischen Adjuvantien sind diese zur Identifizierung immunologisch relevanter Antigene besonders geeignet.

Darüber hinaus können die bakteriellen Trägersysteme mit effizienten Genexpressionssystemen ausgestattetwerden, welchedie Herstellung auch

problematischer Antigene erlauben (PCT/EP91/02478, EP98116827.1).

Aufgrund der direkten Subklonierung der isolierten essentiellen Gene und der einfachen Handhabung der bakteriellen Träger bei der Herstellung und Vakzinierung, können in relativ kurzer Zeit eine große Anzahl von Antigenen hinsichtlich ihres immunogenen und protektiven Potentials durchgetestet werden. In herkömmlichen Verfahren müssen die Test-Antigene dagegen zeitaufwendigen Aufreinigungsverfahren unterworfen werden, wobei oftmals schon bei der gentechnischen Herstellung der ausgewählten Antigene in Bakterien Schwierigkeiten auftreten, die mit der toxischen Wirkung dieser Antigene auf den produzierenden Bakterienstamm verknüpft sind.

Eine wichtige Voraussetzung für das Entwickeln von Wirkstoffen besteht darin, das immunogene Potential der identifizierten Sequenzen festzustellen, um zu bestimmen, inwiefern die entsprechenden Genprodukte für die Herstellung von Antikörpern oder Impfstoffen geeignet sind.

Zur Identifizierung immunologischer Wirkstoffe gegen klinisch relevant Helicobacter-Organismen muß zunächst ermittelt werden, in wie weit das Genproduktdes identifizierten essentiellen Gens immunogene Eigenschaften besitzt. D. h. es muß experimentell ermittelt werden, ob mit dem Antigen eine humorale und zelluläre Immunantwort in einem Säugetier ausgelöst werden kann, die gegen das originale Genprodukt des Erregers gerichtet ist.

Damit werden auf keinen Fall solche Antigene ausgeschlossen, die im Rahmen einer natürlichen Infektion vom Immunsystem nicht erkannt werden. Im Gegenteil, vielmehr könnte man erwarten, daß z. B. bei chronisch infizierten Menschen die Immunantwort gegen schutzvermittelnde Antigene unterdrückt ist oder von einer Qualität ist, die letztendlich keine Schutzwirkung vermittelt. Auszuschließen sind jedoch solche Antigene, die einer hohen genetischen Variation unterliegen und somit einer wirksamen Immunantwort kaum zugänglich sind.

Zum Nachweis der Identität des identifizierten Genprodukts bei einer natürlich vorkommenden Infektion, wird Antiserum von Patienten gewonnen, die entweder unter einer aktiven Gastritis mit Beschwerden leiden, oder aus Patienten, bei denen die Helicobacter-Infektion symptomlos verläuft. Mit diesen Seren wird das elektrophoretisch aufgetrennte rekombinante Protein in einem klassischen Western Blot Verfahren getestet.

Findet eine Erkennungsreaktion mit einem rekombinanten Protein jeweils mit beiden Seren, also dem eines Patienten mit einer fulminanten und dem eines Patienten mit einer symptomlosen Helicobacter Infektion, statt, so spielt dieses Protein bei einer natürlichen Infektion eine Rolle. Wird das rekombinante Polypeptid dagegen nur von dem Serum des Patienten mit einer symptomlosen Infektion erkannt, kann das zusätzlich ein Hinweis auf ein protektives Potential des entsprechenden Proteins sein. Weiterhin können Antikörper, die gegen dieses Protein spezifisch gerichtet sind, möglicherweise zur passiven Immunisierung eingesetzt werden.

Von besonderem Interesse sind außerdem Antikörper von Individuen, die nachweislich keine Helicobacter-Träger sind, da diese auf ein protektives Potential eines entsprechenden rekombinanten Polypeptids schließen lassen.

Desweiteren werden die immunogenen Polypeptide zusammen mit geeigneten Zusatzstoffen zur Immunisierung in vivo eingesetzt. Verwendet werden dazu verschiedene Adjuvantien, bakterielle Toxine, Zytokine oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid als Lebendvakzin. Die Immunantwort wird daraufhin getestet, ob sie nach einer erfolgten Verabreichung eines bestimmten Polypeptids der Erfindung in Kombination mit entsprechenden Zusatzstoffen nach Infektion mit dem homologen Keim eine schützende Wirkung gegen weitere homologe Infektionen herbeiführt (z. B. Infektionen mit verschiedenen H. pylori Stämmen).

Noch eine weitere Möglichkeit zum Testen der Immunogenität besteht darin, im Tiermodell (z. B. Maus, Kaninchen) eine Immunantwort gegen

Helicobacter oder andere Mikroorganismen auszulösen und aus den immunisierten Tieren Antikörper zu gewinnen, dann in einer weiteren Western-Blot-Analyse verwendet werden können. Gleichzeitig müssen Patientenbiopsien in situ immunologisch mit den gleichen Antikörpern untersucht werden, da Helicobacter und andere Mikroorganismen in Kultur bestimmte Proteine verlieren oder hinzugewinnen können.

Parallel dazu ist es bevorzugt zu untersuchen, ob gegen eine Infektion mit heterologen Keimen (bevorzugt andere gram-negative Bakterien), welche das entsprechende Polypeptid exprimieren, eine schützende Wirkung erzielt werden kann.

Nachdem festgestellt wurde, ob die identifizierten Gene bzw. deren Expressionsprodukte in der Lage sind, eine Immunantwort hervorzurufen, kann gemäß dem Verfahren der Erfindung weiterhin untersucht werden, ob auch eine bereits bestehende Infektion mit derartigen Antigenen behandelt werden kann. Kann auf diese Weise ein Polypeptid identifiziert werden, das eine therapeutische Wirkung zeigt, wird es bevorzugt auch auf seine Aktivität bei Infektionen mit heterologen Keimen untersucht.

Das Screening nach prophylaktisch bzw. therapeutisch wirksamen, immunologischen Stoffen kann nach folgendem Schema verlaufen, wobei die Einhaltung der einzelnen Schritte nicht zwingend ist : 1. Klonierung des identifizierten Gens in einen geeigneten bakteriellen Trägerstamm und Nachweis sowie Quantifizierung des vollständigen Genprodukts durch SDS-PAGE.

2. Immunologische Charakterisierung des erzeugten Genprodukts mit Hilfe von (a) Seren infizierter oder/und natürlich geschützter Wirte, die das Genprodukt im Trägerstamm erkennen sollte ; (b) Hyperimmunseren von Tieren, die mit dem rekombinanten Trägerstamm immunisiert wurden. Wobei das jeweilige Hyperimmunserum das originale Genprodukt im pathogenen Keim

erkennen sollte. Hierbei kann es möglich sein, daß das originale Antigen nur in einem bestimmten Entwicklungszeitraum vom Pathogen produziert wird.

3. Die protektive Wirkung der individuellen Antigene in der prophylaktischen oder/und therapeutischen Anwendungsform wird im Tiermodell untersucht.

Alle protektiven Antigene, die mit den beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, können nunmehr in einem zweiten Schritt weiterentwickelt werden. Im Vordergrund dieser Weiterentwicklung steht u. a. die Evaluierung der genetischen Konstanz der identifizierten protektiven Antigene innerhalb des Pathogens bzw. verwandter pathogener Keime in seiner weltweiten Verbreitung. Weiterhin wird zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe, auf die genetischen Unterschiede im Immunsystem der Impflinge eingegangen. Ziel beider Verfahren ist die dentifizierung von Antigenen oder Epitopen, die möglichst breit angewendet werden können. Zur Erfassung der Genvariabilität innerhalb einer Spezies bzw. homologer Keime kann der sogenannte Mega-Primer-Ansatz eingesetzt werden. Aus dem Plasmid mit dem relevanten Gen werden direkt genspezifische Primer mit variablen 3'- Enden über PCR hergestellt, welche die Amplifikation homologer Gene ermöglichen. Anhand der ermittelten DNA-Sequenz der amplifizierten Gene kann deren Variabilität abgeleitet und z. B. genkonstante Bereiche bestimmt werden.

Die genetischen Unterschiede zwischen einzelnen Impflingen, auf ein definiertes Antigen zu reagieren, kann mit Hilfe einer In Vitro-Vakzinierung evaluiert werden. Aus unterschiedlichen Spendern werden hierzu antigenpräsentierendeZellen (APC) isoliert, z. B. dentritischeVorläuferzellen, welche in vitro expandiert und mit den zu testenden Antigenen beschickt werden, wobei die Antigene bevorzugt über entsprechende Vektoren exprimiert werden. Die identifizierten Gene können auch einzeln oder in definierten, Kombinationen in dendritischen Zellen (DC) von nicht infizierten

Spendern exprimiert werden. Dabei werden die Genprodukte von der Wirtszelle prozessiert und durch den MHC-Komplex präsentiert. DC sind besonders für die Antigenpräsentation gegenüber naiven oder "schlummernden"T-Zellen geeignet. Werden DC mit T-Zellen autologer Spender inkubiert, ist es möglich zu bestimmen, ob dieser Spender gegen das eingesetzte Antigen reagieren würde, wenn er auf natürliche Weise damit in Kontakt käme, z. B. im Rahmen einer Schutzimpfung. Anhand der Immunantwort der T-Zellen kann auf eine mögliche Immunogenität des entsprechenden Antigens geschlossen werden. Eine solche Immunantwort besteht beispielsweise aus einer Proliferation der T-Zellen, bzw. einer Zytokin-Ausschüttung insbesondere von IL-2 und IL-4. Die Zytokine können beispielsweise mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Assaykits (z. B. von Genzyme Cambridge M. A.) ausgewertet werden.

Schließlich können die in der beschriebenen Weise identifizierten und charakterisierten Antigene bzw. Epitope zur Entwicklung der ersten Impfstoff-Prototypen eingesetzt werden. Hierbei wird zwischen zwei Impfstofftypen unterschieden, der aktiven und der passiven Impfung.

Zur passiven Immunisierung, werden dem Impfling Antikörper oder <BR> <BR> <BR> <BR> Antikörperfragmente mit schützender bzw. inhibierender Wirkung von außen<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> zugeführt.

Antikörper werden in Form von polyklonalen, bevorzugt monoklonalen Antikörpern (MAKs) oder rekombinanten Antikörpern bereitgestellt. Hierzu gehören Antikörper, die spezifisch mit Polypeptiden der Erfindung oder deren Untereinheiten und Fragmenten reagieren und für eine prophylaktische und/oder therapeutische Anwendung, z. B. einer passiven Immunisierung, verwendet werde können. Diese Anti-Protein-oder Anti-Peptid-Antiseren bzw. monoklonalen Antikörper können mit Hilfe von Standardprotokollen z. B. durch die Immunisierung von Tieren wie Mäusen, Ratten oder Ziegen mit einem gereinigten Polypeptid der Erfindung, einen Fusionsprotein oder

einem Subfragment dessen hergestellt werden. Darüber hinaus können die Tiere auch mit bakteriellen Vakzineträgern immunisiert werden, die mit entsprechenden Genen der Erfindung ausgestattet sind und die kodierten Polypeptide exprimieren. Die Antikörper sind dabei bevorzugt immunspezifisch gegen antigene Determinanten oder Epitope hierzu der beschriebenen He/icobacter-Polypeptide oder einem eng verwandten Polypeptid, das eine Homologie von mindestens 90% besitzt, gerichtet. Sie sind nicht kreuzreaktiv mit Polypeptiden, die z. B. eine Homologie von weniger als 80% aufweisen.

Ausgehend von einer Zellinie, die einen Polypeptid-spezifischen monoklonalen Antikörper produziert, kann aus dem kodierenden Gen eines solchen Antikörpers, chimäre Gene geschaffen werden, die Antikörper determinieren, bestehend aus einer Antigen bindenden Domäne aus der Maus und dem Fc-Teil eines Antikörpers des Menschen. Diese Antikörper können in Zellinien oder transgenen Tieren produziert werden.

Anstelle von Antikörpern, die im Tier generiert wurden, können auch Antikörper-Fragmente, Miniantikörper, verwendet werden, die z. B. in einem heterologen System wie Bakterien hergestellt werden. Diese Miniantikörper können entweder monovalent oder bivalent sein und bestehen aus dimerisierten Einzelketten-Molekülen (Kujau et al., 1998 ; Kalinke et al., 1996 ; Pack et al., 1993).

Antikörper gegen die immunogenen Polypeptide der Erfindung können auch in Pflanzen generiert werden. Beispiele hierzu sind z. B. von Hiatt und Ma (1993), van Engelen et al. (1994) und Ma et al. (1994) beschrieben worden.

Entsprechend der jeweilig verwendeten Pflanze können diese z. B. direkt zum Verzehr und damit als orales Vakzin verwendet werden.

Eine weitere, sehr breit anwendbare Weise, Antikörper herzustellen, ist in Milch und Eiern immunisierter Tiere. Verabreicht man z. B. trächtigen Kühen,

Schafen oder Pferden geeignete Antigene, so finden sich in der Milch Immunoglobuline, die zur Entwicklung eines Vakzins verwendbar sind. Die Milch kann dann entweder direkt als Vakzin verabreicht werden, oder ein konzentriertes Immunglobulin-Extrakt hergestellt werden. Auf die gleiche Weise können auch Antikörper (Hyperimmunantikörper) in Hühnereiern produziert werden (Ling et al., 1998 ; Sasse et al., 1998). Die beschriebenen immunogenen Polypeptide der Erfindung können daher auch zur Entwicklung eines Milchprodukts oder Hühnereiern verwendet werden, die als orales Vakzin verwendet werden können.

