Die Festphasensynthese von Oligomeren oder kleineren organischen Verbindungen an quellbaren oder nicht quellbaren Trägermaterialien findet meistens an Harzen aus relativ inerten Polymeren (z. B. hochvernetztem Polystyrol) statt, die zu kleinen monodispersen Kügelchen oder zu Pulvern mit einer definierten Zahl von funktionellen Gruppen an ihrer Oberfläche gefertigt sind. Nach Abschluß der Synthese bzw. entsprechender Entschützungsprozeduren, die in getrennten Reaktionskammern stattfinden, können diese Produkte in geeigneten Gefäßen aufgefangen werden. Das ursprüngliche Raster, also die Anordnung bei der Synthese geht dabei verloren oder muß durch aufwendige Maßnahmen wiederhergestellt werden, z. B. durch Umpipettieren. Mit dieser Methode ist es damit fast unmöglich ganze Molekülbibliotheken aufzubauen.

Desweiteren gibt es die Synthese von"spatially addressable combinatorial libraries", also Molekülbibliotheken, bei denen die Information über die Sequenz bzw. die durchgeführten chemischen Schritte über die x, y-Anordnung festgelegt sind.

Hier ist insbesondere die parallele Synthese von"Molekül- Arrays"nach der SPOT-Methode (Frank, R., Tetrahedron 48, S.

9217-9232,1992) auf porösen Membranen hervorzuheben, deren hauptsächlicher Nachteil in einem hohen Zeitaufwand sowie in einem nur mangelhaft entwickelten Automatisierungsgrad besteht.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, eine Vorrichtung bereitzustellen, mit der eine automatisier- bare Methode zum Binden von Polymeren, insbesondere zum Aufbau von Molekülbibliotheken, durchgeführt werden kann.

Die Automatisierung der Synthese von Molekülbibliotheken auf Membranoberflächen erfolgt durch den Einsatz einer erfindungsgemäßen Durchflußeinrichtung.

Durchflußeinrichtungen werden bisher nur zu Filtrationszwecken eingesetzt und sind z. B. von der Firma Schleicher & Schüll, 37582 Dassel erhältlich.

Vorteilhafterweise wird eine Durchflußeinrichtung in Form eines Syntheseblocks gemäß Fig. 1 eingesetzt. Die einzelnen Teile des Syntheseblocks sind in den Fig. 2a-2e gezeigt.

Dieser Syntheseblock zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß ein inertes Material verwendet wird, vorzugsweise Delrin, PTFE oder keramische Materialien.

Der in Fig. 1 gezeigte Syntheseblock zeichnet sich durch einen dreiteiligen Aufbau aus, wobei zwischen Teil I und Teil II eine Synthesemembran angeordnet ist.

Teil I enthält nebeneinander angeordnete Bohrlöcher, die einen Innendurchmesser von ca. 3 mm haben, wobei die Bohrloch- Durchmesser natürlich jede für die jeweilige Anwendung geeignete Größe haben können. An der Unterseite ist jedes Bohrloch durch einen Dichtring, z. B. aus PFTE/Silikon, abgedichtet. Die Anzahl der Bohrlöcher beträgt mindestens 96, verzugsweise 384 oder mehr.

Teil II weist vorzugsweise folgenden Aufbau auf : Unterhalb der x, y-Löcher von Teil I befindet sich eine grobporige Membran bzw. Platte, z. B. aus PE, PP, PFTE oder Delrin, von mehreren mm Dicke, vorzugsweise 2-15 mm, ganz bevorzugt 4-10 mm, als Unterlage für die vorzugsweise funktionalisierte Synthesemem- bran, die zwischen Teil I und II zu liegen kommt. Die Porengröße der grobporigen Membran beträgt vorzugsweise von 100 bis 250 ym, bevorzugt 120 bis 200/mi. In einer 1. Ver- tiefung von Teil II befinden sich eine entsprechende Anzahl von Bohrlöchern, die ebenso wie in Teil I mindestens 96, vorzugsweise 384 oder mehr, beträgt und auch mit jeweils einem Dichtring, z. B. aus PFTE/Silikon, abgedichtet sind. In einer 2. Vertiefung von Teil II wurde zur besseren Durchspülungs- und Absaugmöglichkeit ein Saugkanal zur Anlegung eines Vakuums vorgesehen. Durch diesen Aufbau von Teil II, insbesondere durch die grobporige Membran als Unterlage für die Synthese- membran, wird ein angelegtes Vakuum auch auf solche Regionen ausgeweitet, die außerhalb der Dichtungsringe liegen. Das Ansammeln und Verschleppen von unerwünschten Reagenzien wird so verringert. Außerdem ermöglicht diese Modifikation, daß mit einem einzigen Unterbau (Teil II und III) mehrere Reaktortypen (96-Loch, 384-Loch) verwendet werden können.

