EN C ₆ A C ₁₀

La présente invention concerne un procédé nouveau de préparation par voie enzymatique d'arômes, notamment des ionones et des aldéhydes en C ₆ à C ₁₀ . Elle concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'α-ionone optiquement active, de β- ionone, d'aldéhydes en C ₆ tels que le n-hexanal, le trans-2-hexénal, d'aldéhydes en C ₁₀ tels que les trans-2,cis-4-décadiénal et trans-2,trans-4- décadiénal.

La réalisation d'additifs aromatisants pose des problèmes complexes, car dans la plupart des denrées alimentaires, l'arôme naturel, que l'on cherche à retrouver par les aromatisants, est la résultante du mélange de multiples composants chimiques qu'il est le plus souvent difficile à déterminer avec exactitude.

On sait que deux voies s'ouvrent à la recherche des aromatisants : i) la production de molécules de synthèse strictement identiques aux molécules naturelles ; ii) la mise en oeuvre de procédés biotechnologiques tels que microbouturage, culture de cellules, fermentations microbiennes, génie enzymatique.

C'est cette dernière technique qui est utilisée dans la présente invention.

On sait que des ionones, et plus particulièrement 1'α-ionone et la 3-ionone se retrouvent dans 1•arôme de nombreux fruits tels que la framboise, la mûre, le cassis, la pêche, l'abricot, le melon, la tomate, dans

l'arôme de plantes telles que la violette, la Boronia meqastiqma, dans l'arôme de végétaux transformés tels que le thé noir, le tabac, la carotte, la vanille ou encore dans des champignons tels que la chanterelle.

Bien qu'elles soient présentes à de très faibles concentrations, ces substances jouent un rôle important dans 1'arôme de ces végétaux.

Par ailleurs, les "notes vertes", qui sont dues par exemple au n-hexanal (à odeur de pomme verte) ou au trans-2-hexénal (à odeur d'herbe fraîchement coupée) , sont extrêmement répandues parmi les plantes. Leur contribution à la note de fraîcheur des produits en fait des substances d'arôme de première importance.

D'autres composés sont issus, comme les ionones, de la dégradation oxydative de l'alpha et du bêta- carotène par les mêmes voies enzymatiques. On retiendra, entre autres, les composés suivants, qui peuvent être obtenus selon le procédé, objet de la présente invention :

- le dihydroactinidiolide, qui est une lactone, dont l'odeur puissante rappelle celle du thé. Ce composé présente donc un intérêt pour 1'industrie aromatique ;

- l'époxy-5,6-béta-ionone, qui possède une odeur se rapprochant de celle du bois de cèdre, est plus boisée que celle de la bêta-ionone. Ce composé présente donc aussi un intérêt pour 1'industrie des arômes.

On a renoncé à obtenir tous ces composés à partir de sources naturelles, dans lesquelles ils sont généralement présents en infimes quantités, ce qui en rend 1'extraction inintéressante pour des raisons économiques.

Divers travaux, dont ceux de GROSCH et coll, (J. Agric. Food Chem. 24, 456-459, 1976) décrivent un mécanisme enzymatique d'obtention des ionones, au

3 moyen de lipoxygenases et d'acides gras insaturés, pa co-oxydation des caroténoïdes.

Par ailleurs, FISCHER et GROSCH (Z. Lebenson.Unters.-Forsch, 165, 137-139, 1977) on obtenu divers aldéhydes tels que l'hexanal, le 2-4 décadiénal (deux diastéréoisomères) , le trans-2 hexénal et le trans-2-octénal, en mettant en présenc la lipoxygenase L ₂ du soja et de l'acide linoléique.

D'autre part, le brevet américain N° 4 769 24 décrit un procédé de préparation de notes vertes, telles que le n-hexanal, le l-pentène-3-ol, l trans-2-hexanal et le cis-2-pentènol (ex. 1 et 2, colonne 5) en utilisant un mélange constitué par u broyât de graines de soja, des acides gras insaturés, en présence d'eau (dans la proportion de 3 à 20 foi le poids des graines de soja) et d'un ajout de lipase. La température de la réaction se situe entre 5 e 60° C (de préférence 25 et 50° C) . Le mélange es maintenu sous agitation pendant une durée pouvan aller de 5 minutes à 24 heures (de préférence 3 minutes à 10 heures) , tout en procédant à un appor d'air ou d'oxygène au cours de la réaction.

Notons enfin que CHAN et coll. (Biochim. Biophys.Acta, 398, 347-350, 1975) montrent que s l'oxygène est limitant, la formation des aldéhydes longue chaine, tels que le 2,4-décadiénal, es favorisée par rapport à celle des aldéhydes en C ₆ .

Ces différents procédés enzymatiques conduisent la production d'aldéhydes et d'ionones, mais toujour en quantité difficilement exploitable sur le pla industriel.

Les présents inventeurs ont mis au point u procédé permettant 1'obtention d'arômes e concentration élevée.

Selon le procédé de la présente invention, on procède à la mise en contact d'une source ou préparation de lipoxygenase et d'hydroperoxyde-lyase, d'une source naturelle d'acides gras insaturés et éventuellement d'une source naturelle de carotène, en vue de biogénerer les aldéhydes naturels, et le cas échéant, les ionones.