Erfindungsgemäß werden die generierten Antikörper oder deren Fragmente auf ihre Anwendbarkeit getestet. Sie können dazu durch bekannte Verfahren aufgereinigt werden (Präzipitation, chromatographische Verfahren) und bei- spielsweise darauf untersucht werden, ob sie den lnfektionsvorgang von H. pylori inhibieren können (Adhäsionsassays) oder aktivierend auf Komple- ment oder ADCC ("antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity", anti- körperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität) wirken.

Zur passiven Immunisierung werden die Antikörper, die mit Hilfe der Polypeptide der Erfindung generiert wurden, entweder oral oder intra- gastrisch verabreicht. Hierfür werden die Antikörper mit einem Bicarbonat- Puffer gemischt. Sie können aber auch systemisch verabreicht werden, wobei sie nicht gepuffert werden müssen.

Antikörper werden bevorzugt allein oder auch in Kombination mit anderen nicht-immunologischen Wirkstoffen verwendet, z. B. mit Antibiotika oder Protonenblockern.

Aktive Vakzinierung beruht auf einer Immunreaktion, die vom geimpften Organismus selbst ausgelöst wird. Bevorzugt sind Darreichungsformen von Impfstoffen als Antigene, Antigenfragmente, Subunit-Vakzin, als DNA- Vakzin, als Lebend-Vakzin oder als Lebensmittel-Vakzin.

Antigene sind diejenigen Polypeptide oder deren Fragmente, die in vivo eine Immunreaktion hervorrufen können.

Wenn ein Polypeptid als Subunit-Vakzin bereitgestellt werden soll, wird es zunächst in seine Untereinheiten bzw. Strukturdomänen gemäß seines Antigenitätsmusters zerlegt (z. B. T-und B-Zell-Epitope). Dieses Antigenitätsmuster kann mit Hilfe eines Computerprogramms erstellt werden, wobei immunogene Regionen, die aus einer kurzen Polypeptid- sequenz von ca. 8 bis 10 Aminosäuren bestehen, erkannt werden können (Hughes et al., 1992). Die einzelnen Polypeptidstücke können dann anschließend auf ihre Immunogenität in der Maus oder in Primaten bzw. den Menschen getestet werden. Sie können dazu entweder als gereinigte Polypeptide, die synthetisch hergestellt wurden, in Kombination mit entsprechenden Zusatzstoffen wie einem Adjuvans, Toxin oder Cytokin verabreicht werden, oder als Fusionsprotein an ein bekannt immunogenes Protein bzw. Proteinuntereinheit wie z. B. die Cholera Toxin B Untereinheit (Liljeqvist et al., 1997) gekoppelt. Weiterhin können die immunogenen Peptide in äußere Membranproteine wie z. B. dem OmpS Maltoporin von E. coli eingebaut und heterolog in einem Vakzin-Trägerstamm exprimiert werden (Lang und Korhonen, 1997).

Zur Entwicklung eines DNA-Vakzins können die in der Erfindung charakterisierten Polynukleinsäure-Moleküle"nackt"in Fusion mit einem eukaryontischen gewebespezifischen Promoter oder in Form eines Plasmids verabreicht werden. Die"nackte"DNA oder das entsprechende Plasmid wird in Kombination mit einem Zusatzstoff wie einem Reagenz, das die zelluläre Permeabilität verändert wie z. B. Bupivacain (W094/16737), kationischen Lipiden wie z. B. DOTMA (N- [1- (2, 3-dioleyloxy) propyl]-N, N, N- trimethyl-ammoniumchlorid, DOTAP (1,2-bis (oleyloxy)-3-trimethyl- ammonio) propan), DDAB (dimethyl-dioctadecyl-ammoniumbromid), DOGS (dioctadecyl-amidolglycyl-spermidin) bzw. Cholesterinolderivaten, Silica, Gold oder Wolfram (Tang et a/. 1992) bzw. in Liposomen (W093/18759,

W093/19768, W094/25608, W095/2397) oder Mikropartikeln verpackt, verabreicht. Beispiele für brauchbare Promoteren und Genfähren sind von Hartikka et a/. (1996) beschrieben worden. Zur Applikation der Polynukleotid-Moleküle können jedoch auch z. B. attenuierte Salmonellen verwendet werden. Die Bakterien werden hierfür mit eukaryontischen Expressionsvektoren, die ein Polynukleotid-Molekül der Erfindung beinhalten, transformiert und dann oral verabreicht. Die Plasmid-DNA wird anschließend vom Bakterium auf den Wirt übertragen (Darji et al., 1997). Zur Transformation attenuierter Trägerbakterien können jedoch auch filamentöse Phagen verwendet werden. Der Vorteil dieser liegt darin, daß sie eine extrem hohe Anzahl von Plasmiden übertragen können.

Für die Entwicklung eines Lebendvakzins stehen unter anderem virale, wie z. B. adenovirale oder Windpocken-Virus-Vektoren, bzw. bakterielle Vektoren wie etwa Salmonella, Shigella oder Lactobacillus zur Verfügung. Attenuierte, nichtvirulente Salmonella typhimurium-Stämme, die zur rekombinanten Expression heterologer Antigene benutzt werden können und oral verabreicht werden, wurden vielfach charakterisiert (Mekalanos, 1994, W092/11361, Cirillo etal., 1995 und Dorner (1995). Weitere bakterielle Vektoren, die als Vakzinvektoren verwendet werden können, sind von Cirillo etal., (1995) und Dorner (1995) beschrieben worden. Ein Polynukleotid- Molekül der Erfindung, das für ein therapeutisch oder prophylaktisch wirksames Polypeptid kodiert, wird hierzu entweder in das bakterielle Genom stabil integriert und einem Transportsystem unterworfen, das die Darbietung an der bakteriellen Oberfläche ermöglicht (PCT/EP94/04286 ; W097/35022). Das entsprechende Polynukleotid-Molekül kann im Bakterium aber auch als Plasmid in freiem Zustand vorliegen.

Impfstoffe werden in der Regel mit geeigneten Zusatzstoffen wie z. B.

Adjuvantien, bakteriellen Toxinen, Zytokinen etc. verabreicht, die das immunogene Polypeptid in seiner protektiven oder therapeutischen Wirkung unterstützen. Adjuvantien mit geringen Nebenwirkungen zur Verwendung

im Menschen, die für Subunit-Vakzine und Lebend-Vakzine, aber zum Teil auch für DNA-Vakzine in Frage kommen, sind z. B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Calciumphosphat, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D- isoglutamin, N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-Acetyl- <BR> <BR> <BR> <BR> muramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanin-2- (1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3- hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin, Liposomen, Monophosphoryl-Lipid A, Trehalosedimicoloat, Pilz-Polysaccharide wie z. B. Schizophyllan, Muramyl- Dipeptid, Muramyl-Dipeptid-Derivate, sowie Phorbolester, Saponine und immunstimulierende Komplexe (ISCOMS) (Gupta und Siber, 1995). Als bakterielles Toxin kann z. B. Cholera Toxin bzw. dessen Untereinheiten oder das hitzelabile Toxin aus E. coli verwendet werden. Obwohl diese hochpotent als Adjuvantien aktiv sind, können sie aufgrund ihrer Toxizität nur begrenzt auf den Menschen angewendet werden. Mit Hilfe bestimmter Mutagenesetechniken können jedoch Moleküle entwickelt werden, die aktiv, aber ungiftig sind (O'Hagan, 1998).

Eine weitere Möglichkeit, die Immunantwort auf die prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksamen Substanzen der Erfindung zu optimieren, ist, das entsprechende Polypeptid als Fusionsprotein mit einer immunogenen Proteindomäne zu exprimieren. Eine Möglichkeit besteht z. B. darin, die Pilin DSL-Domäne aus Pseudomonas aeruginosa als Fusionspartner zu verwenden. Weiterhin beschrieben sind Fusionsproteine, die an Glutathion S-Transferase oder Thioredoxin fusioniert wurden (Hill et al., 1997 ; Gabelsberger et al., 1997). Das entsprechende Fusionsprotein kann jeweils als Subunit-oder Lebendvakzin hergestelit und verabreicht werden.

Die Immunantwort der identifizierten immunologisch wirksamen Substanzen kann auch insofern moduliert werden, indem diese in Kombination mit bestimmten Zytokinen verabreicht werden. Zur simultanen Verabreichung bietet sich eine Co-Expression der Polynukleotid-Sequenzen der Erfindung mit einem bestimmten Cytokin in Salmonella oder einem anderen Wirtsbakterium an. Das entsprechende Cytokin kann hierzu entweder auf

einem separaten Plasmid, in Reihe oder als Fusionsprotein mit der gewünschten Polynukleotid-Sequenz der Erfindung kodiert sein und dann in das Wirtsbakterium transformiert werden. In Frage kommen Cytokine, die wie z. B. Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-10 (IL-10) oder Interleukin-12 (IL-12) das Immunsystem stimulieren.

Zur weiteren Optimierung können einzelne immunogen wirksame Substanzen der Erfindung miteinander oder in Kombination mit bekannten immunogenen Substanzen wie z. B. VacA bzw. dessen einzelne Untereinheiten kombiniert werden. Das entsprechende Polypeptid kann also gemeinsam mit mindestens einem weiteren Helicobacter Antigen, wie z. B. der nativen Urease oder deren Untereinheiten, Fragmenten Homologen, Mutanten oder Derivaten derselben exprimiert werden. Außerdem können z. B. verschiedene Subunit-Vakzine einzeln oder als Fusionsprotein wie weiter oben beschrieben gemeinsam verabreicht werden. Hierfür können wiederum z. B. gereinigte Polypeptid-Moleküle in Kombination mit einem geeigneten Adjuvans, bakteriellen Toxin oder Cytokin verwendet werden.

Weiterhin können diverse Kombinationen von Nukleotid-Sequenzen immunogener Untereinheiten der beschriebenen Polypeptid-Moleküle auf einem gemeinsamen Plasmid hergestellt und als Lebendvakzin verabreicht werden. Ein Vakzinvektor der Erfindung kann also ein oder mehrere Polypeptide der Erfindung, Derivate bzw. Fragmente dergleichen enthalten.

Außerdem besteht die Möglichkeit der Kombination eines DNA-Vakzins mit ein oder mehreren gereinigten Subunit-Vakzinen in einer geeigneten Trägersubstanz, wie bereits weiter oben beschrieben wurde.

Zur Identifizierung neuer pharmakologischer Wirkstoffe aus dem Pool der identifizierten essentiellen Gene eines Pathogens bzw. zur Weiterentwicklung dieser Wirkstoffe können ebenfalls bakterielle Träger sehr wirksam eingesetzt werden, da die identifizierten Gene direkt in diese Trägersysteme kloniert und dort exprimiert werden können. Das Wirkstoff-

Screening erfolgt dann direkt mit Hilfe dieser rekombinanten, bakteriellen Träger.

Display-Systeme dienen dazu, ein exprimiertes Polypeptid der Erfindung an der Zelloberfläche von Bakterien zu präsentieren. Den Transport von Polypeptiden durch die innere Membran ermöglicht ein Signalpeptid am Aminoende, während andere Anteile die Einlagerung und Verankerung in der äußeren Membran übernehmen. Als Trägeranteile sind verschiedene äußere Membranproteine von E. coli beschrieben worden wie z. B. PhoE (Agterberg etal., (1990) oder OmpA (Francisco etal., 1992). Es können jedoch auch Fusionen mit der Transportdomäne des IgA-Proteasevorläufers IgAß verwendet werden (Klauser etal., 1990). Beispiele für Display-Systeme sind z. B. das DsbA-System (PCT/EP 94/02486) oder das Autotransporter-System (AIDA ; W097/35022). Die an der Oberfläche präsentierten Polypeptide können dann für Bindungsstudien mit Peptid-oder kombinatorischen chemischen Substanzenbanken verwendet werden. Die Bindungsstudien können mit Hilfe eines"High Through Put"Systems, das hohe Testraten ermöglicht, in Flüssigkeit oder aber gebundener Form durchgeführt werden.

Hierfür werden die präsentierten Polypeptide z. B. an ein Chromatophor gekoppelt, das in Kombination mit einem weiteren Chromatophor, das an das Wirkstoff-Peptid oder die chemische Substanz gekoppelt ist, eine Farbreaktion ermöglicht. Die entsprechende Wirkstoffkomponente kann jedoch auch z. B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert oder an eine feste Trägermatrix gekoppelt sein. Bei Verwendung eines"Solid Phase Systems" wird vorher entweder das verwendete Polypeptid der Erfindung oder aber umgekehrt die Peptid-bzw. kombinatorische Wirkstoffbank an die Trägermatrix gekoppelt. Die jeweilige farbstoffmarkierte Komponente bindet dann an die immobilisierte Komponente, wodurch wieder eine Farbreaktion ermöglicht wird. Nach der Bindungsreaktion müssen dann mehrere Waschvorgänge volizogen werden, bevor die entsprechende Substanz isoliert wird. Vorteil des"Solid Phase Systems"gegenüber der Bindung in

Flüssigkeit ist, daß die wirksame Substanz schneller isoliert werden kann, da die ungebundenen Substanzen weggewaschen sind.

Weitere Verfahren zur Identifizierung neuer pharmakologischer Wirkstoffe basieren auf den Kenntnisse aus der Primärstruktur der identifizierten essentiellen Gene bzw. benutzen die aufgereinigten gentechnisch hergestellten Genprodukte.

Eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, spezifische Bindepartner der von den identifizierten Genen kodierten Polypeptide zu finden.

Es können bevorzugt Homologiestudien mit Helicobacter und anderen Organismen durchgeführt werden, z. B. mit Hilfe von Computer-Alignments, Southern Blots, PCR und dgl. und anschließender Zuordnung der Sequenzen. Aufgrund von Homologien kann dann auf potentielle Bindepartner der Proteine geschlossen werden.

