Campo de invención La presente invención incluye la identificación de una proteína con actividad CPC-acetilhidrolasa (CPC-AH) secre- tada por el hongo Acremonium chrysogenum, la purificación de dicha proteína, la clonación del gen que codifica para dicha enzima y la inactivación de este gen por métodos genéticos. Asimismo propone la utilización de la enzima para la preparación de derivados desacetilados de cefalos- porina C y ácido 7-aminocefalosporánico (7-ACA), tales como desacetilcefalosporina C (DAC) y desacetil 7-ACA. Estos compuestos son útiles como material de partida para la sin- tesis de algunos derivados de cefalosporina de interés co- mercial.

En fermentaciones industriales de A. chrysogenum para la producción de cefalosporina se aprecia la acumulación de DAC en los caldos de cultivo. Dicha acumulación se debe por un lado, a la insuficiente acetilación de la DAC y por otro a la desacetilación química y enzimática de la CPC formada.

La inactivación mediante el uso de técnicas de ADN recom- binante del gen cahB, el cual codifica para la enzima CPC- AH B, evita en parte la acumulación de DAC durante la fer- mentación.

Estado de la técnica La producción de desacetilcefalosporina C (en lo suce- sivo referido como DAC) a partir de cefalosporina C (en lo

sucesivo referido como CPC) se realiza por eliminación de resto acetilo en el carbono 3'de la molécula de CPC. Esta conversión se puede llevar a cabo por métodos químicos o enzimáticos. Estos últimos presentan como ventajas que pueden realizarse en condiciones menos drásticas de pH y temperatura y además que producen menos reacciones latera- les. Es conocido el uso de enzimas con actividad cefalospo- rina C-acetilhidrolasa (en lo sucesivo referida como CPC- AH) procedentes de distintas fuentes tales como pieles de cítricos (Jeffery et al., 1961, Biochem. J. 81 : 591-596), actinomicetos (Demain et al., 1963, J. Bacteriol. 35 : 339- 344), Bacillus subtils (Abbott y Fukuda, 1975, Appl.

Microbiol. 30 : 413-419; Takimoto et al., 1994, J. Ferment.

Bioeng. 77 : 17-22), Rodosporidium toruloides (Politino et al., 1997, Appl. Env. Microbiol. 63 : 4807-4811) y Thermo- anaerobium sp. (Lorenz y Wiegel, 1997, J. Bacteriol. 179 : 5436-5441).

Por otro lado, se han detectado cantidades apreciables de DAC tanto en extractos intracelulares como en fluidos extracelulares de A. chrysogenum, el hongo utilizado para la producción industrial de CPC. La presencia de dicho pre- cursor de CPC es indeseable porque reduce los rendimientos finales de CPC y dificulta su purificación. Se han postula- do varias hipótesis no excluyentes para explicar el origen de este compuesto en los caldos de cultivo : (I) Parte de la DAC acumulada puede proceder de la falta de acetilación del intermediario biosintético, pues es conocido el bajo nivel de expresión del gen cefG que codifica para la DAC-acetil- transferasa (Velasco et al., 1994, J. Bacteriol. 176 : 985- 991). (II) La DAC puede originarse por hidrólisis química de CPC siendo más ostensible a pH alcalino (Konecny et al, 1972, J. Antibiot. 26 : 135-141). (III) La DAC puede sinteti- zarse mediante hidrólisis enzimática, habiéndose descrito actividades CPC-AH extracelulares en caldos de fermentación de A. chrysogenum. Fujisawa et al., (1975, Agric. Biol.

Chem. 39 : 1303-1309) describieron un mutante con actividad CPC-AH. Poco tiempo después, Hinnen y Nüesch (1976, Anti- microb. Agents Chemother. 9 : 824-830) purificaron una CPC- AH extracelular con poca afinidad frente a CPC (kM 20 mM) y cuya síntesis está regulada por la fuente de carbono. La CPC-AH purificada mostraba un peso molecular de aproximada- mente 25 kDa y un punto isoeléctrico de 4,3. La enzima era fuertemente inhibida por diisopropilfluorofosfato. Sin em- bargo, tras estos estudios preliminares no se han descrito posteriormente datos más detallados respecto a dichas acti- vidades ni la clonación, caracterización, y utilización del gen correspondiente.

Descripción detallada de la invención Para la detección de la actividad CPC-AH se realizó una fermentación del hongo filamentoso A. chrysogenum C10 (ATCC 48272) en medio definido y se tomaron muestras del caldo de cultivo cada 24 horas. En estas muestras se deter- minó, por un lado, la actividad CPC-AH mediante un ensayo por HPLC y por otro la presencia de actividades acetil- hidrolasas inespecíficas.

La desacetilación enzimática (actividad CPC-AH) se de- tectó mezclando una solución de CPC (20 mM) con 75 (J. 1 de caldo de cultivo. La formación de DAC tras una hora de incubación a 37°C se analizó por HPLC. La actividad aparece en los caldos de cultivo a partir de 96 horas y aumenta progresivamente hasta alcanzar el máximo a las 168 horas de fermentación.

Para esclarecer si la actividad CPC-AH detectada se debe a una o más enzimas, las proteínas presentes en los caldos de fermentación se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida desarrollados en condiciones nativas. Una vez separadas, las enzimas con actividad acetilhidrolasa se detectaron incubando los geles en una

solución que contenía-Naf-l acetato y Fast Blue RR. Tras 10 minutos de agitación aparecieron en el gel bandas de color rojizo correspondientes a la coprecipitación del naftol y el Fast Blue en las zonas donde se sitúan las acetilhidrolasas. De este modo se comprobó que a las 168 horas (momento de máxima actividad CPC-AH) aparecían en los geles de poliacrilamida al menos dos enzimas con actividad acetilhidrolasa, las cuales se denominaron se denominaron CPC-AH A y CPC-AH B. Con el fin de comprobar si ambas enzimas actuaban frente a CPC, se extrajeron de los geles y se confirmó su actividad por HPLC.

La acetilhidrolasa que mostraba una mayor movilidad electroforética (CPC-AH B) se purificó a partir de caldos de cultivo recogidos a las 168 horas de fermentación me- diante precipitación fraccionada con sulfato amónico, cro- matografía de filtración en gel, cromatografía de intercam- bio aniónico y de nuevo cromatografía de filtración en gel esta vez a presión media. Se realizaron estudios cinéticos de la enzima purificada tales como constante de afinidad frente a CPC, velocidad máxima, temperatura y pH óptimos, efecto sobre la actividad de diversos metales e inhibidores y determinación del peso molecular y punto isoeléctrico.

Una fracción de la proteína purificada se utilizó para obtener la secuencia de aminoácidos de su extremo amino terminal. El análisis de dicha secuencia mostró su homolo- gía con la proteasa T del hongo Tritirachium album. En fun- ción de la secuencia de aminoácidos y en base al patrón de utilización de codones de genes de A. chrysogenum, se elaboró un oligonucleótido sintético (SEQ ID NO : 2) que hipotéticamente hibridaría con el extremo 5'del gen.