Teil III enthält eine Vorrichtung in Form mindestens eines Ansaugstücks, um an die Apparatur ein Vakuum anlegen zu können. Ebenso wie die Teile I und II weist Teil III nebeneinander angeordnete Bohrlöcher auf, die vorzugsweise in Anzahl und Größe denen der Teile I und II entsprechen. Eine bevorzugte Modifikation ist das Vorhandensein eines zweiten Vakuumkanals in Teil III, der verhindern soll, daß sich Reagenzien am äußeren Rand der Membran ansammeln. Die beiden Vakuumbereiche (Vakuumkammer unter der Membran, Vakuumkanal für die Randbereiche) sind durch Dichtungen, vorzugsweise aus Silikon, getrennt und können mit verschiedenen Unterdrücken betrieben werden.

Der Zusammenbau der Apparatur erfolgt durch Übereinanderlegen der Teile, wobei zur Arretierung noch Sicherungseinrichtungen, z. B. in Form von Schnallen, vorhanden sind.

Die sich zwischen Teil I und Teil II befindliche Synthesemembran ist eine solche, die sich zum Binden von Polymeren eignet und weist eine Porengröße von 0,1-bis 1,3/mi, bevorzugt 0,2 bis 1,0 jum auf. Eine solche Membran kann aus allen auf diesem Gebiet üblichen Materialien bestehen und sollte vorzugsweise an ihrer Oberfläche funktionelle Gruppen, wie Hydroxyl-, Amino-, Amid-, Phosphat-, Alkyl-, Halogen-, Carboxyl-, Carbonyl-, Thio-, Arylgruppen, Ethengruppen (z. B. Vinyl-, Vinyloxy-, Vinyloxycarbonyl sowie die entsprechenden reinen Thio-bzw. gemischten Thio-Analoga) oder Ethingruppen tragen. Als Grundmaterialien der Membranen eignen sich Nylon, Polyamid, Cellulose, Polypropylen, PFTE, Polyolefin, Polyethy- len oder Polystyrol, Polyvinylidenfluorid, Glasfiber, PVC, Polymethylpenten, Polynorbornen-Copolymere (z. B. Topas, Fa. Hoechst). Ganz bevorzugt handelt es sich bei der verwendeten Membran um eine Membran aus oberflächenoxidiertem (hydro- philisiertem) Polypropylen, das entsprechend derivatisiert wurde.

In bevorzugter Weise weist die Membran Kompartimente auf, die einmal automatisch dadurch entstehen, daß die Membran in den Syntheseblock eingespannt wird und durch die Dichtringe an der Unterseite von Teil I des Syntheseblocks Abschnürungen entstehen, die eine seitliche Abgrenzung der runden Reaktions- flächen bewirken. Die seriell aufzutragenden Reagentien, insbesondere die aktivierten Monomere bei der Herstellung einer Molekülbibliothek, werden nun exakt dosiert zugegeben, um laterale Kontaminationen zu vermeiden. Das abgegebene Volumen sollte so bemessen sein, daß die entstehenden Flecken nicht ineinanderlaufen. Alle parallel verlaufenden chemischen Schritte, z. B. Aufbringen der Waschlösungen, erfolgt im Überschuß, d. h. die Chemikalien verteilen sich in allen Reaktionskammern, werden aber durch ein angelegtes Vakuum durch die Unterlage nach unten abgesaugt. Seitlich wird vorzugsweise ein weiteres Vakuum angelegt, um überschüssiges Reagenz abzusaugen (vgl. Fig. 2e).