Ebenfalls bevorzugt können auch kombinatorische Bindungsstudien über Target-gerichtetes-Screening-Verfahren mit Hilfe von Substanzen- Bibliotheken durchgeführt werden. Die potentiellen bindenden Substanzen werden in einer speziellen Anordnung gebunden vorgelegt, z. B. in Mikrotiterplatten oder anderen Trägermaterialien. Anschließend wird das "Target", in der Regel aufgereinigte, gegebenenfalls rekombinante Helicobacter-Proteine, in löslicher Form hinzugegeben, was den Nachweis einer Wechselwirkung zwischen dem Target und bestimmten Substanzen ermöglicht. Ein indirekter Nachweis kann durch markierte Antikörper, die gegen die Substanz gerichtet sind, oder durch Einführen zusätzlicher Elemente ("Tags") in das Target erbracht werden.

Eine weitere Variante der Bindungsstudien besteht in der Expression von Helicobacter-Proteinen in rekombinanten Bakterien (z. B. solche, die das

fluoreszierende Protein GFP oder bestimmte Enzyme herstellen), welche die Proteine auf der Oberfläche präsentieren, und anschließendes Testen einer Substanzen-Bibliothek.

Weiterhin kann die dreidimensionale Struktur der von den erfindungsgemäßen identifizierten Genen kodierten Polypeptide oder deren Fragmente auch durch kristallographische Analyse ermittelt werden. Bei ausreichender Auflösung können eventuelle"Taschen"oder sonstige Bindestellen in ihrer dreidimensionalen Struktur exakt charakterisiert werden.

Aufgrund dieser Daten kann die Struktur potentieller Bindepartner berechnet werden.

Mit Verfahren, wie etwa"Two-hybrid System", Display-Systemen,"High Throughput Screening"oder kombinatorischen Bindungsstudien können zufällig generierte Polypeptide identifiziert werden, die an die Helicobacter Polypeptide der Erfindung oder deren Fragmente, oder an weitere erfindungsgemäß identifizierte Polypeptide binden. Wird auf diese Weise ein entsprechendes Peptid gefunden, kann dieses chemisch weiter modifiziert werden, bis die optimale mögliche Bindung erreicht ist. Das identifizierte Polypeptid kann z. B. als Inhibitor verwendet werden, indem es z. B. an ein Toxin und ein Internalisierungssignal gekoppelt wird, das den pathogenen Keim zerstört oder aber als Peptidmimetikum, um das Binden des Keims an die zelluläre Oberfläche zu verhindern (EP-41 2,762A und EP-B31,080A). Mit Hilfe des"Two Hybrid Systems"können aber auch Aktivatoren des Immunsystems generiert werden. Die identifizierten Peptide, die an die Helicobacter Polypeptide der Erfindung binden, können hierzu an bestimmte Liganden z. B. für den T-Zell-Rezeptor gekoppelt werden. Werden also einem von Pathogenen befallenen Tier oder Menschen diese so ausgestatteten Peptide verabreicht, wird das körpereigene Immunsystem spezifisch angelockt und aktiviert.

Die Einhaltung der einzelnen Schritte ist hierbei nicht zwingend, sondern kann durch weitere Schritte ergänzt bzw. ersetzt werden.

Die jeweiligen Prototypen eines immunologischen bzw. pharmakologischen Wirkstoffs werden nachfolgend weiterentwickelt und verbessert.

Die Weiterentwicklung eines Impfstoffes kann dahingehend erfolgen, indem mehrere antigene Genprodukte oder Teile davon in einem Wirkstoff kombiniert werden und/oder mit verschiedenen Trägern bzw. Zusatzstoffen <BR> <BR> <BR> verabreicht werden. Als Träger fungieren verschieden attenuierte bakterielle oder virale Organismen und als Zusatzstoffe Adjuvantien und/oder Cytokine.

Zur Weiterentwicklung eines pharmakologischen Wirkstoffs wird eine als wirksam charakterisierte Leadstruktur chemisch weiter modifiziert, so daß eine optimale Bindung und Inhibierung des identifizierten Genprodukts erfolgt. Weiterhin sollte der Wirkstoff vom Patienten gut vertragen werden und geringe Nebenwirkungen besitzen.

Zur Identifizierung von Wirkstoffen, die an Polynukleotide binden, kann ein Polynukleotid der Erfindung z. B. an eine Trägermatrix vorgekoppelt werden bzw. umgekehrt, die Wirkstoffe der Polypeptide-bzw. kombinatorischen Substanzenbank. Das verwendete darauffolgende Schema ist das gleiche wie das, das für die Polypeptide schon beschrieben wurde.

Solche inhibitorischen Substanzen können Polypeptide, Peptide, aber auch chemische Substanzen sein, wie etwa Antibiotika. Die inhibitorische Wirkung kann dabei in verschieden Stadien der Replikation der zu bekämpfenden Mikroorganismen eingreifen. Beispiele sind Expressionsinhibitoren oder Enzyminhibitoren oder sonstige Inhibitoren, welche die natürliche Funktion der Polypeptide von Helicobacter und verwandten Mikroorganismen beeinflussen können. Solche inhibitorischen Substanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Eine weitere Möglichkeit, einen optimalen Wirkstoff gegen Helicobacterund andere bakterielle Infektionen zu finden, ist mit Hilfe von speziellen Computerprogrammen. Aufgrund von kristallographischen Daten, die von den in der Erfindung beschriebenen Polypeptiden gewonnen wurden kann ein Modell erstellt werden, das sterische, elektronische, hydrophobe und sogenannten"resultierende Bindungsmomente" (RBMs) miteinander verbindet (Ray et al., 1998). Anhand dieses Modells können im weiteren Substanzen am Computer modelliert werden, die zwar die bereits identifizierten Leadstrukturen enthalten können, aber mit besseren Bindungseigenschaften ausgestattet sind. Es können jedoch auch völlig neuartige Wirkstoffe entworfen werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für ein essentielles sekretorisches Gen aus Helicobacter pylori kodiert, das durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren identifiziert wurde. Es wurden essentielle Helicobactergene mit dem vorliegenden Verfahren identifiziert, deren Nukleinsäuresequenzen in den SEQ ID NO. 1 bis 245 (ungerade Zahlen) angegeben sind. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure ist beispielsweise dadurch gekennzeichnet, daß sie (a) eine der in SEQ ID NO : n, wobei n eine ungerade ganze Zahl von 1 bis 245 einschließlich ist, dargestellten Nukleinsäuresequenzen oder einen proteinkodierenden Abschnitt davon, (b) eine einer der Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit einer der Sequenzen aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.

Neben den im Sequenzprotokoll gezeigten erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen und diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenzen umfaßt die vorliegende Erfindung auch Nukleotidsequenzen, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisieren. Der Begriff"Hybridisierung"gemäß

vorliegender Erfindung wird bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101- 1.104) verwendet. Vorzugsweise spricht man von einer stringenten Hybridisierung, wenn nach dem Waschen für eine Stunde mit 1 X SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 h in 0,2 X SSC und 0,1 % SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer oder mehreren der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen oder einer diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz hybridisierende Nukleotidsequenz ist eine erfindungsgemäße Nukleotidse- quenz.

Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz eine DNA. Sie kann jedoch auch eine RNA oder ein Nukleinsäureanalogon, wie etwa eine peptidische Nukleinsäure, umfassen. Besonders bevorzugt umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure einen Protein-kodierenden Abschnitt der in Sequenzprotokoll dargestellten Nukleotidsequenzen oder eine Sequenz, die eine Homologie von mehr als 80 %, vorzugsweise mehr als 90 % und besonders bevorzugt mehr als 95 % zu den dargestellten Nukleotidse- quenzen oder einen vorzugsweise mindestens 20 Nukleotide (nt) und besonders bevorzugt mindestens 50 nt langen Abschnitt davon aufweist.

Die Homologie wird in Prozent identischer Positionen beim Vergleich zweier Nukleinsäuren (bzw. Peptidketten) angegeben, wobei 100% Homologie die völlige Identität der verglichenen Kettenmoleküle bedeutet (Herder : Lexikon der Biochemie und Molekularbiologie, Spektrum Akademischer Verlag 1995).

Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann für ein sekretiertes Polypeptid mit Signalpeptid kodieren oder für ein sekretiertes Polypeptid ohne Signalpeptid.

Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt sowohl die Sequenz des kodierenden Strangs als auch die dazu komplementäre Sequenz. Letztere kann beispielsweise bei der Herstellung von Antisense-Nukleinsäuren Anwendung finden.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist natürlich auch eine Genbank, die mindestens 2, bevorzugt mindestens 20, stärker bevorzugt mindestens 100 der genannten Nukleinsäuren in Vektoren kloniert enthält.

Eine Auflistung der hierin und im Sequenzprotokoll angegebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren samt ihrer Genprodukte und deren Funktionen und putativen Funktionen ist in den Tabellen I und 11 angegeben.

Bei den Genen, die im Sequenzprotokoll in ihrer Nukleinsäure-und Aminosäuresequenz angegeben sind, handelt es sich um bakterielle Gene. Prokaryoten verwenden außer dem AUG-Codon (mRNA) auch noch andere (alternative) Start-Codons. Diese sind AUU (codiert normalerweise für Isoleucin, Ile), UUG (codiert normalerweise für Leucin, Leu) und GUG (kodiert normalerweise für Valin, Val). Im Sequenzprotokoll wurden die Aminosäuresequenzen gemäß dem normalerweise verwendeten Translationscode translatiert. Es wird darauf hingewiesen, daß beim Lesen des Sequenzprotokolls die prokaryontische Verwendung alternativer Startcodons berücksichtigt werden muß, und daß somit hierin auch von den Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 35,49,61,69,75,81,103 und 105 kodierte Aminosäuresequenzen offenbart sind, welche anstatt mit einem im Sequenzprotokoll dargestellten jeweiligen Leu-, Val-oder Ile-Rest, mit einem Methioninrest (Met) anfangen.

Auch die folgenden Gen-Sequenzen starten mit alternativen Start-Codons : HPC152 (UUG) ; HPC190 (UUG) ; HPN048 (GUG) ; HPN132 (GUG) ; HPC010 (GUG) ; HPC036 (UUG) ; HPC056 (UUG) ; HPC161 (GUG). Diese Codons werden in der Regel als Met translatiert, wenn sie als Startcodons fungieren.

