[0001] 本发明属于生物工程领域和医药技术领域， 具体涉及一种 SISP1基因稳定高表 达细胞系及其在药物筛选中的应用。

背景技术

[0002] SISP1蛋白为 PD-L1蛋白家族的新成员， 是一种新型的且结构不同的 Ig超家族抑 制性配体， 其胞外域具有与 B7家族配体 PD-L1的同源性。

技术问题

[0003] 现有研究发现， SISP1蛋白多种癌症和自身免疫疾病、 过敏、 感染和炎性病症 例如多发性硬化和关节病症的细胞免疫中起重 要作用， 需进行大量转化研究方 可应用于临床， 但现有技术中缺乏促进 SISP1基因表达的细胞系， 对相关研究的 进展造成了一定的阻碍。

问题的解决方案

技术解决方案

[0004] 一种 SISP1基因稳定高表达细胞系的建立方法， 包括以下步骤：

[0005] ①将 SISP1基因的编码序列插入真核表达载体的多克� ��位点， 得到重组表达载 体；

[0006] ②将步骤 1得到的重组表达载体导入宿主细胞中， 筛选得到稳定表达 SISP1基因 的细胞系。

[0007] 本发明所述真核表达载体为 pIRES2-EGFP， 其图谱如图 1所示。

[0008] 本发明所述宿主细胞为 HeLa细胞、 HepG2细胞或 MCF-7细胞。

[0009] 本发明所述的方法， 其中制备的 SISP1基因稳定高表达细胞系。

[0010] 本发明所述的 SISP1基因稳定表达细胞系， 其特征在于， 所述 SISP1基因稳定表 达细胞系为 SISP1基因稳定高表达的 HepG2细胞系。

[0011] 本发明编码 SISP1基因蛋白编码框 cDNA序列， 引物如下：

[0012] SISP1 -sense: 5，- GGAATTCATGGGCGTCCCCACGGCC -3，； [0013] SISPl -antisense: 5'- GCCCGGGCTAGATGACCTCAAAGTTTG -3'。 发明的有益效果

有益效果

[0014] 本发明的 SISPl基因稳定高表达细胞系为深入探索 SISPl基因的作用提供实验技 术平台， 可用于与 SISP1表达异常相关的药物研究和幵发中。

对附图的简要说明

附图说明

[0015] 图 1为 pIRES2-EGFP载体的图谱。

[0016] 图 2为转导 pIRES2-EGFP-SISPl载体的细胞的 SISP1基因表达水平结果示意图。

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0017] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明， 实施例仅为解释性的， 绝不意味 着以任何方式限制本发明的范围。

[0018] 实施例 1重组真核表达载体 pIRES2-EGFP-SISPl的构建

[0019] 根据 SISP1蛋白编码框的 cDNA序列， 设计 PCR引物如下： 正向引物： 5'- GGAATTCATGGGCGTCCCCACGGCC -3'； ； 反向引物： 5'- GCCCGGGCTAGATGACCTCAAAGTTTG -3'。

[0020] 取 Jurkat细胞并提取总 RNA， 逆转录为 cDNA并以其为模板， 利用上述引物进行 PCR扩增。 将 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收， 用限制性内切酶 Ec oR I和 Xma l对纯化回收后的产物进行酶切， 酶切产物再次进行琼脂糖凝胶电泳 纯化和回收， 得到 SISP1蛋白编码框的 cDNA序列。 同吋， 将真核表达载体 pIRES 2-EGFP也用 EcoR I和 Xma I进行双酶切， 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回 收。 用 DNA连接酶连接上述扩增得到的 SISP1蛋白编码框的 cDNA序列和真核表 达载体 PIRES2-EGFP酶切后的产物， 连接产物转化感受态大肠杆菌 JM107 , 并涂 布于含有卡那霉素的 LB平板上， 培养后送上海生工测序。 测序结果表明， 插入 的 SISP1蛋白编码框的 cDNA序列与 GenBank上记录的序列完全一致。 将得到的重 组表达载体命名为 pIRES2-EGFP-SISPl。 [0021] 实施例二 SISP1基因稳定高表达 HepG2细胞系的建立

[0022] 将上述步骤一得到的重组大肠杆菌利用 Wizard Plus SV Miniprep (购自 Promega ) 提取质粒， 得到高纯度的重组表达载体 pIRES2-EGFP-SISPl， 将重组表达载体 pIRES2-EGFP-SISPl利用 Lipofectamine2000 (购自 Invitrogen) 转染 HepG2细胞， 继续培养转染后的 HepG2细胞 24小吋以上。 用新霉素 （浓度为 1

g/ml)对重组 HepG2细胞进行筛选， 经多次筛选后， 得到 SISP1基因稳定高表达 细胞系。 将 SISP1基因稳定高表达的 HepG2细胞株保存于液氮中。

[0023] 实施例三 荧光定量 PCR检测 SISP1基因表达量

[0024] 分别接种 HepG2细胞和转导 pIRES2-EGFP-SISPl载体的 HepG2细胞至 6孔板。 细 胞密度达到 δΟ^^Ο^吋， 用 RNeasy Mini

Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScrip RT reagent

Kit将 mRNA逆转录为 cDNA， -20°C保存。 取各组细胞的 cDNA 1

μΐ为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR检测 SISP1相对表达量， 设置反 应条件： 95。C 30s， 1循环， 54°C 30s 40循环， 95。C 5s， 60°C lmin, 95。C 15s， 结 果如图 2所示。 可以看到， 转导 pIRES2-EGFP-SISPl载体的 HepG2细胞的 SISP1基 因表达量较 Jurkat细胞有 150倍以上的升高， 说明本发明提供的 SISP1基因 cDNA 序列成功插入至 PIRES2-EGFP表达载体中， 能特异、 持续、 高效、 稳定地促进 SI SP1基因高表达。

工业实用性

[0025] 本发明的 SISP1基因稳定高表达细胞系为深入探索 SISP1基因的作用提供实验技 术平台， 可用于与 SISP1表达异常相关的药物研究和幵发中。