EMULSIONS FLUORESCENTES POUR L'IMAGERIE OPTIQUE

La présente invention est relative à des sondes fluorescentes se présentant sous la forme de nano-émulsions utilisables dans le domaine de l'imagerie fonctionnelle in vivo non invasive. In vivo, le développement récent des méthodes optiques ouvre de nouveaux horizons pour l'imagerie fonctionnelle. Il est maintenant possible de suivre en temps réel et de façon non invasive, le devenir de molécules luminescentes, leur biodistribution, d'établir un diagnostic et d'évaluer l'effet d'une thérapeutique grâce à ces molécules. L'imagerie optique présente un certain nombre d'avantages par rapport aux autres techniques d'imagerie fonctionnelle telles que l'imagerie par résonance magnétique (IRM), l'imagerie par tomographie d'émission de positons (TEP) et l'imagerie par émission monophotonique (SPECT) :

- elle évite la manipulation de molécules radioactives, écartant ainsi les contraintes et les risques qui y sont liés (radioprotection, gestion des déchets, source synchrotron pour les marqueurs TEP) ;

- elle ne nécessite pas de gros investissement d'instrumentation ;

- elle présente une bonne sensibilité par rapport à l'IRM, en terme de quantité de marqueur injectée.

Les applications envisagées à court terme pour ces techniques optiques d'imagerie fonctionnelles sont, dans le petit animal, l'aide à la découverte de biomarqueurs permettant de cibler des tumeurs ou la plaque d'athérome, la découverte et l'évaluation de nouvelles thérapeutiques, la diminution du nombre d'animaux sacrifiés dans les études de toxicité, puisque ces techniques permettent un suivi longitudinal. A très court terme, des applications chez l'homme sont envisagées en chirurgie intra-opératoire dans le but de permettre une meilleure délimitation des berges d'exérèse des tumeurs par exemple. D'autres applications à moyen terme sont explorées en dermatologie, comme outil de diagnostic du cancer du sein, ou par endoscopie du cancer de la prostate ou de polypes précancéreux du colon.

L'imagerie de fluorescence nécessite l'injection préalable d'une sonde ("optical probe" en anglais), équivalent du traceur en médecine nucléaire ou de l'agent de contraste en IRM et tomographie X. Cette sonde est en général un assemblage moléculaire constitué au minimum d'un label fluorescent qui correspond à

l'entité responsable de l'absorption et de l'émission de la fluorescence. Ce label peut être par exemple un fluorophore organique, un complexe de lanthanide, ou bien encore un nanocristal semi-conducteur luminescent ("quantum dot" ou boîte quantique, tel que CdSe, CdTe, InP, Si...). Ces sondes peuvent en outre comporter un ou plusieurs des éléments suivants : a) un ligand biologique, permettant d'imager un processus biologique spécifique. Un tel ligand peut être : i) un ligand biologique de ciblage : c'est alors une entité biologique (anti-corps, peptide, saccharide,...) ou chimique (acide folique par exemple) qui permet une reconnaissance spécifique de certaines cellules (par exemple de cellules tumorales comme décrit par exemple dans l'article de S. Achilefu, Technology in

Cancer Research & Treatment, 2004, 3, 393-408) ou de certains organes, ii) un ligand biologique marqueur d'une activité biologique donnée, par exemple d'une activité enzymatique. Par exemple, ces ligands biologiques seront un peptide clivable par une protéase donnée, à l'extrémité duquel sera greffé un inhibiteur de la fluorescence du label. Ce type de ligands permet d'imager spécifiquement l'activité enzymatique de la protéase ainsi que cela est reporté dans l'article de CH. Tung, Biopolymers, 2004, 76, 391-403. Un autre exemple est constitué par un ligand biologique comportant un pont disulfure séparant le label d'un inhibiteur de sa fluorescence. Ce ligand biologique permet alors d'imager spécifiquement l'internalisation de la sonde dans une cellule comme décrit par exemple dans la demande de brevet français publiée sous Ie numéro FR 2 888 938 ; b) un agent de furtivité : c'est une entité que l'on rajoute à la sonde afin de lui conférer une furtivité vis-à-vis du système immunitaire, d'augmenter son temps de circulation dans l'organisme, et de ralentir son élimination ; c) un "vecteur d'assemblage" : c'est une entité qui peut permettre d'assembler le(s) label(s) fiuorescent(s), et/ou le(s) ligand(s) biologique(s) de ciblage, et/ou le(s) agent(s) de furtivité, et/ou une ou d'autres fonctionnalités (délivrance de médicaments, autre modalité d'imagerie, fonction thérapeutique par exemple).

A partir de ce principe général, quatre grands types de sondes ont été décrits dans la littérature pour l'imagerie de fluorescence non invasive du petit animal.

Le premier grand type de sondes correspond aux sondes ayant pour label un (ou des) fluorophore(s) organique(s) greffés directement sur le ligand biologique. Si le premier fluorophore organique utilisé en imagerie de fluorescence, FICG ("Indo Cyanin Green"), a été employé très tôt "nu" (injection du fluorophore seul) pour imager la vascularisation et la circulation dans les vaisseaux sanguins, ces fluorophores organiques ont ensuite été greffés sur des protéines ou des anti-corps pour cibler différentes cellules. Cependant le couplage à ces grosses molécules peut présenter des inconvénients pour le ciblage et la pharmaco-cinétique, et c'est pourquoi plus récemment la fonctionnalisation de fluorophores par de petits peptides a été préférée. D'une manière générale, ce premier type de sondes possède les inconvénients suivants :

- un ligand biologique n'est marqué que par un faible nombre de labels fluorescents (typiquement 1 fluorophore pour un peptide, 3 à 4 pour un anticorps). Pour augmenter le nombre de fluorophores, il faut sinon utiliser des édifices moléculaires vecteurs complexes (voir ci-après). Ce sont donc des sondes conduisant à de faibles signaux de fluorescence ;

- les fluorophores organiques utilisés, dont les longueurs d'onde d'absorption et d'émission doivent se situer dans le proche infra-rouge (entre 650 et 900 nm), fenêtre optique pour laquelle l'absorption et la diffusion de la lumière dans les tissus biologiques sont minimales, sont généralement sensibles au photo blanchiment, et notamment en tampon aqueux (perte de fluorescence au cours du temps). L'offre de fluorophores organiques greffables à des biomolécules et solubles en tampon aqueux dans ce domaine de longueur d'onde est de plus limitée (exemples : cyanines commercialisées par Amersham, série des produits vendus sous la dénomination commerciale Alexa® par Invitrogen), et à des coûts très élevés alors que de nombreux autres fluorophores pour le proche infrarouge bon marché sont disponibles chez d'autres fournisseurs, mais ne sont malheureusement pas utilisables pour cette application car ils sont non solubles en milieu aqueux ;

