Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxyphenylessigsäure aus Phenylessigsäure.

Es ist bekannt, daß der Abbau von aromatischen Verbindungen durch Mikroorganismen häufig über hydroxylierte aromatische Zwischen¬ produkte verläuft, deren Ring anschließend unter Einführung wei¬ terer Sauerstoffatome gespalten wird.

Ein Stoffwechselweg der Phenylessigsäure, der bei einer Reihe von Pilzen und Bakterien gefunden wird, verläuft zu 2-Hydroxyphenyl- essigsäure als erstem Produkt. In einer zweiten Monohydroxylie- rung wird dann eine weitere OH-Gruppe in Position 5 oder 6 des aromatischen Rings eingeführt. Diese Reaktionsfolge wurde z.B. bei Aspergillus niger und Pseudomonas fluorescens gefunden (Gra- zia Baggi et al., Styrene Catabolism by a Strain of Pseudomonas fluorescens, System. Appl. Microbiol. 4, 141 - 147, (1983); J.K. Faulkner and D. oodcock, The Metabolism of Phenylacetic Acid by Aspergillus niger, Phytochemistry 7, 1741 - 1742, (1968); Fumiki Yoshizako et al., The Metabolism of Phenylacetic Acid by Asper¬ gillus fumigatus ATCC 28282: Identification of 2,6-Dihydroxyphe- nylacetic Acid, Can. J. Microbiol. 23, 1140 - 1142 (1977)).

Diese Mikroorganismen sind für ein wirtschaftliches Herstellver- fahren für 2-Hydroxyphenylessigsäure aus Phenylessigsäure nicht geeignet, da sie 2-Hydroxyphenylessigsäure nur als Stoffwechsel- Zwischenprodukt in kleinen Mengen bilden und sofort weiter ab¬ bauen.

Es bestand daher die Aufgabe, Mikroorganismen zu Verfügung zu stellen, die die oben erwähnten Nachteile nicht besitzen, und ein fermentatives Herstellungsverfahren für 2-Hydroxyphenylessigsäure aus Phenylessigsäure unter Verwendung dieser Mikroorganismen be¬ reitzustellen.

Es wurde gefunden, daß für das eingangs beschriebene Verfahren Mikroorganismen geeignet sind, die einerseits die Fähigkeit be¬ sitzen, Phenylessigsäure in ortho-Position zu hydroxylieren, an¬ dererseits die gebildete 2-Hydroxyphenylessigsäure nicht weiter umsetzen, indem sie sie beispielsweise als Kohlenstoff-Quelle verwerten.

Solche Mikroorganismen erhält man zweckmäßigerweise durch Muta¬ tion von Wildstämmen, die die Fähigkeit zum Abbau von Phenyles¬ sigsäure über 2-Hydroxyphenylessigsäure besitzen. Als Wildstämme sind Bakterien, Aktinomyceten und Pilze geeignet. Besonders geei- gnete Vertreter finden sich beispielsweise in folgenden Gattun¬ gen:

Bacillus, Rhodococcus, Streptomyces, Absidia, Alternaria, Asper¬ gillus, Beauveria, Botryodiplodia, Botrytis, Byssochlamys, Can- dida, Cephalosporium, Chaetomium, Cunningha ella, Curvularia, Dactylium, Drechslera, Epicoccum, Fusarium, Geotrichum, Gibbe- rella, Gleophyllum, Gliocladium, Helminthosporium, Humicola, Hy- phozyma, Metarrhizium, Microascus, Mucor, Neurospora, Paecilomy- ces, Penicillium, Phycomyces, Phyllosticta, Pythium, Rhizopus, Septoria, Sphacelorna, Trichoderma, Trichosporon, Trichurus, Ver- ticillium.

Geeignete Mikroorganismen können leicht durch den in Beispiel 1 beschriebenen, einfachen Test identifiziert werden.

Von den geeigneten Mikroorganismen werden zweckmäßigerweise Mu¬ tanten erzeugt oder isoliert, die nicht mehr in der Lage sind, 2-Hydroxyphenylessigsäure abzubauen.

Zur Erzeugung solcher Mutanten können bekannte mikrobiologische Techniken eingesetzt werden. Zur Auslösung von Mutationen können alle gängigen Methoden verwendet werden wie die Anwendung von mu- tagenen Substanzen, z.B. Nitrosoguanidin, Ethylmethansulfonat, Natriumnitrit , oder die Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung wie UV-, Gamma- oder Röntgenstrahlung. Weiterhin können zur Mutagenese auch transponierbare genetische Elemente verwendet werden. Zur Isolierung der Mutanten kann beispielsweise die Eigenschaft, auf Phenylessigsäure als einziger C-Quelle nicht mehr zu wachsen, benützt werden.

