[0001] 本发明涉及一种 Tud RNA, 特别涉及一种共敲减三种 miRNA表达的 Tud RNA及 其应用。

背景技术

[0002] MicroRNA (miRNA) 是在真核生物中发现的一类内源性的非编码 RNA， 大小 一般在 22-25 nt之间， miRNA广泛分布于植物、 动物和多细胞生物中， 并且能发 挥重要的调节作用， 而在人类 miRNA的研究中， 发现 miRNA在正常组织和肿瘤 组织中的表达有着显著差异， 有些 miRNA会在肿瘤组织中有低表达， 有些则在 肿瘤组织中有高表达， 这说明 miRNA在肿瘤发生过程中起了至关重要的作用。

[0003] miR-152是一种具有多功能的 miRNA, 研究发现 miR- 152与甲基化相关， 如与 甲基转移酶 DNMT1含量和酶活性相关， miR-152可被子宫内膜癌 DNA甲基化变 为沉默基因， 并且其与多种癌症的发生发展相关， 它是一种肿瘤抑制 microRNA ， 与子痫前期、 滋养细胞肿瘤、 膀胱癌、 胃肠癌、 卵巢癌等诸多疾病相关； miR -185是一个长度为 22nt的 miRNA, 定位于人染色体 22ql l.21， 在结肠癌、 胃癌、 食管癌、 肺癌、 肝癌等肿瘤的发生和侵袭等方面作为一个抑癌 基因发挥重要作 用， 另外它一种甲基化相关的抑瘤性 miRNA, 可通过直接靶向 DNMT1的表达而 影响全基因组的甲基化水平， 进而调控某些基因的甲基化修饰状态， 影响基因 表达； miR-424是近年来发现的一个 miRNA, 其在多种肿瘤中通过作用于靶基因 ， 参与靶基因调控的信号通路， 从而影响肿瘤细胞生物学效应和发生发展， 发 挥类似于癌基因、 抑癌基因的作用， 或促进、 抑制肿瘤的侵袭转移。 有研究表 明 miR-424是多功能 miRNA, 它与宫颈癌， 胰腺癌等细胞侵袭转移相关； 与炎性 因子如 IL-6、 TNF-α的表达相关； 由于 miR-424启动子区域具有 CpG岛， 它与甲 基化诱导的基因沉默也相关。 通过控制 miR-152、 miR-185和 miR-424的表达， 同 吋与其他药物协同作用， 能为治疗癌症提供新的表观遗传思路。

技术问题 [0004] MiRNA的功能研究主要通过 miRNA干扰和过表达技术完成。 现有 miRNA干扰 技术中， anti-miR和 antagomiR为瞬吋转染技术， 其干扰效果不能稳定保持， 而 m iRNA sponge效果远未达到最优， 现有技术缺乏一种干扰效果好且能实现长期稳 定干扰的技术。

[0005] Tough Decoy RNA (Tud RNA) 是一种新幵发出的 miRNA抑制手段， 其通过引 入双链 RNA对目标 miRNA进行吸附， 达到抑制 miRNA的目的。 由于弓 |入的 RNA 为双链并且带有茎环的二级结构， 因此其够抵抗胞内核酸酶的降解， 能长期、 稳定和高效地抑制 miRNA。

问题的解决方案

技术解决方案

[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与 不足， 提供一种共敲减三种 miR NA表达的 Tud RNA。

[0007] 本发明的另一目的在于提供上述共敲减三种 miRNA表达的 Tud RNA的应用。

[0008] 本发明的再一目的在于提供一种含有上述 Tud RNA的重组载体。

[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0010] 一种共敲减三种 miRNA表达的 Tud RNA, 编码所述的抑制人 miR-152、 miR- 185 和 miR-424表达的 Tud RNA的 DNA序列如下所示：

[0011] 5'- ggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatc tgtcttgaacccaatccccgaccg aaatctaggagaccagcaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgc gacgatacaaagtcacgtactatc tgtcttgaacccaatccccgaccgaaatctaggagaccagcaagatgatcctagcgccac cttttt -3，。

[0012] 所述的共敲减三种 miRNA表达的 Tud RNA的应用， 该应用包括将所述的 Tud

RNA构建于慢病毒载体上， 得到含有所述 Tud RNA的重组载体； 将含有所述 Tud RNA的重组载体作用于 16HBE细胞， 达到抑制 miR-152、 miR- 185和 miR-424表达 的目的；

[0013] 所述慢病毒载体为 pGLV3/Hl/GFP+Puro (pGLV3) 慢病毒穿梭载体；

[0014] 所述的含有所述 Tud RNA的重组载体的制备方法， 包含以下步骤：

[0015] ( 1) 设计含有抑制人 miR-152、 miR- 185和 miR-424表达的 Tud RNA的 DNA序 歹 |J， 如下所示：

[0016] 5'- ggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatc tgtcttgaacccaatccccgaccg aaatctaggagaccagcaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgc gacgatacaaagtcacgtactatc tgtcttgaacccaatccccgaccgaaatctaggagaccagcaagatgatcctagcgccac cttttt -3'；