- les sondes doivent pouvoir être injectées par voie intraveineuse en quantité importante car seule une faible partie d'entre elles atteint leur cible. En effet les cinétiques de reconnaissance cible-ligand sont souvent lentes et entrent en compétition avec les processus d'élimination par l'organisme. L'ajout d'un agent de

furtivité peut permettre d'améliorer ce point. Néanmoins, et c'est le quatrième inconvénient de ces sondes ;

- l'ajout d'un agent de furtivité (comme éventuellement l'augmentation du nombre de labels fluorescents par ligand biologique, ou l'ajout d'autres fonctionnalités comme la multimodalité ou la délivrance de médicaments) nécessite d'utiliser un "vecteur d'assemblage" pour assembler les différents éléments de la sonde. La synthèse de ces sondes devient alors beaucoup plus complexe.

Le deuxième grand type de sonde correspond aux sondes ayant pour label un nanocristal semi-conducteur luminescent ("quantum dot" ou boîte quantique, tel que CdSe, CdTe, InP, Si...), fonctionnalisé par un ligand biologique.

Les propriétés optiques (absorption, émission, rendement quantique de fluorescence) exceptionnelles de ces nanoparticules en ont fait ces dernières années des labels privilégiés pour l'imagerie non invasive du petit animal (X. Michalet et al, Science, 2005, 307, 538-544). Cependant, si aucune toxicité n'a été observée au cours de ces expérimentations, la présence de métaux lourds dans le coeur de ces nanocristaux demeure un frein important lorsque l'on envisage des applications cliniques chez l'homme (R. Hardman, Environmental Health Perspectives, 2006, 114, 165-172). Un autre des verrous actuels à l'utilisation de ces sondes pour l'imagerie non invasive est le contrôle de leurs propriétés d'interaction avec les tissus biologiques. En effet, ces propriétés sont très dépendantes de l'état de surface de ces nanoparticules (présence de chaînes de poléthylèneglycol (PEG)) et de leur taille.

Le troisième grand type de sondes correspond aux sondes ayant pour label des nanoparticules inorganiques d'oxydes, telles que par exemple des nanoparticules de silice, encapsulant et/ou sur lesquelles sont greffés des fluorophores organiques ou des chélates de lanthanides. Jusqu'à présent, peu de travaux ont mis en oeuvre ce type de sonde in vivo, hormis les travaux de l'équipe de P. Prasad en nanomédecine (I. Roy et al, PNAS, 2005, 102(2), 279-284) bien que la synthèse de cette sorte de labels soit abondamment décrite dans la littérature. Comme les nanocristaux semi-conducteurs décrits ci-dessus, ces nanoparticules inorganiques nécessitent une chimie de surface très poussée afin d'y greffer des agents de furtivité les rendant compatibles avec le vivant.

Enfin, le quatrième grand type de sondes correspond aux sondes ayant pour label des nanoparticules organiques encapsulant et/ou sur lesquelles sont greffés des fluorophores organiques ou des chélates de lanthanides. Parmi celles-ci, sont recensées : - des nanosphères de polymère encapsulant des fluorophores organiques comme décrit par exemple dans l'article de V. Holzapfel et al, J. Phys.: Condens. Mater., 2006, 18, S2581-S2594 ;

- des polymersomes qui sont des assemblages de polymères synthétiques amphiphiles se présentant sous la forme de nanosphères constituées d'une double couche de polymères de façon analogue aux liposomes qui sont, quant à eux, constitués de lipides. Ces polymersomes peuvent être utilisés pour encapsuler des fluorophores organiques comme décrit par exemple dans la demande de brevet américain n° US 2005/0019265 ou dans l'article de P. Ghoroghchian et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2004, 102(8), 2922-2927. Bien que ces systèmes nanoparticulaires soient organiques, ils possèdent un certain nombre d'inconvénients. Les polymersomes et les liposomes montrent des problèmes de stabilité chimique et physique. En ce qui concerne les nanosphères de polymères, leur cytotoxicité et leur synthèse chimique (problème de solvant résiduel) limitent leur utilisation. Même les polymères synthétiques, qui montrent une bonne biodégradabilité et une faible cytotoxicité in vitro tel que les polymères d'acide lactique (PLA), de poly(/?-hydroxybutyrate) (PHB) ou encore le poly(lactide-co-glycolide), possèdent des effets cytotoxiques lorsqu'ils sont délivrés sous forme de nanoparticules.

Les sondes utilisées pour l'imagerie de fluorescence décrites jusqu'à présent dans la littérature présentent donc généralement un ou plusieurs des inconvénients suivants :

- une faible fluorescence par ligand biologique, surtout en milieu biologique,

- une tendance au photoblanchiment, - une chimie d'assemblage ou de fonctionnalisation de surface complexe,

- une toxicité potentielle lorsqu'elles se présentent sous la forme de nanoparticules inorganiques, ce qui nécessiterait la mise en œuvre d'une chimie de surface supplémentaire pour les rendre biocompatibles, rendant ainsi difficile leur utilisant pour l'imagerie humaine ; - une complexité de synthèse dans la mesure ou les nanoparticules inorganiques sont difficiles à synthétiser, notamment en grandes quantités, et nécessitent l'emploi de solvants toxiques tels que le trioctylphosphine (TOP) et l'oxyde de trioctylphosphine (TOPO), et de matériaux dangereux (Cd(Me) ₂ ,...)- Les prix de revient de ces synthèses sont par ailleurs très élevés ; - faible stabilité et synthèse peu reproductible des nanoparticules organiques (polymersomes) ;

- cytotoxicité des nanoparticules organiques de polymère et la synthèse à grande échelle pas encore maîtrisée.

Les nano-émulsions, appelées quelques fois mini-émulsions, émulsions ultrafines ou encore émulsions submicroniques, sont des émulsions dont le diamètre est généralement compris entre 10 et 200 nm. Pour rappel, une émulsion est un mélange de deux substances liquides non miscibles constitué d'une phase continue et d'une phase dispersée. Une substance est dispersée dans la seconde substance (phase continue) sous forme de petites gouttelettes (phase dispersée). Le mélange reste stable grâce à l'action de molécules amphiphiles, appelées émulsifiants ou tensioactifs, qui se placent à l'interface entre les deux phases. Les émulsions sont des édifices supramoléculaires métastables. Ces structures sont à différencier des polymersomes et des micelles.