Selon la présente invention, la réaction enzymatique se déroule dans un milieu "pâteux" à viscosité élevée, ce qui permet de limiter le transfert des produits dans le milieu et par conséquent, de minimiser l'effet inhibiteur que le produit exerce sur la réaction. En d'autres termes, 1•oxydation enzymatique de 1'invention s'effectue dans un milieu dont la teneur en eau est relativement faible, donc concentré en composants bioréactionnels. De ce fait, tout facteur qui augmentera le contact enzyme-substrats accélérera le développement des réactions enzymatiques. Le transfert gazeux est assuré par l'agitation du milieu. On favorisera donc les réactions enzymatiques en assurant un pétrissage intensifié des divers composants. Le rendement en substances d'arôme, obtenu selon le procédé de 1'invention est considérablement plus élevé que ceux obtenus selon les techniques antérieures.

Le milieu pâteux du procédé de l'invention est un milieu réactionnel à plusieurs phases comprenant notamment une phase solide, une ou plusieurs phases liquides et une ou plusieurs phases gazeuses, la phase solide et le(s) phase(s) liquide(s) étant présentes dans des proportions pondérales de 100 : 300 (solide : liquide) environ. La phase solide peut être constituée d'un mélange de solides différents, par exemple de différentes farines, de différents végétaux ou d'un mélange de farines et de végétaux. Là où les phases liquides comprennent au moins une phase huileuse.

Lorsqu'il y a une pluralité de phases liquides, il s'agit de liquides non miscibles.

Plus particulièrement, l'invention consiste en un procédé de préparation par voie enzymatique, d'arômes, notamment d'aldéhydes en C ₆ à C ₁₀ , par la mise en contact d'au moins une source de lipoxygenase et d'hydroperoxyde-lyase, avec une source d'acides gras polyinsaturés, la réaction s'effectuant sous agitation, en présence d'oxygène, dans un milieu à plusieurs phases comprenant au moins une phase solide et une phase huileuse caractérisé en ce que ledit milieu comporte, pour 100 parts de phase solide, 3 à 150 parts environ d'une phase huileuse, et éventuellement 0 à 250 parts environ d'une phase aqueuse.

Typiquement, le milieu est soit un milieu à trois phases : phase solide, phase huileuse et phase gazeuse, soit un milieu à quatre phases : phase solide, phase huileuse, phase aqueuse et phase gazeuse. Ces différentes phases sont entièrement, ou partiellement, fonctionnelles, c'est-à-dire qu'elles peuvent être constituées de réactifs impliqués dans la réaction enzymatique, mais peuvent également comprendre des agents de texture, contribuant à la texture "pâteuse" du milieu.

Les sources de lipoxygenase, d'hydroperoxyde- lyase, d'acides gras polyinsaturés et, le cas échéant, de carotène, ainsi que les agents de texture, sont choisis de façon à ce que le milieu réactionnel comporte toutes les phases évoquées ci-dessus, dans des proportions appropriées, pour l'obtention de la pâte. Par exemple, la source de lipoxygenase et d'hydropéroxyde-lyase peut constituer la phase solide ou une partie de cette phase, et la source d'acides gras polyinsaturés peut constituer la phase huileuse. La présence de la phase solide est indispensable pour

l'obtention d'un milieu "pâteux". Au sein des différentes phases, les concentrations des réactifs sont : i) phase solide activité lipoxygénasique : jusqu'à 1.5 mmole/min/g ;

- carotène : 2.5 à 3 parts pour mille parts de phase solide (poids/poids) , par exemple la partie solide du jus de carotte ;

- acides gras polyinsaturés : jusqu'à 2 % d'acide linoleïque, jusqu'à 2 % d'acide linolénique. ii) phase huileuse :

- acides gras polyinsaturés : jusqu'à 78 % d'acide linoleïque, jusqu'à 60 % d'acide linolénique ;

- carotène : jusqu'à 10 % (oléorésine) .

Les pourcentages indiqués ci-dessus pour les concentrations de réactifs sont des pourcentages poids/poids de la phase en question.

Le milieu est avantageusement un milieu à quatre phases, comportant pour 100 parts de phase solide, 3 à 120 parts de phase huileuse (par exemple 4 à 50) et 20 à 250 parts de phase aqueuse (par exemple 50 à 200) , la phase huileuse et la phase aqueuse représentant ensemble moins de 300 parts, et plus particulièrement moins de 250 parts. Typiquement, lorsque le milieu contient une source aqueuse de carotène, il comporte pour 100 parts de phase solide, 10 à 40 parts de phase huileuse et 80 à 200 parts de phase aqueuse. Lorsque le milieu ne contient pas de source aqueuse de carotène, il comporte de préférence pour 100 parts de phase solide, 3 à 100 parts de phase huileuse et jusqu'à 100 parts de phase aqueuse.

Les aldéhydes obtenus selon ce procédé sont issus de la dégradation oxydative des acides gras polyinsaturés. Ces composés d'arôme diffèrent selon la nature des acides gras insaturés utilisés.

