DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention se rapporte au domaine de la spectroscopie de fluorescence par corrélation temporelle pour la détection et l'analyse de molécules luminescentes ou optiquement diffusantes en solution, ces molécules pouvant être fluorescentes sous l'effet d'une lumière excitatrice.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE Dans des modes classiques de détection de molécules luminescentes optiquement diffusantes, il est connu d'utiliser des systèmes de microscopie confocale. Dans le cas de l'analyse de particules fluorescentes, ces systèmes comprennent une source laser émettant un faisceau laser d'excitation, un miroir dichroïque, un objectif de microscope à grandissement et ouverture numérique élevés, un dispositif de conjugaison optique, un filtre spatial et enfin un détecteur. Le faisceau laser d'excitation est rendu convergeant par l'objectif de microscope en un point de focalisation situé au niveau des particules que l'on souhaite analyser, ces particules étant en solution sur un substrat passif du point de vue optique (une lame de verre). La lumière du faisceau laser focalisé est absorbée par les particules, puis réémise à une longueur d'onde supérieure à celle du faisceau laser pour être ensuite dirigée sur le détecteur via le dispositif de conjugaison optique.

Le filtre spatial permet de délimiter un volume d'analyse et d'obtenir ainsi une résolution spatiale inférieure au micromètre. Pour cela, il comporte un diaphragme disposé en amont du détecteur, dans un plan conjugué au plan focal de l'objectif de microscope. De cette manière, seuls les photons situés dans un volume autour du point de focalisation du faisceau laser d'excitation participent à la formation de l'image au niveau du détecteur. Afin d'obtenir un nombre important d'informations sur des particules fluorescentes en solution, un corrélateur est relié au détecteur afin d'analyser les fluctuations temporelles de la lumière fluorescente émise par le volume d'analyse, de sorte à réaliser une détection par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). Ces fluctuations temporelles sont directement reliées à la diffusion des fluophores au travers du volume d'analyse. Aux temps courts, la fonction d'autocorrélation de l'intensité lumineuse détectée permet d'avoir accès aux paramètres photophysiques des émetteurs ainsi qu'au nombre moyen de molécules détectées. Aux temps longs, cette fonction renseigne sur le temps de séjour moyen - le temps de diffusion - des molécules et sur leur mode de diffusion au travers du volume d'analyse.

Un exemple de système de microscopie se trouve dans le document de brevet US 2007/0291254 A1 , qui décrit un instrument portatif de spectroscopie de fluorescence par corrélations temporelles, aussi appelée par corrélation de fluorescence. Cet instrument comporte en outre une source excitatrice, plusieurs moyens de focalisation agencés pour focaliser la lumière émise par la source excitatrice en direction d'un échantillon de particules, un détecteur agencé pour recevoir la lumière émise par un échantillon de particules excité par la source excitatrice, et enfin un corrélateur pour le traitement des données transmises par le détecteur en vue de fournir des données d'autocorrélation, de corrélation croisée ou une combinaison de ces données.

Du fait de l'utilisation d'un objectif de microscope à forte ouverture numérique (typiquement ON = 1 ,2 à 1 ,5) et d'un substrat passif, ces systèmes de microscopie confocale présentent plusieurs inconvénients, parmi lesquels une complexité et un coût de fabrication élevés, ainsi qu'un encombrement significatif. L'instrument décrit dans le document US 2007/0291254 A1 , bien que décrit comme portatif, comporte bien un objectif de microscope et un substrat passif, ce qui lui confère un niveau de compacité encore insatisfaisant, ainsi qu'une incapacité d'opérer in situ en mode d'endoscopie.

Or, pour certaines applications industrielles de l'analyse de solutions contenant des molécules luminescentes ou optiquement diffusantes, il est préférable de disposer d'un système de spectroscopie qui puisse être à la fois simple à fabriquer, tout en étant compact et portable. En particulier, il est souhaité de disposer d'une sonde portative apte à être directement plongée dans la solution à analyser, sans nécessiter une extraction préalable et un positionnement sur un substrat passif.

Une solution existant actuellement repose sur l'utilisation d'un guide d'onde, et plus particulièrement d'une fibre optique monomode. Il est ainsi réalisé un système de spectroscopie pour l'analyse de particules dans un milieu, comprenant un moyen de détection de la lumière émise par les particules dans le milieu, ce moyen étant couplé à un guide d'onde.