Tabelle 1 : Obligat essentielle Gene SEQ ID Gen Länge Mögliche Eigenschaften der Signal- NO (obligat Genprodukte peptid essentiell) 1+2 HPS001 873bp Signalpeptidase I + (HPS166) 3+4 ProteinderFlagellenbiosynthese-267bp 5+6 HPC005 714bp Lipoprotein + 7+8 HPC029 552bp Sekretiertes Protein (HPC030) 9+10 HPS042 858bp Inneres Membranprotein, Ubiquinol- Oxidoreduktase 11+12 HPC057 192bp Sekretiertes Protein + (HPC109, HPC138) 15+16 HPS065 1629bp Lipoprotein + (HPS153) 17+18 HPS066 1377bp Inneres Membranprotein, Eisen-Schwefel- - Bindungsprotein 21+22 HPS074 957bp Sekretiertes Protein- 23+24 Sekretiertes/periplasmatischesProtein-480bp 25+26 HPS084 1983bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein + 27+28 HPC085 372bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein + 29+30 HPC090 558bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein + 31+32 HPS104 768bp Integrales Membranprotein- 33+34 HPS115 2367bp ATPase für Kationentransport 35+36 HPS120 2751bp Äußeres Membranprotein, protektives + Oberfiächenantigen 37+38 HPS130 990bp Sekretiertes Protein + 39+40 HPS1331482bp Mureinvoriäufer-Protein- 41+42 HPC134 600bp Inneres Membranprotein, Protein- Translokationsprotein 43+44 HPS143 1536bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein + 45+46 HPS144 540bp Peptidoglykan-assoziiertes Lipoprotein + 49+50 HPS152 1062bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein + 51+52 HPS155 2202bp Protein der Flagellenbiosynthese 53+54 HPC157 189bp Sekretiertes Protein (HPC181) 55+56 HPS183 1008bp Eisen (III) ABC-Transporter + 57+58 HPS186 240bp Sekretiertes Protein 59+60 Äu#eresMembranprotein+1764bp 61+62 HPS190 1443bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein 115+116 HPN165 8709bp Toxin-ähnliches Außenmembranprotein ; + Autotransporter 117+118 HPC001 873bp Signalpeptidase I 119+120 HPC042 663bp Inneres Membranprotein, Ubiquinol- Oxidoreduktase 121+122 HPC065 1674bp Lipoprotein + 123+124 HPC066 697bp Inneres Membranprotein, Eisen-Schwefel-n. d. Bindungsprotein 125+126 HPC074 519bp Sekretiertes Protein n. d. 127+128 HPC083 480bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein 129+130 HPC084 1983bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein + 131+132 HPC104 768bp Integrales Membranprotein- 133+134 HPC115 1510bp ATPase für Kationentransport- 135+136 HPC120 1017bp Äu#eres Membranprotein, protektives + Oberflächenantigen 137+138 HPC130 193bp Sekretiertes Protein + 139+140 HPC133 530bp Mureinvorläufer-Protein 141+142 HPC143 1536bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein + 143+144 HPC144 88bp Peptidoglykan-assoziiertes Lipoprotein + 145+146 HPC1 52 1080bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein + 147+148 HPC155 695bp Protein der Flagellenbiosynthese n. d. 384bpToxin-åhnlichesAu#enmembranprotein+149+150HPC165 Autotransporter 151+152 HPC183 1008bp Eisen (III) ABC-Transporter + 153+154 HPC186 240bp Sekretiertes Protein 264bpu#eresMembranprotein+155+156HPC188 157+158 HPC190 1443bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein Tabelle ll : Fakultativ essentielle Gene Signal- SEQ ID Gen Länge Mögliche Eigenschaften der peptid NO (fakultativ Genprodukte essentiell) 99+100 HPS004 1644bp Inneres Membranprotein + (HPS027, HPS121, HPS131) 63+64 HPC008 543bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein (HPC114, HPC145) 65+66 HPS013 1746bp 2', 3'-zyklische Nukleotid-2'-+ Phosphodiesterase 67+68 HPS024 1698bp Chemotaxis-Protein + (HPS025) 69+70 HPS036 855bp Sekretiertes Protein + 71+72 HPS038 669bp Sekretiertes Protein 73+74 HPS039 804bp Sekretiertes Protein (HPS147) 75+76 HPS040 1545bp Sekretiertes Protein + 77+78 HPS048 912bp Sekretiertes Protein + 79+80 HPS050 834bp Periplasmatisches Glutamin-Bindeprotein + 81+82 HPS052 1296bp Äußeres Membranprotein 83+84 HPS056 1197bp Sekretiertes Protein 85+86 HPS059 1131bp Integrales Membranprotein + 87+88 HPS063 516bp ATP Synthase F0, Untereinheit b + 89+90 HPS069 990bp Sekretiertes Protein + 91+92 HPS091 684bp Integrales Membranprotein- 93+94 HPS095 729bp Äußeres Membranprotein + 95+96 HPS099 975bp Sekretiertes Protein 97+98 HPS117 1290bp Sekretiertes Protein + (HPS118, HPS162) 101+102 HPS132 3063bp Kationenefflux Protein + 47+48 HPC140 1557bp AlpA Adhäsin (HPC150, HPC179) 103+104 HPS149 2028bp Methylakzeptierendes Chemotaxisprotein 105+106 HPS161 273bp Sekretiertes Protein + 107+108 HPS176 759bp Protein der cag Pathogenitätsinsel 109+110 HPS187 1245bp Zinkabhängige Metalloprotease + 111+112 HPS189 1566bp Sekretiertes Protein 113+114 HPS191 1782bp Sekretiertes Protein + 13+14 HPS062 957bp Sekretiertes Protein (HPS171) 19+20 HPS068 1533bp Lipase + 159+160 HPN013 1401 bp Sekretiertes/periplasmatisches Protein + 161+162 HPN048 2577bp Zellteilungsprotein + 163+164 HPN091 1329bp Natrium-und Chlorid-abhängiger Transporter 165+166 HPN132 1785bp Periplasmatischer Oligopeptide-ABC-+ Transporter 167+168 HPN137 2007bp Sekretiertes Protein+ 169+170 HPN172 771bp Sekretiertes Protein + 1641bpInneresMembranprotein+171+172HPC004 173+174 HPC010 783bp Sekretiertes Protein + 1131bpSekretiertesProtein+175+176HPC012 675bpSekretiertes/periplasmatischesProtein+177+178HPC013 179+180 HPC024 348bp Chemotaxis-Protein + 1359bp2',3'-zyklischeNukleotid-2'-+181+182HPC034 Phosphodiesterase 183+184 HPC036 858bp Sekretiertes Protein + 185+186 HPC039 804bp Sekretiertes Protein 187+188 HPC048 1657bp Zellteilungsprotein + 189+190 HPC050 684bp An der Flagellenbeweglichkeit beteiligtes + sekretiertes Protein 191+192 HPC056 879bp Hypothetisches Protein + 193+194 HPC059 1131 bp Integrales Membranprotein + 195+196 HPC063 1068bp Sekretiertes Protein- 197+198 HPC068 1533bp Lipase + 199+200 HPC069 516bp ATP Synthase F0, Untereinheit b + 201+202 HPC070-565bp Kationenefflux Protein + 203+204 HPC076 663bp Sekretiertes Protein 205+206 HPC091 454bp Natrium-und Chlorid-abhängiger Transporter 207+208 HPC094 921bp Sekretiertes Protein 209+210 HPC095 1572bp Konserviertes hypothetisches integrales + Membranprotein 211+212 HPC099 966bp Sekretiertes Protein 812bpPeriplasmatischesGlutamin-Bindeprotein+213+214HPC101 215+216 HPC107 1268bp Außeres Membranprotein 217+218 HPC110 312bp Sekretiertes Protein n. d. 219+220 HPC117 1290bp Sekretiertes Protein + 221 +222 HPC129 471 bp Sekretiertes Protein 223+224 HPC132 186bp Sekretiertes Protein + 225+226 HPC137 1096bp Sekretiertes Protein + 227+228 HPC149 1722bp Methylakzeptierendes Chemotaxisprotein 229+230 HPC161 273bp Sekretiertes Protein + 231+232 HPC169 183bp Integrales Membranprotein 543bpSekretiertesProteinn.d.233+234HPC172 729bpÄu#eresMembranprotein+235+236HPC174 237+238 HPC176 540bp Protein dercag Pathogenitätsinsel 239+240 HPC180 864bp Sekretiertes Protein + 1072bpZinkabhängigeMetalloproteasen.d.241+242HCP187 243+244 HPC189 357bp Sekretiertes Protein 245+246 HPC191 1251 bp Sekretiertes Protein n. d. n. d. = nicht bestimmt SEQ ID NO 247 : zeigt die Sequenz des Vektors pSRM4 (Abbildung 13).

Die Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis 114 sind im beiliegenden Sequenzprotokoll dargestellt.

Die Sequenzen SEQ ID NO. 115 bis 246 sind in den Abbildungen 14 und 15 dargestellt.

In den nachfolgenden Tabellen A und B elnd die Nukleinsäure-Sequenzen der fdentifiziorten (Gen-ID)aufgeführt,derenNuklelnsäure-Sequenzennichtvolistà ¤ndigemitteitHellcobacterGene worden konnten. Das dargestelfte Leseraster der ermittelten Hellcobacter Gensequenzen Ist aufgrund der Selektion nach funktionaten Fusionen mit dem verwendeten Indlkatorgen, der I3-Lactamase sichergdateltt (slehe Belsplel 3 und 4). in dieHelicobacterGeneaufgaführt,dieeinunvoliständiges5'-Ende und/oder3'-Endesind TabelleBsindsoicheHelicobacterGeneaufgeführt,denenaufgrundf ehlenderSequenz-enthalten.In Daten eine oder mehrere Aminosäuren nicht zugeordnet werden können. In allen Fällen können Stop- Codons ausgeschlossen werden.

Tabellemitunvollstänbdigem5'-und/oder3'-Ende.Gen-Sequenz en assentielleGeneKategor@e;Obligat Fehiendes5'-EndeFahiendes3'-EndeGen-ID(Intern) HPC XHPC088X XHPC074X HPC HPC HPC130 HPC HPC XHPC156X HPC165X HPC Kategorie:: Fakultativ essentielle Gene Gen-ID (Intern) Fehlendes 5'-Ende Fehlendes 3'-Ende HPC010X HPC024X HPC034X HPC048X HPC070X HPC078X HPC091X HPC101X HPC017X XHPC110X HPC129X HPC137X HPC149X HPC169X HPC172X HPC176 XHPC187X XHPC191X Tabelle B Aminosäuren-Sequenzen Kwtagode : Obligat esaentlelle Gene AS-Position'NS-PositionzGen-ID(Intern) 73HPC00126 1078HPC086360 334HPC066112 HPC074 490;493185 5001207;1496HPC084403; 610HPC104204 41HPC15514 Kategorie : Fakultativ essentielle Gene AS-Position1NS-PositionzGen-ID(Intern) 235568;703HPC012190; 207;219607;619;655HPC013203; 91HPC03831 397202;1189HPC04868; HPC056 1916; 3881141;1158HPC068381; 148;155;168;169430;442:483:502;506HPC069144; 526HPC076176; HPC101HPC101133; 484397; 291661;871HPC017221; 979HPC137327 835HPC149279 191;209541;571;625HPC180181; 1Position der fehienden Aminosäure In der abgelefteten Aminosäuren Sequenz derNukleinsäuren-Sequenz,ersteBasevomkodierendenBasen-Tripl ett.2Positionin

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen Abschnitt davon enthält. Die Nukleinsäure oder der Nukleinsäureabschnitt kann so in den Vektor kloniert sein, daß sie entweder in Sense-oder Antisense Richtung exprimiert werden kann. Der Nukleinsäureabschnitt hat bevorzugt eine Mindestlänge von 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt 20 Nukleotiden, stärker bevorzugt 50 Nukleotiden. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße DNA- Sequenz vorzugsweise in Verbindung mit Expressionssignalen befindet, wie z. B. Promoter, Operator, Enhancer etc. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie etwa Bakteriophagen (z. B.

Bakteriophage A) und extrachromosomale Vektoren wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Vektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontische Vektoren sind z. B. bei Sambrook etal., Molecular Cloning (1987), Kapitel 1-4, beschrieben. Andererseits kann der erfindungsgemäße Vektor auch ein eukaryontischer Vektor sein, z. B. ein Hefevektor oder ein für höhere Zellen geeigneter Vektor (z. B. ein Plasmidvektor, viraler Vektor, Pflanzenvektor). Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al., supra, Kapitel 16 beschrieben. CAI-und SRM-Vektoren, wie oben beschrieben, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure transformiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Zelle eine prokaryontische Zelle, vorzugsweise ein gram-negatives Bakterium, z. B. E. coli. Andererseits kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Pilzzelle, eine Hefezelle, eine tierische oder eine pflanzliche Zelle. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Zelle um einen Mikroorganismus, z. B. Helicobacter oder Salmonellen. Mit CAI-oder SRM-Vektoren transformierte Mikroorganismen sind oben bereits beschrieben worden. Diese sind, wie auch mit den obigen

Verfahren herstellbare Mutantenbanken, ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein essentielles und bevorzugt sekretiertes Polypeptid von H. pylori. Insbesondere ist dies ein Polypeptid, das (a) eine der in SEQ ID NO : m, wobei m eine gerade ganze Zahl von 2 bis 246 einschließlich ist, dargestellten Aminosäuresequenzen oder (b) eine mit einer der Sequenzen gemäß (a) immunologisch kreuzreagierende Sequenz umfaßt.

Unter immunologische kreuzreagierenden Sequenzen sind somit auch Muteine, Varianten und Fragmente der in den SEQ ID NO. 2 bis 246 dargestellten Sequenzen umfaßt. Darunter sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von den obigen Sequenzen unterscheiden.

Aufgrund von Homologieanalysen mit Hilfe des FASTA Proteinprogramms konnten den identifizierten Polypeptiden, deren Sequenz mit der Nukleinsäuresequenz gefunden werden konnte, bestimmte Merkmale bzw. eine mutmaßliche Lokalisation im Bakterium zugewiesen werden. Einige der von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Polypeptide besitzen ein Signalpeptid und werden durch den Sec-abhängigen Transport- mechanismus an ihre Zielstelle exportiert, während andere kein Signalpeptid besitzen und daher wahrscheinlich über einen Sec-unabhängigen Transportmechanismus, z. B. durch das ABC-Transporter-System, sekretiert werden (siehe Tabellen I und li).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide und-fragmente. Die Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man

eine Zelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül oder Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet, und das Polypeptid aus der Zelle oder/und aus dem Kulturüberstand isoliert. Dabei kann das erfindungsgemäße Polypeptid sowohl als Fusionspolypeptid als auch als Nichtfusionspolypeptid gewonnen werden.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch einen Antikörper, der gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Fragmente solcher Antikörper, wie z. B. Fab-Fragmente oder Fc-Fragmente.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Inhibitor der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Fragmente, bzw. deren Expression, Präsentation oder/und natürlichen Funktion. Dies ist bevorzugt ein Molekül, welches in der Lage ist, spezifisch an ein Polypeptid oder Fragment davon zu binden oder/und dessen Expression, Präsentation oder/und natürliche Funktion zu beeinflussen. Die Identifizierung von solchen spezifischen Bindepartnern wurde oben bereits beschrieben. Besonders geeignet als Inhibitoren sind Proteine oder Peptide, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid in seinen natürlichen Funktion hemmen, z. B. können Enzyme durch Blockieren des aktiven Zentrums gehemmt werden.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül, einen erfindungsgemäßen Vektor, eine erfindungsgemäße Zelle, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, einen erfindungsgemäßen Antikörper oder Fragment davon oder/und ein inhibitorisches Molekül, das in der Lage ist, spezifisch an ein

erfindungsgemäßes Polypeptid zu binden, gegebenenfalls zusammen mit üb- lichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Zusatz-und Trägermitteln enthält.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf ver- schiedene Art und Weise und unterVerwendung einzelner ihrer Bestandteile als wirksame Substanzen zur Hemmung der Reproduktion von Helicobacter Organismen in einem Wirt, speziell im Menschen verwendet werden.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einerseits zur Diagnostik einer Helicobacter-Infektion verwendet werden. Die Diagnostik auf Nukleinsäureebene erfolgt vorzugsweise durch Verwendung von Hybridisierungssonden, bzw. Primern, welche eine spezifische DNA- Sequenz aufweisen, die zu mindestens einen Abschnitt einer der in SEQ ID NO. 1 bis 245 (ungerade Zahlen) dargestellten Sequenzen komplementär ist, so daß sie eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Sequenzen erlauben.

Wie bereits erwähnt, können diese Amplifikationsprimer oder Sonden auch zur Amplifikation und damit zur Detektion von verwandten Mikroorganismen verwendet werden, wenn diese Gensequenzen aufweisen, die for dasselbe essentielle Gen kodieren. Auf Proteinebene erfolgt die Diagnostik vorzugsweise mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper.

