CAMPO DA INVENÇÃO

[001 ] A presente invenção refere-se a uma formulação compreen dendo pelo menos uma planta medicinal, parte ou extrato da mesma, um ou mais agentes extratores e um ou mais excipientes farmaceutica- mente ou cosmeticamente aceitáveis que geram um extrato vegetal (de rivado vegetal) com alto teor de bioativos para regeneração da pele, das mucosas dérmicas e anexos, utilizado como um insumo farmacêutico ativo para tratamento de ferimentos de qualquer natureza ou como um insumo cosmético para proteção, manutenção e equilíbrio natural da pele, das mucosas dérmicas e anexos.

[002] A utilização da referida formulação gera produtos farmacêu ticos de alta eficácia, de aplicação tópica, que proporcionam tratamen tos de baixo custo, de tempo reduzido e de menor complexidade dos procedimentos pelos profissionais médicos e de enfermagem, destinado ao tratamento de lesões crónicas e agudas da pele, das mucosas dér micas e anexos.

[003] A utilização da referida formulação ainda gera produtos cos méticos, de aplicação tópica, visando à proteção, manutenção e equilí brio natural da pele, das mucosas dérmicas e anexos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Estima-se que toda a população mundial, aproximadamente 7,4 bilhões de pessoas, faz, no mínimo, um ferimento agudo por ano e que cerca de 2% da população global (de acordo com a OMS), faz feri mentos crónicos, equivalente a cerca de 149 milhões de pessoas, su perior à população da Rússia, da ordem de 142 milhões de pessoas.

[005] A incidência mundial desses ferimentos pode ser dividida por tipo de origem das lesões. Segundos dados de 2013, a maior parte dos ferimentos foi decorrente de cirurgias (102,8 milhões) e, na sequência, por lacerações (21 ,4 milhões). As úlceras foram responsáveis por 29,7 milhões de ferimentos: 1 1 ,3 milhões foram devido à úlcera diabética, 1 1 milhões por úlcera venosa e 7,4 milhões por lesão por pressão. Outros 9,8 milhões de ferimentos foram por queimadura e 1 milhão de ferimen tos por motivos diversos.

[006] Os ferimentos ocorrem como resultado de uma extensa va riedade de traumatismos, de simples cortes a lesões extremas, que re sultam em uma ruptura da estrutura anatômica da pele, com a subse quente perda da sua função protetora, entre outras finalidades.

[007] Os ferimentos são classificados em:

• Ferimentos Agudos: Caracterizam-se pela capacidade do próprio metabolismo de promover a cura por meio de um processo fisiológico normal, com sua cicatrização ocorrendo em torno de 21 dias. Podem-se citar, como exemplos de ferimentos agudos, os cortes, as escoriações, as incisões cirúrgicas e as queimaduras de espessura par cial.

• Ferimentos Crónicos: Caracterizados por uma reação in flamatória prolongada que interfere no processo normal de cicatrização, entre outros parâmetros, que demandam supervisão médica e medica mentos ou dispositivos específicos. Esse tipo de ferimento também é caracterizado quando a cicatrização não ocorre em até 42 dias, entre outros critérios. São exemplos, desse tipo de ferimento, as úlceras de pé diabético, úlceras venosas, lesões por pressão, úlceras arteriais, in cisões cirúrgicas infectadas e queimaduras de espessura total.

[008] A cicatrização é um processo de reparação tecidual que substitui o tecido lesado por um tecido novo. É um processo dinâmico que envolve fenômenos bioquímicos e fisiológicos que ocorrem de forma coordenada e harmoniosa a fim de garantir a restauração tissular. Ela é formada por três fases evolutivas sobrepostas: fase inicial ou in flamatória, fase proliferativa ou de fibroplasia e fase de remodelação ou maturação.

[009] Vários fatores podem influenciar na cicatrização, dentre eles: tipo da lesão, faixa etária do paciente, estado nutricional, localização anatômica, tipo da pele, raça, técnica cirúrgica utilizada, existência de doenças crónicas, tabagismo, infecção, utilização de terapia medica mentosa e tratamento tópico adequado.

[010] As terapias para o tratamento dos ferimentos podem utilizar produtos nas seguintes categorias:

• Tradicionais: como, por exemplo, os curativos secos, adesivos e bandagens que possuem como função proteger e cobrir a lesão;

• Avançados: como, por exemplo, os hidrocolóides, hidro- géis e alginatos. São produtos que, além da atuação da categoria dos produtos tradicionais, promovem um ambiente úmido no leito da lesão, favorecendo as condições de cicatrização;

• Ativos: como os produtos à base de agentes ativos, de nominadas peles sintéticas, produtos que são substitutos temporários de pele e os produtos que são substitutos permanentes de pele (enxer tias). São produtos que, além da atuação da categoria dos produtos avançados, estimulam o processo de cicatrização; e

• Dispositivos Médicos: São terapias que utilizam apare lhos que objetivam melhorar o processo de cicatrização por meio de di ferentes tecnologias. Como exemplos, temos: câmara hiperbárica, dis positivos de VAC ( Vacuum Assisted Closure ) e dispositivos de ultras som, entre outros.

[01 1 ] As indústrias farmacêuticas estão focadas e continuam a in vestir em produtos que utilizam diversas e dispendiosas tecnologias para geração de membranas físicas à base de tecidos vivos ou de teci dos sintéticos, na categoria de produtos Ativos, que demandam trata mentos que decorrem em:

• Alto custo de tratamento: Como exemplo, um único cura tivo Apligraf®, reconhecido como um dos mais eficazes do mercado, tem um custo de US$34,47 por cm ² , com previsão de substituição, no máximo, a cada 7 dias. Além desse custo, existem ainda os gastos re lacionados a:

a) Profissionais: como médicos e enfermeiros necessários à implantação desses curativos e assistência periódica ao tratamento desses pacientes, além de centros cirúrgicos ou de áreas próprias para realização dos procedimentos médicos e de enfermagem;

b) Necessidade de medicamentos e materiais adicionais associados ao tratamento; e

c) Quantidade desses curativos necessários para cobrir toda a extensão do ferimento crónico, em geral de área expressiva, du rante todo o tratamento.

• Prolongado tempo de tratamento: O tempo de tratamento com um produto dessa natureza é, normalmente, de longa duração, seja pela complexidade requerida no tratamento do ferimento, seja pelo pró prio efeito terapêutico do produto.