Une telle solution est décrite dans le document de brevet EP 0 697 590 A1 . Dans ce document, une première alternative consiste à émettre une lumière depuis une source lumineuse de stimulation, via une première fibre optique, jusqu'à un coupleur puis, via une seconde fibre optique, jusqu'à l'échantillon à analyser. La lumière de fluorescence émise par les particules de l'échantillon sont transmises, via la seconde fibre optique, jusqu'au coupleur puis, via une troisième fibre optique, jusqu'au détecteur. Selon une seconde alternative, la lumière émise par la source est portée sur l'échantillon via une première fibre optique et la lumière de fluorescence émise par les particules de l'échantillon est portée sur le détecteur via une seconde fibre optique. Dans chaque cas, l'extrémité des fibres faisant face à l'échantillon est orientée de sorte que la lumière émise par la source soit portée de manière précise sur le volume d'échantillon que l'on souhaite analyser. Cette solution peut être transposée à la spectroscopie de particules fluorescentes ou optiquement diffusantes, pour laquelle il est possible de s'affranchir de source lumineuse excitatrice, ce qui revient à n'utiliser qu'une seule fibre optique couplée d'un côté au détecteur et de l'autre côté au volume d'échantillon à analyser. Cette solution permet de disposer d'une sonde portative, constituée par l'embout du guide d'onde qui n'est pas couplé au détecteur. Cette sonde peut directement être plongée dans la solution à analyser, ce qui permet de s'affranchir de l'utilisation d'un substrat passif. L'inconvénient de cette solution réside toutefois dans la faible efficacité de détection que peut atteindre un système de spectroscopie utilisant un guide d'onde, ce qui empêche la détection de molécules individuelles et limite par conséquent le seuil de détection à des particules de diamètre typiquement supérieur à 25 nanomètres.

OBJET DE L'INVENTION

Partant d'un système de spectroscopie de fluorescence par corrélations temporelles pour l'analyse de particules dans un milieu, comprenant un moyen de détection de la lumière émise par les particules dans le milieu, ce moyen étant couplé à un guide d'onde, le but de la présente invention est d'en faire un système qui puisse présenter une simplicité et un bas coût de réalisation, constituer une sonde de spectroscopie portative et offrir une sensibilité pouvant aller jusqu'à la molécule unique.

Dans ce but, l'invention a pour objet un système de spectroscopie de fluorescence par corrélations temporelles pour l'analyse de particules dans un milieu, comprenant un moyen de détection de la lumière émise par les particules dans le milieu. Le moyen de détection est apte à détecter la lumière émise par fluorescence par les particules dans le milieu et est couplé à un moyen de traitement du signal qu'il fournit. Ce moyen de traitement est configuré pour effectuer une analyse des évolutions temporelles du signal détecté. Le moyen de détection est couplé à un guide d'onde. Le guide comporte en son embout un moyen de confinement de la lumière injectée dans le guide.

Cette solution permet d'exalter la réception de lumière émise par les particules, que cette émission soit due aux propriétés de luminescence ou de diffusion optique des particules, ou de fluorescence de celles-ci sous l'effet d'une lumière excitatrice. Il est ainsi permis de n'observer avec le détecteur qu'un très petit volume d'observation dans le milieu à analyser, ce qui permet d'obtenir une résolution très inférieure à celle obtenue avec des systèmes de spectroscopie à guide d'onde de l'état de l'art, ce qui rend possible de résoudre jusqu'à la dimension d'une molécule unique avec un fort rapport signal à bruit. Par ailleurs, la combinaison du moyen de confinement et du guide d'onde, couplé d'une part au détecteur et d'autre part au volume d'observation dans le milieu à analyser, permet de simplifier le système, puisque l'utilisation d'un objectif de microscope et d'un substrat passif est rendu inutile. La fabrication d'un tel système est alors simplifiée, pour un coût moins élevé.

Selon d'autres application où la portabilité est de moindre importance, il sera néanmoins toujours possible de réaliser un système de spectroscopie à microscope confocal, dont l'objectif de microscope est couplé par un embout à un guide d'onde, lui-même couplé par son autre embout au volume d'observation. Ce type de système présente alors une grande finesse d'analyse tout en disposant d'une sonde portative du fait que l'embout du guide d'onde peut être plongé directement dans la solution contenant les particules. Enfin, cette combinaison permet de disposer d'une sonde portative, constituée par le guide d'onde muni à son embout d'un moyen de confinement. Cette sonde peut être directement plongée dans la solution à analyser, la position du volume d'observation étant alors fonction de la position de l'embout du guide. Cette sonde, relié au reste du système qui peut ne pas être portatif, offre une souplesse d'utilisation et convient parfaitement à des applications telles que l'endoscopie, à base de mesures in situ.