[0017] 为将其克隆到 pGLV3慢病毒穿梭载体上， 合成以下正义链 （F) 及反义链 （R ) DNA序歹 'J :

[0018] Tud- 152- 185-424正义链：

[0019] 5'-

GATCCggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcac gtactatctgtcttgaacccaatc cccgaccgaaatctaggagaccagcaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcact catctcgcgacgatacaaagtca cgtactatctgtcttgaacccaatccccgaccgaaatctaggagaccagcaagatgatcc tagcgccacctttttG -3 '；

[0020] Tud- 152- 185-424反义链：

[0021] 5，-

AATTCaaaaaggtggcgctaggatcatcttgctggtctcctagatttcggtcgggga ttgggttcaagacagatagtacgt gactttgtatcgtcgcgagatgagtgcaaaacgttgtattctgtgaccagaatacttgct ggtctcctagatttcggtcggggatt gggttcaagacagatagtacgtgactttgtatcgtcgcgagatgagtgcaaaacgttgat gatcctagcgccG -3，。

[0022] 上述正义链模板的 5'端添加了 GATCC , 与 BamHI酶切后形成的粘端互补； 反义 链模板的 5'端添加了 AATTC, 与 EcoRI酶切后形成的粘端互补；

[0023] (2) 将等量的正义链和反义链 DNA混合， 进行退火， 以形成 DNA双链， 得到 Tud RNA模板；

[0024] (3) 将 pGLV3载体用 BamHI和 EcoRI双酶切， 得到线性化的 pGLV3载体；

[0025] (4) 将步骤 (2)中的 Tud RNA模版和步骤 (3)中线性化的 pGLV3载体进行连接， 得到重组载体 pGLV3-Tud- 152- 185-424；

[0026] (5) 将重组载体 pGLV3-Tud-152-185-424与包装载体 pGag/Pol、 pRev、 pVSV-

G共转染至 293T细胞， 收集培养上清获得含有目的 Tud RNA的病毒颗粒， 可用于 转染目的细胞。

发明的有益效果 有益效果

[0027] 本发明所述抑制人 miR-152、 miR-185和 miR-424表达的 Tud RNA

能共敲减三种 miRNA的表达。 将所述抑制人 miR-152、 miR-185和 miR-424表达的

Tud RNA构建于慢病毒载体上， 不仅可有效作用于分裂及非分裂状态的细胞， 也适用于体内及体外研究。

对附图的简要说明

附图说明

[0028] 图 1为 pGLV3载体的结构图； 图 2各组细胞的 miRNA表达水平， 其中， a.

miR-152的表达情况， b. miR-185的表达情况， c. miR-424的表达情况。

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0029] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细 的描述， 但本发明的实施方式不 限于此。

[0030] 实施例一共敲减三种 miRNA表达的 Tud RNA的设计与合成

[0031] 根据 TuD RNA设计序列和 miRBase中提供的 miR-152、 miR-185和 miR-424的序 列信息， 设计出同吋针对 miR-152、 miR-185和 miR-424的 TuD RNA寡核苷酸序列

， 其序列为 5'- ggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatc tgtcttgaacccaatccccgaccg aaatctaggagaccagcaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgc gacgatacaaagtcacgtactatc tgtcttgaacccaatccccgaccgaaatctaggagaccagcaagatgatcctagcgccac cttttt -3，。 委托上海生 工合成。

[0032] 为将其克隆到 pGLV3慢病毒穿梭载体上， 设计以下正义链 （F) 及反义链 （R

) DNA序歹 'J :

[0033] Tud- 152- 185-424正义链：

[0034] 5'-

GATCCggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcac gtactatctgtcttgaacccaatc cccgaccgaaatctaggagaccagcaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcact catctcgcgacgatacaaagtca cgtactatctgtcttgaacccaatccccgaccgaaatctaggagaccagcaagatgatcc tagcgccacctttttG -3 '； [0035] Tud- 152- 185-424反义链：

[0036] 5'-

AATTCaaaaaggtggcgctaggatcatcttgctggtctcctagatttcggtcgggga ttgggttcaagacagatagtacgt gactttgtatcgtcgcgagatgagtgcaaaacgttgtattctgtgaccagaatacttgct ggtctcctagatttcggtcggggatt gggttcaagacagatagtacgtgactttgtatcgtcgcgagatgagtgcaaaacgttgat gatcctagcgccG -3，。

[0037] 上述正义链模板的 5'端添加了 GATCC , 与 BamHI酶切后形成的粘端互补； 反义 链模板的 5'端添加了 AATTC, 与 EcoRI酶切后形成的粘端互补。