Les ionones obtenus sont des a- et 3-ionones et des expoxy-ionones, et sont produits par la co- oxydation des caroténoïdes par les radicaux péroxyles, libérés au cours de la réaction d'oxydation des acides gras insaturés.

On notera tout particulièrement que l'α-ionone obtenue par le procédé est essentiellement la R(+)trans-α-ionone. Or cet énantiomère est majoritaire à plus de 90% dans les arômes naturels de framboise, violette, Boronia meqastiqma, thé noir, carotte ou encore de vanille.

Notons enfin, qu'il est possible de passer de l'aldéhyde (hexanal, hexénal) à l'alcool (hexanol, hexénol) en mettant en oeuvre des bioprocédés faisant appel à des alcool-déshydrogénases.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé comprend la mise en contact d'une source ou d'une préparation de lipoxygenase et d'hydroperoxyde-lyase, d'une source naturelle d'acides gras polyinsaturés et d'une source naturelle de carotène, la réaction s'effectuant dans un malaxeur, en milieu concentré à viscosité élevée, l'alimentation en oxygène du mélange réactionnel étant effectuée au cours du malaxage par un apport d'air ou d'oxygène ou d'un mélange air/oxygène. La pression qui règne dans le milieu réactionnel est au moins égale à la pression atmosphérique.

En ce qui concerne l'origine des différents composants du mélange bioréactionnel, les sources peuvent être les suivantes :

On utilisera comme source de lipoxygenases (E.C. 1.13.11.12), des substances plus ou moins purifiées, provenant de végétaux, d'animaux ou de micro¬ organismes. Les sources végétales sont particulièrement préférées, par exemple les oléagineux tels que le soja, le colza, le tournesol ; les

protéagineux tels que les pois, les fèveroles, les lupins ; les céréales telles que le blé, le maïs, l'orge, l'avoine, le riz, le seigle, le sarrasin, le sorgho et le triticale ; les tubercules tels que la pomme de terre ou le manioc. Les céréales peuvent être utilisées sous forme de grains entiers, de fraction de grains (résultant par exemple d'un traitement enzymatique, chimique, thermique ou mécanique du grain) , ou de tout autre produit issu du broyage du grain tel que la farine ou la semoule, à condition que leur activité enzymatique soit conservée. Par exemple, les sources de lipoxygenases peuvent être de la farine de soja enzymatiquement active, des graines de soja germées ou non. Dans ce dernier cas, les graines de soja germées ou non doivent, de préférence, être broyées à l'aide d'un broyeur ou d'un homogénéisateur, sans inactivation thermique des enzymes présentes. L'activité enzymatique de ces préparations peut être vérifiée en appliquant les méthodes décrites par GROSCH et al. (supra) .

On utilisera de préférence, la farine de soja, la farine de blé ou les germes broyés de maïs comme source de lipoxygenase et d'hydroperoxyde-lyase. Lorsque les enzymes sont utilisées sous cette forme, elles constituent la phase solide.

La source d'hydropéroxyde-lyase est normalement la même que la source de lipoxygenases. Cette enzyme catalyse le clivage des hydropéroxydes formés au cours de la réaction d'oxydation des acides gras, assurant ainsi la production des aldéhydes.

Les acides gras insaturés utilisés dans le procédé ont de préférence entre 8 et 20 atomes de carbone, et sont avantageusement polyinsaturés.

On utilisera comme source d'acides gras, des acides gras naturels tels que l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide α-linolénique, l'acide

eicosapentaénoïque, l'acide arachidonique et l'acide ricinoléique. On peut également utiliser des graisses ou des huiles d'origine végétale, animale ou microbienne, renfermant ces acides gras, et que l'on soumettra à une réaction de lipolyse de préférence par voie enzymatique grâce à une ou plusieurs lipases.

Ces graisses ou huiles d'origine végétale peuvent être, par exemple, les huiles de soja, de tournesol, de carthame, d'olive, de pépin de raisin, de germe de maïs, de germe de blé, d'arachide, de sésame, de noix, de lin, de graines de coton, de bourrache, d'onagre, de cynara, ainsi que le beurre de cacao.

Ces graisses peuvent être aussi d'origine animale comme le beurre, le lard, les huiles de morue, de sardines et divers autres poissons ou mammifères.

On effectuera l'hydrolyse au moyen d'une ou de plusieurs lipases ou d'une préparation de lipases, provenant de micro-organismes, de végétaux ou d'animaux. La préparation de lipase peut être purifiée ou non. Toute lipase capable d'effectuer la réaction sur la graisse ou l'huile choisi peut être utilisée. Il peut s'agir d'une préparation purifiée contenant une seule enzyme ou alternativement, un mélange de plusieurs enzymes présentant une activité de lipase. L'enzyme possédant une activité de lipase peut être immobilisée sur un support solide. Cette réaction peut être effectuée préalablement à la réaction lipoxygénasique ou concomitamment. La quantité de lipase(s) ajoutée variera généralement de quelques dizaines à quelques centaines d'unités par gramme d'huile ou de graisse.