• Complexos procedimentos de tratamento: a forma de apresentação sólida desses produtos são membranas físicas que ge ram vários inconvenientes aos pacientes e aos profissionais da área médica e de enfermagem decorrentes das seguintes condições:

a) Por cobrirem completamente a superfície do ferimento, as membranas não podem ser aplicadas, indiscriminadamente, sem uma avaliação médica prévia;

b) Aprovada a utilização, a aplicação desses produtos sem- pre exige a assistência de profissionais da área médica e de enferma gem, além de um ambiente físico tecnicamente apropriado;

c) Na hipótese de infecção, situação comumente encon trada em ferimentos crónicos, o início da aplicação das membranas so mente pode ocorrer após o tratamento prévio dessa infecção no feri mento;

d) As membranas podem apresentar casos de reações ad versas devido à existência de elementos alergênicos;

e) Algumas membranas podem aumentar significativa mente a secreção do ferimento, afetando a pele nas bordas do feri mento, gerando uma cicatrização inapropriada; e

f) Ocorre um desconforto gerado pelo contato físico da membrana com a região lesionada, área de alta sensibilidade à dor, em geral.

[012] O surgimento das categorias de produtos Ativos e Dispositi vos Médicos foi uma decorrência natural oriunda da baixa eficácia per cebida dos produtos Tradicionais e Avançados em tratamentos de feri mentos crónicos.

[013] Um dos produtos existentes no mercado para o tratamento de ferimentos é o Plenusdermax®. Um insumo farmacêutico ativo, pro duzido por tecnologia de processo, para manipulação de um medica mento fitoterápico cicatrizante, à base de Calendula officinalis L. e exci- pientes (Hidroxitolueno Butilado - BHT, etanol, polietilenoglicol, fenoxi- etanol, caprililglicol, bicarbonato de sódio e água purificada). O extrato é utilizado para preparações tópicas magistrais no tratamento de lesões da pele e de mucosas, promovendo a cicatrização e combatendo pos síveis focos inflamatórios.

[014] De todo modo, permanece a necessidade no mercado de se buscar um produto de maior eficácia que proporcione um tratamento de baixo custo, com um tempo de tratamento reduzido e com mínima com plexidade nos procedimentos pelos profissionais das áreas médica e de enfermagem.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[015] Um primeiro objetivo é prover uma formulação compreen dendo, pelo menos, uma planta medicinal, parte ou extrato da mesma, um ou mais agentes extratores e um ou mais excipientes farmacêutica mente ou cosmeticamente aceitáveis que geram um extrato vegetal (de rivado vegetal) com alto teor de bioativos para regeneração da pele, das mucosas dérmicas e anexos, em que a formulação possui um pH na faixa de 4,5 a 10 e, pelo menos, um agente extrator é um biossurfac- tante. Dita formulação possui por finalidade a aplicação tópica para tra tamento de ferimentos de qualquer natureza da pele, das mucosas e anexos no âmbito farmacêutico e para proteção, manutenção e equilí brio da regeneração natural da pele, das mucosas e anexos no contexto cosmético.

[016] Um segundo objetivo é proporcionar o uso da referida formu lação, resultando em medicamentos que proporcionem tratamentos mé dicos, bem como produtos para aplicações cosméticas, ambos de baixo custo, de tempo reduzido e de mínima complexidade dos procedimentos profissionais da área da saúde e do setor de cosmetologia, respectiva- mente.

[017] Um terceiro objetivo é a descrição de um produto compreen dendo a referida formulação para utilização na pele, nas mucosas dér micas e anexos, seja no âmbito farmacêutico no tratamento de lesões crónicas e agudas, bem como no contexto cosmético para proteção, manutenção e equilíbrio da regeneração natural da pele, das mucosas dérmicas e anexos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[018] O primeiro objetivo é atingido ao prover uma formulação compreendendo, pelo menos, uma planta medicinal, parte ou extrato da mesma, um ou mais agentes extratores e um ou mais excipientes far- maceuticamente ou cosmeticamente aceitáveis, em que a formulação possui um pH na faixa de 4,5 a 10, e em que, pelo menos, um agente extrator é um biossurfactante. Ditos excipientes podem ser seleciona dos dentre antioxidantes, conservantes, precipitantes, solventes e mo- duladores de pH (alcalinizantes ou acidulantes). Dita formulação pode ser utilizada como Insumo Farmacêutico Ativo (IFA) ou como insumo cosmético.

[019] O segundo objetivo é atingido ao utilizar dita formulação, como Insumo Farmacêutico Ativo (IFA), na composição de medicamen tos para a regeneração da pele, das mucosas dérmicas e anexos ou como um insumo na composição de cosméticos para a manutenção e equilíbrio natural da pele, das mucosas dérmicas e anexos, ambos de aplicação tópica.

[020] O terceiro objetivo é atingido ao poder se obter um produto farmacêutico acabado, podendo ser industrializado ou manipulado, uti lizando dita formulação, proteção, manutenção e equilíbrio da regene ração natural da pele, das mucosas dérmicas e anexos, no âmbito cos mético, ou para acelerar a regeneração tecidual da pele, das mucosas dérmicas e anexos, no âmbito farmacêutico.

[021 ] Em uma concretização alternativa, o terceiro objetivo é atin gido ao poder se obter um produto cosmético acabado utilizando dita formulação para proteger, manter e garantir o equilíbrio da regeneração natural da pele, das mucosas dérmicas e anexos. O produto é de apli cação tópica, como, por exemplo, na forma de apresentação de uma loção pós-solar, podendo ter outras aplicações cosméticas e outras for mas de apresentação, como, por exemplo, géis, cremes e pomadas. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[022] Figura 1 - Fluxograma da execução do teste de migração celular in vitro utilizada. (1). Plaqueamento de fibroblastos humanos (HFF1) (2). Após 24 horas é realizada a ranhura ( Scratching ) e captura de imagem (3). Incubação com os tratamentos (0,02%).

[023] Figura 2 - Gráfico de distribuição dos valores de distâncias de Mahalanobis das nove replicatas para a condição experimental Pro duto B. No eixo x, representando cada uma das nove réplicas e eixo y, os valores de distâncias obtidos. A linha em azul determina o valor de threshold ( upper control limit ) utilizado para determinação dos outliers na análise, sendo as réplicas com valores acima do limite excluídas das análises. Sendo UCL=1 ,78 e a=0,05.