Asimismo, se sintetizó un segundo oligonucleótido (SEQ ID NO : 3), deducido por comparación con zonas totalmente con- servadas de proteasas similares a la proteasa T de T. album.

A continuación, se abordó la clonación del gen corres- pondiente a la proteína CPC-AH B mediante hibridación con una librería genética de cepa A. chrysogenum C10 realizada en el vector de sustitución EMBL3-ble.

Los experimentos de hibridación anteriormente men- cionados fueron realizados con dos sondas de distinta pro- cedencia : Sonda 1.-Fragmento de 1.020 pb EcoRI-DraI corres- pondiente al gen que codifica para la proteasa T de T. album.

Sonda 2.-Fragmento de 700 pb obtenido por PCR, utili- zando como cebadores los oligonucleótidos descritos en SEQ ID NO : 2 y SEQ ID NO : 3 y como molde ADN total de A. chrysogenum C10.

Como resultado se purificó un fago positivo que fue estudiado en detalle. Finalmente se aisló un fragmento de ADN SmaI de aproximadamente 1,6 kb que presumiblemente incluía el gen cahB. Seguidamente, se secuenciaron un total de 1.621 pb que incluían un marco de lectura de 1.295 pb interrumpida por dos intrones de 68 y 78 pb, que codificaba para una proteína de 383 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos encontrada en la proteína madura se corresponde con la de los aminoácidos 107 a 127 de la proteína deducida del gen. Este hecho indica la formación de una preproteína que será finalmente procesada en la posición Gln106 para formar la proteína madura.

Una serie de búsquedas realizadas utilizando las bases de datos se secuencias de proteínas (por ejemplo SwissProt) y en la traducción conceptual de bases de datos de secuencias de ADN (por ejemplo GenBank y EMBL) en los seis posibles marcos de lectura, revelaron similitudes significativas de la secuencia de aminoácidos con varias proteasas, especialmente con las de la familia de la subtilasa. Adicionalmente, la CPC-AH B posee secuencias conservadas alrededor de los residuos de histidina (His176) y

serina (Ser'jl) tipicos ae las proteasas de serina de la familia de la subtilasa. Por tanto, la enzima está fuertemente relacionada con proteasas alcalinas fúngicas. De hecho, la CPC-AH B purificada muestra actividad proteolítica.

TABLA 1 1. CPC-AH B A. chrysogenum 2. PROTT-TRI 64,5 % 3. PROTK-TRI 49,5 0 54, 6 0 4. PROTR-TRI 48,4 % 52,2 % 85,2 % 1. 2. 3. CPC-AH B PROTT-TRI PROTK-TRI A. chrysogenum Comparación de la proteína CPC-AH B (1) con otras proteínas recogidas en la base de datos SwissProt : (2) PROTT-TRI : Preproteasa T de Tritirachium album (Samal et al. 1989, Gene. 85 : 329-333). (3) PROTK-TRI : Preendoproteasa K de Tritirachium album (Paehler et al. 1984, EMBO J. 3 : 1311- 1314); (4) PROTR-TRI : Preproteasa R de Tritirachium album (Samal et al. 1990, Mol. Microbiol. 4 : 1789-1792).

Porcentaje de identidad entre las cuatro secuencias analizadas.

Varios grupos de acetilhidrolasas (esterasas) y lipa- sas muestran un alto grado de conservación en la secuencia y estructura tridimensional del centro activo con proteasas y p-lactamasas (Cygler et al., 1993, Protein Science 2 : 366-382). Algunos autores han propuesto que varios grupos de enzimas con serina en su centro activo, entre los que se incluyen esterasas, lipasas, proteasas, P-lactamasas y pro-

teínas que se unen a penicilina (PBPs) derivan de un gen ancestral común (Brenner, 1988, Nature 334 : 528-530). Aun- que estas enzimas reconocen diferentes sustratos, se han encontrado importantes homclogías en la secuencia entre miembros de cada grupo.

Los genes implicados en la biosíntesis de cefalos- porina están agrupados en el genoma de A. chrysogenum en dos conjuntos o"clusters". Con la finalidad de determinar si el gen cahB se localiza en alguna de estas agrupaciones, se separaron mediante la técnica de CHEF los cromosomas que constituyen el genoma de A. chrysogenum, se transfirieron a filtros y se hibridaron con el fragmento de 1.020 pb EcoRI- DraI anteriormente mencionado. De esta forma se determinó que el gen cahB se localiza en el cromosoma de mayor tamaño (VIII), mientras que el agrupamiento de genes tempranos (pcbAB-pcbC) se encuentra en el cromosoma VII y el de genes tardíos (cefEF-cefG) en el cromosoma I sugiriendo que el origen del gen cahB no está relacionado con el de los genes de biosíntesis de cefalosporina.

Para la obtención de la proteína CPC-AH B en gran cantidad se planteó la expresión del gen cahB en Escherichia coli. Dado que el gen cahB presenta dos intrones se hacía necesaria la clonación del gen a partir de una genoteca de ADNc. Con este fin, se construyó una genoteca de ADNc a partir de ARNm de la cepa A. chrysogenum C10. Esta genoteca se rastreó con la sonda de 700 pb anteriormente mencionada interna al gen cahB, lo cual permitió la purificación y caracterización del ADN de una serie de fagos positivos.

Utilizando el gen en forma de ADNc, se realizaron dos construcciones : una para la expresión de la proteína completa incluyendo el péptido líder (pT7B2.1) y otra para la formación de la proteína madura (pT7B2.2) en E. coli JM109 (DE3). La producción de estas proteínas heterólogas en E. coli se analizó mediante electroforesis desnaturalizante

en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). La cepa E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.1 sintetiza una proteína adicional de 42 kDa mientras que E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.2 muestra una proteína de 31 kDa. Los transformantes de E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.2 mostraron una débil actividad CPC-AH, mientras que en los de E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.1 no se detectó esta actividad enzimática.

La CPC-AH B obtenida de E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.2 se utilizó en reacciones de desacetilación de CPC, demos- trándose su utilidad en este tipo de procesos. La cepa parental de este clon, E. coli DH5a/PJEllB se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia) con el n° 5067.

Por otro lado, la acumulación de DAC en los caldos de cultivo de A. chrysogenum supone un detrimento en el ni- vel de producción de CPC. Una fracción de esta DAC acumu- lada se debe a la desacetilación enzimática de la CPC por enzimas CPC-AH extracelulares. La inactivación, mediante el uso de técnicas de ADN recombinante, de los genes que codi- fican para estas enzimas podría evitar la desacetilación enzimática de CPC durante la fermentación con el consi- guiente aumento en los rendimientos obtenidos.