Andererseits können schon vorher auf der Membran abgeschweißte Bereiche aufgebracht werden, die exakt den Löchern der Teile I und II des Syntheseblocks entsprechen und in diese eingepaßt werden müssen. Dadurch entsteht formal eine den üblichen Syn- theseformaten identische Anordnung mit relativ kleinen, gegeneinander abgegrenzten Membranflächen. Dies funktioniert in der Weise, daß die Membran in den Syntheseblock eingelegt wird. Durch Abdrücken der Dichtungsringe und Anlegen eines erhöhten Drucks und/oder Temperatur oder durch Abdichten mit einem inerten thermoplastischen Kunststoff (z. B. niedrig schmelzendes Polypropylengranulat) unterhalb der Dichtungen entstehen einzelne abgetrennte Reaktionskammern. Reagentien, die seriell oder parallel aufgetragen werden sollen, können nun auch im Überschuß aufgebracht werden, ohne daß es zu einer lateralen Kontamination kommt, weil die Membrankompartimente gegeneinander abgedichtet sind. Es entsteht eine"Spiegelei"- Struktur, deren abgegrenzte Einheiten einen Vorteil hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationen und Verschleppen von Reaktanten über die gesamte Membran.

Reagentien werden über handelsübliche Synthesizer (z. B.

Spotsynthesizer der Fa. Abimed Analysentechnik, Langenfeld, Deutschland) in die Löcher von Teil I des Syntheseblocks auf die Membranoberfläche pipettiert und dort kovalent durch eine chemische Reaktion gebunden. Überschüssige Reagentien bzw. W- aschlösungen werden mittels Vakuum abgesaugt. Dadurch verkürzt sich die Zykluszeit erheblich, die Bindung der Polymere an der Membranoberfläche und somit der Aufbau einer Molekülbibliothek erfolgt um ein Vielfaches schneller. Neben der minimierten Synthesezeit ermöglicht die nach wie vor vorhandene Membran- struktur, daß die komplette Membran nach beendeter Synthese einem Screening-Verfahren (z. B. Hybridisierung einer radioaktiv markierten DNA-Sonde aufgrund spezifischer Basenpaarung) unterzogen werden kann. Dies findet statt, ohne daß die Oligomeren in andere Gefäße wie im Stand der Technik überführt werden oder auf anderen Trägern verankert werden müssen. Dadurch ist gewahrleistet, daß beispielsweise die gesamte Molekülbibliothek unter exakt gleichen Bedingungen auf spezifische Wechselwirkungen hin überprüft werden kann.

Unter Polymeren sollen verzugsweise DNA, RNA, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Nukleinsäureanaloga (z. B. PNA, LNA) verstanden werden.

Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen : Fig. 1 : Syntheseblock Fig. 2 : Aufbau des Syntheseblocks a : Syntheseblock Teil I Aufischt b : Syntheseblock Teil I Unterseite c : Syntheseblock Teil I Unterseite, Bohrloch vergrößert d : Syntheseblock Teil II Aufsicht e : Syntheseblock Teil III Aufsicht Fig. 3 : a : Membran hybridisiert mit d (T) 16 33PyATP b : Membran zusätzlich hybridisiert mit d (C) 16 33PyATP c : Kontrolle Die Erfindung wird weiter anhand des Beispiels beschrieben : Beispiel Membran : hydrophilisiertes Polypropylen, Porengröße 0,2/mi, umgesetzt mit Trisamin-Jeffamin 500 (bisfunktionelles Amino- Polyethylenglykol) nach Carbonyldiimidazol-Aktivierung Beladung : 0,12 µmol/cm² Vorbehandlung : Membran mit einer Mischung aus 2 ml NMP, 33 ylDiisopropylcarbodiimid (DIC), 62,0 mg Fmoc-ß-Ala-OH, 27,0 mg HOAt eingeschweißt und 3 h bei 37°C inkubiert.