La source d'acides gras polyinsaturés, accompagnée ou non de lipases, peut être ajoutée avant, pendant ou après le broyage ou le mélangeage des autres matières premières, de manière continue ou discontinue.

Lorsque le milieu contient une source de carotène, on utilisera le carotène naturel, provenant de plantes supérieures, d'algues ou de micro¬ organismes. Il s'agit d'α et de β -carotènes. Les meilleures sources sont la carotte, l'huile de palme et certaines algues. Le carotène peut être sous forme d'oléorésine, au quel cas, il fera partie de la phase huileuse. Il peut également être utilisé sous forme de solution aqueuse ou encore sous forme de suspension, par exemple un jus de carotte concentré contenant par exemple 20% de solides suspendus.

On ajoute une quantité convenable d'eau ou d'une solution renfermant les caroténoïdes, ou d'une autre phase aqeuse, de préférence correspondant à une valeur comprise entre 1/3 et 2 fois la masse de farine ou de graines de soja. La phase aqueuse peut être ajoutée avant, pendant ou après broyage ou mélangeage des autres matières premières, de manière discontinue ou continue.

Le milieu peut contenir également des agents de texture, par exemple la glycérine, ainsi que d'autres additifs tels que des agents émulsifiants ; des agents permettant d'optimiser l'activité enzymatique, par exemple le chlorure de calcium, le sulfate ferreux et l'acide ascorbique. Il est important d'inclure les proportions de ces additifs dans le calcul des parts de chaque phase.

La réaction est conduite en milieu concentré, à viscosité élevée, sous agitation, en présence d'air et/ou d'oxygène, sous pression.

De préférence, l'oxygène est présent sous forme d'un gaz comportant au moins 21% d'oxygène, par exemple l'air, l'air enrichi en oxygène ou l'oxygène pur. Ce gaz comportant au moins 21% d'oxygène constitue la phase gazeuse du milieu réactionnel. Son incorporation dans le milieu est de préférence telle

que la densité apparente finale, c'est-à-dire à l'issue de la réaction, soit comprise entre 0.9 à 0.4kg.L ^"1 , par exemple 0.5kg.L ^"1 , et est fonction des trois paramètres suivants : le débit de 1'oxygène ou de l'air, la pression sous laquelle la réaction est conduite et l'agitation. La "densité apparente" signifie la densité du milieu comprenant la phase gazeuse incorporée.

Le débit maximal d'air et/ou d'oxygène injecté au cours de la bioréaction peut atteindre 15 fois le volume du mélange bioréactionnel par minute, par exemple 2 ou 4 fois. Si le débit est trop important, il en résultera des pertes en arômes élevées par entraînement. On injectera de 0 à 15 litres/min par litre de milieu, par exemple de 1 à 2 1/min d'air et/ou d'oxygène pour 2 litres de mélange pâteux.

La pression d'air et/ou d'oxygène au sein du réacteur (mélangeur-malaxeur) est comprise entre la pression atmosphérique et 50 bar (environ 50 x 10 ⁵ Pa) , par exemple entre 8 bar (environ 8 x 10 ⁵ Pa) et 25 bar (environ 25 x 10 ⁵ Pa) .

Selon la quantité d'oxyqène, provenant de l'air et/ou de l'oxygène pur, injectée dans le réacteur et l'intensité de la pression qui y règne, la réaction aboutira à la formation d'aldéhydes "à chaîne courte" (tels que le n-hexanal, le trans-2-hexénal, etc..) ou d'aldéhydes "à chaîne longue" (tel que le 2,4- décadiénal, etc...) .

L'agitation du milieu est effectuée par tout moyen approprié, de préférence par un agitateur de type planétaire, utilisé à une vitesse de rotation comprise entre 20 à 200 t.min, par exemple 60 à 150 t.min ^"1 .

Au cours de la bioréaction, la température sera généralement comprise entre 10 et 60° C. de préférence entre 20 et 40° C.

En ce qui concerne la viscosité du milieu pâteux, elle peut être caractérisée à l'aide de deux types de mesures, à savoir : a) la force de compression, dont la valeur a été comprise au cours des essais effectués entre 3N (pour un mélange à 55% d'eau) et 5N (pour un mélange à 45% d'eau) ; b) la force d'adhérence, dont la valeur a été comprise au cours des essais effectués entre 5N et 8N.

La durée de la réaction sera généralement comprise entre 5 et 48 heures, de préférence entre 10 et 24 heures.

La réaction est normalement effectuée à un pH compris entre 4.5 et 10, plus généralement entre 5 et 7.

La fraction volatile renfermant les arômes sera extraite par tout moyen approprié, tel que l'hydro¬ distillation accélérée, par exemple dans un turbo- extracteur, ou par entraînement à la vapeur ou bien encore au moyen de C0 ₂ supercritique.

On procédera à une ultime étape de purification, dans laquelle il pourra être fait appel notamment à la distillation fractionnée, aux cyclodextrines.

Les rendements en ionones et en aldéhydes sont, selon l'invention, exploitables à l'échelle industrielle. Par exemple, la concentration en α- et 3-ionones peut atteindre entre 100 et 400mg.kg" ¹ milieu. La concentration en aldéhydes peut atteindre lOOOmg.kg ^"1 milieu.