[024] Figura 3 - Avaliação do potencial cicatrizante por meio da migração celular. Gráfico da distribuição de Percentual de Fechamento máximo em relação às condições experimentais testadas. A linha hori zontal evidencia o limite para a condição controle. ( ^** ) p<0,01 (teste t de Student).

[025] Figura 4 - Dendrograma das condições experimentais resul tantes da análise de agrupamento hierárquico. Os valores máximos de Percentual de Fechamento para cada condição foram utilizados para a construção do diagrama em árvore. Os losangos apontam o limite da distância (gráfico abaixo do Dendrograma) utilizado para definição dos números de clusters (2) na análise.

[026] Figura 5 - Box plot da distribuição dos dados de % de fecha mento por cluster. O cluster 1 é formado pelos produtos A e B, cluster 2 formado pelo Produto C e condição Controle.

[027] Figura 6 - Úlcera venosa, fotografada antes (A) e após (B) o tratamento com o produto da presente invenção, que consiste no Pro duto B testado, com o gabarito em azul (paciente LCC).

[028] Figura 7 - Úlcera venosa, fotografada antes (A) e após (B) o tratamento com o produto da presente invenção, que consiste no Pro duto B testado, com o gabarito em azul (paciente CAC). [029] Figura 8 - Úlcera venosa, fotografada antes (A) e após (B) o tratamento com produto à base do produto da presente invenção, que consiste no Produto B testado, com o gabarito em azul (paciente VBSS).

[030] Figura 9 - Úlcera venosa, fotografada antes (A) e após (B) o tratamento com produto à base do produto da presente invenção, que consiste no Produto B testado, com o gabarito em azul (paciente RMM). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[031 ] Para fins de referência, unhas, pêlos, cabelos, glândulas se- báceas e glândulas sudoríparas são considerados anexos da pele e das mucosas dérmicas.

[032] Ainda, a menos que especificamente revelado ao contrário, entende-se por“pelo menos um” a presença de um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais elementos definidos na presente invenção.

[033] A formulação aqui descrita é obtida a partir uma planta me dicinal, parte ou extrato da mesma, muitas das quais são tradicional mente conhecidas por atuar no tratamento de lesões na pele, em com binação com um ou mais agentes extratores e um ou mais excipientes farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitáveis, em que a formula ção possui um pH na faixa de 4,5 a 10, e em que, pelo menos, um agente extrator é um biossurfactante, os quais auxiliam no processo de extração, gerando um extrato vegetal (derivado vegetal) com alto teor de bioativos não encontrados similares no mercado, capaz de acelerar o tratamento de lesões, crónicas ou agudas, podendo ser inferior à me tade do tempo de tratamento, quando comparada aos outros produtos e métodos utilizados atualmente.

[034] Essa tecnologia engloba em um único produto, por meio da combinação de ingredientes específicos e método de extração otimi zada e padronizada, que extraem, de forma expressiva, os bioativos es pecíficos, principalmente os monoésteres triterpenóides, importantes para ação cicatricial, resultando num produto com potencial de modula ção de diversos mecanismos biológicos no leito da lesão e que propor cionam a alta eficácia para a cura do paciente, incluindo ação antimicro- biana, anti-inflamatória, reparo tecidual, proliferação e migração celular, reestrutu ração da matriz extracelular e curativa por meio de uma pelí cula biomolecular formada pelo produto. Devido a essa atuação dos bi- oativos específicos naturais, no âmbito cicatricial da pele, bem como a eficiência superior de tratamento comparada aos outros medicamentos convencionais utilizados para a regeneração de lesões crónicas e agu das, pode-se assegurar que se tem um produto ímpar no mercado glo bal. Compreendem os monoesteres triterpenóides os seguintes bioati- vos: lupeol, calenduladiol laurato, arnidiol laurato, faradiol laurato, ca- lenduladiol miristato, arnidiol miristato, faradiol miristato, calenduladiol palmitato, arnidiol palmitato e faradiol palmitato.

[035] A escolha do enriquecimento de monoésteres triterpenóides, na presente formulação, foi adotada com o objetivo de se obter um pro duto com alta eficácia nos mecanismos cicatriciais cutâneos. O emba samento científico das propriedades benéficas dos monoésteres triter penóides e sua potencial ação como agente cicatrizante são fundamen tados por meio de diversas pesquisas científicas.

[036] Agra e colaboradores publicaram, em 2015, uma revisão para tratar exclusivamente desse assunto e utilizaram buscas sistemá ticas de trabalhos originais publicados de 1910 até 2013 nos bancos de dados do Medline, ScienceDirect e LILACS. A conclusão, a partir da análise de mais de dois mil artigos que foram pesquisados, é que os triterpenóides induziram a redução do tempo de fechamento das lesões em praticamente todos os tipos de ferimentos.

[037] Com base nos mecanismos de ação relatados, os triterpe nóides também modulam a produção de radicais livres ROS no micro- ambiente da lesão, acelerando o processo de reparo tecidual, induzindo a migração celular, proliferação celular e deposição de colágeno no lo cal lesionado (Agra, et al. 2015).

[038] Patel e colaboradores, em outro trabalho publicado em 2018, avaliaram o potencial biológico de atividade antioxidante e de agente microbiano. O trabalho concluiu que o Lupeol, efetivamente, tem propri edades excelentes para eliminar os radicais livres em taxa proporcional à concentração do monoésteres triterpenóides utilizada. Os testes rea lizados, por intermédio da metodologia de disco-difusão, confirmaram a atividade antimicrobiana observando os halos de inibição no ágar for mado.

[039] Em paralelo, foram realizados testes de citotoxicidade, por meio do método de MTT com linhagens de fibroblastos 3T3 para o Lu peol, e os dados identificaram viabilidade aceitável e sem toxicidade constatada. Com base nesse estudo, foi possível concluir que os triter penóides presentes no extrato de Calêndula têm papel comprovado de ação antioxidante e antimicrobiana sem qualquer indício de citotoxici dade (Pavel et al., 2018).

[040] Alguns trabalhos evidenciam o papel de outro monoéster muito abundante nos extratos de Calêndula, o faradiol. Esse compo nente tem papel anti-inflamatório e promove aceleração do processo ci- catricial, quando utilizado topicamente. Delia Loggia e colaboradores estudaram formas de aumentar as quantidades desse monoéster triter- penóide nos extratos, e os resultados da ação anti-inflamatória são pro porcionais às concentrações obtidas do faradiol no extrato, concluindo seu papel no mecanismo de reparo de lesões (Delia Loggia et al., 1994).