Con el fin de inactivar el gen que codifica para la CPC-AH B se empleó la técnica de disrupción génica por integración simple. En este proceso se busca generar dos copias del gen mutadas, lo que se logra cuando se produce la recombinación entre un fragmento interno del gen objetivo localizado en un plásmido, y el gen endógeno. Para favorecer la recombinación homologa, se empleó para la construcción del plásmido un fragmento de ADN genómico de tamaño superior al gen cahB (7 kb).

Para que se generen las dos copias del gen objetivo mutado, es necesario introducir dos mutaciones en el gen localizado en el plásmido y además es necesario que la

recombinación tenga lugar entre estos dos puntos. Para ello se generaron dos mutaciones en el extremo 5'del gen, se eliminó un corte de restricción BamHI, se eliminó un corte KpnI y en el extremo 3'del gen se introdujo una mutación en el corte StyI. El fragmento de 7 kb con las mutaciones se introdujo en el plásmido pJL43 dando lugar al plásmido pB*2. Para favorecer la recombinación, se digirió con ClaI, sitio de restricción localizado entre las dos mutaciones introducidas en el gen.

El plásmido pB*2 se transformó en A. chrysogenum C10 y los transformantes fueron seleccionados en medio TSA suplementado con sacarosa (10,3%) y fleomicina (40 pg/ml).

Los transformantes obtenidos se fermentaron en MDFA, reco- giéndose muestras del caldo de cultivo cada 24 horas. La presencia de actividades acetilhidrolasas en las muestras tomadas a las 168 horas se analiz6 mediante geles nativos de poliacrilamida. Al menos 3 de los 10 transformantes ana- lizados carecían de la actividad CPC-AH B.

Para comprobar si la ausencia de la actividad CPC-AH B en uno de los transformantes seleccionados (C3A) ocurre a lo largo de toda la fermentación, se analizaron los sobre- nadantes recogidos cada 24 horas tanto de este trans- formante como de la cepa parental A. chrysogenum C10. La banda de actividad CPC-AH B no apareció en ninguna de las muestras analizadas, mientras que el patrón electroforético del resto de acetilhidrolasas se mantuvo similar al de la cepa control C10.

La ausencia de la actividad CPC-AH B en el transfor- mante C3A se manifiesta en un cambio en la proporción de DAC y CPC en los caldos de cultivo recogidos a las 168 ho- ras. Mediante análisis de dichos caldos por HPLC se observa que la concentraci6n de CPC es mayor en el transformante con el gen cahB inactivado que en la cepa C10 sin transformar, mientras que la concentración de DAC desciende de forma apreciable en el transformante. Esta cepa trans-

formada de A. chrysogenum se depositó en la Colección Espa- ñola de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edi- ficio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia) con el n° 20305.

Ejemplo 1 1.1. Purificación de la enzima CPC-AH B.

1.1.1. Determinación de actividades CPC-AH en sobrena- dantes de cultivo de Acremonium chrysogenum C10.

Para la fermentación de A. chrysogenum C10 se sembraron placas de medio sólido LPE (Le Page y Campbell, 1946, J.

Biol. Chem. 162 : 163-171) y se incubaron durante 7 días a 28°C hasta obtener un cultivo esporulado en césped. La fer- mentación en medio líquido se inicia inoculando las esporas procedentes de tres placas en un matraz indentado de 500 ml que contiene 100 ml de medio definido de inoculo. Este ma- traz se incuba durante 48 horas a 25°C y 250 rpm para obte- ner un micelio vegetativo abundante. La fermentación en con- diciones de producción de antibióticos se inicia al inocular 5 ml del cultivo vegetativo anterior en otro matraz indenta- do de 500 ml con 100 ml de medio definido de fermentación.

Este cultivo se incubó durante 168 horas (7 días) a 25°C y 250 rpm. Se recogieron muestras de 1 ml cada 24 horas para el seguimiento de distintos parámetros de la fermentación.

La composición de los medios de inocule y fermentación es la descrita previamente (Shen et al., 1986, Bio/Technology 4 : 61-64).

Para cuantificar la degradación enzimática de la CPC se realizó una mezcla de reacción, basada en la descrita por Fujisawa et al. (1975, Agric. Biol. Chem. 39 : 1303-1309) que contenía, en un volumen total de 100 1 : Tris-HC1, pH 8.0,50 mM; CPC, 20 mM y sobrenadante de cultivo 75 u. La mezcla se

incubó durante 60 minutcs a 37°C y la reacción se detuvo añadiendo 100 µl de metanol. Las proteínas precipitadas se eliminaron por centrifucación durante 5 minutos a 14.000 r. p. m. en una centrífuga Eppendorff. La producción de DAC se analizó inyectando 100 ul de la mezcla de reacción en un HPLC Beckman System Gold equipado con una columna Bondapack C18. La elución se llevó a cabo mediante una mezcla de solventes A (10 mM acetato sódico-ácido acético, pH 4,5) y B (100% acetonitrilo) usando un gradiente lineal de 0 a 3 % de solvente B entre los 0 y 2 minutos y 3% constante des- de el minuto 2 al 15 a un flujo de 1,3 ml/min. Las cefalos- porinas se detectan por su absorbancia a 260 nm. En estas condiciones la DAC eluye con un tiempo de retención de 3,1 min. mientras que la CPC lo hace a los 8,3 min. Ambos com- puestos se identificaron por coelución con muestras patrón de CPC y DAC.

La actividad CPC-AH es indetectable hasta las 96 h momento a partir del cual se incrementa hasta alcanzar el máximo a las 168 h (fig. 1A). En las mismas muestras se comprueba, tras la separación por HPLC, la producción de CPC y de DAC a lo largo de la fermentación. Para ello, se tomaron muestras de 100 µl del caldo de cultivo de A. chrysogenum, se precipitaron las proteínas añadiendo 100 pl de metanol y centrifugando a 10.000 x g durante 5 minutos.

100 pl del sobrenadante se analizaron por HPLC en la forma descrita anteriormente. La aparición de DAC en los caldos de cultivo sigue un curso paralelo a la actividad CPC-AH.

Se analizaron también, mediante ensayo en geles de poliacrilamida (15%) desarrollados en condiciones nativas y tinción por actividad frente a ß-naftil acetato, las activi- dades acetilhidrolasas inespecíficas presentes en los sobre- nadantes de cultivo. Para realizar este ensayo, basado en el descrito anteriormente por Gabriel (1971, Methods in Enzymol. 22 : 578-604) se cargan en los geles 10-50 pl de

sobrenadante de cultivo diluido con la misma cantidad de tampón de muestra nativo y se desarrollan a 4°C. Una vez completa la electroforesis se sumerge el gel en una solución PO4KH2/PO4EH 50 mM pH 6.8 que contiene 0.05% de Fast Blue RR y 0.02% de ß-naftll acetato. Tras 10 minutos en agitación aparecen bandas de color rojizo correspondientes a la coprecipitación del naftol y el Fast Blue.