Selon différents modes particuliers de réalisation :

- le moyen de détection comporte une photodiode, et

- le guide d'onde comporte une fibre optique.

Le moyen de confinement peut être réalisé de différentes façons, notamment :

- il comporte une microstructuration de l'embout du guide,

- il comporte une microsphère, ou

- il comporte une combinaison de ceux-ci.

De préférence, le moyen de confinement présente une focale strictement positive et un indice de réfraction supérieur à celui du milieu. Afin d'obtenir un volume d'observation de forme symétrique autour de l'axe du guide d'onde, il est avantageusement prévu que le moyen de confinement soit sensiblement centré sur le cœur du guide. Dans ce cas, l'embout du guide peut être agencé de sorte à centrer automatiquement le moyen de confinement à son niveau.

Afin de confiner toute la lumière qui traverse le guide d'onde, il est avantageusement prévu que le moyen de confinement présente une section sensiblement égale à celle du cœur du guide. Dans le cas où le moyen de détection est couplé à plusieurs guides d'onde, chacun de ces guides comporte de préférence en son embout un moyen de confinement.

Dans le cas où un guide d'onde comporte plusieurs cœurs, chacun comporte de préférence en son embout un moyen de confinement.

Le système de spectroscopie par corrélation de fluorescence pour l'analyse de particules dans un milieu comprend en outre un moyen d'illumination apte à émettre un faisceau lumineux d'excitation, le moyen de détection étant apte à détecter la lumière émise par fluorescence par les particules dans le milieu sous l'effet du faisceau lumineux d'excitation et étant couplé à un moyen de traitement du signal qu'il fournit.

Dans le cas ci-dessus, le moyen de traitement correspond à un corrélateur relié au détecteur afin d'analyser les fluctuations temporelles de la lumière émise par le volume d'analyse, par fluorescence, de sorte à réaliser une détection par spectroscopie de corrélation de fluorescence.

Le moyen d'illumination peut être, selon différentes variantes :

- un laser, ou

- une lampe mercure munie d'un filtre.

De préférence, le moyen d'illumination est couplé à un guide d'onde, ce qui permet de délocaliser la source d'excitation. Ce nouveau guide d'onde peut également être muni à son embout d'un moyen de confinement de la lumière qui traverse ce guide. Le faisceau lumineux d'excitation est ainsi lui aussi confiné dans un volume d'excitation de petite dimension. Le moyen d'illumination est alors agencé de sorte à ce que le volume d'excitation corresponde au volume d'observation. On s'assure ainsi d'une puissance excitatrice parfaitement concentrée et localisée, et par-là même d'autant plus forte.

Dans ce dernier cas où le moyen d'illumination est couplé à un guide d'onde, il peut être avantageusement prévu que les moyens de détection et d'illumination soient couplés au même guide d'onde via un coupleur, ce qui permet de parfaitement superposer le volume d'excitation et le volume d'observation.

L'invention concerne également un système de spectroscopie de fluorescence par corrélations temporelles pour l'analyse de particules dans un milieu comprenant au moins deux moyens d'illumination aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation à des longueurs d'onde d'excitation différentes, et au moins deux moyens de détection de la lumière émise par fluorescence par les particules dans le milieu du fait des faisceaux lumineux d'excitation aux longueurs d'onde d'excitation différentes. Chaque moyen de détection est couplé à un guide d'onde. Les moyens de détection sont couplés à un moyen de traitement du signal qu'ils fournissent. Le moyen de traitement est configuré pour effectuer une analyse des évolutions temporelles du signal. Les guides couplés aux moyens de détection comportent en leur embouts des moyens de confinement de la lumière injectée dans les guides. L'invention concerne enfin un système de spectroscopie de fluorescence par corrélations temporelles pour l'analyse de particules dans un milieu, comprenant au moins deux systèmes de spectroscopie selon l'un des modes de réalisation décrits ci-dessus, les moyens d'illumination de ces systèmes étant aptes à émettre des faisceaux lumineux d'excitation à une même longueur d'onde d'excitation, les moyens de détection étant aptes à détecter la lumière émise par fluorescence par les particules dans le milieu et étant couplés à un même moyen de traitement du signal qu'ils fournissent. Le moyen de traitement correspond ici également à un corrélateur. Pour faciliter la lecture du brevet, l'homme du métier comprendra ici que des guides couplés les uns avec les autres, tels que les guides liés aux moyens de détection, sont considérés comme ayant pour embout celui du guide résultant des différents couplages, ce qui correspond dans le cas d'espèce à l'embout plongé dans le milieu à analyser.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée d'un exemple non limitatif de réalisation, accompagnée de figures représentant respectivement :