[041 ] Fronza e colaboradores em 2009 realizaram estudos com extrato de Calêndula e monoésteres triterpenóides, como palmitato e miristato de faradiol, para determinar o efeito da cicatrização in vitro uti lizando a técnica de Scratch Assay em linhagens de fibroblastos 3T3. Foi observado que o faradiol, nas formas de miristato e palmitato, tem papel parcial no processo cicatricial comparadas ao extrato, dessa forma é possível inferir que o faradiol é um dos componentes triterpe- nóides que também agem na cicatrização, porém é o conjunto de todos esses monoésteres triterpenóides que promove sinergicamente a po- tencialização do mecanismo de reparo tecidual como um todo (Fronza et al., 2009).

[042] A presente formulação, rica em bioativos e acentuados teo res de monoésteres triterpenóides, possui, pelo menos, uma planta me dicinal, parte ou extrato da mesma utilizada para regeneração de pele, de mucosas dérmicas e anexos.

[043] Em uma modalidade preferida, as plantas medicinais (drogas vegetais) que podem ser utilizadas para produção dos extratos vegetais são fontes de obtenção de monoésteres triterpenóides. Além da referida Calendula officinalis, referidas plantas medicinais são preferencialmente selecionadas dentre, sem estarem limitadas a: Acacia senegal, Achillea millefolium, Aesculus hippocastanum, Agrimonia eupatoria, Ajuga tur- kestanica, Alcea rosea, Alchemilla vulgaris, Aleurites moluccana, Aloe barbadensis, Aloe vera, Althaea officinalis, Ammi visnaga, Ananas sati- vus, Anethum graveolens, Angélica archangelica, Anthemis nobilis, Ara- chis hypogaea, Arctium lappa, Arctostaphylos sp., Argania spinosa, Ar nica montana, Artemísia absinthium, Artemísia capillaris, Artemísia vul garis, Ascophyllum nodosum, Astragalus membranaceus, Astragalus si- nicus, Atractylodes lancea, Avena sp., Bellis perennis, Berberis aristata, Berberis vulgaris, Bertholletia excelsa, Beta vulgaris, Bétula alba, Boe- rhavia difusa, Borago officinalis, Boswellia carterii, Brassica campestres, Brassica oleracea, Brassica rapa, Buddleja davidii, Bupleurum falcatum, Butyrospermum parkii, Buxus chinensis, Calendula arvensis, Calendula bicolor, Calendula eckerleinii, Calendula lanzae, Calendula maderensis, Calendula marítima, Calendula maroccana, Calendula meuselii, Calen- dula pérsica, Calendula stellata, Calendula suffruticosa, Calendula trip- terocarpa, Calluna vulgaris, Calophyllum inophyllum, Camellia japonica, Camellia oleifera , Camellia sinensis, Cannabis sativa, Carthamus tinc- torius , Carya illinoensis , Castanea sativa , Cedrus atlantica , Centaurea cyanus, Centella asiatica, Chamaemelum nobile, Chamomilla recutita, Chondrus crispus , Citrullus colocynthis , C/f/x/s aurantifolia , C/f/x/s auran- tium , Citrus medica, Citrus unshiu, Coffea arabica, Cola acuminata, Co- leus barbatus, Commiphora myrrha, Copaifera officinalis, Copernicia ce- rifera, Cornus sp., Corylus americana, Corylus avellana, Crataegus mo- nogyna, Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita pepo, Curcuma longa, Cymbopogon citratus, Cymbopogon martini, Diplolepis rosae, Echinacea purpurea, Elaeis guineenses, Epilobium sp., Equisetum ar vense, Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia aromatica, Eugenia caryophyllus, Euphorbia cerifera, Euphrasia officinalis, Euterpe olera- cea, Evodia rutaecarpa, Fagus sylvatica, Filipendula glaberrima, Filipen- dula rubra, Filipendula ulmaria, Fucus vesiculosus, Gardenia jasminoi- des, Gentiana lutea, Geranium pratense, Ginkgo biloba, Glyzyrrhiza gla- bra, Gossypium herbaceum, Hamamelis sp., Hapagophytum procum- bens, Helianthus annuus, Hibiscus sp., Hippophae rhamnoides, Horto- nia floribunda, Humulus lupulus, Hydnocarpus kurzii, Hypericum perfo- ratum, llex paraguariensis, lllicium verum, Jasminum grandiflorum, Juni- perus communis, Kigelia africana, Lagerstroemia indica, Lamium album, Larrea tridentata, Lavanda multifida, Lavanda penduculata, Lavanda pinnata, Lavanda stoechas, Lavanda viridis, Lavandula angustifolia, La- vandula latifolia, Leontopodium alpinum, Leptospermum scoparium, Limnanthes alba, Linum usitatissimum, Litchi sinensis, Lithospermum erythrorhizon, Lonicera sp., Luffa cylindrica, Malva sylvestris, Mangifera indica, Matricaria chamomilla, Medicago sativa, Melaleuca alternifolia, Melissa officinalis, Morinda citrifolia, Morus bombycis, Morus nigra, Nar- dostachys jatamansi, Nasturtium officinale , Oenothera biennis, Olea eu- ropaea, Oryza sativa, Padina pavonica, Paeonia albiflora, Paeonia su- ffruticosa, Palmaria palmata, Panax ginseng, Panicum miliaceum, Pa- paver somniferum, Passiflora incarnata, Paullinia cupana, Pelargonium graveolens, Perilla frutescens, Perilla ocymoides, Persea gratíssima, Persicaria hydropiper, Petroselinium crispum, Phyllanthus emblica, Pi- cea abies, Pilocarpus jaborandi, Pinus lambertiana, Pinus sylvestris, Pi- per nigrum, Pistacia vera, Pisum sativum, Pogostemon cablin, Polygo- num cuspidatum, Portulaca oleracea, Prunella vulgaris, Prunus ameri cana, Prunus amygdalus, Prunus armeniaca, Prunus domestica, Puera- ria lobate, Púnica granatum, Pyrus cydonia, Pyrus malus, Quercus in- fectoria, Ricinus communis, Robinia pseudoacacia, Rosa canina, Rosa centifolia, Rosa damascena, Rosa mosqueta, Rosa roxburghii, Rosa ru- biginosa, Rosmarinus offícinalis, Rubia sp., Rubus idaeus, Rubus occi- dentalis, Rubus ursinus, Ruscus aculeatus _^ Salix alba, Salix nigra, Sal- via offícinalis, Sambucus canadenses, Sambucus cerúlea, Sambucus nigra, Sapindus mukurossi, Saponaria offícinalis, Sargassum filipendula, Saxifraga sarmentosa, Saxifraga stolonifera, Schinus sp., Scutellaria baicalensis, Serenoa repens, Solanum ycopersicum, Solanum tubero- sum, Solanum ycopersicum, Stryphnodendron sp., Symphytum offici- nale, Syzygium aromaticum, Tanacetum parthenium, Taraxacum offici nale, Terminalia catappa, Terminalia sericea, Theobroma cacao, Thymus serpyllum, Thymus vulgaris, Tília cordata, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Tussilago farfara, Ulmus rubra, Uncaria tomentosa, Urtica dioica, Vaccinium macrocarpon, Vaccinium myrtillus, Valeriana offícinalis, Vanilla plani folia, Viola tricolor, Vitis sp., Ximenia americana, Zanthoxylum piperitum, Zanthoxylum simulans, Zingiber officinale, Zin- giber zerumbet, Ziziphus jujuba ou misturas das mesmas.