Les polymersomes (famille comprenant les liposomes) sont des vésicules de quelques dizaines à quelques milliers de nm de diamètre. Ces vésicules sont composées d'une ou de plusieurs bicouches de tensioactifs qui permet(tent) de séparer le milieu intravésiculaire du milieu extérieur, les deux milieux étant de même nature (aqueux).

Les micelles consistent en des agrégats de tensioactifs autoassemblés, de quelques nanomètres de diamètre. Les tensioactifs s'organisent de manière à orienter leur partie hydrophile vers l'extérieur (le solvant) et leurs chaînes hydrophobes vers le cœur de la micelle.

Des systèmes d'émulsions destinées à différentes applications dans le domaine du médical ont déjà été décrits dans la littérature :

- systèmes de nutrition parentérale qui sont des émulsions à base de lipides injectées par voie intraveineuse comme source d'acides gras essentiels, de vitamines lipophiles et d'énergie. Ces émulsions sont généralement constituées d'un mélange d'huiles d'origine naturelle (végétale ou de poisson) ;

- systèmes pour la délivrance de médicaments ("Drug Delivery") qui sont des émulsions de type huile dans eau étudiées et utilisées notamment pour l'encapsulation de principes actifs peu solubles dans l'eau. Ces émulsions ont comme avantage d'améliorer la biodisponibilité du principe actif qu'elles contiennent et de réduire ses effets secondaires, mais aussi d'augmenter sa stabilité en limitant son hydrolyse. Les émulsions sont utilisées pour 3 modes d'administration différents : oculaire / parentéral / oral. Pour limiter la métabolisation des émulsions administrées par voie parentérale, certaines formulations ont recours à l'utilisation de co- tensioactifs de furtivité, augmentant ainsi le temps de circulation des émulsions dans le système sanguin ;

- systèmes pour l'imagerie utilisant des agents de contraste à base d'émulsions. Ces systèmes ont été développés pour l'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) comme cela est par exemple décrit dans l'article de P. M. Winter, et al, Cancer Research, 2003, 63, 5838-5843 et pour l'imagerie par rayons X comme par exemple décrit dans la demande de brevet US 2005/0079131.

L'agent de contraste pour l'IRM conçu par Winter et al. (pré-cité) est une émulsion d'huile fluorocarbonée (par exemple le bromure de perfluorooctyle), dans l'eau stabilisée par une couche de tensioactifs. Le mélange de tensioactifs utilisé est notamment composé de chélates de gadolinium tels que l'acide pentaacétique de gadolinium-diéthylènetriamine-bis-oléate (Gd-DTPA-BOA) à hauteur de 30 % (mol). Ces composés sont des agents chélatants qui jouent le rôle de label IRM de par leurs propriétés magnétiques. Le ciblage de tumeurs est assuré par l'ajout d'une faible quantité de distéaroylphosphatidyléthanolamine poly(éthylène glycol-2000)- maléimide (DSPE-PEG (2000)-maléimide) couplé à un antagoniste peptidomimétique des intégrines αγβ ₃ dans la couche de tensioactifs (0,5% mol). Les nanoparticules vont

alors cibler les cellules exprimant les intégrines αγβ ₃ , protéines associées à l'angiogénèse accompagnant la croissance tumorale.

Les propriétés d'agents de contraste dans ces nanoparticules sont donc conférées par les tensioactifs. De plus, le diamètre de ces particules, environ 270 nm, est relativement grand et la polydispersité est importante. Les auteurs Winter et al. estiment d'ailleurs que la diffusion des nanoparticules vers les tumeurs est limitée par leur grande taille. Ces nanoparticules permettent cependant d'augmenter le signal d'IRM de 126 % dans les zones ciblées.

Les nanoparticules décrites dans la demande de brevet US 2005/0079131 sont également des émulsions d'huile dans l'eau, formées par un composé lipophile couplé à un élément ayant un numéro atomique (Z) élevé, tel que Z>36, stabilisées par une couche de tensioactifs à base de lécithine et de cholestérol. Dans cette formulation, préparée par microfluidiseur, c'est l'huile qui joue le rôle d'agent de contraste pour les rayons X grâce à son atome lourd Z>36. Le ciblage est là encore assuré par l'utilisation de DSPE-PEG (2000)-maléimide couplé à un antagoniste peptidomimétique des intégrines αγβ ₃ . La taille nominale des particules est inférieure à 200 nm. Cependant cette demande de brevet ne mentionne aucun test biologique in vivo dans l'animal vivant avec ce type d'émulsion. D'ailleurs aucun agent de furtivité n'est greffé en surface pour permettre une biodistribution homogène de l'agent de contraste dans le corps. Il est par ailleurs indiqué dans cette demande de brevet que la nanoparticule peut de plus inclure un fluorophore, à sa surface (au sein la couche de tensioactifs), celui-ci pouvant notamment être la fluorescéine, en tant qu'agent d'imagerie auxiliaire ("ancillary agent"). Il est cependant à noter que la fluorescéine n'est pas un fluorophore absorbant/émettant dans le proche infrarouge et n'est donc pas utilisable pour l'imagerie in vivo non invasive du petit animal. De plus, la présence d'un élément de numéro atomique élevé dans l'huile présente l'inconvénient d'inhiber la fluorescence des nanoparticules.

C'est donc afin de remédier à l'ensemble des problèmes rencontrés lors de la fabrication ou de la mise en œuvre des systèmes existants que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de l'invention.

Les Inventeurs se sont en effet fixés pour but de pourvoir à une sonde fluorescente n'ayant pas les inconvénients des sondes fluorescentes

actuellement disponibles et qui soit simple à préparer et à utiliser, en particulier pour l'imagerie in vivo non invasive du petit animal.

La présente invention a donc pour objet une émulsion fluorescente de type huile-dans-eau comprenant au moins une phase continue aqueuse et au moins un phase dispersée huileuse, ladite émulsion étant caractérisée par le fait que la phase dispersée est constituée de gouttelettes d'au moins une huile biocompatible de diamètre moyen supérieur ou égal à 10 nm et inférieur ou égal à 200 nm, que lesdites gouttelettes d'huile comprenant au moins un fluorophore lipophile absorbant et émettant dans le proche infrarouge, lesdites gouttelettes étant stabilisées par une couche tensioactive située à la périphérie desdites gouttelettes, ladite couche comprenant, en mélange, au moins un tensioactif amphiphile et au moins un co- tensioactif de furtivité.