Es wurde ein neuer Pilz der Gattung Humicola oder Chaetomium ge¬ funden, der unter der Hinterlegungsnummer DSM 7047 bei der Deut¬ schen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braun¬ schweig, hinterlegt wurde.

Weiterhin wurde gefunden, daß der Pilz DSM 7047 besonders gut zur Hydroxylierung von aromatischen Verbindungen, insbesondere von aromatischen Säuren und Säurederivaten verwendet werden kann. Es wurde weiterhin gefunden, daß sich durch Züchtung des Pilzes DSM 7047 in Gegenwart von Phenylessigsäure ein vorteilhaftes Her- stellungsverfahren für 2-Hydroxyphenylessigsäure aus Phenylessig¬ säure ergibt .

Der Pilz DSM 7047 wurde von CBS (Centraalbureau voor Schimmelcul- tures, Baarn, Niederlande) als Humicola fuscoatra Traaen be¬ stimmt, während er von DSM als Chaetomium, vermutlich Chaetomium seminudum, bezeichnet wurde. Eine endgültige Zuordnung zu der Gattung Humicola oder Chaetomium ist derzeit nicht möglich. Der Stamm DSM 7047 zeichnet sich dadurch aus, daß er Phenylessigsäure in ortho-Position hydroxyliert, aber die entstandene 2-Hydroxy- phenylessigsäure nicht metabolisiert.

Zur Prüfung, ob dies ein generelles Merkmal der Gattungen Humi¬ cola oder Chaetomium ist, wurden verschiedene Stämme dieser Gat¬ tungen analog Beispiel 1 getestet:

Humicola brevispora ATCC 28403 " brunnea ATCC 22629 fuscoatra ATCC 22723

ATCC 22721 Li 664 grisea ATCC 22724 " " Li 193 parvispora ATCC 22715

Chaetomium alba-avenulum Li 69 globosum ATCC 6205

Li 70 " " Li 444

Die mit Li bezeichneten Stämme stammen aus der Stammsammlung der landwirtschaftlichen Versuchsstation der BASF Aktiengesellschaft in Limburgerhof.

Bei allen diesen Stämmen konnte 2-Hydroxiphenylessigsäure in ge¬ ringen Mengen nachgewiesen werden. Sie wurde jedoch stets wieder vollständig abgebaut.

Durch Mutagenese mit UV-Licht konnten aus DSM 7047 in einem

Schritt Revertanten gewonnen werden, die Phenylessigsäure genauso abbauten wie die oben aufgelisteten Humicola- und Chaetomium- Wildtypstämme. Dadurch wurde gezeigt, daß es sich bei DSM 7047 um eine Mutante eines Phenylessigsäureabbauers handelt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxy- phenylessigsäure aus Phenylessigsäure beinhaltet die Züchtung der geeigneten Mikroorganismen in einem üblichen Nährmedium. Geeignet sind Nährmedien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anor- ganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Spurenele¬ menten und Vitaminen enthalten.

Als Stickstoffquellen können anorganische bzw. organische Stick- stoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen ent¬ halten, verwendet werden. Beispiele sind Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Hefe, Harnstoff und Kartoffelprotein.

Als Kohlenstoffquellen können beispielsweise Zucker wie Glucose, Polyole wie Glyzerin oder Fette wie Sojaöl verwendet werden. Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Kalzium, Ma- gnesium, Mangan, Zink, Kupfer, Eisen und anderen Metallen. Als Anion der Salze ist besonders das Phosphation zu nennen. Gegebe¬ nenfalls werden dem Nährmedium Wachstumsfaktoren wie Biotin, Riboflavin und andere Vitamine zugesetzt.

Ein besonders gut geeignetes Nährmedium ist das Medium 2, das in Beispiel 2 beschrieben wird.

Dem Nährmedium wird Phenylessigsäure zugesetzt. Phenylessigsäure kann als freie Säure oder als Salz, bevorzugt als Alkali- oder Ammoniumsalz, dem Medium zugesetzt werden. Da die Löslichkeit von Salzen in wäßrigen Nährmedien im allgemeinen größer ist als die der freien Säure, wird das Natrium- oder Ammoniumsalz der Phenyl¬ essigsäure bevorzugt verwendet. Das entsprechende Salz kann zweckmäßigerweise durch Titration der Phenylessigsäure mit einer Base in situ hergestellt werden.