El patrón de acetilhidrolasas se modifica a lo largo de la fermentación (fig. 1B), no apreciándose bandas de actividad hasta las 72 h. A las 96 h aparecen al menos 4-5 bandas, algunas de las cuales desaparecen en horas pos- teriores. Finalmente, a las 168 h de cultivo se observan dos únicas bandas de actividad acetilhidrolasa que se denomina- ron CPC-AH A y CPC-AH B.

1.1.2. Actividad CPC-AH de las acetilhidrolasas A y B detectadas en geles.

Para comprobar si las actividades acetilhidrolasa detectadas en geles de poliacrilamida poseían actividad frente a CPC, se realizó un gel de poliacrilamida prepara- tivo en el que se cargaron 500 pl de sobrenadante de cultivo recogido a las 168 horas. En una parte del gel se determinó la presencia de acetilhidrolasas por tinción con ß-naftil acetato y Fast Blue como se describe en el apartado 1.1.1. y, una vez localizadas las bandas, se cortaron separadamente las zonas del gel que contenían la banda superior (A) y la inferior (B). Como control, para eliminar el posible efecto de la acrilamida, se cortó también una parte del gel en la que no aparecían bandas de actividad acetilhidrolasa. Se ma- ceró el gel, se le añadieron 200 µl de tampón Tris-HC1 50 mM pH 8,0 y seguidamente se permitió la difusión de las enzimas del gel al tampón mediante incubación durante 12 horas a 4°C.

Las proteína extraída de la banda B mostró una actividad CPC-AH de 14,7 pKat/mg de proteína.

1.1.3. Purificación de la actividad CPC-AH B.

La actividad CPC-AH B se purificó a partir de 2 litros de sobrenadante de cultivo de A. chrysogenum C10 to- mado a las 168 horas de fermentación (fig. 2). El cultivo se realizó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.

Las proteínas presentes en el sobrenadante se pre- cipitaron fraccionadamente con cantidades crecientes de (NH4) 2SO4 (0-30, 30-60,60-90 % de saturación) y se resuspen- dieron en tampon Tris-HCl 50 mM pH 8,0,100 mM NaCl (tampon A). Dado que la actividad CPC-AH B aparecía mayoritariamente en la fracción de proteína que precipita entre 30-60 % de saturación, dicha fracción se cargó en una columna de gel filtración Sephadex G-75SF, se eluyó con tampon A y la acti- vidad acetilhidrolasa de las fracciones obtenidas se analizó en geles nativos de poliacrilamida.

Las fracciones enriquecidas en la actividad CPC-AH B se cargaron en una columna de intercambio iónico DEAE- Sepharose FF equilibrada con tampon A y se eluyeron con un gradiente de 150 ml de tampón A y 150 ml de tampón A + 0.5 M NaCl. Las fracciones activas se concentraron por ultrafil- tración y 200 pl del concentrado se cargaron en una columna de gel filtración en FPLC Superosa 12. Tras este proceso, la CPC-AH B apareció como una banda única de 31 kDa en SDS-PAGE (fig. 4).

1.2. Caracterización de la enzima.

1.2.1. Determinación del peso molecular.

La determinación del peso molecular de la enzima CPC-AH B se llevó a cabo utilizando dos técnicas : (I) el peso mo- lecular de la enzima en su forma nativa (no desnaturalizada) se calculó mediante cromatografía de filtración en gel y

(II) el peso molecular de la proteina desnaturalizada se determinó por electroforesis en gel de poliacrilamida de la proteina previamente purificada.

Para estimar el peso molecular de la enzima en estado nativo, se calibró una columna de filtración en gel Superosa 12 para FPLC (Pharmacia) con proteínas de peso molecular conocido (Seroalbúmina bovina, 67 kDa; ovoalbúmina, 43 kDa; quimotripsinógeno A, 25 kDa; y ribonucleasa A, 13 kDa) y seguidamente se construyó una recta patrón representando gráficamente los valores de KAV obtenidos a partir de los volúmenes de elución de las proteínas control frente a los logaritmos de sus pesos moleculares.

A continuación, se recogió por filtración el sobre- nadante de cultivo de A. chrysogenum fermentado durante 168 horas en las condiciones descritas anteriormente y las proteínas se precipitaron con un 85% de saturación de (NH4)2SO4. El precipitado se resuspendió en un volumen 20 veces inferior de tampón A (Tris-HCl 50 mM pH 8,0) y 200 ml de esta preparación se cargaron en la columna Superosa 12 equilibrada con tampón A, eluyendo a un flujo de 0,3 ml/min y recogiendo fracciones de 0,3 ml. Se analizaron las actividades acetilhidrolasa presentes en cada fracción para determinar su volumen de elución. Con este dato y conociendo el volumen total de la columna y el volumen muerto se determinó una Kav de 0,3760 para la CPC-AH B. Este valor comparado con los de la recta de calibración permitió calcular un peso molecular de 31 kDa para esta actividad (fig. 3A).

El peso molecular de la proteína desnaturalizada se determinó por comparación de la distancia de migración de la proteína purificada en SDS-PAGE frente a la de proteínas de peso molecular conocido (Pharmacia) con las que se calculó una recta de calibración. La CPC-AH B purificada aparece en estas condiciones como una única banda de 31 kDa. Este valor coincide con el obtenido en condiciones no desnaturalizantes

por lo que se puede afirmar que la enzima activa es un monómero de peso molecular 31 kDa.

1.2.2. Determinación del punto isoeléctrico.

Una alícuota del sobrenadante concentrado preparado anteriormente se pasó por una columna de gel filtración Sephadex G25 (Pharmacia) para eliminar las sales y se diluyó en 50 ml de agua Milli Q conteniendo 10% glicerol, 4M urea y 2% anfolitos de pI 3-10. La disolución así obtenida se cargo en el aparato de isoelectroenfoque preparativo Rotofor (Bio- Rad). Las fracciones obtenidas tras la separación de las proteínas según su punto isoeléctrico se analizaron por tinción de actividad acetilhidrolasa en geles de poliacril- amida. La actividad CPC-AH B apareció en la fracción número 2 del gradiente, la cual tiene un pH de 4 (fig. 3B).

1.2.3. Efecto de la concentración de sustrato.

Con fracciones procedentes de la separación por inter- cambio iónico se realizaron ensayos de actividad CPC-AH por HPLC variando la concentración de CPC. Los valores de actividad obtenidos se representaron frente a las concentra- ciones de CPC (representación de Michaelis-Menten) compro- bando que se ajustaban a una parábola. Por otra parte, se representó el valor inverso de la actividad CPC-AH B frente al inverso de la concentración de CPC utilizada (represen- tación de Lineweaver-Burk). Por este procedimiento se calcu- ló una constante de Michaelis (ka,) de 33,72 mM y una velo- cidad máxima (V=) de 91,95 pKat/mg (fig. 3C).