[0038] (2) 将等量的正义链 （10 μΜ， 5 μΐ) 和反义链 （10 μΜ， 5 μΐ) DNA混合， 加 入 90 μ1 (1(1Η2Ο， 在 PCR仪上按照如下程序进行退火处理： 95°C 5 min， 然后以每 秒下降 O.rC的速率降至 25°C进行退火， 最后 4°C保存备用。 将退火后所得 Tud RNA模板溶液稀释 5倍， 使其终浓度为 200 nM， 用于连接反应。

[0039] (3) 将 pGLV3载体（吉玛基因股份有限公司）用 BamH I和 EcoR I双酶切， 进 行载体的线性化处理， 酶切条件如下所述： 将 pGLV3载体（10μ 、 BamH I内 切酶（5 L， Fermentas)、 EcoR I内切酶（5 L， Fermentas)、 FastDigest buffer(8(VL ， TOYOBO)混匀， 置于 37°C反应 1小吋， 用凝胶回试剂盒（Axygen)回收线性 载体片段， 将其浓度稀释至 50ng^L。

[0040] (4) 将线性化的 pGLV3载体 1 μ1、 经退火处理的 Tud RNA模版 1μ1、 Τ4 DNA 连接酶 （NEB) 、 1μ1、 10xT4连接缓冲液 （NEB) 2μ1、 去离子水 15 μΓ混匀， 于 4°C连接过夜。 取连接产物 5 μ1转化大肠杆菌 ToplO感受态细胞， 在含有 10(Vg/ml氨苄青霉素的 LB平板上于 30°C培养过夜。 挑选长出的单克隆在含有 100 μ _§ /ηι1氨苄青霉素的 LB液体培养基中于 30°C培养过夜， 用质粒抽提试剂盒 (Omega

bio-tek) 纯化质粒， 经测序验证后大量制备重组质粒 pGLV3-Tud-152-185-424。

[0041] (5) 将重组载体 pGLV3-Tud-152-185-424与包装载体 pGag/Pol、 pRev、 pVSV-

G共转染至 293T细胞， 收集培养上清获得含有目的 Tud RNA的病毒颗粒， 可用于 转染目的细胞。

[0042] 实施例二慢病毒转导 16HBE细胞

[0043] 接种 16HBE细胞于 6孔板中， 每孔 1000000个细胞， 12h后细胞密度约为 50% ， 分别取病毒液， 用 DMEM完全培养基 10倍稀释病毒， 再加入聚凝胺

(polybrene)至终浓度为 8 g/mL。 去除 6孔板中的培养基， 加入含病毒的 DMEM 完全培养基（含 10%胎牛血清)， 24h后弃去含病毒的 DMEM完全培养基， 更换新 鲜的 DMEM完全培养基， 24h后用 0.5 g/ml浓度的嘌呤霉素筛选细胞。 筛选 10d, 每隔 3d更换培养基一次， 并不断的增加嘌呤霉素的浓度至 1.0 g/ml。 筛 选获得的细胞株命名为 TuD-152-185-424细胞株。

[0044] 实施例三荧光定量 PCR检测 miRNA的表达水平变化

[0045] 分别接种正常 16HBE细胞、 TuD-152-185-424细胞至 6孔板 （每孔约 300000个） ， 培养细胞约 24 h后至融合度 80%。 用 miRcute miRNA提取分离试剂盒提取这些 细胞的 miRNA, 然后用 S-Poly(T) hsa-miR-152 qPCR-assay primer set、 S-Poly(T) hsa-miR-185 qPCR-assay primer set和 S-Poly(T) hsa-miR-424 qPCR-assay primer set 试剂盒对 miRNA进行逆转录和加尾， 得到相应的 cDNA。 取 2种细胞的 cDNA各 2 为模板， 荧光定量 PCR检测 miR-152、 miR-185和 miR-424表达水平的变化， 实 验重复 3次， 每孔设置 3个平行样，以 snord 44作为内参。 结果如图 2所示， 可以看 到与 TuD-152-185-424细胞的 miR-152的表达水平比 16HBE细胞低 58<¾， miR-185 的表达水平比 16HBE细胞低 49%， miR-424的表达水平比 16HBE细胞低 68%。 差 异有统计学意义 （ρ<0.01) ， 说明 TuD-152-185-424细胞株构建成功。

工业实用性

[0046] 本发明所述抑制人 miR-152、 miR-185和 miR-424表达的 Tud RNA

能共敲减三种 miRNA的表达。 将所述抑制人 miR-152、 miR-185和 miR-424表达的

Tud RNA构建于慢病毒载体上， 不仅可有效作用于分裂及非分裂状态的细胞， 也适用于体内及体外研究。