Cette émulsion présente les avantages suivants :

- elle est composée de matériaux organiques biocompatibles dont une grande partie est assimilable par l'organisme dans lequel elle est susceptible d'être injectée ;

- elle constitue une sonde moléculaire pour l'imagerie de fluorescence du petit animal in vivo dans laquelle les molécules organiques fluorescentes sont encapsulées et donc indétectables par l'organisme ; - cette sonde moléculaire est conçue de manière à avoir un temps de circulation dans l'organisme important. Cela entraîne une augmentation des chances de reconnaissance cible - ligand ;

- du fait de leur présence directement au coeur des gouttelettes d'huile, un grand nombre de molécules fluorescentes est associé à la reconnaissance d'une cible par un ligand, ce qui permet une meilleure sensibilité de la détection.

Au sens de la présente Invention, le terme "gouttelette" englobe à la fois les gouttelettes d'huile liquide proprement dites ainsi que les particules solides issues d'émulsions de type huile-dans-eau dans lesquelles l'huile utilisée est une huile cristallisable. Dans ce dernier cas, on parle alors d'émulsion solide. Le fait que le fluorophore lipophile soit incorporé directement au cœur des gouttelettes d'huile apporte les avantages supplémentaires suivants :

- de protéger le fluorophore de renvironnement aqueux, dans lequel son photo-blanchiment (perte de fluorescence en présence de lumière) est plus rapide ;

- d'encapsuler un grand nombre de fluorophores tout en laissant libre les fonctions de greffage de surface des nanoparticules pour leur fonctionnalisation par les ligands biologiques. Ainsi aucune liaison de greffage en surface de la nanoparticule n'a besoin d'être sacrifiée pour le greffage de fluorophores, elles peuvent toutes être utilisées pour le greffage de ligands de ciblage, dont la densité surfacique peut ainsi être plus élevée ;

- par le choix des fluorophores présents dans le cœur des gouttelettes d'huile de l'émulsion conforme à l'invention. Les fluorophores utilisés dans l'invention sont des fluorophores lipophiles et absorbant/émettant dans le proche infrarouge ;

- par la présence d'agents de furtivité pour donner à la nanoparticule la pharmaco-dynamique adéquate : ces agents de furtivité permettent à la fois d'augmenter la stabilité des émulsions mais aussi de "leurrer" les défenses immunitaires de l'organisme ;

La taille des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion est de préférence comprise entre 10 et 80 nm inclusivement.

Selon l'invention, les huiles biocompatibles peuvent être d'origine naturelle (végétale ou animale) ou synthétique et sont utilisées sans modification chimique ou physique préalablement à la formation de l'émulsion.

Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d'origine végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de palme, d'arachide, d'olives, de pépins de raisins et de tournesol ; les huiles d'origine animale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de poissons ; les huiles synthétiques parmi lesquelles figurent notamment les triglycérides, diglycérides, monoglycérides ; lesdites pouvant être utilisées seules ou en mélanges.

Ces huiles peuvent être de première expression, raffinées ou inter- estérifiées.

Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, ces huiles sont choisies parmi les huiles peu solubles dans l'eau, c'est-à- dire présentant une balance hydrophile-lipophile (HLB) généralement inférieure à 8 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 6 telles que par exemple l'huile de

soja ou bien encore parmi les huiles cristallisables telles que les glycérides semisynthétiques et en particulier le mélanges de glycérides semisynthétiques vendus sous la dénomination commerciale Suppocire® NC par la société Gattefossé.

Selon l'Invention, la nature du ou des tensioactifs amphiphiles assurant la stabilisation des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion n'est pas critique. Ces tensioactifs amphiphiles (comportant une partie hydrophile et une partie amphiphile) sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan vendus sous les dénominations Span ^® par la société Sigma ; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs nonioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween ' par la société ICI Americas Inc. et Triton ^® par la société Union Carbide Corp. ; les esters de sucre tels que les mono- et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose ; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges. Selon l'invention, le ou les tensioactifs sont de préférence des tensioactifs d'origine naturelle et assimilables (biocompatibles) comme les phospholipides et le cholestérol.

La nature du ou des fluorophores lipophiles utilisables dans l'émulsion conforme à la présente invention n'est pas critique à partir du moment où ils sont compatibles avec l'imagerie de fluorescence in vivo et qu'ils absorbent et émettent dans le proche infrarouge. En effet, pour que la lumière d'excitation et la lumière émise par le fluorophore puissent traverser les tissus, il convient d'utiliser des fluorophores absorbant et émettant dans le proche infrarouge, c'est-à-dire à une longueur d'onde comprise entre 640 et 900 nm. A titre de fluorophore lipophile on peut par exemple citer les composés décrits dans le chapitre 13 ("Probes for Lipids and Membranes") du catalogue InVitrogen.

De façon plus précise, on peut notamment citer, à titre de fluorophore, les analogues d'acides gras et les phospholipides fonctionnalisés par un groupement fluorescent tels que les produits fluorescents vendus sous les dénominations commerciales Bodipy ® tels que le Bodipy ® 665/676 (Ex/Em.) ; les dérivés amphiphiles de dialkylcarbocyanines telles que le perchlorate de l,r-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD) vendu sous la référence D-307 ; les sondes fluorescentes dérivées de sphingolipides, de stéroïdes ou de lipopolysaccharides tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales BODIPY ® TR céramides, BODIPY ® FL C ₅ -lactosylcéramide, BODIPY ® FL C ₅ -ganglioside, BODIPY ® FL cérébrosides ; les dérivés amphiphiles de cyanines, de rhodamines, de fluorescéines ou de coumarines tels que l'octadécyl rhodamine B, l'octadécyl ester de fluorescéine et la 4-heptadécyl-7- hydroxycoumarine ; et le diphénylhexatriène (DPH) et ses dérivés ; l'ensemble de ces produits étant vendu par la société Invitrogen. Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, les fluorophores sont choisis parmi les dérivés amphiphiles de dialkylcarbocyanines.

Le ou les co-tensioactifs de furtivité utilisables dans les émulsions conformes à la présente Invention sont de préférence des molécules amphiphiles dont la partie hydrophile est totalement ou en partie composée d'une chaîne d'oxyde de polyéthylène (PEO ou PEG) et dans laquelle le nombre de motifs PEO varie de préférence entre 2 et 500. Les co-tensioactifs de furtivité peuvent aussi être composés de poly-saccharides de type dextrans par exemple. A titre d'exemple de co-tensioactifs de furtivité utilisables selon la présente Invention, on peut en particulier citer les composés conjugués polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Brij ® (par exemple Brij ® 35, 58, 78 ou 98) par la société ICI Americas Inc., les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Myrj ® par la société ICI Americas Inc. (par exemple Myrj ® 45, 52, 53 ou 59) et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic ® par la société BASF AG (par exemple Pluronic ® F68, F 127, L64 ou L61) ou les produits vendus sous la dénomination

commerciale Synperonic ® par la société Unichema Chemie BV (par exemple Synperonic ® PE/F68, PE/L61 ou PE/L64).

Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la couche tensioactive située à la périphérie des gouttelettes d'huile de l'émulsion comprend en outre au moins un agent de ciblage d'une activité biologique d'intérêt, ledit agent de ciblage étant constitué d'un co-tensioactif de greffage amphiphile dont la partie hydrophile est liée, de façon covalente, à un ligand biologique. La présence d'un agent de ciblage permet de cibler un processus biologique d'intérêt particulier.

Selon une forme de réalisation avantageuse de l'Invention, lesdits agents de ciblage sont choisis parmi les composés de formule (I) suivante :

dans laquelle :

- A est la partie lipophile d'un co-tensioactif de greffage amphiphile (CoTA), - X ₁ et X ₂ , identiques ou différents, constituent la partie hydrophile dudit co-tensioactif CoTA et sont composés d'un bras espaceur flexible choisi parmi les chaînes carbonées linéaires ou ramifiées, saturées ou insaturées, éventuellement substituées, interrompues et/ou terminées par un ou plusieurs hétéroatomes choisis par exemple parmi N, O, P et S, et/ou par un ou plusieurs groupements choisis par exemple parmi les radicaux alkyle en C ₁ -C ₄ , alcoxy en Cj-C ₄ , aryle ou par une ou plusieurs fonctions choisies parmi les fonctions éther, ester, amide, carbonyle, carbamate, urée, thiourée et disulfure ;

- Y] et Y ₂ , identiques ou différents, sont choisis parmi les groupements chimiques aptes à relier Xi et Bj, respectivement X ₂ et B ₂ , par des liaisons covalentes ;

- B ₁ et B ₂ , identiques ou différents, sont des ligands biologiques dont l'une des extrémités est engagée dans la liaison covalente formée avec Xi, respectivement X ₂ ;

- n est un nombre entier compris entre 1 et 20 inclusivement ; - q est un nombre entier égal à 0 ou 1 ;

- m est un nombre entier compris entre 0 et 20 inclusivement, étant entendu que m - 0 lorsque q = 0 ;

- p est un nombre entier compris entre 0 et 10 inclusivement ; et

- R est un nombre entier compris entre 0 et 10 inclusivement. La partie lipophile (A) du co-tensioactif de greffage CoTA présent dans l'agent de ciblage de formule (I) lui permet de s'ancrer à la surface des gouttelettes d'huile au sein de la couche tensioactive périphérique. Elle peut notamment être composée d'une chaîne alkyle en C ₆ -C ₂₆ , linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée. La partie hydrophile du CoTA constituant les bras espaceurs Xj et

X ₂ des composés de formule (I) ci-dessus peut notamment être choisie parmi les chaînes constituées de motifs polyoxyéthylène ou dextran.

Selon une forme de réalisation avantageuse de l'Invention, les liaisons covalentes (groupements fonctionnels Yi/Y ₂ ) assurant la fixation de X ₅ /X ₂ aux unités Bj/B ₂ sont issues de la réaction entre une fonction chimique initialement portée par la partie hydrophile du CoTA avant sa réaction avec Bi/B ₂ et une fonction chimique complémentaire portée par les ligands biologiques Bj/B ₂ avant leur réaction avec Xi respectivement X ₂ . A titre d'exemple non limitatif et non exhaustif, on peut notamment citer les liaisons covalentes résultant de la réaction : - d'une aminé et d'un ester activé, par exemple par un groupement

N-succinimidyle conduisant à la formation de liaisons amide ;

- d'une oxyamine et d'un aldéhyde conduisant à la formation de liaisons oxyme ; et

- d'un maléimide et d'un thiol conduisant à la formation de liaisons thioéther.

Parmi les ligands biologiques utilisables à titre d'unités B] /B ₂ des agents de ciblage de formule (I) ci-dessus, on peut notamment citer : i) les ligands biologiques permettant de cibler spécifiquement certaines cellules tels que des peptides par exemple le peptide RGD (linéaire ou cyclisé), leurs dérivés et leurs analogues (ex : le peptide octéotrate, analogue de la somatostatine, un analogue de la bombésine, de la neurotensine, l'EGF, le VIP...) ; des protéines, des anti-corps, leurs dérivés ou leurs analogues ; des monosaccharides

tels que le glucose, des oligosaccharides, des polysaccharides, leurs dérivés et leurs analogues ; des oligonucléotides, ADN, leurs dérivés et leurs analogues ; des molécules organiques telle que le folate, le pamidronate biphosphonaté et des complexes organométalliques dont l'activité de ciblage est due à la reconnaissance moléculaire de ces ligands par des récepteurs sur-exprimés à la surface des cellules de la zone d'intérêt ; ii) les ligands biologiques marqueurs d'une activité biologique donnée, par exemple d'une activité enzymatique. A titre d'exemple de tels ligands, on peut par exemple mentionner les peptides clivables par une protéase donnée, à l'extrémité desquels sera greffé un inhibiteur de la fluorescence du label. Ce type de ligands permet d'imager spécifiquement l'activité enzymatique de la protéase (CH. Tung, pré-cité). Un autre exemple est constitué par les ligands biologiques comportant un pont disulfure séparant le label d'un inhibiteur de sa fluorescence. Un tel ligand biologique permet alors d'imager spécifiquement l'internalisation de la sonde dans une cellule comme décrit par exemple dans la demande de brevet FR 2 888 938.

Le couplage des ligands biologiques sur les co-tensioactifs de greffage CoTA peut être réalisé soit avant l'émulsification soit après l'émulsification. Dans ce dernier cas, il faut que les réactions chimiques employées soient compatibles avec la stabilité colloïdale des émulsions. Elles doivent notamment se dérouler en solution aqueuse et à un pH ni trop acide ni trop basique (pH 5-11).