Des weiteren ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und Bekämpfung von He/icobacter-lnfektionen und Infektionen mit verwandten Mikroorganismen geeignet.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der identifizierten essentiellen Gene von Helicobacterpylorizur Prävention oder Bekämpfung einer Infektion mit Helicobacter oder verwandten Mikroorganismen. Insbesondere können diese identifizierten essentiellen Gene zur Herstellung von Impfstoffen (Vakzinen) verwendet werden (siehe oben).

Eine weitere Verwendung der Polypeptide der Erfindung besteht in der Aufreinigung der Antikörper gegen H. pylori Polypeptide und gegen entsprechende Polypeptide aus verwandten und anderen Mikroorganismen.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele, Abbildungen und das Sequenzprotokoll näher erläutert. Im Sequenzprotokoll sind die in den Tabellen I und II aufgelisteten Nukleinsäure-und Aminosäuresequenzen dargestellt.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung eines CAI-Vektors.

Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung eines Verfahrens der konditionalen Antisense-Hemmung (CAI).

Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung der Untersuchung der Lebendfähigkeit von defizienten Mikroorganismen anhand ihrer Überlebensraten mit Hilfe des CIA- Verfahrens.

Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung des subtraktiven CAI-Verfahrens (CAI).

Abbildung 5 zeigt eine schematische Darstellung eines SRM-Vektors.

Abbildung 6 zeigt eine schematische Darstellung der reversiblen Inaktivierung eines Gens durch die Insertion/Excision eines konditional replizierenden SRM-Plasmids.

Abbildung 7 zeigt eine schematische Darstellung eines SRM- Verfahrens.

Abbildung 8 zeigt eine schematische Darstellung der Anreicherung von Fragmenten essentieller Gene durch subtraktive Hybridisierung.

Abbildung 9 zeigt eine Übersichtskarte von pSRM4. Der"origin of replication" (ori) ist als Balken, kodierende Regionen (nähere Erläuterungen s. unten) sind als Pfeile dargestellt. Singuläre Restriktionsschnittstellen sind angegeben.

Abbildung 10 zeigt eine Schematische Darstellung der Integration und Exzision eines pSRM Plasmids, das ein Insert mit Homologie zu einem Gen des Empfängerorganismus trägt. Die Doppelpfeile zeigen die Gleichgewichtsreaktionen zwischen Integration und Exzision. Gestrichelte Linien deuten auf den DNA- Bereich, in dem homologe Rekombination stattfindet.

Abbildung 11 zeigt eine schematische Übersicht über die Schritte zur Konstruktion einer zufälligen Fragmentbank.

Abbildung 12 zeigt die vollständige Nukleotid-und Aminosäuresequenz der Genfusion des HPC001- Proteins mit dem RGS-His4-Epitop. Die Vektorsequenzen sind schwarz unterlegt.

Abbildung 13 zeigt die Nukleotidsequenz des SRM-Vektors pRSM4.

Abbildungen 14 und 15 zeigen die Nukleotid-und Aminosauresequenzen weiterer essentieller Helicobacter-Gene.

Beisoiele Beispiel 1 Identifizierung essentieller Gene durch Herstellung gendefizienter Mikroorganismen durch subtraktive Rekombinations-Mutagenese (SRM) Die Anwendung des dargestellten Gesamtverfahrens ist exemplarisch am Beispiel des Pathogens Salmonella dargestellt, läl3t sich jedoch auch mit anderen pathogenen Keimen, z. B. Helicobacter, durchführen.

Das SRM-Verfahren wird mit dem Vektor pSRM4 durchgeführt, der speziell für dieses Verfahren entwickelt wurde (siehe Abbildung 9, Sequenz siehe SEQ ID No. : 247 Das Plasmid weist folgende Eigenschaften auf : pSRM4 trägt eine temperatursensitive Replikationsfunktion (repAts, ori +) aus dem Streptococcus Plasmid pWV01 (Kok, etal., 1984 ; Maguin, etal., 1992) und repliziert bei permissiver Temperatur (30°C) in Gram-negativen Bakterien (E coli, Salmonella, u. a.) und in Gram-positiven Bakterien (Bacillus, Lactococcus, Streptococcus, u. a). Auf Grund des Replikationsmechanismus ("rolling circle"Mechanismus) ist es möglich, dass das Plasmid ebenso in Helicobacter pylori wie auch in Mycobakterien repliziert (del Solar, et al., 1993 ; Kleanthous, et a/., 1991).

Zum Test der Stabilität von pSRM4 bei 30°C in E. coli oder Salmonella werden die Bakterien über Nacht bei 30°C in Flüssigmedium (FlMed) mit Tetrazyklin (Tet) (17.5 Ng/ml) angezogen, 1 : 100 in mit Tet verdünnt, nach 3 Stunden Inkubation bei 30°C nochmals 1 : 103 in FIMed verdünnt (tO) und anschliessend bei 30°C ohne Tet inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Aliquots der Kultur entnommen und in geeigneten Verdünnungen auf Festmedium (FeMed) mit und ohne Tet ausplattiert. Nach Inkubation bei 30°C werden die Koloniezahlen auf beiden Medien bestimmt und die Anzahl

an Klonen pro ml Kultur berechnet. Die Anzahl Tet resistenter und Tet sensitiver Klone ist bis zu 7 Stunden nach t0 identisch, nach 19 Stunden sind noch ca. 10% der Klone resistent gegen Tet.

Bei 37°C repliziert pSRM4 weder in Salmonella noch in E. coli.

Das Experiment wird wie unter (1) durchgeführt mit dem Unterschied, dass die Inkubation bei 37°C (ohne Tet) stattfindet. Nach 80 bis 180 Minuten nach t0 beginnt die Zahl an Tet sensitiven Klonen logarithmisch anzusteigen, während die Anzahl an Tet resistenten (plasmidhaltigen) Klonen gleich bleibt. pSRM4 codiert für eine Tetrazyklin Resistenz, die Resistenz gegen 17,5, ug Tetrazyklin/ml vermittelt. Das Tetrazyklin-Resistenzgen kann gegen andere Resistenzgene ausgetauscht werden. Dazu stehen innerhalb des Vektors mehrere Restriktionsschnittstellen zur Verfügung (s. Abb. 9). pSRM4 enthält eine sog."multiple cloning site" (mcs) mit verschiedenen, singulären Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme.

Die mcs liegt in einem Teil des/acZ Gens, das zur alpha-Komplementation in E. coli- Stämmen wie DH5a, XL1-Blue, oder EC101 (Law, etal., 1995) verwendet werden kann. Dadurch können Plasmide, die kionierte DNA Fragmente in der mcs tragen, durch blau/weiss-Unterscheidung auf Festmedium mit X-Gal (80 µg/ml) und IPTG (420 µM IPTG) identifiziert werden. Klone von EC101, die Plasmide mit Inserts tragen, bilden weisse Kolonien, während Kolonien von Klonen, die Plasmide ohne Insert enthalten, blau sind. pSRM4 lässt sich mit einer Effizienz von 2x107 bis 2x108 pro, ug DNA in E. coli DH5a bzw. EC101, und mit einer Effizienz von von 5x106/pg in S. typhimurium ATCC14028 transformieren. Die Transformation erfolgt über Elektroporation nach Standardprotokollen.

pSRM4 rekombiniert nicht mit dem Genom von S. typhimurium. pSRM4 wurde in S. typhimurium ATCC 14028 transformiert ; die Transformanten wurden 48 h bei 30°C auf FeMed mit Tet kultiviert und vereinzelt. Eine Einzelkolonie (ca. 108 Zellen) wurde in einem ml FIMed resuspendiert und in entsprechenden Verdünnungen auf FeMed mit Tet bei 30°C zur Bestimmung der Gesamtzelizahl bzw. bei 37°C zur Bestimmung der Anzahl der Integranten inkubiert. Unter 1 X108 Zellen der Ausgangskolonie wurde kein Klon gefunden, der bei 37°C Kolonien bildet.

Die Häufigkeit der nicht-homologen Rekombination des Plasmids mit dem Genom von S. typhimurium beträgt demnach weniger als 1x10-8. pSRM4 mit kurzen genomischen Inserts eignet sich zur Inaktivierung von genomischen Genen über homologe Rekombination (Beispiele : phoP Gen und phot Gen aus S. typhimurium).

Interne Fragmente der Gene phoP (561 bp) bzw. phot (543 bp) wurden in pSRM4 kloniert. Die entsprechenden Plasmide (pSRM4-phoP bzw. pSRM4- pholv) wurden in S. typhimurium ATCC14028 transformiert und die erhaltenen Klone bei 30°C mit Tet selektioniert. Zwei Kolonien wurden in mehreren Verdünnungen auf BCiP-haltige Minimalmediumplatten ausplattiert und bei 30°C und bei 37°C inkubiert. Kolonien, die bei nicht-permissiver Temperatur (37°C) wachsen, bestehen aus Zellen mit genomisch integriertem Vektor. Diese Kolonien zeigen keine bzw. nur eine schwache Blaufärbung, da durch die Insertion des Vektors pSRM-phoN bzw. pSRM4- phoP das für die saure Phosphatase PhoN codierende Gen phot bzw. dessen Aktivatorgen phoP inaktiviert werden und damit keine Umsetzung des Farbstoffes BCiP erfolgen kann. Aus den erhaltenen Werten errechnen sich durchschnittliche Rekombinationsraten von ca. 3,6x10-4. Diese Rekombinationsraten wurden auch für kürzere genomische Fragmente von bis zu 100 bp Länge beobachtet.

Bei 37 ° C wachsende Kione werden auf homologe Rekombination und Integration des Plasmids in das Genom überprüft. Zum Nachweis der Integration werden PCR-Reaktionen mit einem PCR-Primer, der mit Sequenzen des Plasmids hybridisiert, und einem phoN-bzw. phoP- spezifischen Primer, der zu einer chromosomalen phoN-bzw. phoP-Sequenz, nicht aber zum klonierten phoN-bzw. phoP-Fragment homolog ist, durchgeführt (Primerpaare phoNfor [GCTGTCGACTTTCTACCACTGATCGTAGC]/ IacZ2 [CATGCCATGGCTGCGCGTAACCACC] bzw. phoP3 <BR> <BR> <BR> <BR> [CCCCAAAGCACCATAATCAACGC]/lacZ1 [CATGCCATGGAAGAGCGCCCAATAC]).

Amplifiziert wird DNA von dem Plasmid zusammen mit einem Stück chromosomaler DNA, die benachbart zur Insertionsstelle liegt. Bei genomischer Integration des Plasmids werden grosse Mengen an PCR Fragment erhalten. Zur Überprüfung des Verlusts an freier Plasmid-DNA dient eine PCR mit den Primern lacZ1/SRMgb2 [ATACCGTCGACCTCGAG].

Beide Primer hybridisieren nur gegen Sequenzen des Plasmids, die sich seitlich zu dem klonierten Insert bedinden ; bei genomisch integriertem Plasmid ergibt diese Amplifikation nur ein eine sehr geringe Menge an Produkt.

Genomisch integriertes pSRM4 exzisiert bei permissiver Temperatur.

Klonierte genomische Inserts können über PCR mit verschiedenen Primerpaaren (SRMgb2/SRMgb4 [AACAAAAGCTGGGTACC] ; lacZ1/SRMgb2) leicht präpariert werden.

Integrantenstämme (S. typhimurium ATCC14028-Derivate mit Integration von pSRM-phoN) werden auf FeMed mit Tet bei 30°C und bei 37°C inkubiert und anschliessend kolonieweise unter Verwendung verschiedener Verdünnungen bei beiden Temperaturen auf FeMed mit oder ohne Tet ausplattiert, um die Häufigkeit der Exzision zu quantifizieren. Der Quotient aus der Kolonienzahl auf FeMed ohne Tet und derjenigen auf FeMed mit Tet gibt an, in wieviel Zellen einer Kolonie das Plasmid frei vorliegt im Vergleich zu Zellen mit genomisch integriertem Plasmid. Der Quotient ist ein Mass für

die Exzisionsrate. Je nach Ausgangskolonie ergeben sich Exzisionsraten von 3,2 bis 17,1.

Exzisiertes Plasmid wird wiederum unter Verwendung der Primer SRMgb2 und SRMgb4 oder der Primer lacZ1 und SRMgb2 in einer PCR nachgewiesen. Es ergeben sich grosse Mengen an PCR Produkt.

Bei der Insertion und Exzision von pSRM4-fragment über homologe Rekombination handelt es sich um eine Gleichgewichtsreaktion (siehe Abb. 10). Bei 30°C ist das Gleichgewicht zur Seite des frei in der Zelle replizierenden Plasmids verschoben, bei 37°C liegt vor allem genomisch integriertes Plasmid vor. Sowohl bei 30°C als auch bei 37°C kann freies und integriertes Plasmid über PCR nachgewiesen werden. Die jeweiligen Mengenverhältnisse sind aber entsprechend der Temperatursensitivität des Plasmids verschoben.

Eine Mutante, die pSRM4-phoP im phoP Gen enthält, ist in einem Zell kultursystem stabil und attenuiert.