Die Phenylessigsäure wird in der Regel in solchen Mengen zugege¬ ben, daß eine Konzentration von 0,5 bis 30 g, bevorzugt von 1 bis 20 g, pro Liter Nährmedium eingestellt wird.

Die Phenylessigsäure kann dem Nährmedium am Anfang der Züchtung des Mikroorganismus oder während der Züchtung in mehreren Portio¬ nen oder kontinuierlich zugegeben werden.

Außerdem ist es möglich, den gezüchteten Mikroorganismus nach be¬ endetem Umsatz zurückzubehalten und ihn in frischem Nährmedium mit Phenylessigsäure weiterzuzüchten.

Diese Form der Wiederverwendung der Biomasse ist eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens, da dabei beispielsweise die Anzuchtszeit für die Biomasse eingespart wird.

Die Züchtung des Mikroorganismus bedarf keiner weiteren besonde¬ ren Bedingungen. So kann die Züchtungstemperatur in der Regel zwischen 20 und 40°C liegen, bevorzugt wird eine Temperatur zwischen 25 und 35°C gewählt.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird während der Fermenta¬ tion zwischen 3 und 9 festgehalten. Vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 4 und 7. Eine Ansäuerung des Mediums während der Fermen¬ tation kann beispielsweise durch Zugabe einer Base wie Ammoniak kompensiert werden.

Die Fermentationszeiten betragen üblicherweise zwischen 1 und 10 Tagen, um eine maximale Anreicherung des Produkts im Fermenta¬ tionsmedium zu erreichen.

Der Reaktionsumsatz kann leicht durch Probenentnahme und bei¬ spielsweise gaschromatographische Analyse festgestellt werden. Die Isolierung und Reinigung der 2-Hydroxyphenylessigsäure aus dem Nährmedium kann nach bekannten Methoden erfolgen. Zweckmäßi- gerweise trennt man die feste Biomasse vom Nährmedium ab, extra¬ hiert den Wertstoff z. B. mit einem organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls nach vorausgegangener Ansäuerung des Mediums, und isoliert den Wertstoff aus der extrahierten Phase.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veran¬ schaulicht.

Beispiel 1

Test von Mikroorganismen auf ortho-Hydroxylierung von Phenyl¬ essigsäure

Reinkulturen von Mikroorganismen aus öffentlichen Stammsammlungen oder aus Bodenisolaten (Drews: Mikrobiologisches Praktikum, 3. Auflage, Springer Verlag 1976, Seite 47-48) wurden in einem Test daraufhin überprüft, ob sie Phenylessigsäure spezifisch in ortho-Position hydroxylieren können.

Dazu wurden die Stämme von Agarplatten in Flüssigmedium mit Phenylessigsäure angeimpft. Es wurde folgendes Medium verwendet (Ml-Medium) :

10 g/1 Glucose

5 g/1 Hefeextrakt (Difco)

5 g/1 (NH-,) ₂ S0 ₄

0,5 g/1 MgS0 ₄ x 7H ₂ 0

0,05 g/1 MnS0 ₄ x 4H ₂ 0 2 ml/1 Spurenelementlösung

1.5 g/1 KH ₂ P0 ₄

3.6 g/1 K ₂ HP0 ₄

Spurenelementlösung:

200 mg/1 Eisen(II) sulfat-1-hydrat

10 mg/1 Zink(II) sulfat-4-hydrat

3 mg/1 Manganchlorid-4-hydrat

30 mg/1 Borsäure 20 mg/1 Cobalt (II)chlorid-6-hydrat

1 mg/1 Kupfer (II)chlorid-2-hydrat

2 mg/1 Nickel(II)Chlorid-6-hydrat

3 mg/1 Natriummolybdat-2-hydrat

500 mg/1 Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)

Die Phenylessigsäure wurde als 25 %ige Lösung angesetzt, mit NaOH auf pH 7 titriert, autoklaviert und zu dem separat angesetzten Medium zugegeben.