1.2.4. Temperatura y pH óptimos.

Para estudiar el efecto de la temperatura sobre la actividad CPC-AH B se realizaron ensayos incubando las

mezclas de reacción a diferentes temperaturas (entre 4 y 65°C). La preparación enzimática utilizada para ello fue una fracción enriquecida en CPC-AH B procedente de la cromatografía de intercambio aniónico en DEAE-Sepharose FF (Pharmacia). La CPC-AH B mostró actividad en un amplio rango de temperaturas. La actividad máxima se alcanzó a los 45°C (fig. 3D), pero es apreciable a temperaturas de hasta 65°C.

Utilizando la fracción anteriormente mencionada se reali- zaron ensayos variando la solución tampon con la que se estabiliza el pH. Se emplearon tampón fosfato potásico 50 mM en el rango entre 5 y 8 y Tris-HC1 50 mM en el rango entre 8 y 11. Como se observa en la figura 3E entre pH 7 y 9 se aprecian niveles de actividad apreciables alcanzando el valor máximo de actividad a pH 8. La enzima mantiene mejores niveles de actividad a pH alcalino que a pH ácido.

1.2.5. Efecto de diversos metales e inhibidores.

Se analizó el efecto de diversos metales e inhibidores sobre la CPC-AH B. El extracto enzimático utilizado para las determinaciones correspondió a las fracciones procedentes de la cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sepharose FF. Dichas fracciones se sometieron a un proceso de filtración en gel en una columna Sephadex G-25 (Pharmacia) para elimi- nar los restos de sales minerales. Los iones se preincubaron durante 15 minutos con las preparaciones enzimáticas a 4°C de modo que una vez añadidos el resto de componentes del ensayo de reacción la concentración final de los iones resultase 1 mM. En la tabla 1 se comprueba que Mg2+, Mn2+ y Ca2+ tienen efecto estimulante, mientras que Fe, Zn2+, Ag'y Cu"inhiben la actividad en mayor o menor medida (tabla 2).

TABLA 2 Efecto de diversos metales sobre la actividad CPC-AH B Metales (lmM) Act CPC-AH (%) NINGUNO 100 FeSO4 49 MgSO4141 MnSO4140 CuSO464 ZnSO460 CoS04 80 CaCl2 147 NaCl 94 K2CO3 77 AgNO360 Para la determinación del efecto de los potenciales inhibidores se utilizaron los mismos extractos que para estudiar el efecto de los cationes preincubando del mismo modo el extracto con cada compuesto antes de la adición del resto de componentes de la mezcla de reacción. Entre los compuestos ensayados destaca el fuerte efecto inhibidor del Fenilmetil-sulfonil-fluoruro (PMSF) y del Diisopropil- fluorofosfato (DIPFF) (tabla 3).

TABLA 3 Efecto de alqunos inhibidcres sobre la actividad CPC-AH B Inhibidores Act CPC-AH (%) NINGUNO 100 86EDTA10mM 1mM87 0,1mM91 0PMSF10mM 1mM11 0, 1mu 59 0,01mM91 0DIPFF10mM 1mM9 O, ImM 7 1.2.6. Secuenciación del extremo amino terminal de la CPC-AH B.

Para determinar la secuencia de aminoácidos del extremo amino terminal de la CPC-AH B, se cargaron 100 pmoles de la proteína purificada en un gel SDS-PAGE al 15 % y se trans- firieron a una membrana de PVDF (Inmobilon P, Millipore) utilizando el sistema MiniTrans-Blot (Bio Rad). Ex tampon de transferencia utilizado fue CAPS 10 mM pH 11,0 con 10 % metanol. La zona del filtro que contenia la banda electro- forética de proteína correspondiente a la actividad CPC-AH B se cortó y se sometió a 21 ciclos de degradación de Edman en

un secuenciador automático de proteínas 476A (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO 1.

Ejemplo 2 : 2.1. Clonación del gen cahB.

En función de la secuencia amino terminal de la enzima CPC-AH B y mediante la utilización del patrón de uso de codones de genes de A. chrysogenum, se diseñó un oli- gonucleótido sintético correspondiente al anterior extremo 5'del gen. La secuencia de dicho oligonucleótido se muestra en SEQ ID NO 2.

Tras el análisis de esta secuencia se comprobó su similitud con la secuencia de aminoácidos de la proteasa T del hongo T. album (Samal et al., 1989, Mol. Microbiol. 4 : 1789-1792) cuyo gen correspondiente ya había sido clonado y secuenciado. La comparación de esta secuencia con la de otras proteasas conocidas reveló la existencia de zonas totalmente conservadas en todas ellas. Una de estas zonas, concretamente la correspondiente al centro activo (Pro-His- Val-Ala-Gly-Leu), fue utilizada para elaborar el oligonucleótido descrito en SEQ ID NO 3, el cual nos permitiría realizar reacciones de PCR junto con el oligonucleótido descrito en SEQ ID NO 2.

La clonación del gen correspondiente a la proteína CPC- AH B se abordé mediante el rastreo de una librería genética de la cepa A. chrysogenum C10 realizada previamente en el vector de sustitución REMBL3-ble (Gutiérrez et al. 1991, J.

Bacteriol. 173 : 1354-2365) con dos sondas de distinta procedencia : Sonda 1.-Fragmento de 1.020 pb EcoRI-DraI correspondiente al gen que codifica para la proteasa T de T. album. Sonda 2.-Fragmento de 700 pb obtenido por PCR,

utilizando los oligonucleótidos descritos en SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3 y como molde ADN total de A. chrysogenum C10.

Los fagos positivos fueron purificados y caracterizados mediante análisis de Southern según técnicas estándar (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Como resultado de la serie de rondas de hibridación y purificación se obtuvo el fago F41, el cual contenía el gen cahB (fig. 4A).

En la digestión EcoRI del fago F41 apareció una banda de hibridación de 5 kb que se consideró adecuada para su subclonación, mapeo y secuenciación (fig. 4B). Dicho fragmento EcoRI de 5 kb fue subclonado en pBluescript I KS (+) (Stratagene) en sus dos orientaciones y mapeado con diversas enzimas de restricción. El gel de agarosa resul- tante del mapeo se transfirió a un filtro de nylon y se hibridó con la sonda 1 anteriormente mencionada obteniendo señales positivas. Entre ellas se determinó la existencia de un fragmento de ADN SmaI-EcoRI de aproximadamente 1,6 kb, el cual era lo suficientemente grande como para contener el gen completo ya que el tamaño esperado era de aproximadamente 1,2 kb. Por ello, se procedió a subclonar el fragmento SmaI- EcoRI (tras generar extremos romos con klenow) en el sitio SmaI en pBluescript I KS (+) en las dos orientaciones. Los dos plásmidos obtenidos se denominaron pJEllA y pJEllB.