- la figure 1 , un schéma d'un système de spectroscopie pour l'analyse de particules dans un milieu selon un premier mode de réalisation de l'invention,

- les figures 2 et 2A, un schéma de l'embout du guide d'onde plongé dans le milieu à analyser selon ce premier mode de réalisation,

- la figure 3, des schémas de différentes variantes de réalisation du moyen de confinement de la lumière injectée dans le guide d'onde,

- la figure 4, un schéma d'un système de spectroscopie par corrélation croisée de fluorescence selon un deuxième mode de réalisation de l'invention,

- la figure 5, un schéma d'un système de spectroscopie par corrélation croisée de fluorescence selon un troisième mode de réalisation de l'invention, et

- la figure 6, un schéma d'un exemple de mise en œuvre d'un système de spectroscopie par corrélation de fluorescence à sonde portative. Pour plus de clarté, les éléments identiques ou similaires sont repérés par des signes de référence identiques sur l'ensemble des figures.

EXPOSE DETAILLE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS

La figure 1 représente un schéma d'un système de spectroscopie pour l'analyse de particules dans un milieu selon un premier mode de réalisation de l'invention. Le système de spectroscopie 1 vise à analyser un échantillon dans un milieu 2. Cet échantillon peut être un milieu liquide, gazeux, ou un objet biologique contenant des particules à analyser. Les particules à analyser peuvent être des molécules ou des assemblages moléculaires, comme par exemple des complexes moléculaires, des nanocristaux ou des nanobilles.

Le système 1 comporte pour cela un moyen de détection 3, un guide d'onde 4 et un moyen de confinement 5. Le moyen de détection 3 permet la mesure de l'intensité du flux lumineux 7 émis par l'échantillon 2 au niveau d'un volume d'observation et collecté par le système de spectroscopie 1 . Dans un mode de réalisation particulier, ce moyen 3 comprend des photodétecteurs à amplification d'électrons, avantageusement des photodiodes fonctionnant en régime d'avalanche ou de cascade - APD (photodiode à avalanche, soit « avalanche photodiode » en langue anglo-saxonne). Ces photodétecteurs peuvent également être des photomultiplicateurs. Selon d'autres modes de réalisation, ce moyen de détection 3 comprend des photodétecteurs à amplification optique, telles que des caméras CCD ou CMOS refroidies, par exemple à air liquide ou élément Peltier.

La détection s'effectue suivant un régime temporel où le détecteur intègre le signal sur des plages temporelles courtes par rapport au processus à analyser. L'information est alors donnée par l'analyse de cette trace temporelle. Le système 1 comprend en outre un coupleur 12 et un troisième guide d'onde 1 1 . Le coupleur de fibre réalise le couplage des fibres 4 et 10, respectivement reliés aux moyens de détection 3 et d'illumination 9. La lumière résultante est transmise à la fibre 1 1 qui est munie en son embout d'un moyen de confinement 5. La lumière excitatrice 6 est alors concentrée dans un petit volume d'excitation. Suite à l'excitation des particules dans le volume d'excitation, celles-ci émettent en retour de la lumière 7 par fluorescence. Du fait du moyen de confinement 5, cette lumière 7 traverse la fibre 1 1 puis la fibre 4, via le coupleur 12, avant d'arriver sur le moyen de détection 3. Du fait de la disposition d'une fibre 1 1 par laquelle passe les flux lumineux d'excitation 6 et de fluorescence 7, ainsi que de l'agencement d'un unique moyen de confinement 5, les volumes d'excitation et d'observation 8 sont identiques, ce qui permet de concentrer le flux d'excitation directement au niveau du volume d'observation et optimise donc la stimulation des particules.