Le procédé de l'invention, est appliqué, de préférence, pour la production d'α-ionones optiquement active, de ,9-ionones, de n-hexanal, de trans-2- hexénal, de trans-2,cis-4-décadiénal, de trans-2,trans-4-décadiénal, d'époxy-5,6-,9-ionone et de dihydroactinidiolide.

L'invention vise également un procédé de production, par voie enzymatique, d'alcool notamment des alcools en C ₆ à C ₁₀ , caractérisé en ce qu'il comporte : i) la préparation, selon le procédé de l'invention décrit ci-dessus, d'aldéhydes en C ₆ à C ₁₀ ; ii) la mise en contact des aldéhydes obtenus selon i) avec un ou plusieurs alcools- déshydrogénases ; iii) la récupération des alcools ainsi obtenus.

Selon cette variante de l'invention, un ou plusieurs alcools-déshydrogénases sont mis en oeuvre. Cette étape de la procédure peut être effectuée de manière concomitante avec la réaction d'oxydation, ou de manière successive. La production de cis-3-hexénol et d'hexanol est particulièrement préférée.

Les caractéristiques ci-dessus, ainsi que d'autres caractéristiques et avantages secondaires, apparaîtront de façon plus complète dans la description détaillée de modes de réalisations donnés à titre indicatif et non limitatif, par les exemples ci-après, en utilisant l'appareillage qui fait l'objet de la figure unique en annexe.

Sur cette figure, on a représenté de façon schématique un réacteur au sein duquel s'effectuent de façon avantageuse les opérations d'homogénéisation et de malaxage du mélange pâteux, d'oxygénation du mélange visqueux, ainsi que la bioréaction qui donne lieu à la formation des arômes par voie d'oxydation enzymatique.

Ce réacteur est composé d'une enceinte ou cuve étanche 1, dont la partie supérieure est obturée par un couvercle fixe 2 dans lequel peut tourner un plateau mobile 2a support d'un axe principal tournant 3. Des joints tournants 4 permettant la rotation dudit

plateau 2a, tout en laissant immobile la cuve 1 et en assurant 1'étanchéité.

Le couvercle fixe 2 est assemblé à la cuve 1 de manière étanche, par l'intermédiaire d'un joint fixe circulaire 5. Un outil tournant 6, assurant les fonctions de mélangeage et de malaxage, par mouvement planétaire, est entraîné en rotation par un axe secondaire tournant 7. Cet outil tournant 6, qui constitue le dispositif mécanique d'agitation du milieu visqueux 8, en assure simultanément l'homogénéisation et l'oxygénation au sein de l'enceinte étanche 1. Cet outil tournant peut être soit une boucle, soit une lame, soit une palette ou tout élément grillagé, en métal ou autre substance chimiquement inerte.

Une atmosphère libre 9, qui surmonte le milieu visqueux 8, composée d'air, d'un mélange air/oxygène ou d'oxygène pur, sous une pression de l'ordre de 1 à 8 bar, est au contact du milieu visqueux 8 brassé par l'outil tournant 6. Le milieu gazeux est injecté dans l'enceinte du réacteur au niveau d'un conduit d'alimentation 10a, alors qu'une fuite permanente du même milieu gazeux est prévue par l'intermédiaire d'un conduit 10b assurant une fuite contrôlée de manière à assurer le renouvellement du fluide gazeux en permanence, sur la base de 2 fois le volume du fluide par minute, tout en maintenant la pression dans l'enceinte à la valeur désirée pour la bioréaction.

Les effets conjugués de la pression et du renouvellement de l'atmosphère ont pour conséquence de parfaire les conditions d'oxygénation du milieu visqueux.

Les exemples ci-après, qui font appel au réacteur décrit ci-dessus, illustrent quelques compositions caractéristiques de mélanges, mettant en oeuvre le procédé selon la présente invention, en vue de

l'obtention par voie enzymatique d'ionones et d'aldéhydes en C ₆ -C ₁₀ . Dans tous les exemples, les compositions sont définies en pourcentage pondéral calculé sur la base de la masse totale des divers composants.

EXEMPLES

EXEMPLE 1

On a préparé le mélange bioréactionnel dans un mélangeur-malaxeur, du type du réacteur précédemment décrit, d'un volume intérieur de 6 litres, sous agitation.

Ce mélange est constitué par de la farine de soja (full-fat crue enzymatique) dans la proportion de 35,25%, de l'oléorésine de carotte dans la proportion de 4,41%, de l'huile de carthame dans la proportion de 9,30% et de l'eau dans la proportion de 48,96%.

Ces proportions correspondent à 100 parts de phase solide, 38.9 parts de phase huileuse et 138.9 parts de phase aqueuse.

On réalise ainsi une émulsion des composants dans la phase aqueuse. L'hydrolyse de l'huile de carthame se déroule en même temps que la genèse des substances d'arôme grâce à l'ajout de 828 KU de lipase. Les activités enzymatiques en jeu nécessitent l'apport de chlorure de calcium (à raison de 1,18%), de sulfate ferreux (à raison de 0,09%) et d'acide ascorbique (à raison de 0,01% environ).