[044] Em uma modalidade preferida, o derivado vegetal é um ex trato é um extrato hidroglicólico, glicólicos ou fluidos. [045] Em uma modalidade preferida, o derivado vegetal é um ex trato hidroglicólico de Calendula arvensis, Calendula bicolor, Calendula eckerleinii, Calendula lanzae, Calendula maderensis, Calendula marí tima, Calendula maroccana, Calendula meuselii, Calendula officinalis, Calendula pérsica, Calendula stellata, Calendula suffruticosa, Calendula tripterocarpa ou misturas das mesmas.

[046] Em uma modalidade ainda mais preferida, o derivado vegetal é um extrato hidroglicólico de Calendula officinalis.

[047] Em uma modalidade mais preferida, a presente formulação é um extrato hidroglicólico de Calendula officinalis com um ou mais ex- cipientes.

[048] Como exemplo da extração resultante da formulação aqui descrita, observou-se que, em uma formulação de Calendula officinalis, o teor alcançado de monoésteres triterpenóides no derivado vegetal compreende a faixa de 0,0899 - 0,1868 mg/ml_ expressos em Lupeol, sendo que a fração enriquecida da extração por meio de diclorometano revela 5,5% de monoésteres de calenduladiol, 15,7% de monoéstres de arnidiol e 35,2% de monoéstres de faradiol. A metodologia utilizada para a quantificação é por meio da plataforma de Cromatografia Líquida de Alta Eficácia (CLAE).

[049] Em uma modalidade preferida, os biossurfactantes são sele cionados entre monorramnolipídeos, dirramnolipídeos, soforolipídeos, lipídeos de manosileritritol, celubioses, xilolipídeos, tre-halipídeos, lipo- peptídeos, glicosídeos ou partes da molécula, tal como, a ramnose, ou misturas dos mesmos.

[050] Em uma modalidade, os agentes extratores, são seleciona dos dentre, porém não são limitados a: água, álcool etílico de cereais, clorofórmio, etanol, éteres, metanol, polietilenoglicóis, propilenoglicóis, surfactantes ou mistura dos mesmos.

[051 ] Em uma modalidade, os surfactantes adequados para uso na presente formulação são aqueles com ampla faixa de atuação e pe quena irritabilidade à pele humana.

[052] Em uma modalidade preferida, os surfactantes são selecio nados dentre, porém não são limitados a: ácido sulfônico, alcanolami- das, álcoois e alquilfenóis etoxilados, alquilpoliglicosídeos, aminas gra xas etoxiladas, brometos de cetil trimetil amónio, cloretos de benzalcô- nio, cloretos de cetil trimetil amónio, cocoamida propil betaína, dietano- lamida de ácido graxo do coco, ésteres de ácidos graxos, ésteres de anidro-hexitoses cíclicas, etoxiaminas, lauril éter sulfato de sódio, lauril sarcosinato de amónio, lauril sarcosinato de sódio, lauril sulfato de amó nio, octoxinol, óxidos de amina, polioxietileno, tridecila e tensoativos: carboximetilados, catiônicos não nitrogenados; fosfatados; organossili- conados; poliméricos; quaternários de amónio; sulfatados; sulfonados ou mistura dos mesmos.

[053] Os excipientes presentes na referida formulação possuem uma ou mais funções selecionadas dentre: antioxidantes, conservantes, precipitantes, solventes e moduladores de pH (alcalizantes ou acidulan- tes).

[054] Em uma modalidade, os excipientes que possuem a função de antioxidante, são selecionados dentre, porém não são limitados a: ácido alfa lipóico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido elágico, ácido fe- rúlico, ácido retinóico, antocianinas, betacarotenos, bissulfitos, clori- drato de cisteína, flavonóides (quercetina, rutina, kaempferol, miricetina, hiperosídeo), hidroquinonas, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolu- eno butilado (BHT), isotiocianatos, metabissulfitos, polifenóis, propilga- latos, resveratrol, sulfitos, taninos, tioglicerol, tióis, tiossorbitol, tocofe- róis ou mistura dos mesmos.

[055] Em uma modalidade, os excipientes, que possuem a função de conservante, são selecionados dentre, porém não são limitados a: acetato de fenilmercúrio, ácido benzóico, ácido bórico, ácido de-hidroa- cético, ácido fórmico, ácido propiônico, ácido salicílico, ácido sórbico, ácido undecilênico, álcool benzílico, álcool etílico, álcool fenetílico, ben- zilemiformal, benzilparabeno, benzisotiazolinona, benzoato de sódio, bi- guanida de poliaminopropila, borato de sódio, brometo de domifeno, bronidox, bronopol, butilcarbamato de iodopropinila, butilparabeno, ca- prilil glicol, clofucarban, cloramina T, cloreto de benzalcônio, cloreto de bezetônio, cloreto de prata, clorexidina, clorfenesina, cloroacetamida, clorobutanol, clorocresol, clorofeno, cloroxilenol, conservantes fenóli- cos, de-hidroacetato de sódio, diacetato de clorexidina, diazolidinil uréia, dicloridrato de clorexidina, digliconato de clorexidina, dimetil oxazoli- dina, dioxanediol, disetionato de hexamidina, DMDM hidantoína, 2-bro- mo-2-nitropropano-1 , etilparabeno, fenilfenato de sódio, fenoxietanol, fenoxisopropanol, glutaral, hexetidina, hidroximetilglicinato de sódio, hinokitiol, imidazolinidil uréia, iodeto de sódio, isobutilparabeno, isopro- pilparabeno, isotiazolinonas, metenamina, metildibromo glutaronitrilo, metilparabeno, nisina, nitronersol, o-cymen-5-OL, o-fenil fenol, p-Cloro- m-cresol, propilparabeno, propionato de cálcio, propionato de sódio, quatérnio 15, quatérnio 73, resorcinol, 7-etilbicicloxazolidina, sorbato de potássio, timerosal, timol ou mistura dos mesmos.