Par ailleurs, le système 1 comporte ici un moyen de traitement 25 du signal, relié au moyen de détection 3. Ce moyen 25 comprend avantageusement un compteur et un corrélateur qui permettent de traiter numériquement les données reçues. En particulier, le compteur réalise l'enregistrement de la valeur de l'intensité lumineuse de fluorescence reçue et le corrélateur réalise l'analyse temporelle des fluctuations de l'intensité lumineuse de fluorescence reçue. Cette analyse peut se faire aux temps courts et aux temps longs de sorte à obtenir des informations complémentaires sur les particules en solution dans le milieu 2. Aux temps courts, la fonction d'autocorrélation de fluorescence permet d'avoir accès aux paramètres photophysiques des émetteurs ainsi qu'au nombre moyen de molécules détectées. Aux temps longs, cette fonction renseigne sur le temps de séjour moyen des molécules et sur leur mode de diffusion au travers du volume d'observation.

Le guide d'onde 4 est constitué d'une unique fibre optique monomode à saut d'indice. Elle est couplé, par son embout 4a, au volume d'observation dans le milieu 2 et, par son autre embout 4b, au moyen de détection 3. Comme illustré sur la figure 2, elle comporte de manière classique un cœur 4' entouré d'une gaine 4", dont les indices de réfraction sont déterminés de sorte que le faisceau lumineux 7 émis par l'échantillon à analyser puisse se propager au sein de la fibre. Selon d'autres modes de réalisation, la fibre optique utilisée peut être multimodes ou à gradient d'indice.

Le moyen de confinement 5 présente une focale strictement positive et un indice de réfraction supérieur à l'indice de réfraction du cœur 4' du guide 4. Dans ces conditions et comme illustré en figure 2, les particules situées dans le volume d'observation 8 émettent de la lumière, par fluorescence suite à une excitation lumineuse préalable, qui traverse le moyen de confinement 5. Ce volume 8 est situé dans une zone limitrophe du moyen de confinement 5. Ce volume est rendue étroit car sa focale est strictement positive et son indice de réfraction est supérieur à celui du cœur 4' du guide 4. Les particules qui ne sont pas situés dans le volume d'observation 8 vont émettre de la lumière qui ne peuvent être dirigés à l'intérieur du cœur 4', du fait de l'agencement du moyen de confinement 5. La lumière injectée dans le guide d'onde 4 est donc limitée à celle émise par les particules dans le volume d'observation 8.

Ce moyen de confinement 5 permet donc d'isoler un certains nombre de particules situées dans un très petit volume d'observation 8. En particulier, ce volume 8 peut atteindre la moitié de la longueur d'onde en dimension longitudinale et la longueur d'onde en dimension axiale, c'est-à-dire des dimensions inférieures à la limite de diffraction, ce qui permet donc d'atteindre un volume d'analyse inférieur au dixième de femtolitre.

De plus, l'indice de réfraction étant supérieur à celui du cœur 4', le faisceau lumineux 7 collecté puis détecté est d'autant plus important. Le moyen de confinement 5 constitue ainsi une interface microstructurée entre le milieu 2 et le guide d'onde 4, de sorte à diminuer les dimensions du volume d'observation correspondant à la partie du flux lumineux effectivement collectée. Ce moyen 5 présente des dimensions micrométriques, de l'ordre de 1 à 5 micromètres, et un indice de réfraction élevé, de l'ordre de 1 ,4 à 1 ,6.

Le moyen de confinement 5, en tant qu'interface microstructurée, peut être réalisé suivant différentes variantes, comme illustré par les figures 3A à 3F.

Dans le cas des figures 3A à 3E, le moyen de confinement 5 est une microbille de forme sphérique, rendue non solidaire du cœur 4' du guide 4.

Les microbilles ou microsphères 5 des figures 3A à 3C présentent un diamètre sensiblement égal à celui du cœur 4'. La microbille de la figure 3A est simplement déposé sur l'embout de la fibre 4 par dispersion de microbilles diélectriques. Celles des figures 3B et 3C est également déposé par dispersion de microbilles diélectriques, mais après une étape préalable d'attaque chimique de l'embout de la fibre de façon à former une cuvette servant de réceptacle pour les microbilles, ce qui permet de centre correctement la bille vis-à-vis de l'axe de la fibre 4. Ce type de réalisation présente l'avantage d'être simple à mettre en œuvre et de pouvoir être étendu à grande échelle.