Zur Überprüfung der Stabilität und Attenuierung einer pSRM4-phoPMutante wird die intrazelluläre Vermehrung dieser Mutante in murinen J774A. 1 Makrophagen mit der Vermehrung von pSRM4-phoN, mit dem Wildtyp S. typhimurium ATCC14028, und mit stabilen phoP und phot Mutanten verglichen. Dazu werden 4x105 Makrophagen der Zellinie J774A. 1 mit 8x106 Bakterien eines Klons bei 37°C, 5% C02 infiziert. Nach 30 min werden die extrazellulären Bakterien durch Waschen mit PBS sowie durch die Zugabe von 10, ug/ml Gentamicin zum Medium entfernt. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion werden die Makrophagen mit 0,5% Natriumdesoxycholat lysiert und geeignete Verdünnungsstufen des Zelilysats auf FeMed ausplattiert. Nach Inkubation werden die Koloniezahlen bestimmt und die Anzahl an Bakterien pro ml Kultur berechnet. Während sich der wildtypische Stamm über einen Zeitraum von 7 bis 24 Stunden

deutlich in den Makrophagen vermehrt, ist eine stabile phoP Mutante stark attenuiert. Eine stabile phot Mutante und eine pSRM4-phoN Insertionsmutante verhalten sich wie der Wildtyp. Eine pSRM4-phoP Insertionsutante verhält sich wie die stabile phoP Mutante. Die Vermehrungsraten sind in nachfolgender Tabelle zusammengefasst Tabelle III : Stabilität und Attenuierung von pSRM-Insertionsmutanten unter Selektion in Makrophagen.

Stamm Vermehrung (x-fach) nach Stunden<BR> 3 5 7 24<BR> 14028 Wildtyp 0,1 1,0 18,8 34,7<BR> 14028 phoN 0,1 1,3 3,9 39,9<BR> 14028 pSRM4- 1,6 4,2 11,3 20,8<BR> phoN<BR> 14028 phoP 0,1 0,2 0,1 0,6<BR> 14028 pSRM4- 0,1 0,1 0,1 1,5<BR> phoP

pSRM4 eignet sich zur Konstruktion von SRM rPCR Fragmentbanken.

Die rPCR (random PCR) Fragmentbanken werden auf folgende Art hergestellt : 1.) Amplifikation von zufallig erzeugten-500 bp Fragmenten Nach dem"random Annealing"von Random-Primer OL-30N8 [AAGTCGACGGATCCGGTACCTNNNNNNNN ; N = A, T, G, oder C ; unterstrichen : Kpnl-Restriktionsschnittstelle] an gescherte chromosomale DNA von S. typhimurium ATCC14028 (400 ng) werden die Primer mittels Klenow- Polymerase verlängert (s. Abb. 11) ; die DNA wird aufgereinigt und einer PCR mit dem Primer OL-30 [AAGTCGACGGATCCGGTACCT] unterworfen.

Fragmente von ca. 500 bp werden aus einem Agarose-Gel eluiert, aufgereinigt und zur erneuten Amplifikation mit dem Primer OL-30 eingesetzt. Dieser Schritt wird wiederholt. Das genaue Protokoll ist der Tab.

IV zu entnehmen ; das Prinzip des Verfahrens ist in Abb. 11 illustriert.

2.) Ligation und Erstellung der Fragmentbank Spaltung der eluierten genomischen Fragmente mit Kpnl und Ligation mit dephosphoryliertem, Kpnl-restringiertem pSRM4. Transformation in E. coli EC101 oder S. typhimurium ATCC14028. Selektion der Transformanten auf FeMed mit Tet bei 30°C.

3.) Test der Fragmentbank mittels PCR und blau/weiss-Selektion Bestimmung des Hintergrundes an religiertem Vektor mittels Kontroll- Ligationen und mittels blau/weiss-Selektion auf FeMinimalmedium mit BCiP (40, ug/ml). PCR von klonierten Inserts mit Primer lacZ1 und SRMgb4. Der Hintergrund an religiertem Vektor liegt nach PCR-Detektion und Auswertung der blau/weiss-Selektion bei etwa 10-25% Tabelle IV : Reaktionsbedingungen zur Konstruktion einer zufälligen Fragmentbank mittels rPCR.

Tabelle IV : Reaktionsbedingungen zur Konstruktion einer zufalligen Fragmentbank mittels rPCR. Klenow EndkonzentrationMenge@µKonzentration 30N8)10µM=10pmol/µl0,4µM2Primer(Oligo Klenow-Putfer lux I x 2 U/µl0.Klenow2.5 mM200µM3.dNTPs1.25 400ng/AnsatzTemplate:geschertechromosomale DNA 2° ad 20 alles bisaut'K.Ienowzusammenpipettieren 1', 94°C zur Denaturierung, dann auf Eis zur Vermeidung von Rehybridisierung zumAnnealing5',25°C Zugabe von Klenow Inkubation 37°C, 2' Aufreinigung aus 1,3% Agarose Gel mit GFX Gelelutions-Kit Elution der DNA in 20 + 10 ul H, O ; DNA-Konzentrationsbestimmung 1.PCR Menge@µEndkonzentration Pnmer (Oligo 30) µM 0,8 µ@ 1x5Puffer10x mM200µM8dNTPs1.25 iemplate : (ossenonierte DNA aus Klenow Reaktion Taq-Polymerase 5 U/µl 0.4 H2O ad 50 PrimerserstnacherstemPCR-Zyklus- Zugabedes I. PCR : 95°C, 1'; 50°C, 1' ; 72°C, 2' ; 1 x Zugabe des Primers 94°C,40";64°C,45";72C,1';10xII.PCR: 94°C,35";60°C,45";72°C,72°C,1';20xIII.PCR: Aufreinigung aus 1,3% Agarose Gel mit GFX Gelelutions-Kit Elution der DNA in 20 + 10 µl H20 ; DNA-Konzentrationsbestimmung 2. PCR Menge[µl]Endkonzentration 10Primer(OL30) 0,8µM4pmol/µl Puffer1x510x i g z mM200µ@dNTPs1.25 DNA10-50ngTemplate:Grössenfraktionierte aus 1. PCR U/µl0.3Taq-Polymerase5 H2O ad 50 5';94°C,35";- PCR-Reaktion:94°C, 72°C,1';25x.45"; Auftrag auf 1.3% iges Agarose-Gel und Elution des Bereiches um 550 bp.

SRM Fragmentbanken werden zur Konstruktion von SRM Mutantenbanken verwendet.

SRM Fragmentbanken, die in E. coli EC101 kloniert wurden, werden in S. typhimurium ATCC14028 transformiert. Die Transformanten werden bei 30°C auf FeMed mit Tet selektioniert. Die erhaltenen Kolonien werden von den Platten in F) Med mit Tet abgeschwemmt. Zur Reduktion der Menge an Zellen mit freiem Plasmid wird die Bakteriensuspension 3 Stunden bei 37°C inkubiert, und anschliessend auf FeMed mit Tet ausplattiert. Auf diese Art werden Tausende von genomischen Insertionsmutanten erhalten, die in ihrer Gesamtheit die SRM Mutantenbank darstellen. Um die Redundanz der SRM Mutantenbank zu verringern, wird von mehreren unabhängigen Konstruktionen der SRM Fragmentbank ausgegangen, von denen unabhängige Mutantenbanken erzeugt werden. Es werden jeweils 96 SRM Mutanten in einem Pool vereinigt. Diese 96 Mutanten eines SRM Pools können auch als einzelne Klone durch Tiefkühlung konserviert werden.

SRM Mutantenbanken werden negativ selektioniert.

Die SRM Mutantenbank von S. typhimurium wird in J774A. 1 Makrophagen oder in BALB/c Mäusen selektioniert (es können auch andere Zelllinien und andere Mausstämme verwendet werden). Dabei wird jeweils 1 Pool (96 Mutanten) selektioniert. Nach der Selektion werden die Bakterien zunächst auf FeMed mit Tet bei 37 °C kultiviert. Durch diesen Schritt vermehren sich nur diejenigen Klone, die genomisch integriertes pSRM Plasmid enthalten.

Wiedergewinnung von SRM Fragmenten aus genomisch integrierten SRM Mutantenbanken.

Die Exzision der integrierten SRM Plasmide aus dem Genom erfolgt durch Inkubation in F) Med mit Tet bei 30°C. Plasmide, die aus einem selektionierten Pool von SRM Mutanten gewonnen wurden, werden als "Driver"bezeichnet. Plasmide, die aus dem identischen aber nicht selektionierten Pool stammen, ergeben den"Tester". Die Plasmid DNA wird

für Tester und Driver durch Plasmidpräparation aus den Bakterien gewonnen.

Einzelne DNA Fragmente, die in pSRM4 kloniert sind, können nach Amplifikation von Tester und Driver Fragmentbanken über PCR durch genetische Subtraktion identifiziert werden.

Die SRM Fragmente der selektionierten Klone aus einem 96er Pool werden für die Tester Gruppe durch PCR mit dem Primerpaar SRMgb2/SRMgb4 amplifiziert. Für die Driver Gruppe werden diese Fragmente mit gleichen Primern amplifiziert, wobei die Primer zur Amplifikation der Driver DNA am 5'-Ende und am 2. Nukleotid nach dem 5'-Ende biotinyliert sind. Die Randsequenzen der Tester-DNA-Fragmente können durch eine anschliessende Restriktion mit Kpnl eliminiert werden, so dass Hybridisierungen über die homologen Primersequenzen ausgeschlossen wird.

Für die Subtraktion werden biotinylierte Driver-DNA und Tester-DNA in Verhältnissen von 10 : 1 bis 1000 : 1 gemischt. Die DNA dieser Ansätze wird präzipitiert, in 10 FI Hybridisierungspuffer (0,05 M HEPES pH7,5, 1mM EDTA, unterschiedliche NaCI Konzentration) gelöst, zunächst für 3 Minuten bei 95°C inkubiert, gefolgtvon einer 18 stündigen Inkubation bei 65°C. Die während dieser Hybridisierung gebildeten biotinylierten Homo-und Heterodimere werden über Streptavidin-gekoppelte magnetische Partiel aus dem Ansatz extrahiert. Um die Effizienz der Extraktion von homologen Driver-DNA-Fragmenten aus der Tester-DNA zu erhöhen (Anreicherung der zu identifizierenden Tester-DNA-Fragmente), wird die Subtraktion zwei bis dreimal wiederholt.

Für die Isolierung und anschliessende Identifizierung der angereicherten Tester-DNA-Fragmente werden diese über die Kpnl-Schnittstelle in den pSRM4-Vektor kloniert.

Identifizierung von SRM Fragmenten durch Southern (Dot) Blot.

Als Alternative zur genetischen Subtraktion kann ein Blotting Verfahren angewendet werden, um SRM Fragmente von essentiellen Genen zu identifizieren. Dazu werden die SRM Fragmente aus jeweils 96 SRM Mutanten mit freien pSRM Plasmiden über PCR (Primer SRMgb2/SRMgb4) amplifiziert und einzeln auf einem Membranfilter fixiert. Als Sonde zur Hybridisierung werden (1) PCR-amplifizierte SRM Fragmente aus dem Driver und (2) PCR-amplifizierte SRM Fragmente aus dem Tester verwendet. DNA Fragmente, die mit der Sonde aus dem Driver, aber nicht mit der Sonde aus dem Tester ein Signal ergeben, sind die gesuchten Fragmente essentieller Gene.

Subtraktive Rekombinations-Mutagenese in Helicobacter Das SRM Verfahren kann in allen Organismen angewendet werden, in denen pSRM4 eine temperatursensitive Replikation zeigt. Darüberhinaus kann das SRM Verfahren für andere Organismen wie z. B. Helicobacter spp., Campylobacter spp., oder andere adaptiert werden, indem SRM Vektoren für diese Organismen konstruiert werden. Um den SRM Vektor z. B. für Helicobacterspp. zu adaptieren wird von einem Plasmid ausgegangen, dass in Helicobacter spp. repliziert, z. B. pHel (Heuermann und Haas, 1995 ; Heuermann und Haas, 1998). Das Plasmid repliziert wie pSRM nach dem "rolling circle"Mechanismus, und die RepA Proteine beider Proteine sind homolog (del Solar, et a/., 1993 ; Kleanthous, et a/., 1991). Von dem Plasmid wird entsprechend dem von Maguin et al. beschriebenen Verfahren (Maguin, et a/., 1992) eine termperatursensitive Variante hergestellt. Dazu wird das Plasmid nach Standardmethoden in vitro mit Hydroxylamin mutagenisiert und bei permissiver Temperatur in H. pylori transformiert.

Alternativ wird nur das repA Gen mutagenisiert und die mutagenisierte DNA anschliessend in ein repA-freies Plasmid kloniert. Durch Replika-Plattierung von H. pylori Klonen, die mutagenisiertes Plasmid bzw. repA enthalten, und Selektion der Klone mittels einer plasmid-kodierten Antibiotikaresistenz werden Varianten des Plasmids bzw. repA Gens identifiziert, die eine

Replikation bei 30°C, aber nicht bei 37°C erlauben. Die Mutation (en), die die Temperatursensitivität vermitten, werden durch Sequenzierung des Plasmids (bzw. des repA Gens) identifiziert. Die Temperatursensitivität des Plasmids wird weiterhin wie oben für pSRM4 beschrieben charakterisiert.

Das Plasmid wird im Folgenden wie pSRM4 als Vektor für die Subtraktive Rekombinationsmutagenese in Helicobacter spp. eingesetzt.