250 ml-Erlenmeyerkolben wurden mit 30 ml Ml-Medium mit 1 g/1 Phe¬ nylessigsäure gefüllt, mit jeweils einem Mikroorganismenstamm von Agarplatten angeimpft und bei 25°C mit 180 U/min schüttelnd inku¬ biert. Nach 3, 7 und 10 Tagen wurde 1 ml des KulturüberStandes abgenommen, mit 100 μl 5 N Salzsäure und 800 μl Essigsäureethyles- ter versetzt und 15 s kräftig gemischt. 700 μl der Essigsäure- ethylesterphase wurden abgenommen und bei 50°C unter einem leich¬ ten Stickstoffström eingedampft. Der Rückstand wurde in 70 μl Es- sigsäureethylester gelöst und 50 μl davon in ein Probegläschen für die Gaschromatographie überführt. Dazu wurden 50 μl N-Methyl- N-trimethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA) gegeben und gemischt. Die Proben wurden gaschromatographisch untersucht. Als Vergleich diente eine authentische Probe 2-Hydroxyphenylessigsäure.

Mit Stämmen aus folgenden Gattungen wurde die Bildung von 2-Hydroxyphenylessigsäure beobachtet:

Pilze:

Absidia

Alternaria

Aspergillus Beauveria

Botryodiplodia

Botrytis

Byssochlamys

Candida Cephalosporium

Chaetomium

Cunninghamella

Curvularia

Dactylium Drechslera

Epicoccum

Fusarium

Geotrichum

Gibberella Gleophyllum

Gliocladium

Helminthosporium

Humicola

Hyphozyma Metarrhizium

Microascus

Mucor

Neurospora

Paecilomyces Penicillium

Phycomyces

Phyllosticta

Pythium

Rhizopus Septoria

Sphaceloma

Trichoderma

Trichosporon

Trichurus Verticillium

Streptomyceten:

Streptomyces aureofaciens Streptomyces hygroscopicus Streptomyces kasugaensis Streptomyces niveus Streptomyces roseochromogenus Streptomyces viridifaciens

Bakterien:

Bacillus Rhodococcus

Beispiel 2

Umsetzung von Phenylessigsäure mit DSM 7047

Medium 2 :

50 g/1 Glucose

10 g/1 Hefeextrakt (Difco)

10 g/1 (NH ₄ ) ₂ S0 ₄

0 , 5 g/1 MgS0 ₄ - 7H ₂ 0 3 , 6 g/1 K ₂ HP0 ₄

1 , 5 g/1 KH ₂ P0 ₄

10 ml/1 Spurenelementlösung

Vorkultur: DSM 7047 wurde von einer Agarplatte in 150 ml Medium 2 mit 1 g/1 Phenylessigsäure und zusätzlich 3 g/1 Carbopol® 946 in einem 1 1-Erlenmeyerkolben angeimpft und 3 Tage bei 30°C und 180 U/min geschüttelt.

Mit dieser Vorkultur wurde ein 1,5 1-Fermenter mit Medium 2 und 5 g/1 Phenylessigsäure angeimpft. Zusätzlich wurde 1 ml/1 Pluriol P 2000 zur Verhinderung der Schaumentwicklung zugegeben.

Der Fermenter wurde auf 30°C temperiert, mit 1 1 Luft pro Minute (= 0,66 vvm) begast und mit 600 U/min gerührt.

Nach 5 Tagen war die Phenylessigsäure vollständig zu 2-Hydroxy- phenylessigsäure umgesetzt.

Die Zellen wurden durch Watte-Filtration abgetrennt und mit 100 ml Wasser nachgewaschen. Die zellfreie Kulturbrühe und das Waschwasser wurden vereinigt, mit HC1 auf pH2 gestellt und zwei¬ mal mit dem gleichen Volumen tert-Butyl-methylether extrahiert.

Nach dem Eindampfen der organischen Phase bis zur Trockne wurde ein Rückstand von 8,2 g erhalten, der zu 98 % (ermittelt über GC-Analyse) aus 2-Hydroxyphenylessigsäure bestand. Die Struktur des Produkts wurde durch NMR bestätigt.

Beispiel 3

Verbesserte Fermentation von DSM 7047

Vorkultur und Animpfen des Fermenters wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt; der pH-Wert des Fermentationsmediums sank während der Fermentation von 6,8 auf 5,6 ab. Ein weiteres Ansäuern wurde durch Zugabe von Ammoniak kompensiert. Sobald die Phenylessig- säure-Konzentration auf einen Wert zwischen 2,5 und 1 g/1 abge- sunken war, wurden viermal 1 g/1 Phenylessigsäure zudosiert. Nach 7 Tagen war die Phenylessigsäure vollständig zu 2-Hydroxyphenyl- essigsäure umgesetzt.