Bien que la dimension préférée du moyen d'une microbille soit telle que son diamètre soit sensiblement égal à celui du cœur 4', il peut également être envisagé de la rendre inférieure au diamètre du cœur 4' (figure 3D) ou supérieure (figure 3E). Dans chaque cas, il reste préférable que la microbille ou microsphère soit centrée suivant l'axe du guide 4.

Dans le cas de la figure 3F, le moyen de confinement 4b est une microstructuration en forme de coupole sphérique, par conséquent solidaire du cœur 4' du guide 4 puisque formant une partie de celui-ci. Ce type de microstructuration peut être obtenu par des procédés classiques de réalisation d'une micropointe ou d'une microstructure en extrémité de fibre optique.

L'homme du métier notera ici qu'il est possible de combiner les variantes ci-dessus afin de réaliser un moyen de confinement hybride, superposant en particulier des moyens solidaires du cœur (obtenus par structuration du cœur) et des moyens non solidaires de celui-ci (des microbilles), ou en superposant plusieurs microbilles.

L'homme du métier notera également que la forme du moyen de confinement n'est pas nécessairement sphérique et peut en particulier être elliptique ou cylindrique. D'autres formes sont envisageables dans la mesure où elles permettent de confiner dans un petit volume d'observation 8 la lumière 7 à injecter dans le guide 4.

Dans le deuxième mode de réalisation, illustré par la figure 4, le système 1 est agencé pour réaliser de la spectroscopie par corrélation croisée de fluorescence. Il comprend pour cela deux moyens d'illumination 9' et 9", émettant respectivement, via des guides d'ondes 10' et 10", des faisceaux lumineux d'excitation 6' et 6" à des longueurs d'onde λ' et λ" différentes. Ces faisceaux 6' et 6" sont mélangés au niveau d'un coupleur 12' pour générer un faisceau lumineux d'excitation 6, comportant deux longueurs d'onde, qui est ensuite injecté dans un guide 1 1 ', puis dans un guide 1 1 via un autre coupleur 12.

Ce faisceau 6 excite les particules du milieu 2 situé dans un volume d'excitation délimité par le moyen de confinement 5. Les particules excités dans ce volume émettent alors un faisceau lumineux 7 en réponse, par fluorescence, qui est injecté dans le guide 1 1 grâce au moyen de confinement 5. Cette lumière de fluorescence est transmise au guide 1 1 " via le coupleur 12, puis est séparée de manière spectrale, au niveau du coupleur 12", en deux faisceaux 7' et 7" respectivement aux longueurs d'onde λ'" et λ"", fonction des longueurs d'onde d'excitation λ' et λ".

Ces deux faisceaux 7' et 7" sont alors portés jusqu'aux moyens de détection 3' et 3" par l'intermédiaire des fibres 4' et 4". Un moyen de traitement 26 est relié à ces deux moyens de détection 3' et 3" pour enregistrer les signaux générés par les deux détecteurs et les analyser sous forme de corrélation croisée. Ce type de mesure permet alors d'accéder à d'autres paramètres concernant les particules à analyser.

Dans le troisième mode de réalisation, illustré par la figure 5, le système 1 est agencé pour réaliser de la spectroscopie par corrélation croisée de fluorescence.

Il comprend pour cela deux systèmes (ou sous-systèmes) de spectroscopie 1 ' et 1 " analogues au mode de réalisation de la figure 1 . Ces sous-systèmes comportent respectivement un moyen d'illumination 9' (ou 9"), des guides d'ondes 4' 10' et 1 1 ' (ou 4", 10" et 1 1 "), un coupleur 12' (ou 12"), un moyen de détection 3' (ou 3") et un moyen de confinement 5' (ou 5").

Les moyens d'illumination 9' et 9" sont aptes à émettre des faisceaux lumineux d'excitation à une même longueur d'onde d'excitation, via les guides d'ondes 10' et 1 1 ' (10" et 1 1 "). Les moyens de détection 3' et 3" sont aptes à détecter la lumière 7' et 7" émise par fluorescence par les particules dans le milieu 2, et sont également couplés à un même moyen de traitement 26 du signal qu'ils fournissent. Le moyen de traitement 26 opère alors la corrélation croisée des données transmises par les deux détecteurs 3' et 3". Les deux embouts de guides 1 1 ' et 1 1 " - ainsi que les moyens de confinement 5' et 5" qui y sont disposés - sont agencés de sorte à observés des régions différents de l'espace, i.e. deux volumes d'observations différents mais séparés d'une distance typiquement de l'ordre de la largeur des guides 1 1 ' et 1 1 ", soit environ entre 2 et 3 micromètres. De la sorte, il est possible de mesurer des vitesses de transit des particules entre l'un et l'autre des embouts de guide, donc entre l'un et l'autre des sous-systèmes de spectroscopie 1 ' et 1 ".