Beispiel 2 Identifizierung essentieller Gene durch Herstellung gendefizienter Mikroorganismen durch konditionale Antisense-Hemmung (CAI) Das CAI Verfahren kann mit verschiedenen Vektoren durchgeführt werden, die in dem zu untersuchenden Organismus replizieren und selektioniert werden können. Beispielhaft ist im Folgenden die Durchführung des Verfahrens in Salmonella typhimurium beschrieben. Als Vektor wird pCAI verwendet. pCAI enthält die Replikations-und Resistenzfunktionen von pWSK29 (Wang und Kushner, 1991), oder von pBluescript, oder von pUC, oder von anderen Plasmide. Der jeweilige Vektor enthält einen regulierbaren CAI Promoter sowie dessen cis-und trans-regulatorische Komponenten. Die Transkription von diesem Promoter wird durch exogene Faktoren (Induktoren) gesteuert. Bei dem regulierten CAI Promoter handelt es sich um den tet Promoter, der durch den tet-Operator und den Tet- Repressor nur in Anwesenheit von Tetrazyklin im Wuchsmedium aktiviert wird (Hillen und Berens, 1994). Alternativ wird der ara Promoter verwendet, der über den ara-Operator und AraC, ein Aktivator Protein gesteuert wird und nur in Anwesenheit von Arabinose im Wuchsmedium aktiviert wird (Guzman, etal, 1995). Grundsätzlich kann auch jeder andere durch exogene Signale regulierbare Promoter, verwendet werden. Stromaufwärts von der regulatorischen Sequenz des CAI Promoters werden mehrere Terminator Strukturen (Wilson und von Hippel, 1995 ; Yarnell and Roberts, 1999) eingefügt, die die transkriptionelle Aktivität von Sequenzen stromaufwärts des Promoters in Abwesenheit des Induktors unterdrücken. Stromabwärts von dem CAI Promoter können ein oder mehrere RNA-

stabilisierende Elemente (RSE) eingefügt werden (Carrier und Keasling, 1 997a ; Carrier und Keasling, 1 997b ; Carrier und Keasling, 1999). Die RSE werden so kloniert, dass sich nach der Insertion von CAI Fragmenten am 5'- und/oder am 3'-Ende der transkribierten RNA Fusionen mit den RSE ergeben. Zwischen dem Promoter und der 5'-RSE Sequenz einerseits und der 3'-RSE Sequenz andererseits werden eine Kpnl und andere Restriktionsschnittstellen (mcs) eingefügt, die später zur Insertion von CAI Fragmenten verwendet werden.

In dem CAI Vektor wird eine Bank mit genomischen Fragmenten des zu untersuchenden Organimus konstruiert. Dazu werden in die mcs genomische DNA Fragmente kloniert, die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen rPCR Verfahren präpariert wurden.

Die so erhaltene CAI Genbank wird in den zu untersuchenden Organismus transformiert und einzelne Klone werden über den Plasmid-kodierten Resistenzmarker selektioniert.

Das CAI Verfahren kann mit verschiedenen Selektions-und/oder Screening Verfahren angewendet werden, die nachfolgend beschrieben sind. Die Funktionalität der einzelnen Screening Verfahren wird jeweils mit einem bestimmten Gen demonstriert. Dazu werden das aroA Gen, das phoP Gen, und das phot Gen aus S. typhimurium verwendet. Zunächst werden Fragmentbanken von (1) dem aroA Gen, (2) dem phoN Gen, und (3) dem phot Gen in pCAI konstruiert. Zur Konstruktion dieser Fragmentbanken werden die genomischen Bereiche dieser Gene einschliesslich benachbarter Sequenzen von ca. 500 bp auf jeder Seite des Gens durch PCR amplifiziert.

Die so erhaltenen PCR Produkte werden als Template für die Erzeugung von rPCR Fragmenten nach dem oben beschriebenen Verfahren verwendet. Die rPCR Fragmente werden ohne Fraktionierung verschieden langer DNA Fragmente oder in verschiedenen Gruppen mit unterschiedlichen Längen (durch Gelelution fraktioniert) in die Kpnl Schnittstelle in der mcs von pCAI

kloniert. Die so erhaltenen Fragmentbanken werden in S. typhimurium transformiert und auf den pCAI-kodierten Resistenzmarker selektioniert. Die drei Banken werden dann auf folgende Art getestet : (1) aroA Fragmentbank-Identifizierung von Klonen durch fehlendes Wachstum auf Nährmedium : Die Klone der aroA Fragmentbank werden auf Platten mit Festmedium (M9 Minimalmedium mit Casaminoacids [CAA, Aminosäure Mischung] ohne Induktor) plattiert. Die Funktion des aroA Gens ist notwendig, damit sich die Bakterien auf M9 ohne CAA vermehren können. Die erhaltenen Kolonien werden durch Repl-ika-Plattierung auf M9 mit CAA und auf M9 ohne CAA, jeweils mit Induktor, übertragen. Klone, bei denen Fragmente der aroA Fragmentbank in antisense Orientierung von dem CAI Promoter transkribiert werden und RNA synthetisieren, die das genomische aroA Gen translationell inhibieren, vermehren sich auf M9 mit CAA mit Induktor aber nicht auf M9 ohne CAA mit Induktor. Klone, die sich auf M9 ohne CAA nicht vermehren, werden isoliert und weiter analysiert.

(2) phoN Fragmentbank-Identifizierung von Klonen durch geänderte biochemische (Farb)-Reaktion auf Festmedium : Die Klone der phoN Fragmentbank werden durch Replika-Plattierung auf M9 Medium mit BCiP und mit Induktor, und auf M9 mit BCiP ohne Induktor übertragen. Durch die Aktivität von PhoN wird BCiP zu einem blauen Farbstoff umgesetzt. Klone, in denen die Translation des phot Gens durch asRNA inhibiert werden, bleiben auf M9 Medium mit BCiP mit Induktor weisslich, während sie sich auf M9 Medium mit BCiP ohne Induktor blau verfärben.

(3) phoP Fragmentbank-Identifizierung von Klonen aus negativ selektionierten Pools : Die Funktion des phoP Gens ist notwendig, damit sich die Bakterien in Makrophagen vermehren können. Die Klone derphoPFragmentbank werden in einem Pool zusammengefasst. Der Pool wird in zwei identische Gruppen geteilt, die in J774A. 1 Makrophagen passagiert werden. Für die eine Gruppe wird während der Infektion Induktor zu dem Kulturmedium der

Makrophagen zugesetzt. Die zweite Gruppe wird in J774A. 1 Makrophagen ohne zugesetzten Induktor passagiert. (Beschreibung des Infektionsexperiments siehe Beispiel 1.) Nach der Infektion (Dauer zwischen 7 und 24 Stunden) werden aus beiden Ansätzen die pCAI Plasmide präpariert. Die CAI Fragmente beider Ansätze werden durch PCR mit Primern, die benachbart zu den klonierten Fragmenten auf dem pCAI Vektor hybridisieren, amplifiziert und anschliessend durch genetische Subtraktion (siehe Beispiel 1) voneinander getrennt. Fragmente, die zur Inaktivierung von phoP führen, werden so isoliert.

(4) Anwendung der Tests 1-3 auf eine genomische Fragmentbank : Das CAI Verfahren wird dann mit einer kompletten genomischen Fragmentbank in S. typhimurium angewendet. Die Klone mit der CAI Fragmentbank werden nach den oben beschriebenen drei Verfahren (1-3) getestet.

Beispiel 3 Anreicherung von H. pylori Genen, kodierend für sekretierte/exkretierte Polypeptide Herstellung einer H. pylori Genbank im Minimalvektor pMin2 : Als Ausgangsstamm dient der H. py/oriWildtyp Stamm 69A. Die Bakterien werden auf Serumplatten (s. Westblom et al., 1991) bei einer Temperatur von 37 °C in einer Atmosphäre von 5% 02,10% CO2,85% N2 angezüchtet.

Die Isolierung der chromosomalen DNS erfolgt nach der Methode von Leying et al. (1992), wobei die DNS abschließend über einen Cäsium-Chlorid- Gradienten aufgereinigt wird. 50, ug der gereinigten, chromosomalen DNS wird mit den Restriktionsendonukleasen Sau3A und Hpall partiell gespalten, die DNS-Fragmente in einem Agarosegel aufgetrennt und die Fragmente in einer Grosse von 3 bis 6 kbp aus dem Gel mit Hilfe des Geneclean II Kits (Bio101) eluiert. Die isolierten DNS-Fragmente werden in den Bglll und Clal geschnittenen pMin2-Vektor (Kahrs et al., 1995) kloniert und über Elektroporation in den E. coli-Stamm E181 transformiert, dem zuvor das

Plasmid pTnMax9 übertragen wurde. Insgesamt werden über einen solchen Ansatz ca. 4000 Klone generiert. Der E. coli-Stamm E181 ist ein Derivat des Stammes HB101 (Boyer und Roulland-Dussoix, 1969) und enthält den lysogenen A-Phagen ACH616 zur Replikation des pTnMax9-Plasmids.

Serumplattenrezeptur 36 g GC-Agar (Basis) in 910 ml Aqua dest. suspendieren und autoklavieren (-) auf ca. 45°C abkühlen lassen (-) Zugabe von 10 ml Vitaminmix (-) Zugabe von jewejts 1 ml der Antibiotikastammlösung (-) Vancomycin (10 mg/I in Aqua bidest) (-) Nystatin (0,793 mg/l in DMF) (-) Trimethoprim (5 mg/l in DMF) Amphotericin (5mg/l in DMF) Dimethylformamid*DMF= (-) Zugabe von 90 ml Serum oder (-) Zugabe von 8 % Pferdeblut = 80 ml (-) oder gleiche Menge Humanblut -Herstellung der Komponenten : -Antibiotika-Stammlösunqen Vancomycin 100 mg in 10 ml Aqua bidest Nystatin 7,93 mg in 10 ml DMF je 1 ml pro Liter GC-Agar Trimethoprim 50 mg in 10 ml DMF zusetzen Amphotericin 50 mg in 10 ml DMF (Lagerung im Küh ! schrank bis max. 8 Wochen) Vitaminmix (Konzentrat) Dextrose (D-Glucose) 100 g L-Glutamin 10 g Cystein HCl (C3H7NO, S x HCl x H20) 26 g

Cocarboxylase 100 mg in 50 ml Fe (NO3)3 20 mg Aqua bidest lösen Thiamin HC1 3 mg DPN NAD 250 mg Vitamin B12 10 mg L-Cystein (C6H12N2O4S2) 1, 1 g Adenin 1,0 g in 15 ml HCl Guanin Cl 30 mg (32% ig) lösen Uracil 500 mg L-Arginin HC1 150 mg (sterilfiltrieren, in 10 ml p-Aminobenzoesäure 13 mg Portionen abfüllen + einfrieren) Genetische Anreicherung sekretierter/exkretierter H. pylori Genprodukte: Das auf pTnMax9 liegende Transposon TnMax9 ist mit dem genetischen Markerß-Lactamase ausgestattet. Dieser Marker ist auf dem Transposon so angelegt, dass damit die Selektion erfolgreicher Transposon-Insertionen ermöglicht wird, wenn dieses im korrekten Leserahmen solcher Gene vorliegt, deren Produkte von E. co/i-Stamm E145rif sekretiert bzw. exportiert werden. Die Insertion des Transposons in ein solches Gen führt zu einer Genfusion zwischen dem Zielgen und dem Marker, wobei durch ein im Zielgen determiniertes Sekretions-und/oder Exportsignal das Fusionsprotein aus der Zelle geschleust wird und die Aktivität des integralen Reportergens entfaltet wird. Im Fall der ß-Lactamase können die Klone direkt über die Entwicklung einer Resistenz gegen Ampicillin nachgewiesen werden. Das TnMax9 Transposon auf pTnMax9 wird über IPTG aktiviert.

Die Transposon-Mutagenese der Genbank wird in Pools von bis zu 20 Einzelklonen durchgeführt. Die jeweiligen Pools werden auf LB-Platten ausplattiert, die mit 100, uM IPTG, 15, ug/ml Chloramphenicol und 15, ug/ml Tetrazyklin versetzt sind. In einem zweiten Schritt werden die TnMax9 mutagenisierten pMin2-Plasmide über Konjugation in den E. coli Stamm E145rif überführt, da diese mit einem entsprechenden mob-Signal (oriT) ausgestattet sind. Die pTnMax9-Plasmide werden dagegen nicht übertragen.

Folglich kommt es in E. coli E145rif zu einer spezifischen Vervielfaltigung der mutagenisierten pMin2 Genbank. Die entsprechenden Transkonjuganten werden auf LB-Medium mit 1 , ug/ml Chloramphenicol, 1, ug/ml Tetrazyklin

and 100, ug/ml Rifampicin selektioniert. Insgesamt werden 500-1000 Transkonjuganten in 2 ml LB-Medium zusammengefasst und in entsprechenden Verdünnungen (10-'-10-2) auf LB-Platten angezüchtet, die mit 50 Ng/ml Ampicillin versetzt sind. Nach einer Kultivierung der Platten über 36 Stunden bei 37°C erhä ! t man im gesamten Ansatz 200-300 Ampicillin-resistente Klone mit Transposon inserierten Plasmide.

Herstellung gendefizienterH. pylori, die in sekretierte/exkretierte Polypeptide kodierende Gene mutiert sind und die Identifizierung solcher Gene mit essentieller biologischer Funktion.

Herstellung gendefizienter H. pilori Mutanten : Durch Einbringung der gewonnenen Plasmide mit den TnMax9-mutierten H. pylori Genen, kodierend für sekretierte/exkretierte Polypeptide in einen H. pylori Wildtyp Stamm können Gen-spezifische Mutanten erzeugt werden.

Bedingt durch die klonierten H. pylori Gensequenzen auf den Plasmiden kommt es im Falle eines doppelten homologen Rekombinationsereignisses zu der genomischen Insertion des TnMax9-Transposons in das chromosomale Zielgen und damit zu dessen Inaktivierung. Durch den genetischen Marker auf dem Transposon kann dieser Vorgang selektioniert werden, da das pMin2 Plasmid in H. pylori nicht repliziert wird.

In der Durchführung wird der H. pylori Wildtyp Stamm 69A in Einzelansätzen mit den gewonnenen individuellen Plasmiden transformiert, wobei die natürliche Kompetenz des Bakteriums, DNS aufzunehmen, ausgenutzt wird (Haas et al., 1993). Ausgehend von einer Vorkultur auf Serumplatten entsprechend den Standard Kultivierungsbedingungen, werden die Bakterien in BHI-Medium aufgenommen und bis zu einer optischen Dichte bei 550 nm von 0,1 bei 37°C unter mikroaerophilen Bedingungen angezüchtet. Die einzelnen Kulturansätze werden jeweils mit 100 bis 500 ng gereinigte Plasmid-DNS versetzt und die Kultur über Nacht fortgesetzt.