Reaktionszyklus : -C ap p i n g i n 2 0 m l D M F + 6 0 0 yl Essigsäureanhydrid ; 30" Capping in 20 ml DMF+600, l Essigsäureanhydrid ; 2' 2 x waschen in DMF, 2'und 5' 2 x waschen in Ethanol, 2'und 5' 2 x waschen in DMF, 2'und 5' -entschützen in 20% Piperidin in DMF 2 x waschen in DMF, 2'und 5' 2 x waschen in Ethanol, 2'und 5' 2 x waschen in DMF, 2'und 5' Färben in 20 ml DMF + 600 yl BPB- Stammlösung, 10 mg/ml -Entfärben in Ethanol -trocknen Aus allen zu spottenden Aminosäuren wurden 0,3 molare Stammlösungen in NMP hergestellt und über Molsieb bei 4°C aufbewahrt.

Vor dem Spotten wurde die jeweilige Stammlösung aufgewärmt und im Verhältnis 1 : 1 : 1 mit 0,3 molarer HOAt-Stammlösung und 0,4 molarer DIC-Stammlösung gemischt. Von dieser Mischung wurden 0,2 y1 pro Spot auf die Membran aufgetragen. Dies wurde 3 x wiederholt, die Reaktionszeit nach jedem Auftragen betrug jeweils 20-40 min.

Gespottet wurde ein 8x12-Raster im Mikrotiterplattenformat.

Nach jeden Spotzyklus wurde der folgende, an die Apparatur gemäß Fig. 1 angepaßte Reaktionszyklus gefahren : -Capping in 20 ml DMF+600. 1 Essigsäureanhydrid (+ 600 y1 Pyridin) ; 200 y1 pro Spot ; 10'Reaktionszeit, absaugen -2 x waschen in DMF ; 200 Al pro Spot ; permanent absaugen -2 x waschen in Ethanol ; permanent absaugen -2 x waschen in DMF ; permanent absaugen -entschützen in 20 % Piperidin in DMF ; 10' Reaktionszeit, absaugen 2 x waschen in DMF ; 200 y1 pro Spot ; permanent absaugen 2 x waschen in Ethanol ; permanent absaugen -mindestens 45'trockensaugen.

Folgende Linkermoleküle werden aufgetragen : -Fmoc-Rink-Handle (in Array 1, Zeilen 1-4) bzw. Fmoc-ß-Ala-OH (in Array 2 und 3, Zeilen 5-8 und 9-12) -Fmoc-Lys (Dansyl)-OH.

Danach wurden 10 Zyklen mit Fmoc-A (aeg)-OH (Zeilen 1,5,9) ; Fmoc-C (aeg)-OH (Zeilen 2,6,10) ; Fmoc-G (aeg)-OH (Zeilen 3,7, 11) bzw. Fmoc-T (aeg)-OH (Zeilen 4,8 12) gespottet.

Die Membran wurde in die 3 Arrays aufgeteilt, Array 1 und 3 eingefroren.

Endbehandluncr für Arrav 2 : Array 2 wurde 10 min bei RT in 9,5 ml TFA, 500 yl Triisobutylsilan inkubiert (Abspaltung der Seitenschutzgruppen), 2 x in DMF und 1 x in Ethanol gewaschen und getrocknet. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Danach wurde Array 2 in Hybridisierungslösung (d (T) 16 33PyATP) für 30'bei RT inkubiert und gewaschen. Die Membran wurde dann über Nacht auf einem Phos-phorimager-Screen exponiert. Es zeigte sich das in Fig. 3a gezeigte Bild.

Die Membran wurde anschließend gewaschen und zusätzlich in <BR> <BR> <BR> Hybridisierungslösung (d (C) 16 33PyATP) für 30'bei RT inkubiert, gewaschen und für 4 Tage auf einen Phosphorimager-Screen exponiert. Die Signale sind deutlich wie in Fig. 3b gezeigt.

Die Effizienz der ersten Kopplung kann anhand der Fluoreszenz- Intensität des ersten ankondensierten Bausteins ermittelt werden. In diesem Fall wurde Fmoc-Lys (Dansyl)-OH als erster Baustein eingesetzt. Wird dieser Fluoreszenz-Label während der Synthese an bestimmten Punkten nur eingesetzt, kann über die relative Intensität die Kondensationsausbeute bestimmt werden.

Es ergibt sich bei 353 nm (normale W-Lampe) das in Fig. 3c gezeigte Bild. Hieraus läßt sich erkennen, daß die Verteilung der Spots punktuell stattfand und keine Kreuzkontamination erfolgt.