Les deux derniers modes de réalisation décrits ci-dessus permettent tous deux de réaliser de la spectroscopie par corrélation croisée de fluorescence, mais de façons différentes. Dans le deuxième mode, on utilise un seul guide d'onde 1 1 avec moyen de confinement et deux longueurs d'ondes d'excitation différentes. On recoupe alors un ensemble de données spectrales, afin d'obtenir certaines informations sur les particules dans le milieu, complémentaires de celles fournies par un auto-corrélation. Dans le troisième mode, on utilise deux guides d'ondes 1 1 ' et 1 1 " avec moyen de confinement et une seule longueur d'onde d'excitation. On recoupe alors un ensemble de données spatiales, afin d'obtenir d'autres informations sur les particules, en particulier des flux et des vitesses de transit. On décrit enfin un exemple de mise en œuvre d'un système de spectroscopie par corrélation de fluorescence à sonde portative, combinant la présente invention et un système de microscopie confocale, en référence à la figure 6.

Ce système de spectroscopie comprend toujours, comme décrit dans d'autres modes de réalisation de l'invention, un moyen d'illumination 9, une fibre optique 4, un moyen de confinement 5, un moyen de détection 3 et un moyen de traitement 25. L'embout de la fibre 4 au niveau de laquelle se trouve le moyen de confinement 5 constitue une sonde spectroscopique portative apte à être plongée dans le milieu 2 à analyser.

La fibre 4 est couplée par son autre embout à un objectif de microscope 21 qui permet d'injecter de manière optimale le flux lumineux d'excitation généré par la source lumineuse 9. Afin que la sonde soit couplée à la fois au moyen d'illumination 9 et au moyen de détection 3, le système comporte un séparateur dichroïque 20, dont la longueur d'onde de coupure se situe entre la longueur d'onde λ1 du flux lumineux d'excitation 6 et la longueur d'onde λ2 (supérieur à λ1 ) du flux lumineux 7 émis en réponse par les particules fluorescentes. De la sorte, le flux d'excitation 6 est réfléchi sur le séparateur, tandis que le flux de réponse 7 est transmis à travers lui. Ce séparateur 21 se présente avantageusement sous la forme d'un filtre dichroïque disposé à 45° par rapport au moyen d'illumination 9. Le reste du dispositif microscopique comprend deux lentilles 22 et 23, ainsi qu'un diaphragme 24 permettant de réaliser un filtrage spatial. La dimension du diaphragme 24 est avantageusement réglable. Il est disposé suivant l'axe du faisceau lumineux de réponse 7. Il est disposé au niveau du point de focalisation 27 de la lentille 22. Il permet alors de sélectionner un volume de détection - ou volume de filtrage spatial - autour du point de focalisation 27 de la lentille 22, puisque des rayons lumineux ne provenant pas de ce volume de filtrage spatial ne traversent pas l'ouverture 24. Les dimensions de la zone de détection sont d'autant plus courtes que celles de l'ouverture 24 le sont également. L'ensemble constitué des éléments 22, 23 et 24 forme ainsi un sténopé ayant une ouverture variable 24 placée dans un plan intermédiaire image de sorte que le système de microscopie conjugue le point de focalisation 27 du faisceau de réponse 7 avec l'ouverture variable 24 du sténopé.

L'homme du métier notera qu'il peut utiliser d'autres moyens de filtrage spatial du faisceau de réponse 7, le système n'étant alors plus à microscopie confocale. Il pourra utiliser en particulier un trou dans une plaque métallique, une fibre optique, dont le diamètre de cœur fixe l'ouverture utile, ou encore la dimension réduite du moyen de détection.

Les systèmes de spectroscopie décrits ci-dessus offre de nombreuses applications dans le domaine des tests biologiques en milieu liquide, notamment pour la recherche scientifique, les tests médicaux, l'analyse agroalimentaire, l'industrie chimique et pharmaceutique et la défense. Les modes de réalisation précédemment décrits de la présente invention sont donnés à titre d'exemples et ne sont nullement limitatifs. Il est entendu que l'homme du métier est à même de réaliser différentes variantes de l'invention sans pour autant sortir du cadre du brevet.