La phase continue de l'émulsion conforme à l'Invention est une phase aqueuse, de préférence constituée d'eau et/ou d'un tampon physiologiquement acceptable tel qu'un tampon phosphate comme par exemple du PBS ("Phosphate Buffer Saline") ou d'une solution de chlorure de sodium. L'émulsion conforme à l'Invention peut être préparée par toute méthode classique connue de l'homme de l'art pour la préparation des émulsions, par exemple selon un procédé comprenant les étapes suivantes :

- la préparation d'un prémélange huileux pour la phase dispersée de l'émulsion consistant à mélanger les différents constituants huileux biocompatibles dans un solvant organique tel que par exemple le chloroforme pour obtenir, après évaporation du solvant, un prémélange huileux homogène pour la phase dispersée,

- la préparation proprement dite de la phase dispersée de l'émulsion par mélange homogène dudit prémélange huileux avec au moins un fluorophore lipophile absorbant et émettant dans le proche infrarouge ;

- Ia préparation de la phase continue de l'émulsion par mélange, en phase aqueuse, de préférence à chaud, d'au moins un tensioactif amphiphile, d'au moins un co-tensioactif de furtivité et éventuellement d'au moins un agent de ciblage d'une activité biologique d'intérêt, ledit agent de ciblage étant constitué d'un co- tensioactif de greffage amphiphile dont la partie hydrophile est liée, de façon covalente, à un ligand biologique ; - l'ajout de la phase continue à la phase dispersée et l'émulsification du mélange résultant jusqu'à l'obtention d'une émulsion homogène dans laquelle le diamètre moyen des gouttelettes d'huile est supérieur à 10 nra et inférieur à 200 nm. Cette émulsification peut par exemple être réalisée à l'aide d'un sonificateur, pendant une durée comprise entre 4 et 10 minutes. Avant son utilisation, l'émulsion est ensuite de préférence diluée, par exemple au demi et stérilisée par exemple par filtration. Cette, étape de filtration permet par ailleurs d'éliminer les éventuels agrégats qui pourraient s'être formés au cours de la préparation de l'émulsion.

Ainsi que cela a été amplement décrit et explicité ci-avant, les émulsions fluorescentes conformes à l'Invention peuvent être utilisés pour la détection d'une activité biologique d'intérêt in vivo.

La présente Invention a donc pour deuxième objet, le réactif de diagnostic d'une activité biologique d'intérêt, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins une émulsion fluorescente conforme à l'Invention et telle que décrite ci-dessus. Selon une forme de réalisation particulière et préférée de l'invention, le réactif est un réactif de diagnostic in vivo.

Enfin, l'Invention a pour objet, l'utilisation d'au moins une émulsion fluorescente conforme à l'invention et telle que décrite précédemment pour la préparation d'un réactif de diagnostic d'une activité biologique d'intérêt in vivo par imagerie de fluorescence et/ou pour l'aide au développement et à l'optimisation d'outils thérapeutiques, comme des médicaments. En effet, un tel réactif peut permettre :

- la détection de cellules cancéreuses chez l'animal, éventuellement chez l'homme, par imagerie de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive ;

- la détection de plaques d'athéromes chez l'animal, éventuellement chez l'homme, par imagerie de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive.

- la détection de fibres β-amyloïdes caractéristiques des maladies neuro-dégénératives chez l'animal, éventuellement chez l'homme, par imagerie de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive. - le suivi in vivo de processus enzymatiques chez l'animal, éventuellement chez l'homme, par imagerie de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive ;

- le suivi in vivo de l'expression de gènes chez l'animal, par imagerie de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive. - l'évaluation d'une thérapie chez l'animal, par imagerie de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive ; ou bien encore

- le suivi de la biodistribution d'une drogue, de sa délivrance contrôlée, de son efficacité. Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation d'émulsions fluorescentes conformes à la présente invention, à un exemple comparatif mettant en oeuvre une telle émulsion pour l'imagerie par fluorescence in vivo, ainsi qu'aux figures 1 à 10 annexées dans lesquelles : - la figure 1 est une représentation schématique des différentes entités pouvant constituer une sonde pour l'imagerie de fluorescence ;

- la figure 2 est une représentation comparative de la structure d'une nano-émulsion (b), par rapport aux systèmes miscellaires (c) et aux polymersomes (a), les structures (a), (b) et (c) ayant toute pour point commun d'avoir de l'eau pour phase continue de la dispersion ;

- la figure 3 correspond au schéma de principe de l'agent de contraste décrit par Winter et al, (pré-cité), constitué d'une émulsion huile-dans-eau

dans laquelle la phase continue aqueuse renferme une dispersion de gouttelettes (diamètre environ 270 nm) de bromure de perfluorooctyle stabilisées par des tensioactifs notamment composés de chélates de gadolinium sur certains desquels sont fixés du DSPE-PEG (2000)-maléimide couplé à un antagoniste peptidomimétique des intégrines αγβ ₃ ;

- la figure 4 correspond au schéma de principe de l'agent de contraste décrit dans la demande de brevet US 2005/0079131, celui-ci se présentant sous la forme d'une émulsion huile-dans-eau dans laquelle la phase continue aqueuse renferme une dispersion de gouttelettes d'huile (diamètre moyen d'environ 200 nm) incorporant un composé lipophile couplé à un élément de numéro atomique > à 36, lesdites gouttelettes étant stabilisées par une couche de tensioactifs dans laquelle s'insère un agent auxiliaire d'imagerie, le ciblage des biomolécules étant assuré par le DSPE-PEG (2000)-maléimide couplé à un antagoniste peptidomimétique des intégrines αγβ ₃ ; - la figure 5 correspond au schéma de principe de l'émulsion huile- dans-eau conforme à la présente invention, dans laquelle la phase continue aqueuse renferme une dispersion de gouttelettes d'huile (diamètre moyen < 200 nm) au cœur desquelles est encapsulé au moins un fluorophore lipophile, lesdites gouttelettes étant stabilisée par une couche périphérique tensioactive comprenant au moins un tensioactif, au moins un co-tensioactif de furtivité et au moins un agent de ciblage d'une activité biologique d'intérêt ;

- la figure 6 représente le spectre d'absorption/émission d'une émulsion conforme à la présente invention dans laquelle les gouttelettes d'huile sont constituées d'huile de soja renfermant le fluorophore DiD vendu sous la référence D-307 par la société Invitrogen. Sur cette figure, l'intensité exprimée en unités arbitraire est fonction de la longueur d'onde exprimée en nm, l'absorption correspondant à la courbe de gauche et l'émission de la fluorescence à la courbe légèrement décalée vers la droite ;

- la figure 7 montre les rendements quantiques du fluorophore DiD en fonction de son milieu (en solution dans le méthanol, incorporé dans les nano- émulsions et en solution dans l'eau) par rapport à celui du Cy5-NHS (Amersham) dont la valeur a été arbitrairement fixée à 100 ;

- la figure 8 représente la distribution en taille pondérée en volume d'une émulsion de la présente invention préparée suivant l'exemple 1. Sur cette figure, le pourcentage en volume est fonction de la taille en nm ;

- la figure 9 montre l'évolution de la distribution, au cours du temps chez la souris, d'une sonde fluorescente ne faisant pas partie de l'invention, c'est-à-dire une cyanine Cy5-NHS (Amersham), qui est un analogue hydrophile du fluorophore DiD. La cyanine n'est pas encapsulée dans une émulsion et ne possède pas d'agent de ciblage. Le fluorophore est d'abord stocké dans les reins puis s'élimine. ;

- la figure 10 montre l'évolution de la distribution au cours du temps chez la souris, d'une émulsion fluorescente conforme à la présente invention, c'est-à- dire contenant le fluorophore DiD, sans agent de ciblage. La distribution des nanoparticules dans l'organisme est très homogène et il n'y a pas d'élimination.