[056] Em uma modalidade, os excipientes que possuem a função de precipitar peptídeos, são selecionados dentre, porém não são limita dos a: ácido acético, ácido poliacrílico, ácido sulfossalicílico, ácido tri- cloroacético (TCA), bicarbonato de sódio, carboximetilcelulose (CMC), éter dietílico, quitosana, sais neutros, sulfato de amónio, terc butil éter de metila ou mistura dos mesmos.

[057] Em uma modalidade preferida, o pH da formulação deve se apresentar dentro da faixa entre 4,5 a 10, mais preferivelmente de 6 a 8. [058] Em uma modalidade, moduladores de pH, acidulantes ou al- calinizantes, podem ser utilizados para ajuste do pH da formulação.

[059] Em uma modalidade preferida, os agentes acidulantes são selecionados dentre, mas não limitados a: ácido acético, ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido adípico, ácido fosfórico, ácido glioxílico, ácido fu- márico, ácido láctico, ácido lactobiônico, ácido málico, ácido propiônico, ácido sórbico, ácido succínico, ácido tartárico, glucona delta lactona (GDL) ou mistura dos mesmos.

[060] Em uma modalidade preferida, os agentes alcalinizantes são selecionados dentre, mas não limitados a: aminometil propanol, bicar bonato de sódio, borato de sódio, citrato de potássio, hidróxido de sódio, hidróxido de alumínio, trietanolamina ou mistura dos mesmos.

[061 ] Em uma modalidade preferida, a formulação descrita pode ser utilizada na obtenção de um produto, como um cosmético para pro teção, manutenção e equilíbrio da regeneração natural da pele, das mu cosas dérmicas e anexos ou como um medicamento para acelerar a regeneração da pele, das mucosas dérmicas e anexos.

[062] A formulação descrita é utilizada como um Insumo Farma cêutico Ativo (IFA) para a preparação de um produto farmacêutico ou um produto cosmético, tanto industrial, quanto magistral.

[063] O produto pode ser de aplicação tópica como, por exemplo, na forma de apresentação de um líquido cicatrizante para aplicação por spray, podendo ter outras aplicações terapêuticas, como indicadas na tabela abaixo, bem como outras formas de apresentação, como, por exemplo, loções, géis, cremes e pomadas. As terapias alvo do produto acabado são as lesões crónicas e as lesões agudas que demandam a aceleração da regeneração da pele, das mucosas dérmicas e anexos. Os produtos que podem ser desenvolvidos, a partir da dita formulação, tanto no âmbito farmacêutico, quanto no contexto cosmético, incluem as atuações tópicas descritas nas Tabelas 01 e 02, respectivamente, a se guir:

TABELA 01. ATUAÇÕES TÓPICAS DE ÂMBITO FARMACÊUTICO.

TABELA 02. ATUAÇÕES TÓPICAS DE CONTEXTO COSMÉTICO.

não está limitado a: uma loção pós-solar, um gel ou creme de proteção para assadura de bebés, um líquido cicatrizante na forma de aplicação por spray, entre outros.

[065] Em uma modalidade preferida, o produto é um cicatrizante líquido com aplicação por spray, permitindo a aspersão do produto de forma mais homogénea e sem contato com fontes de contaminação, formando uma película protetora biomolecular, garantindo um trata mento mais eficaz e seguro ao paciente.

[066] Em uma modalidade mais preferida, o produto é um cicatri zante de alto desempenho, composto de 50% da presente formulação como IFA e 50% de um veículo farmaceuticamente aceitável, como, por exemplo, água purificada, para aplicação por spray.

[067] Em uma modalidade, a terapia alvo da presente formulação é para regeneração de pele, de mucosas dérmicas e anexos de qual quer natureza, mais particularmente para o tratamento de qualquer tipo de lesão crónica ou aguda.

[068] Em uma modalidade preferida, as terapias alvo da presente formulação são, mas não estão limitadas a, lesões crónicas podendo ser lesões por pressão, úlceras venosas e úlceras de pé diabético, bem como as lesões agudas, como, por exemplo, cortes na pele por traumas ou por meio cirúrgico, raladuras, assaduras e queimaduras de qualquer natureza, incluindo radiodermites e para aceleração da regeneração da pele, das mucosas dérmicas e anexos, tal como onfalocele.

[069] O produto compreendendo a presente formulação é um pro duto disruptivo, na medida em que, praticamente, é o único produto a ser utilizado de ponta-a-ponta no tratamento de um ferimento crónico, e que pode representar uma economia no custo de um tratamento de fe rimento crónico, por meio de um sistema de Home Care, hospitalar ou ambulatorial, entre outros, seja pelo menor tempo de tratamento, seja pela menor complexidade nos procedimentos médicos e de enferma gem. Essa situação também ocorre no tratamento de um ferimento agudo, com similares vantagens, mesmo considerando a menor com plexidade do tratamento.

[070] A utilização da formulação da presente invenção traz bene fícios e vantagens como:

^■ Um custo inferior de tratamento: Por possuir um custo in ferior ao dos medicamentos e produtos tradicionalmente utilizados, pelo tempo de tratamento ser inferior, pela menor demanda de profissionais de saúde (médicos e enfermeiros) envolvidos, bem como de instalações e recursos físicos adicionais desnecessários.

^■ Tempo de tratamento reduzido: Pode diminuir o tempo de tratamento de 30% a 40%, no caso de ferimentos agudos, e, no caso de ferimentos crónicos, pode ser superior a 50% de redução.

^■ Mínima complexidade nos procedimentos do tratamento: Decorrente do fato que o produto, contendo a presente formulação, ser líquido, para sua aplicação, basta espargir e deixar secar. A troca de um curativo utilizando produto da categoria Avançados, em um ferimento crónico é 10 vezes mais demorada que espargir e deixar secar o produto contendo a presente formulação. Tratando-se da Categoria de produtos Ativos, essa relação pode ser muito superior, considerando que existem curativos que exigem cirurgião, anestesista e centro cirúrgico para se aplicar o produto, além dos procedimentos pós-aplicação. Cabe citar que, em pacientes de Home Care, recorrentemente, a aplicação do ci- catrizante do produto com a formulação da presente invenção pode ser realizada pelo próprio paciente ou por um cuidador familiar, somente com supervisão periódica do serviço de enfermagem e médica.