On a obtenu un milieu pâteux, qui a été malaxé à raison de 90 t.min-i, à 25° C. L'apport en oxygène au mélange a été assuré par un débit continu d'oxygène pur à raison de 0,5 L.min-1, sous la pression atmosphérique.

La densité apparente du milieu est comprise entre 0.7 et 0.8 kg.l ^"1 .

Les substances d'arôme synthétisées ont été extraites par entraînement à la vapeur, sous pression atmosphérique, pour différentes durées de bioproduction. La fraction volatile est analysée par chromatographie en phase gazeuse et éventuellement par spectrométrie de masse.

Les meilleures concentrations en ionones, obtenues après une durée d'essai de 26 heures, sont de 95mg.kg-ι de pâte pour l'α-ionone et de 300mg.kg-ι de pâte pour la _/ 0-ionone. La concentration en époxy-5,6- ?-ionone est de 575mg.kg-ι de pâte et la concentration en dihydroactinidiolide est de I30mg.kg-1 de pâte.

L'α-ionone produite est optiquement active. L'énantiomère obtenu est très majoritairement la R(+)trans-α-ionone.

EXEMPLE 2

On a répété le protocole décrit dans 1'exemple 1, à ceci près que le débit de l'oxygène apporté au mélange bioréactionnel est double (1 L.min-1) .

La durée de la bioréaction a été encore de 26 heures et 1'on a constaté que les concentrations en ionones et en dihydroactinidiolide étaient similaires à celles obtenues dans l'exemple 1.

Pour les quatre composés pris en considération, on a constaté que les concentrations maximales étaient atteintes plus rapidement.

EXEMPLE 3

On a répété le protocole décrit dans 1'exemple 1, à ceci près que 1'apport en oxygène au mélange bioréactionnel est assuré par un débit continu d'air à raison de 1,5 L.min ^"1 .

La durée de la bioréaction a été encore de 26 heures et 1'on a constaté que les concentrations en époxy-5,6-3-ionone et dihydroactinidiolide ont été en

croissant tout au long de la durée de 1'essai et ont respectivement atteint à la 26ème heure les valeurs de lOOO g.kg ^"1 de pâte et de 300mg.kg ^"1 de pâte.

En ce qui concerne les concentrations en β- et α-ionones, elles ont atteint leurs valeurs maximales à la 20ème heure et sont demeurées stables jusqu'à la fin de la durée de la bioréaction. A la 26ème heure, les concentrations en β- et α-ionones ont été respectivement de 230mg.kg ₁ de pâte et de lOOmg.kg ^"1 de pâte.

EXEMPLE 4

On a préparé le mélange bioréactionnel dans un mélangeur-malaxeur du type du réacteur précédemment décrit, d'un volume intérieur de 6 litres, sous agitation.

Dans cet exemple, le mélange est constitué par du jus de carotte (20% solides suspendus) dans la proportion de 65,87%, de la farine de soja dans la proportion de 25,80% et de l'huile de carthame dans la proportion de 6,81%.

Ces proportions correspondent à 100 parts de phase solide, 17.47 parts de phase huileuse et 134.9 parts de phase aqueuse.

On a procédé à un ajout de 595 KU de lipase, ainsi qu'à un apport de chlorure de calcium (à raison de 0,86%), de sulfate ferreux (à raison de 0,07%) et d'acide ascorbique (à raison de 0,01% environ).

On a obtenu un milieu pâteux, qui a été travaillé dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2 (débit continu d'oxygène pur, à raison de 1 L.min ^"1 , sous la pression atmosphérique) .

Après 12 heures de bioréaction, les concentrations en β- et α-ionones ont respectivement atteint les valeurs de 2l0mg.kg ^"1 de pâte et I85mg.kg" ¹ de pâte.

En ce qui concerne les concentrations en époxy-5,6-)0-ionone et en dihydroactinidiolide, elles ont respectivement atteint les valeurs de I40mg.kg ^"1 de pâte et 20mg.kg ^"1 de pâte après 12 heures de bioréaction.

A la 24ème heure, elles ont été respectivement de 5l0mg.kg ^"1 de pâte et de 50mg.kg ^*1 de pâte.

En outre, on a obtenu à la 24ème heure, des concentrations appréciables de n-hexanal et de 2,4- décadiénal (formes trans-2,trans-4-décadiénal et trans-2,cis-4-décadiénal) , qui atteignaient respectivement les valeurs de 950mg.kg ^"1 et I020mg.kg ^"1 de pâte.

EXEMPLE 5

On a répété le protocole décrit dans 1'exemple 4, à ceci près que l'on a omis les apports en sulfate de fer et en acide ascorbique.

La durée de la bioréaction a été de 28 heures et 1'on a constaté que les concentrations en β- et α- ionones ont atteint respectivement après 16 heures de bioréaction les valeurs de 255mg.kg ^"1 de pâte et de lδOmg.kg ^"1 de pâte.

En ce qui concerne les concentrations en époxy-5,6-,9-ionone et dihydroactinidiolide, elles ont respectivement atteint les valeurs de δOmg.kg ^"1 de pâte et 85mg.kg ^"1 de pâte après 16 heures de bioréaction.