Il doit être entendu toutefois que ces exemples ne sont donnés qu'à titre purement illustratif de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une quelconque limitation.

EXEMPLE 1 : PREPARATION DE NANO-EMULSIONS FLUORESCENTES NON FONCTIONNALISEES

1) Préparation d'un pré-mélange pour la phase dispersée

On a préparé un pré-mélange constitué de 15 % p/p d'huile de soja (Sigma-Aldrich), de 45 % p/p de glycérides semisynthétiques vendus sous la dénomination commerciale Suppocire® NC (Gattefossé) et de 40 % p/p de lécithine de soja (enrichie à 75 % de phosphatidylcholine) vendue par la société Lipoïd sous la dénomination commerciale Lipoïd® S75. Ces composés ont été dissous dans du chloroforme, la solution a ensuite été évaporée sous pression réduite et séchée à 50°C de manière à obtenir un pré-mélange se présentant sous la forme d'une huile visqueuse qui se solidifie en refroidissant.

2) Préparation de la phase dispersée

On a prélevé, à une température d'environ 70°C, 0,833 g du prémélange préparé ci-dessus à l'étape précédente, auquel on a ajouté 1,5 mg de perchlorate de l,l'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD) qui est un fluorophore huileux vendu sous la référence D-307 par la société Invitrogen. La

solution a été homogénéisée par vortex, et maintenue à 70 ⁰ C en prévision de la phase d'émulsification.

3) Préparation de la phase continue

La phase continue était composée de 0,125 g de glycérol, de 0,55 g de stéarate de polyoxyéthylène à 50 moles d'oxyde d'éthylène vendu sous la dénomination commerciale Myrj® 53 par la société ICI Americas Inc. et d'une solution tampon phosphate (Phosphate Buffer Solution : PBS) pour compléter à 4,166 g. Cette solution a été chauffée à 70°C en prévision de l'émulsification.

4) Emulsification La phase continue a été ajoutée à la phase dispersée et le mélange a été émulsionné pendant 6 minutes pour une énergie totale de 6 000 Joules avec un sonificateur AV505 ® équipé d'une sonde conique de 3 mm de diamètre (Sonics, Newtown).

5) Préparation pour l'injection intraveineuse chez la souris L'émulsion précédemment obtenue a alors été diluée par un facteur

6,25 avec du PBS, puis filtrée sur un filtre de 0,22 μm en fluorure de polyvinylidène (PVDF) vendu sous la dénomination commerciale MilIex®-GV par la société Millipore Corporation de façon à éliminer les agrégats, mais aussi de la stériliser.

Cette émulsion peut ensuite être directement utilisée comme sonde fluorescente pour l'imagerie fonctionnelle in vivo.

Le spectre d'absorption et d'émission de cette émulsion est représentée sur la figure 6 annexée sur laquelle l'intensité exprimée en unités arbitraire est fonction de la longueur d'onde exprimée en nm ; sur cette figure l'absorption correspond à la courbe de gauche et l'émission de la fluorescence à la courbe légèrement décalée vers la droite.

Le rendement quantique de cette émulsion est 1,3 fois supérieur à celui du Cy5-NHS, comme le montre la figure 7 annexée.

La taille nominale des nanoparticules, déterminée par diffusion dynamique de la lumière sur un dispositif vendu sous la référence ALV-5000/EPP par la société ALV, était inférieure à 70 nm. La courbe de distribution des tailles est représentée sur la figure 8 annexée.

EXEMPLE 2 : PREPARATION DE NANO-EMULSIONS FLUORESCENTES FONCTIONNALISEES AVANT EMULSIFICATION

1 ) Préparation d'un peptide de ciblage fonctionnalisé par un co-tensioactif de greffage

Un peptide cyclique de ciblage des intégrines αvβ ₃ surexprimées à la surface des cellules endothéliales, c(RGDf[ε-S-acétylthioacétyl])K (identifié SEQ ID NO: 1 dans la liste de séquence annexée) vendu par la société Ansynth Service BV (Pays-Bas) et dénommé cRGD dans ce qui suit possédant un groupement thiol protégé sous la forme d'un acide mercaptoacétique, a été couplé à un co-tensioactif de greffage le distéaroylphosphatidyléthanolamine poly(éthylène glycol-2000)- maléimide, (à savoir le DSPE-PEG(2000)-maléimide vendu par la société Avanti Polar Lipids, Inc.)- Celui-ci a été mélangé au cRGD avec un ratio molaire 1 :1 dans une solution tampon acide sulfonique de (4-(2-hydroxyéthyl)-l- pipérazineéthane/acide éthylène-diamine-tétraacétique (HEPES/EDTA) avec une concentration en hydroxylamine de 0,05 M. La solution a été agitée lentement sous un léger flux d'argon à température ambiante pendant 4 heures, évaporée sous pression réduite, puis redissoute dans du chloroforme en vue de la deuxième étape. T) Préparation d'un pré-mélange pour la phase dispersée

Le pré-mélange était constitué de 15 % p/p d'huile de soja (Sigma- Aldrich), de 45 % p/p de Suppocire® NC (Gattefossé), de 38 % p/p de Lécithine® S- 75 (Lipoïd) et de 2 % p/p de DSPE-PEG(2000)-maléimide (Aventi Polar Lipids, Inc.) couplé au cRGD. Ces composés ont été dissous dans du chloroforme, la solution a ensuite été évaporée sous pression réduite et séchée à 50°C de manière à obtenir une huile visqueuse qui se solidifie en refroidissant.

3) Préparation de la phase dispersée On a prélevé, à une température d'environ 70 ⁰ C, 0,833 g du prémélange préparé ci-dessus à la deuxième étape auquel on a ensuite ajouté 1 ,5 mg du fluorophore D-307 (Invitrogen). La solution a ensuite été homogénéisée par vortex, et maintenue à 70°C en prévision de la phase d'émulsification.