EXEMPLOS

[071] Os exemplos a seguir demonstram concretizações preferi das da presente invenção. Deve-se, no entanto, ressaltar que ditos exemplos possuem, como único propósito, a ilustração da invenção e não deverão ser considerados como limitações, uma vez que, muitas variações dos mesmos são possíveis sem, com isso, reduzir ou restrin gir o escopo da invenção.

Exemplo 1

[072] É descrita a seguir uma modalidade preferida da formulação da presente invenção, a qual pode ser utilizada como IFA na preparação de um produto final para regeneração da pele, das mucosas dérmicas e anexos.

TABELA 03A. EXEMPLO DE FORMULAÇÃO COMPREENDENDO

EXTRATO VEGETAL, AGENTES EXTRATORES,

BIOSSURFACTANTE E EXCIPIENTES

** Quantidade suficiente para ajuste do pH

TABELA 03B. EXEMPLO DE FORMULAÇÃO DO PRODUTO

PLENUSDERMAX®

TESTES

[073] Testes realizados in vitro e in vivo demonstram que a formu lação da presente invenção apresenta uma superioridade quanto a ace leração do processo de cicatrização frente a outras formulações.

TESTE 1 - ANÁLISE DO POTENCIAL CICATRIZANTE POR MEIO DO ENSAIO DE MIGRAÇÃO DE FIBROBLASTOS HUMANOS in vitro i SCRATCH ASSAY) EM FORMULAÇÕES À BASE DE EXTRATOS HIDROGLICÓLICOS DE CALÊNDULA

[074] Foram utilizadas três formulações, conforme abaixo:

1. Formulação conforme composição preferida da Tabela 03A com pH 6 (Produto A) que integra a formulação da presente invenção;

2. Formulação conforme composição preferida da Tabela 03A com pH 8 (Produto B) que integra a formulação da presente invenção;

3. Plenusdermax® (Produto C), conforme composição da Tabela 03B.

[075] Como controles foram utilizados:

- Controle (mitomicina);

- Meio (controle positivo).

[076] Para fabricação do Plenusdermax® (Produto C) foi utilizada conforme definido na Tabela 03B.

[077] T odas as condições de tratamento (formulações) foram incu badas com mitomicina e, dessa forma, as comparações se deram em relação ao controle (mitomicina).

[078] A condição Meio (controle positivo), sem tratamento, foi utili zada como parâmetro de qualidade interno e atenderam perfeitamente os requisitos. A condição Meio (controle positivo) não foi utilizada não comparações de resultados.

[079] A Figura 1 , representa o fluxograma da execução do teste de migração celular, no qual é feito o plaqueamento de fibroblastos huma nos (HFF1), após 24h é realizada a ranhura ( scratching ) e captura de imagem. Depois, incuba-se com 0,02% do tratamento (formulações), concentração estipulada de acordo com a análise de citotoxicidade, a qual foi superior a 80% de viabilidade celular. O protocolo de análise seguido foi conforme ensinamentos de Coecke S, Balis M, Bowe G, Da vis J, Gstraunthaler G, Hartung T, Hay R, Merten OW, Price A, Schecht- man L, Stacey G, Stokes W. Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report ofthe Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice. Altern Lab Anim. 33(3):261-87, 2005.

[080] A partir dos dados brutos da contagem de pixels da área do scratching calculam-se a Área de Fechamento e o Percentual de Fecha mento (%), sendo a primeira medição por meio da diferença da conta gem de pixels da área do scratching no tempo zero em relação ao tempo 24 horas, após incubação nas condições experimentais, e a segunda medição, por meio da relação proporcional da Área de Fechamento no tempo 24 horas relativamente à Área de Fechamento no tempo zero, sendo considerada a área inicial no tempo zero igual a 100%.

[081 ] Para a análise de outliers utilizou-se o método Multivariated Robust Outliers ( Mahalanobis distance ) (MAHALANOBIS, 1936; FAR- BER & KADMON, 2003, AGGARWAL, 2017), pelo programa JMP v.14. A análise estatística adotou o método One-way ANOVA utilizando o teste t de Student, comparando todas as condições entre si, conside rando o valor de a = 0,05.

[082] Os valores máximos de Percentual de Fechamento, para cada condição experimental dos produtos, foram utilizados na análise de agrupamento hierárquico, por meio do método Ward e cálculos do FoldChange, considerando a razão entre as condições desejadas.

[083] Foram realizados 45 ensaios: foram triplicatas experimentais e técnicas das 5 diferentes condições testadas, sendo 3 formulações e 2 controles. A Tabela 04 apresenta os valores brutos e seus respectivos valores de Área de Fechamento e de Percentual de Fechamento.

[084] A Figura 2 apresenta o gráfico de distribuição dos valores de distância, a partir dos dados de Percentual de Fechamento para a con dição Produto B, a fim de determinar os possíveis outliers por meio do método de distância de Mahalanobis.

[085] Para cada condição foi calculado um valor limite ( threshold ), referenciado como UCL ( Upper Control Limit), utilizado para identifica ção e seleção das réplicas que foram consideradas outliers nos dados. As réplicas com valores acima do limite foram excluídas das análises. TABELA 04. TABELA CONTENDO OS VALORES BRUTOS E SEUS RESPECTIVOS VALORES CALCULADOS DE ÁREA DE FECHA MENTO E DE PERCENTUAL DE FECHAMENTO

086] As condições experimentais (Produtos) testadas que foram identificadas com diferença significativa em relação ao grupo controle foram: Produto A e Produto B.

[087] Os valores de significância e o valor máximo de Percentual de Fechamento (%) para todas as condições experimentais testadas em relação ao grupo controle estão ilustrados na Figura 3 e na Tabela 05.

[088] A Tabela 05 apresenta as condições classificadas de forma decrescente em relação ao valor máximo de Percentual de Fechamento. Nas Tabelas 06, 07 e 08 estão todas as análises comparativas entre Produtos e seus respectivos valores de significância.