Charakterisierung der biologischen Funktion der gendefizienten H. pylori<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Mutanten im Wachstumstest : Die einzelnen Ansätze werden nach der Kultivierung auf Serumplatten ausplattiert, welche mit 4wug/ml Chloramphenicol versetzt sind. Hinsichtlich der Wachstumseigenschaften der einzelnen Mutanten im Vergleich zum Wildtyp Stamm können 3 Kategorien unterschieden werden : (1) Mutanten, die nicht wachsen ; (2) Mutanten, die kleinere Kolonien ausbilden ; (3) Mutanten, die eine normale Koloniegrösse entwickeln. Diese Ergebnisse können für jedes-Ausgangsplasmid reproduzierbar erzielt werden. Zur eindeutigen Beurteilung der biologischen Bedeutung der gendefizienten Mutanten der Kategorie 1 werden diese dem CAI-Verfahren zugeführt. Die gendefizienten Mutanten der Kategorie 2 und 3 werden in den anderen biologischen Testsystemen analysiert.

Beispiel 4 Ermittlung der Identität der H. pylori Gene kodierend für sekretierte/exportierte Polypeptide.

Zur Ermittlung der Primärstruktur der identifizierten H. pylori Gene, werden die jeweiligen Ausgangsplasmide aus dem E. coli Stamm verwendet. Die Plasmide werden aus diesen Stämmen isoliert und die Nukleotidsequenz der Zielgene durch Sequenzierung der Bereiche oberhalb und unterhalb der Insertionsstelle des Transposons im Zielgen bestimmt. Das Leseraster des Zielgens kann direkt ermittelt werden, da das Transposon-kodierte ss- Laktamase Gen eine aktive Fusion mit dem Genprodukt des Zielgens eingeht (s. o.). Die Sequenzierung wird mit Hilfe eines ABI-Sequenz-Automaten nach Angaben des Hersteflers mit folgenden Sequenzprimern durchgeführt : M 13- F (GTAAAACGACGGCCAGT) und M13-RP1 (CAGGAAACAGCTATGACC ). Zur weiteren Charakterisierung der Gene wird die Datenbank Genebank des GCG-Programms herangezogen, z. B. zur Identifizierung bekannter, homologer Gene anderer Mikroorganismen (FASTA), zur Identifizierung

potentieller Signalpeptidbereiche (SPSCAN) oder zur Identifizierung von Lipoproteinen (MOTIFS).

Bei einem Teil der identifizierten Klone konnte nicht die vollständige Gensequenz ermittelt werden, da das klonierte DNS-Fragment nicht das gesamte Gen enthielt. Das verfügbare DNS-Fragment wird dazu eingesetzt, um aus der Original-Genbank ein DNS-Fragment mit vollständigen Gen zu isolieren. Aus diesen Klonen können dann mit einem Gen-spezifischen Primer und einem Vektor-spezifischen Primer die fehlenden Gensequenzen amplifiziert und anschliessend direkt sequenziert werden. Hierzu wird chromosomale D. NS aus dem H. pylori Stamm 69A isoliert, 25-35 Ng davon partiel mit Bsp1431 (Sau3AI-lsoschizomer) verdaut und entstehende Fragmente einer Grosse von 2 bis 8 kbp isoliert. Zur Klonierung wird der Vektor pACYC184 mit BamHl geschnitten, mit Shrimp Alkaline Phosphatase dephosphoryliert und anschließend mit den isolierten Fragmenten ligiert.

Nach Transformation in den E. coli Stamm 0466 und Selektion auf 30, ug/ml Chloramphenicol werden 5560 Einzelkolonien isoliert und mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion analysiert.

Aus den bekannten Genfragmenten werden hierbei möglichst nahe benachbart zum fehlenden Genstück Primer für eine Produktgrösse von kleiner/gleich 700 bp abgeleitet. Mit diesen Primern werden Amplifikationsprodukte hergestellt, welche einen Klon enthalten, der beide Primer-Bindungsstellen umfasst. Aus den positiven Klonen werden anschliessend die Plasmide isoliert, welche entweder durch Sequenzierung oder durch Dot Blot Analyse verifiziert werden.

Sequenzierung Zur Vervollständigung der DNS-Sequenz von Genen, die nach den Sequenzreaktionen mit den Universalprimern M13F und M13RP1 nicht vollständig bestimmt werden kann, wird die Technik des Primer-Walkings verwendet. Dazu wird ein etwa 50 bis 200 bp stromaufwärts des 3'-Endes des bekannten Sequenzabschnitts bindendes Oligonukleotid abgeleitet und als Primer für eine weitere Sequenzreaktion nach dem Dye-Terminator- Prinzip (Amersham Pharmacia Biotech) eingesetzt. Am Beispiel der vollständig bestimmten DNS-Sequenz des Gens hpc052 von H. pylori 69Awird dies durch die Oligonukleotidprimer MuO52a (5'- AGGCTAAAGACGTGTTAG-3') und Mu052b (5'-CTAGCGTGGAATTAGCC- 3') erreicht.

Expressionsklonierung Zur Charakterisierung der Genprodukte der identifizierten Gensequenzen werden die Gensequenzen heterolog in attenuierten Salmonella- Vakzinstämmen exprimiert. Hierzu wird das Polymerase-Promotor-System des Bakteriophagen T7 (Tabor & Richardson 1985) verwendet. Das auszuprägende Gen wird durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit spezifischen Oligonukleotidprimern aus chromosomaler DNS amplifiziert. Die Auswahl der genspezifischen Oligonukleotidprimer erfolgt abhängig von der Präsenz eines Signalpeptids zur Sec-abhängigen Translokation des Genprodukts ins Periplasma. Liegt ein solches vor, wird das Oligonuklotidprimerpaarso gewählt, dass ein Fragmentdes auszuprägenden Gens amplifiziert wird, das für das reife Protein ohne Signalpeptid kodiert.

Liegt keine Signalsequenz vor, wird der gesamte offene Leserahmen amplifiziert.

Die amplifizierten Genfragmente werden in einen von pBR322 abgeleiteten Plasmidvektor inseriert. Die Insertion erfolgt so, dass sich die klonierten Genfragmente jeweils als Fusion mit einem für das Detektionsepitop RGSHis4 kodierenden Sequenzabschnitt unter der transkriptionellen Kontrolle

des Promotors des Bakteriophagen T7 befinden. Die Ausprägung der Genprodukte wird im Salmonella typhimurium Vakzinstamm SL3261 : : pYZ84 (Yan & Meyer 1996) untersucht der mit den auf o. g. Weise hergestellten Expressionsvektoren transformiert wird. Die Detektion der RGSHis4- Fusionsproteine erfolgt durch SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS- PAGE) und anschliessender Western-Blot-Analyse mit einem für das RGSHis4-Epitop spezifischen monoklonalen Antikörper (RGS. His) Beispielhaft wird anhand der Gensequenz HPC001 eine Expressionsklonierung mit anschliessender Western Blot Analyse dargestellt.

Hierfür wird das Genfragment des hpc001 Gens, das für das reife HPC001 Protein kodiert (ohne Signalpeptid) mit Hilfe der Oligonukleotidprimer LAT50 (5'-GATCAGATCTACATATGTTTATCATTCCCTCTCGC-3') und LAT51 (5'- GATCGGTACCAAAACCTTAATGCGTTGCT-3') mittels PCR amplifiziert. Das 0,9 kb grosse Amplifikat wird mittels BgAI und Acc651 hydrolysiert und in den mit BamH und Acc651 hydrolysierten Vektor pLAT289 inseriert. Der resultierende Expressionsvektor pMSC34 kodiert für ein Fusionsprotein, das aus dem hpc001 Gen besteht, dem die Signalsequenz von HPC001 fehlt und dem RGSHis4-Epitop. Das Expressionsprodukt besitzt eine Molekülmasse von 34 kDa.

Beispiel 5 Biologisches Modell"kokkoide Helicobacter" Herstellung kokkoider Formen.

Die experimentelle Überführung der spiralförmigen Helicobacter Form in eine kokkoide Form kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Insbesondere kann die Umwandlung unter Stressbedingungen beobachtet werden, z. B. in Gegenwart subletaler Dosen eines wirksamen Antibiotikums, bei Substratmangel oder in einer Normalluft-Atmosphäre. Der Umwandlungsprozess kann somit als Schutzreaktion der Bakterien verstanden werden. Tatsächlich kann man diese Formen auch im Gewebe

infizierter Menschen beobachten. Möglicherweise handelt es sich hierbei um eine Überdauerungsform. Ein Wegfallen oder die verzögerte bzw. unvollständige Ausprägung dieser Eigenschaft, z. B. durch Wegfallen oder Inaktivierung eines Gens oder Genprodukts kann für das Bakterium im Überlebenskampf fatale Nachteile haben.

Die experimentelle Umwandlung der spiralförmigen Helicobacter in eine kokkoide Form wird in der Regel von einer frischen Plattenkultur gestartet, die unter idealen Bedingungen angezogen wurde (Serumplatten, 37°C, mikroaerophile Atmosphäre (5% 02,10% COZ, 85% N2)) und somit überwiegend spiralförmige Helicobacter enthält. Im nachfolgenden Beispiel werden die abgeernteten Bakterien in ein Minimalmedium überführt, das sich aus Wasser, z. B. sterilisiertem Leitungswasser, und x% (v/v) einer komplexen Protein-Lösung, z. B. foetalem Kälberserum (FCS) zusammensetzt. In Abhängigkeit von der FCS-Konzentration x bilden sich die Bakterien innerhalb weniger Stunden oder in mehreren Tagen vollstandig in kokkoide Formen um. Gängige Konzentrationen sind 10-30% (v/v) FCS in Wasser. In der üblichen Anordnung werden die Bakterien in definierter Anzahl, z. B. bei einer OD550 von 0.2, in 5 ml Minimalmedium bei 37°C in einem Zellkulturschrank kultiviert, wobei der CO2 Anteil in der Luft auf 10% eingestellt wird. Der fortschreitende Entwicklungsprozess wird einerseits mikroskopisch und durch Wachstumsbestimmungen dokumentiert.

Mikroskopisch wird im Phasenkontrast die Morphologie (kokkoid _ spiralförmig) und die Beweglichkeit (kokkoid + unbeweglich ; spiralförmig + beweglich ; spiralförmig + unbeweglich) der Bakterien im Kulturansatz anteilig bestimmt, z. B. in einer Zählkammer. Gegebenenfalls werden spezifische Färbungen durchgeführt um auch strukturelle Änderungen, z. B. in der Bakterienhülle, indirekt zu erfassen bzw. den Anteil toter Keime zu bestimmen. Da kokkoide Formen auf herkömmlichen Medien, z. B. Serum- Platten nicht wachsen, kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Anteil vitaler bzw. noch reaktivierbarer Zustandsformen (colony forming units ; CFU) anteilig ermittelt werden.

Reaktivierung kokkoider Formen.

Die Aktivierung der kokkoiden Bakterien erfolgt in einem Medium, das in EP 0900839 beschrieben ist. Die Bakterien werden in definierter Anzahl, z. B.

500-1000 Bakterien, auf diesem Medium ausplattiert und unter mikroaerophilen Bedingungen bei 37°C für mehrere Tage bebrütet. Auch in diesem Ansatz wird der Entwicklungsprozess mikroskopisch (s. o.) und über die Bestimmung der CFU dokumentiert.

Schließlich können diese Untersuchungen auch im Tiermodell durchgeführt werden. Es ist anzunehmen, dass im Tier andere Reaktivierungs-und Selektionsmechanismen wirken als im oben dargestellten Kultivierungsmodell. Z. B. können andere oder zusätzliche Gene oder Gengruppen am Prozeß beteiligt sein. Die hergestellten kokkoiden Formen werden in definierter Anzahl, z. B. 108 Bakterien, einer Maus, z. B. Balb/c, oral in einer wässrigen Lösung verabreicht, z. B. mit einer Magensonde.

Nach einer bestimmten Zeit, z. B. nach 2-4 Wochen werden die infizierten Tiere getötet, der Magen entnommen, vom Inhalt befreit und histologisch und durch Wachstumstests (s. o.) auf Besiedlung untersucht. In der histologischen Untersuchung kann der Anteil kokkoider und spiralförmiger Bakterien bestimmt werden. Das Experiment sollte bevorzugt mit Helicobacter-Stämmen des Typus I durchgeführt werden, da die Stämme vom Typus II weniger virulent sind.

Identifizierung essentieller Helicobacter Gene.

Die beschriebenen biologischen Systeme (A+B) können z. B. zur Analyse definierter Helicobacter-Mutanten eingesetzt werden, welche über die beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. Die Untersuchung erfolgt jeweils im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp-Stamm. Ist eine Mutante z. B. nicht in der Lage, sich zur kokkoiden Form umzuwandeln oder bleibt eine Reaktivierung der kokkoiden Form aus oder treten die Umwandlungen mit großen zeitlichen Verzögerungen auf, kann für das mutierte Gen eine

fakultativ essentielle Funktion abgeleitet werden. Bei der Reaktivierung kokkoider Formen im Tiermodell können pro Versuchsansatz mehrere Mutanten gleichzeitig eingesetzt werden, z. B. 10 Stämme. Voraussetzung ist, dass die Wiedererkennung dieser Stämme im Gewebe durch geeignete Verfahren sichergestellt ist, z. B. durch entsprechende PCR-Verfahren oder durch in situ Hybridisierung.

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