4) Préparation de la phase continue La phase continue était composée de 0,125 g de glycérol, de 0,55 g de Myrj ® 53 et d'une solution tampon PBS pour compléter à 4,166 g. Cette solution a été chauffée à 70°C en prévision de l'émulsification.

5) Emulsification

La phase continue a été ajoutée à la phase dispersée et le mélange a ensuite été émulsionné pendant 6 minutes pour une énergie totale de 6 000 Joules avec un sonifîcateur AV505 ® équipé d'une sonde conique de 3 mm de diamètre (Sonics, Newtown).

6) Préparation pour l'injection intraveineuse chez la souris

L'émulsion précédemment obtenue a ensuite été diluée par un facteur 6,25 avec du PBS, puis filtrée sur filtre de 0,22 μm de façon à éliminer les agrégats, mais aussi de la stériliser. Cette émulsion peut ensuite être directement utilisée comme sonde fluorescente pour l'imagerie fonctionnelle in vivo.

EXEMPLE 3 : PREPARATION DE NANO-EMULSIONS FLUORESCENTES FONCTIONNALISEES APRES EMULSIFICATION

1) Préparation d'un pré-mélange pour la phase dispersée Le pré-mélange était constitué de 15 % p/p d'huile de soja (Sigma-

Aldrich), de 45 % p/p de Suppocire ® NC (Gattefossé), de 38 % p/p de lécithine de soja S-75 (Lipoïd) et de 2 % p/p de DSPE-PEG(2000)-maléimide (Aventi Polar Lipids). Ces composés ont été dissous dans du chloroforme, puis la solution a ensuite été évaporée sous pression réduite et séchée à 5O ⁰ C de manière à obtenir une huile visqueuse qui se solidifie en refroidissant.

2) Préparation de la phase dispersée

On a prélevé à une température d'environ 70° C, 0,833 g du prémélange décrit ci-dessus dans 1), auquel on a ajouté 1,5 mg du fluorophore DiD vendu sous la référence D-307 par la société Invitrogen. La solution a été homogénéisée par vortex et maintenue à 70 ⁰ C en prévision de la phase d'émulsifîcation.

3) Préparation de la phase continue

La phase continue était composée de 0,125 g de glycérol, de 0,55 g de Myrj ® 53 et d'une solution tampon PBS pour compléter à 4,166 g. Cette solution a été chauffée à 70 ⁰ C en prévision de l'émulsification. 4) Emulsification

La phase continue a été ajoutée à la phase dispersée et le mélange a été émulsionné pendant 6 minutes pour une énergie totale de 6 000 Joules avec un

sonificateur AV505 ® équipé d'une sonde conique de 3 mm de diamètre (Sonics, Newtown).

5) Fonctionnalisation

L'émulsion a été diluée dans un tampon HEPES/EDTA contenant 0,05 M d'hydroxylamine. La solution a été désoxygénée pendant 30 minutes par un flux d'argon, puis 2 mg du peptide cRGD porteur d'un groupe thiol protégé

(C(RGDfK(Ac-S-CH ₂ CO)), Ansynth service BV, Pays-Bas) ont été ajoutés. Le mélange réactionnel a été agité lentement sous un léger flux d'argon à température ambiante pendant 4 heures. La solution a ensuite été dialysée contre du PBS avec une membrane de dialyse Spectra/Por ® ayant un seuil de coupure égal à 12000 de manière à éliminer les cRGDs n'ayant pas réagi.

6) Préparation pour l'injection intra-veineuse chez la souris

L'émulsion précédemment obtenue a été diluée par un facteur 6,25 avec du PBS, puis filtrée sur un filtre de 0,22 μm de façon à éliminer les agrégats, mais aussi de la stériliser.

Cette émulsion peut ensuite être directement utilisée comme sonde fluorescente pour l'imagerie fonctionnelle in vivo.

EXEMPLE 4 : BIODISTRIBUTION COMPARATIVE DE NANOPARTICULES NON FONCTIONNALISEES ET FONCTIONNALISEES APRES INJECTION INTRA- VEINEUSE CHEZ LA SOURIS

200 μL de l'émulsion préparée ci-dessus à l'exemple 1 (émulsion utilisant le fluorophore D-307), correspondant à 10 nmoles de fluorophore, ont été injectés par voie intraveineuse dans la queue de souris nude femelles de 6 à 8 semaines, et maintenues sous conditions sans pathogènes (IFF A-Credo, Marcy l'Etoile, France). Celles-ci ont été maintenues sous anesthésie générale par voie gazeuse (isoflurane) tout le long de l'expérience. Les animaux anesthésiés ont été imagés avec un dispositif d'imagerie de fluorescence par réflectance (FRI = "Fluorescence Réflectance Imaging"), comportant comme source d'excitation une couronne de LEDs munies de filtres interférentiels, émettant à 633 nm (puissance d'éclairement 50 μW.cm ^"2 ) comme décrit par exemple dans l'article de Texier, I. et al, "Luminescent probes for optical in vivo imaging", Proceedings of the SPIE, 2005, 5704, 16-22. Les images ont été recueillies après filtration par un filtre coloré RG665

de densité optique >5 à la longueur d'onde d'excitation par une caméra CCD (Orca

BTL, Hamamatsu) avec un temps d'exposition de 20 ms. Les signaux ont été quantifiés à l'aide d'un logiciel de traitement d'images.

A titre comparatif, 200 μl d'une composition comparative renfermant 20 nmoles d'un fluorophore Cy5-NHS (Amersham)ne se présentant pas sous la forme d'une émulsion, ont été également injectées à des souris, dans les mêmes conditions que pour l'émulsion de l'exemple 1.

Les résultats obtenus ont été reportés sur la figure 9 annexée qui montre l'évolution de la distribution au cours du temps de l'émulsion contenant la cyanine Cy5-NHS (Amersham). On peut notamment y voir que les reins et la vessie accumulent rapidement le fluorophore, limitant le temps où celui-ci peut être imagé dans l'organisme.

A titre comparatif, la figure 10 annexée montre l'évolution de la distribution des gouttelettes chargées en fluorophore DiD au cours du temps. On peut notamment voir que même si certains organes captent dans un premier temps une partie importante des gouttelettes chargées en fluorophore (comme le foie ou les poumons) la fluorescence s'homogénéise avec le temps. Ces résultats montrent donc que l'encapsulation du fluorophore au sein des gouttelettes d'huile améliore le temps de circulation et réduit son élimination par certains organes comme l'intestin, le foie ou les reins, permettant une meilleure exploration de l'ensemble du corps de l'animal.