2.2. Secuencia de nucleótidos del gen cahB.

Los plásmidos pJEllA y pJEllB se digirieron con BstXI y XbaI para someterlos posteriormente a un proceso de dele- ciones unidireccionales usando el kit erase-a-base (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se selec- cionaron un total de 8 clones de cada orientación, los cuales se secuenciaron utilizando los procedimientos habi- tuales. Se obtuvo así una secuencia de 1.621 pb corres-

pondientes a la totalidad del fragmento SmaI-EcoRI (SEQ ID NO 4). En esta secuencia se detectó un marco de lectura abierta (ORF) de 383 aminoácidos, interrumpido por dos intrones de 68 y 78 pb, en los cuales se determinó la pre- sencia de secuencias consenso de procesamiento situadas en 5', 3'e internamente, conservadas en los intrones de hongos.

El polipéptido deducido se muestra en el código de aminoácidos de tres letras, debajo de sus correspondientes tripletes en SEQ ID NO : 4 y también en un contexto aislado en SEQ ID NO : 5. Una serie de búsquedas realizadas en las bases de datos de proteínas (SwissProt) del servidor de acceso público BLAST del Centro Nacional de Información en Biotecnología (NCBI, USA) revelaron similitud de la se- cuencia de aminoácidos con proteasas producidas por el hongo T. album con las que mostró la siguiente identidad (Tabla 1) : 64.5 % con la preproteasa T, 49.5 % de identidad con la preendoproteasa K y 48.5 % con la preproteasa R. Por tanto, la secuencia del gen cah3 muestra que la enzima está fuertemente relacionada con proteasas alcalinas de origen fúngico. El centro activo de varias esterasas y lipasas muestran un alto grado de similitud con el de b-lactamasas y proteasas (Cygler et al. 1993 Protein Science 2 : 366-382).

La CPC-AH B está más relacionada con proteasas de serina del tipo de la subtilasa (Siezen et al. 1991, Protein Eng. 4 : 719-737). E1 centro activo de estas enzimas está formado por la llamada triada catalítica (ácido aspártico, serina e his- tidina). Los aminoácidos típicos de dicho centro activo se han localizado en la secuencia de la CPC-AH B en las posiciones D14s, H176 y S331, respectivamente. Asimismo se puede observar un alto grado de conservación en los aminoácidos próximos a los que forman esta triada en las 4 enzimas comparadas.

La secuencia de aminoácidos deducida de la secuen- ciación de la CPC-AH B purificada coincide exactamente con

la de los aminoácidos 107 a 127 de la proteína deducida del gen. Este hecho indica que A. chrysogenum sintetiza ini- cialmente una preproteína de 383 aminoácidos que se procesa entre las posiciones Glnl° y Ala107 para formar la proteína madura de 277 aminoácidos (SEQ ID NO : 6). El peso molecular (26,9 kDa) y el pI (3,5) deducidos de la secuencia de ADN de la proteína madura difieren ligeramente de los deducidos experimentalmente. Estas diferencias pueden deberse a gli- cosilaciones post-traduccionales o de una migración elec- troforética irregular de la proteína.

2.3. Análisis de la transcripción del gen cahB.

Con el fin de estudiar el patrón temporal de trans- cripción del gen cahB, se realizó un análisis de Northern según técnicas estándar (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) a partir de ARN total extraído por procedimientos previamente descritos (Ausubel et al. 1987, Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, New York) de muestras de micelio tomadas cada 24 horas desde el inocule hasta las 120 horas de fermentación (Figura 5). Las muestras de ARN se hibridaron con una sonda de ADN SmaI-EcoRI de 1,6 kb que incluye el gen cahB. Las mismas preparaciones de ARN se hibridaron con una sonda KpnI-NcoI de 0,83 kb interna al gen de la ß-actina de Aspergillus nidulans. Esta hibridación se utilizó como control de la cantidad y calidad del ARN ya que la trans- cripción del gen de la ß-actina no varia a lo largo de la fermentación.

El análisis de Northern mostró que el gen cahB se transcribe formando un único ARN mensajero de alrededor de 1,4 kb. Este transcrito se detectó únicamente a las 72 y 96 horas, siendo indetectable en las muestras anteriores y posteriores. Según estos resultados, parece existir un

retraso de aproximadamente 24 horas entre el momento de la transcripción (72 horas) y el momento en que la proteína CPC-AH B aparece en los caldos de fermentación (96 horas).

Este retraso puede deberse al tiempo requerido para la traducción, procesamiento y transporte de la proteína al medio de cultivo.

2.4. Localización cromosómica del gen cahB.

Las muestras de ADN para separar cromosomas enteros mediante la técnica PFGE ("pulse field gel electrophoresis" o electroforesis en gel de campo pulsado) deben prepararse por un procedimiento que libere el ADN del resto de com- ponentes celulares del hongo sin que se produzca la rotura física o degradación enzimática del mismo. Con este pro- pósito se aplicó un protocolo que consistió en la obtención de protoplastos a partir del micelio del hongo seguido de un tratamiento enzimático y químico de dichos protoplastos para obtener el ADN libre e intacto. Los protoplastos se prepararon de acuerdo con un procedimiento descrito pre- viamente (Gutiérrez et al. 1991, Mol. Gen. Genet. 225 : 56- 64).

La resolución de los cromosomas se realizó en un sistema CHEF-DRII (Bio Rad). El gel se preparó con agarosa de grado cromosómico (Bio Rad) al 0,6 %. El tampón de elec- troforesis fue Tris 0,05 M, Ácido Bórico 0,05 M y NaEDTA 0,1 mM. La electroforesis se realizó durante 216 horas a 40 V con el tampón a una temperatura de 9°C, sustítuyéndolo cada 72 horas por tampon nuevo. Mediante esta técnica se separaron siete bandas cromosómicas del genoma de A. chrysogenum. Por comparación con los cromosomas de A. nidu- lans, Schyzosaccharomyces pombe y Saccharomyces cerevisiae se estimaron tamaños de 5,3,4,6,4,1,3,8,2,8 2,4 y 2,2 Mb para las siete bandas de A. chrysogenum. La banda de 3,8 Mb mostró una intensidad mayor sugiriendo la presencia de

dos cromosomas de similar tamaño. Los cromosomas se nume- raron de I a VIII por orden creciente de tamaño. El gen cahB se localizó mediante hibridación en el cromosoma de mayor tamaño (5,3 Mb). En la autorradiografía (Figura 6) se aprecian dos señales adicionales correspondientes a ADN retenido en el pocillo del gel y a ADN degradado en la parte inferior del gel.

Ejemplo 3 : 3.1. Clonación del gen cahB a partir de una genoteca de ADNc.

Con la finalidad de obtener la proteína CPC-AH B en gran cantidad, se planteó la expresión del gen cahB en Escherichia coli. Este sistema procariótico permite la ex- presión eficiente de proteínas heterólogas cuando la región codificante del gen se sitúa bajo señales de inicio de la transcripción y traducción bien reconocidas por la bacte- ria. Sin embargo, los genes eucariotas pueden estar interrumpidos por intrones que no son procesados por los procariotas por lo que se hace necesaria una clonación previa del gen de interés a partir de una genoteca de ADNc.