En outre, on a obtenu à la 16ème heure des concentrations en n-hexanal et en 2,4-décadiénal respectivement de I55mg.kg ^"1 de pâte et de 200mg.kg ^"1 de pâte. Des mesures effectuées à la 21ème heure de bioréaction ont donné les valeurs respectives de 220mg.kg ^"1 de pâte et de 2l0mg.kg ^"1 de pâte.

EXEMPLE 6

On a répété le protocole décrit dans l'exemple 5, à ceci près que l'on a fait passer dans le mélange

bioréactionnel un débit double d'oxygène (2 L. in ^"1 , sous la pression atmosphérique) .

La durée de la bioréaction a été encore de 28 heures et 1•on a constaté que les concentrations en β- et α-ionones ont atteint respectivement après 16 heures de bioréaction les valeurs de lδOmg.kg ^"1 de pâte et de I30mg.kg ^"1 de pâte. Des mesures effectuées à la 28ème heure de bioréaction ont donné les valeurs respectives de 270mg.kg ^"1 de pâte et de 175mg.kg ^"1 de pâte, soit des valeurs en accroissement de l'ordre de 50%.

En ce qui concerne la concentration en époxy-5,6-3-ionone, elle a été de I30mg.kg ^*1 de pâte à la 16ème heure et a atteint la valeur de 255mg.kg ^"1 de pâte à la 28ème heure. La concentration en dihydroactinidiolide avait alors atteint la valeur de lOOmg.kg ^*1 de pâte.

En ce qui concerne les concentrations en n- hexanal et en 2,4-décadiénal, elles ont atteint respectivement après 21 heures de bioréaction les valeurs de 920mg.kg ^"1 de pâte et 280mg.kg ^"1 de pâte.

EXEMPLE 7

On a préparé le mélange bioréactionnel dans un mélangeur-malaxeur du type du réacteur précédemment décrit, d'un volume intérieur de 6 litres, sous agitation.

Dans cet exemple, le mélange est constitué par du jus de carotte concentré (20% solides suspendus) dans la proportion de 77,67%, de la farine de soja dans la proportion de 16,05% et de l'huile de carthame dans la proportion de 5,18%.

Ces proportions correspondent à 100 parts de phase solide, 16.40 parts de phase huileuse et 196.36 parts de phase aqueuse.

On a procédé à un ajout de 450 KU de lipase, ainsi qu'à un apport de chlorure de calcium (à raison de 0,65%) .

On remarquera que dans cet exemple, comparativement aux exemples 4, 5 et 6, la concentration en jus de carotte a été accrue et que, corrélativement, les concentrations en farine de soja, huile de carthame et en lipase ont été diminuées.

Le mélange bioréactionnel obtenu a été travaillé dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2 (débit d'oxygène : 1 L. in ^"1 , sous la pression atmosphérique) .

La durée de la bioréaction a été de 35 heures et 1*on a constaté que les concentrations en β- et α- ionones n'ont été respectivement que de 78mg.kg' ¹ de pâte et de 70mg.kg ^'1 de pâte à la 35ème heure. En outre, elles n'ont été qu'en très faible croissance au cours du déroulement de la réaction jusqu'à la 35ème heure.

En ce qui concerne la concentration en époxy-5,6-?-ionone, elle a été de 70mg.kg" ¹ de pâte après 35 heures de bioréaction. Au même moment, la concentration en dihydroactinidiolide atteignait la valeur de δOmg.kg ^"1 de pâte.

En ce qui concerne les concentration en n-hexanal et en 2,4-décadiénal, elles ont atteint respectivement après 35 heures de bioréaction, les valeurs de 250mg.kg ^"1 de pâte et de 75mg.kg ^"1 de pâte.

EXEMPLE 8

On a préparé le mélange bioréactionnel dans un mélangeur-malaxeur du type du réacteur précédemment décrit, d'un volume intérieur de 80 litres, sous agitation.

Ce mélange est constitué par du jus de carotte concentré (20% solides suspendus) dans la proportion de 55,50%, de la farine de soja dans la proportion de

37,50% et de l'huile de carthame dans la proportion de 5,72%.

Ces proportions correspondent à 100 parts de phase solide, 11.76 parts de phase huileuse et 91.02 parts de phase aqueuse.

On a procédé à un ajout de 16 500 KU de lipase, ainsi qu'à un apport de chlorure de calcium (à raison de 0,72%) .

On a obtenu un milieu pâteux, qui a été malaxé à raison de 70 t.min ^"1 , à 26° * 1° C. L'apport en oxygène au mélange a été assuré par un débit continu d'air à raison de 10 L.min ^"1 environ. L'atmosphère qui surmontait le milieu bioréactionnel était sous une pression de 2 bars.

La durée de la bioréaction a été de 40 heures et 1•on a constaté que la concentration en α-ionone produite a été de 230mg.kg ^"1 de pâte à la 40ème heure, alors qu'elle n'était que de llOmg.kg ^"1 de pâte après 24 heures de bioréaction.

On a constaté que la 0-ionone n'était présente qu'à l'état de traces.