Con este fin, se construyó una genoteca de ADNc a partir de ARN de la cepa A. chrysogenum C10 utilizando el sistema ZAP-cDNA (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fa- bricante.

El gen cahB en forma de ADNc se aisló a partir de esta genoteca mediante procedimientos ya descritos (Sam- brook et al. 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) utilizando como sonda un fragmento de ADN de 715 pb interno al gen cahB. Como resultado de dicho rastreo se obtuvieron 4 clones positivos, a partir de uno de los

cuales se purificó un fragmento de 567 pb interno al gen cahB pero carente de intrones.

3.2. Expresión en Escherichia coli El fragmento genómico de 715 pb (BamHI-NcoI) del plás- mido pJEllA se sustituyó por el fragmento de 567 pb con los mismos extremos dando como resultado el plásmido pJEB12, el cual contenía el gen cahB sin intrones (Figura 7). La construcción final para su expresión en E. coli se realizó con un fragmento de 1.257 pb obtenido por PCR, utilizando los oligonucleótidos SEQ ID NO : 7 y SEQ ID NO : 8 y como molde pJE12. E1 fragmento de 1.155 pb se trató con klenow, se digirió con SalI y se subclonó en el plásmido pT7.7 (NdeI, Klenow, SalI) dando como resultado el plásmido pT7B2.1. De forma análoga, pero utilizando los oligonucleó- tidos SEQ ID NO : 9 y SEQ ID NO : 8 se preparó por PCR un fragmento de 839 pb que correspondía a la proteína procesada carente de los 106 primeros aminoácidos de la preproteína.

E1 plásmido generado por ligación de este fragmento relle- nado con klenow y digerido con SalI en pT7.7 (Ndel, Klenow, SalI) se denominó pT7B2.2.

Los plásmidos pTB2.1 y pTB2.2 se transformaron en E. coli JM109 (DE3) y los transformantes se crecieron en medio LB añadiendo 100 µg/ml de ampicilina (LB-Ap) a 37°C durante 12 horas. Se inocularon 100 ml de medio LB-Ap fresco con 2 ml del cultivo anterior y se incubaron a 37°C y 250 rpm has- ta que el cultivo alcanzó una DO a 600nm de 0,4 unidades.

En ese momento se añadió IPTG a una concentración final de 0,5 mM y las células se recogieron por centrifugación 3 ho- ras después. La síntesis de proteínas heterólogas se anali- zó mediante SDS-PAGE. En extractos de la cepa E. coli JM109 (DE3) transformada con el plásmido pT7B2.1. apareció una banda de proteína de 42 kDa correspondiente a la enzima CPC-AH B sin procesar, mientras los extractos del transfor-

mante con el plásmido pT7B2.2. presentaron una banda de 31 kDa correspondiente a la C-C-AH B procesada. (Figura 8). En los transformantes de E. ccí JM109 (DE3)/pT7B2.2 se detectó una débil actividad CPC-AH, mientras que en los de E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.1 no se apareció esta actividad enzimáti- ca.

Ejemplo 4 : 4.1. Desacetilación de CPC y derivados.

Extractos enzimáticos procedentes de E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.2 se utilizaron para desacetilar"in vitro"tanto CPC como 7-ACA en las mismas condiciones des- critas en el apartado 1.1.1 (Ejemplo 1) para la determina- ción de las actividades CPC-AH en A. chrysogenum. En la reacción de desacetilación de 7-ACA se sustituyó la CPC por 7-ACA a una concentración de 20 mM. En ambos casos se detectó la aparición de los correspondientes derivados des- acetilados : desacetil CPC (DAC y desacetil 7-ACA.

Ejemplo : 5.1. Inactivación del gen cahB en A. chrysogenum.

Con el fin de inactivar la actividad CPC-AH B se empleó la técnica de disrupción génica por integración sim- ple. En este proceso se busca generar dos copias del gen mutadas, lo que se logra cuando se produce la recombinación entre un fragmento interno del gen diana, localizado en un plásmido, y el gen objetivo endógeno. En nuestro caso, el gen cahB es de un tamaño relativamente pequeño (1,1 kb) y está descrito que la recombinación en A. chrysogenum es mayoritariamente por via heteróloga. Para favorecer la recombinación homologa, se empleó para la construcción del

plásmido un fragmento de ADN genómico de 7 kb que contenía el gen cahB.

Para que se generen las dos copias del gen diana mutado, es necesario introducir dos mutaciones en el gen y que la recombinación tenga lugar entre estos dos puntos.

Para ello se generaron en el extremo 5'del gen cahB dos mutaciones eliminando sendos sitios de restricción BamHI y KpnI. La eliminación del sitio de restricción KpnI se realizó utilizando el kit"Quickchange" (Stratagene) si- guiendo las instrucciones del fabricante. En el extremo 3' del gen se introdujo una mutación en el sitio de restric- ción StyI.

El fragmento de 7 kb con las 3 mutaciones men- cionadas se introdujo en el plásmido pJL43 dando lugar al plásmido pB*2 (Figura 9). Antes de la transformación se digirió el plásmido pB*2 con ClaI (que se encuentra locali- zado entre las dos mutaciones introducidas en el gen) para generar una molécula lineal, ya que está descrito que la transformación con plásmidos lineales favorece la recom- binación. Se transformó A. chrysogenum C10 con estos plás- midos siguiendo el procedimiento descrito por Gutiérrez et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 225 : 56-64). Los transformantes se seleccionaron en medio TSA suplementado con sacarosa (10,3%) y fleomicina (40 pg/ml).

5.2. Aumento de la producción de cefalosporina en los transformantes de A. chrysogenum con el gen cahB inactivado.

La producción de cefalosporina de los transformantes de determinó cada 24 horas en muestras procedentes de una fermentación en las condiciones descritas anteriormente. Se analizó la presencia de actividades acetilhidrolasas en los caldos de cultivo mediante geles nativos de poliacrilamida en las muestras tomadas a las 168 horas. Al menos 3 de 10

transformantes analizados (C1A, C3A y C5A) carecían de la actividad CPC-AH B (Figura 10). En otro gel, cargado con las mismas muestras pero teñido con azul de Coomassie para detectar la presencia de proteinas totales, se comprobó la ausencia de la banda de proteína asociada a la actividad CPC-AH B en los transformantes ClA, C3A y C5A.