En ce qui concerne la concentration en époxy-5,6-,9-ionone, elle est demeurée faible tout au long de la bioréaction et n'atteignait que la valeur de 23mg.kg ^"1 de pâte à la 30ème heure.

En ce qui concerne la concentration en n-hexanal, celle-ci n'a cessé de croître tout au long de la bioréaction pour atteindre 802mg.kg ^"1 de pâte à la 24ème heure et 9δ0mg.kg ^"1 de pâte à la 40ème heure.

En ce qui concerne le 2,4-décadiénal, il en a été de même, et cela dans des proportions encore plus prononcées puisque sa concentration qui atteignait llômg.kg ^"1 de pâte à la 24ème heure est montée jusqu'à 232mg.kg ^"1 de pâte à la 40ème heure, soit un doublement de sa valeur.

EXEMPLE 9

On a préparé le mélange bioréactionnel dans un mélangeur-malaxeur du type du réacteur précédemment décrit, d'un volume intérieur de 6 litres, sous agitation.

Ce mélange est constitué par de la farine de soja dans la proportion de 47,30%, de l'huile de carthame dans la proportion de 1,97% et de l'eau dans la proportion de 49,27%. On a réalisé ainsi une émulsion des composants dans la phase aqueuse.

Ces proportions correspondent à 100 parts de phase solide, 4.16 parts de phase huileuse, 103.9 parts de phase aqueuse.

On a procédé à un ajout de 347 KU de lipase, ainsi qu'à un apport de chlorure de calcium (à raison de 0,80%), de sulfate ferreux (à raison de 0,07%) et d'acide ascorbique (à raison de 0,01% environ).

On a obtenu un milieu pâteux, qui a été malaxé à raison de 110 t. in ^"1 , à 26° ± 1° C. L'apport en oxygène au mélange a été assuré par un débit continu d'air à raison de 1,66 L.min ^"1 , sous la pression atmosphérique.

Les substances d'arôme synthétisées ont été extraites par entraînement à la vapeur, sous pression atmosphérique, pour différentes durées de bioréaction.

La durée de la bioréaction a été de 23 heures et 1'on a constaté que les concentrations en n-hexanal et en 2,4-décadiénal, les principaux composés d'arôme obtenus dans le présent essai ont atteint respectivement après 23 heures de bioréaction les valeurs de 1,71g.kg ^*1 de pâte et de 0,70g.kg" ¹ de pâte.

L'analyse de la fraction volatile par chromatographie en phase gazeuse a révélé en outre la présence de trans-2-hexénal, de trans-2-nonénal, de 2,6-nonadiénal, notamment.

EXEMPLE 10

On a répété le protocole décrit dans l'exemple 9, à ceci près que l'on a augmenté la quantité d'huile de carthame dont la concentration a été accrue au détriment de celle de la farine de soja (45,33%), (100 parts de phase solide, 8.76 parts de phase huileuse et 108.4 parts de phase aqueuse).

On a obtenu un milieu pâteux, qui a été malaxé à raison de 100 t.min ^"1 , à 25° ± 1° C. La durée de la bioréaction a été de 23 heures et l'on a constaté que les concentrations en n-hexanal et en 2,4-décadiénal ont atteint respectivement à la 23ème heure les valeurs de 3,40g. g ^"1 de pâte et de 0,86g.kg ^"1 de pâte.

EXEMPLE 11

On a préparé le mélange bioréactionnel dans un mélangeur-malaxeur du type du réacteur précédemment décrit, d'un volume intérieur de 80 litres, sous agitation.

Ce mélange est constitué par de la farine de soja dans la proportion de 50,23%, de l'huile de carthame dans la proportion de 3,59% et de l'eau dans la proportion de 44,65%. On a réalisé ainsi une émulsion des composants dans la phase aqueuse.

Ces proportions correspondent à 100 parts de phase solide, 6.96 parts de phase huileuse et δ9.25 parts de phase aqueuse.

On a procédé à un ajout de 14 600 KU de lipase, ainsi qu'à un apport de chlorure de calcium (à raison de 0,73%), de sulfate ferreux (à raison de 0,07%) et d'acide ascorbique (à raison de 0,01% environ).

On a obtenu un milieu pâteux, qui a été malaxé à raison de 70 t.min ^"1 , à 32° ± 1 C. L'apport en oxygène au mélange a été assuré par un débit continu d'air à raison de 10 L.min ^'1 environ. L'atmosphère qui surmontait le milieu bioréactionnel était sous une pression de 2 bars.

La durée de la bioréaction a été de 17 heures. On a constaté que les deux principales substances d'arôme présentes dans la fraction volatile étaient le n- hexanal et le 2,4-décadiénal. Elles ont respectivement atteint les concentrations de 2,99g.kg ^"1 de pâte et de 0,40g.kg ^"1 de pâte à la 17ème heure de bioréaction.

Bien que le présent procédé ait été décrit en se référant à des exemples spécifiques de réalisation, il est bien évident à tout spécialiste dans ce domaine technique que 1'on peut lui apporter diverses modifications de détail sans sortir pour autant du cadre de l'invention.