Entre los transformantes con el gen cahB presunta- mente inactivado, se eligió el C3A para comprobar si la ausencia de la actividad CPC-AH B se mantiene a lo largo de toda la fermentación. Para ello se analizaron los sobrena- dantes recogidos cada 24 horas tanto de este transformante como de la cepa A. chrysogenum C10 sin transformar. La banda de actividad CPC-AH B no apareció en ninguna de las muestras del transformante C3A analizadas mientras que el patrón del resto de actividades acetilhidrolasa se mantu- vieron similares a las de la cepa control C10 (Figuras 11 A y 11 B). La ausencia de la actividad CPC-AH B en el trans- formante C3A se manifestó en un cambio en la proporción de DAC y CPC en los caldos de cultivo recogidos a las 168 horas y analizados por HPLC. En los cromatogramas (Figura 12) se observó que la concentración de CPC es mayor (32 %) en el transformante con la enzima inactivada que en la cepa A. chrysogenum C10 sin transformar mientras que la concen- tración de DAC descendió de forma apreciable (41 %) en el transformante.

Descripción detallada de las figuras.

Figura 1. A. Producción de CPC, DAC y cefalosporinas totales en un cultivo de A. chrysogenum C10 en medio defi- nido de fermentación y actividad CPC-AH en caldos del mismo cultivo. B. Tinción de actividad acetilhidrolasa frente a ß-naftil acetato de un gel de poliacrilamida en el que se separaron las proteínas presentes en los sobrenadantes de cultivo de A. chrysogenum a diferentes tiempos de fermen-

tación. Las dos bandas de actividad CPC-AH A y B se indican mediante flechas a la derecha.

Figura 2 : Análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en los sucesivos pasos de purificación de la actividad CPC-AH B : Carriles 1 y 6 : Marcadores de peso molecular (los tamaños de los marcadores en kDa se indican mediante flechas a la izquierda). 2 : Sobrenadante cultivo; 3 : Fracción de proteínas precipitadas entre 30 y 60 % de saturación de sulfato amónico; 4 : Fracciones activas tras filtración en gel en Sephadex G75 SF; 5 : Fracciones activas tras cromatografía de intercambio anionico en DEAE- Sepharosa FF; 7 : CPC-AH B purificada tras filtración en gel en Superosa 12 para FPLC.

Figura 3 : Caracterización de la proteína CPC-AH B : A : Determinación del peso molecular por filtración en gel.

Marcadores de Pm de izquierda a derecha : Ribonucleasa A, Quimotripsinógeno, Ovoalbúmina y Seroalbúmina; B : Determinación del punto isoeléctrico mediante electro- enfoque preparativo; C : Determinación de la KN, y V,,.. de la CPC-AH B frente a CPC; D : Efecto de la temperatura y E del pH sobre la actividad CPC-AH B.

Figura 4 : Panel A; Mapa de restricción de una región de 14,8 kb del ADN de A. chrysogenum clonado en el fago F41 y que contiene al gen cahB (flecha). El fragmento EcoRI indicado por líneas verticales se subclonó originando los plásmidos pJElA o pJElB (en ambas orientaciones). El fragmento de 1,6 kb SmaI-EcoRI marcado con una caja se subclonó para dar lugar a los plásmidos pJEllA ó pJEllB (CECT 5067). Las dos interrupciones en el gen cahB corresponden a dos intrones. Panel B; Hibridación del ADN del fago F41 digerido con SalI (carril 1), SalI-EcoRI (carril 2) y EcoRI (carril 3) con la sonda de 0,7 kb interna al gen cahB (panel de la izquierda) y con la sonda de 1,02 kb EcoRI-DraI correspondiente a la proteasa T de Tritirachium album (derecha). Los tamaños de las bandas de

hibridación (en kb) se indican mediante flechas a la derecha.

Figura 5 : Transcrito del gen cahB (1,4 kb) de A. chrysogenum (panel izquierdo) en micelio recogido a las 48, 72 96 y 120 de fermentación en condiciones de producción de cefalosporina. Como control (C) se muestran los transcritos del gen que codifica para P-actina (1,6 kb) en las mismas muestras de ARN (panel derecho).

Figura 6. A. Resolución de los cromosomas de A. chrysogenum C10 mediante electroforesis en gel de campo pulsado. Carril 1 : Marcadores de tamaño cromosómico (indicados en Mb a la izquierda). Los tres marcadores de mayor tamaño son cromosomas de Schizosaccharomyces pombe y los dos más pequeños son de Saccharomyces cerevisiae. Carril 2 : Cromosomas de A. nidulans FGSC4 utilizados como marcadores de tamaño : 5,0,4,5,4,1,3,7 (doblete), 3,4 (doblete) y 2,4 Mb (Montenegro et al, 1992, J. Bacteriol. 174 : 7063- 7067). Carril 3 : Cromosomas de A. chrysogenum C10 numerados de menor a mayor (derecha). B. Hibridación del gel de la izquierda con una sonda NcoI-BamHI de 0,6 kb interna al gen cahB. El gen cahB se localiza en la banda de mayor tamaño (cromosoma VIII de 5,5 Mb).

Figura 7 : Clonación del gen cahB a partir de una genoteca de ADNc y construcción de plásmidos para expresión de la CPC-AH B en E. coli.

Figura 8 : SDS-PAGE de extractos celulares de las cepas de E. coli que expresan las distintas formas de la CPC-AH B.

Carriles 1 y 5 : Marcadores de peso molecular (los tamaños de los marcadores en kDa se indican mediante flechas a la izquierda). 2 : E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.1 Células comple- tas; 3 : E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.1 Extracto soluble; 4 : E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.1 Fracción insoluble; 6 : E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.2 Células completas; 7 : E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.2 Extracto soluble, 8 : E. coli JM109 (DE3)/pT7B2.2 Fracción insoluble. Las flechas en los

carriles 4 y 8 muestran las proteínas sobreexpresadas de 42 y 31 kDa respectivamente.

Figura 9 : Mapa de restricción del fragmento de ADN insertado en el plásmido pJL43 para construir el plásmido pB*2. Las posiciones de los sitios de restricción elimi- nados se indican mediante flechas verticales en la parte inferior y sus sitios de restricción correspondientes se muestran sombreados.

B : BamHI; C : ClaI E : EcoRI; H : HindIII, N : NotI; S : SalI; Sm : SmaI; St : StyI.

Figura 10 : Detección de actividad CPC-AH en geles de po- liacrilamida en sobrenadantes de cultivo (168 horas) de va- rios transformantes de A. chrysogenum C10 obtenidos con el plásmido pB*2. Se indica mediante flechas la banda corres- pondiente a la actividad CPC-AH B y los transformantes C3A y C5A utilizados en estudios posteriores.

Figura 11 : Actividades CPC-AH a lo largo de una fermen- tación de A. chrysogenum C10 (panel A) y el transformante C3A. (panel B) en muestras de caldo de cultivo tomadas cada 24 horas. Se indica mediante una flecha la posición de la CPC-AH B en la cepa C10 y su ausencia en la cepa C3A mediante una caja.

Figura 12 : Análisis mediante HPLC de la proporción relativa de DAC y CPC en la cepa A. chrysogenum C10 y en su trans- formante C3A en caldos de cultivo tomados a las 168 horas de fermentación.