TABELA 05. VALORES DE FOLDCHANGE OBTIDOS PARA CADA

COMPARAÇÃO

Produto A

Produto B ,16 1

Produto C ,57 1 ,36 1

CONTROL ,45 2,12 1 ,56 1

Observação: o valor de FoldChange foi calculado com base na razão entre as condições (condição no eixo x/condição no eixo y) utilizando os valores de máximo Percentual de Fechamento. TABELA 06. ANÁLISE ESTATÍSTICA DAS FORMULAÇÕES EM RELAÇÃO AO GRUPO CONTROLE - COMPARAÇÃO PARA CADA PAR USANDO TESTE DE T STUDENT - LEAST SIGNIFICANT

DIFFERENCE (LSD) THRESHOLD MATRIX

Valores positivos mostram pares de meios que são significamente diferentes

TABELA 07. ANÁLISE ESTATÍSTICA DAS FORMULAÇÕES EM RE LAÇÃO AO GRUPO CONTROLE - COMPARAÇÃO PARA CADA PAR USANDO TESTE T DE STUDENT - RELATÓRIO DE CONEXÃO

DE LETRAS

Níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes

TABELA 08. ANÁLISE ESTATÍSTICA DAS FORMULAÇÕES EM RE LAÇÃO AO GRUPO CONTROLE - COMPARAÇÃO PARA CADA PAR USANDO TESTE T DE STUDENT - RELATÓRIO DE

DIFERENÇAS ORDENADAS

[089] De acordo com a classificação dos valores de fechamento má ximo, obtidos para cada condição experimental (Tabela 09), as formu- lações que melhor desempenharam o processo de migração para a área do scratching foram: Produto A e Produto B, sendo essas as formula ções que apresentaram diferença significativa em relação ao controle.

TABELA 09. CLASSIFICAÇÃO DAS CONDIÇÕES EXPERI- MENTAIS EM RELAÇÃO AO PERCENTUAL DE

FECHAMENTO MÁXIMO p-Value % de fechamento

Ranking Condições (Produtos)

(Valor máximo)

1 Produto A 0,0054 86,73

2 Produto B 0,0041 74,98

3 ^o Produto C 0,0515 55,1 Observação: Os valores de diferença significativa foram calculados por meio do teste t de Student em relação à condição controle, a = 0,05.

[090] A análise das diferenças observadas entre as condições fo- ram avaliadas e os valores de FoldChange calculados (Tabela 05) evi denciaram o aumento da migração, em relação ao controle, de 2,45 ve zes pelo Produto A e de 2,12 vezes pelo Produto B. Em relação ao pro duto C (Plenusdermax®) os valores de FoldChange para os Produtos A e B foram de 1 ,57 vezes e 1 ,36 vezes superiores, respectivamente. As métricas utilizadas na análise estatística das comparações entre as di ferentes formulações em relação ao grupo controle estão dispostas nas Tabelas 06, 07 e 08.

[091] A análise de agrupamento hierárquico resultou na formação de 2 clusters distintos, de acordo com as variações de Percentual de Fechamento obtidas entre as condições de tratamentos (Produtos) (Figura 4). Assim temos que os clusters são formados da seguinte ma neira:

I. Cluster 1 : Produto A e Produto B;

II. Cluster 2: Produto C (Plenusdermax®) e Controle.

[092] A análise estatística comparativa entre os diferentes clusters evidenciam diferenças significativas em relação ao Percentual de Fe chamento, p=0,0049. As métricas utilizadas na análise estatística das comparações entre os clusters estão dispostas na Tabela 10. TABELA 10. ANALISE ESTATÍSTICA ENTRE OS CLUSTERS FORMADOS POR MEIO DA ANÁLISE DE AGRUPAMENTO HIERÁRQUICO - ANÁLISE ONE-WAY DE % DE FECHAMENTO POR

TESTE T DE STUDENT,

ASSUMINDO VARIAÇÕES DESIGUAIS

[093] As análises estatísticas de cada condição (Produto) apresen taram diferenças significativas do Percentual de Fechamento do scrat- ching em relação ao grupo controle, o que reflete a eficácia da migração de fibroblastos para o scratching. Essas formulações (Produtos) foram posteriormente classificadas de acordo com o valor máximo de Percen tual de Fechamento obtido nas análises, evidenciando o Produto A como a formulação que obteve melhor desempenho, seguida do Pro duto B. Na sequência, ficou o Produto C, o Plenusdermax®.

[094] Observando os valores comparativos de FoldChange entre as formulações Produto A e Produto B em relação à formulação Produto C, houve uma diferença de 57% e 36%, respectivamente, de aumento no processo de cicatrização in vitro (migração celular) para as formula ções (Tabela 5) utilizando-se os percentuais máximos de fechamento obtidos.

[095] Foi utilizado o método de Ward para análise de agrupamento para evidenciar quais formulações (Produtos) apresentavam o mesmo desempenho no processo de cicatrização in vitro (migração celular). Os Produtos que se destacaram e foram agrupados de acordo com seu de sempenho foram as formulações Produto A e Produto B, sendo perten centes ao cluster 1 (Figura 3 e Figura 5).

[096] Esses resultados demonstram que o balanço dos componen tes da fórmula, juntamente com os agentes extratores em conjunto com os bioativos (monoésteres triterpenóides) produziram formulações ím pares e eficazes no processo de cicatrização in vitro, como visto por meio da análise estatística disposta na Tabela 9.

[097] O teste de eficácia de análise do processo de cicatrização in vitro ( scratch assay ) utilizado para avaliar as formulações quanto ao Percentual de Fechamento revelou duas formulações com potencial na aceleração do processo de migração celular. As formulações que se destacaram e, significativamente, se mostraram diferentes em relação ao controle foram: Produto A e Produto B. As formulações Produto A e Produto B foram as mais promissoras e mais eficazes em relação a for mulação do Produto C testada.

[098] O balanço dos componentes da fórmula juntamente com os agentes extratores em conjunto com os bioativos (monoésteres triterpe- nóides) presentes nos Produto A e Produto B conduziram a aceleração do processo de cicatrização in vitro que, comparativamente ao Produto C demonstrando ser 57% e 36% superior, respectivamente.

TESTE 2 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CICATRIZANTE DA FORMULAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO À BASE DE EXTRATO VE- GETAL DIFERENCIADO DE EFICAZ TECNOLOGIA CONTENDO Bl- OATIVOS ORIUNDOS DA PLANTA MEDICINAL Calendula Officina- lis L. EM ÚLCERAS VENOSAS

[099] Por meio de um estudo clínico foi possível comparar a ativi dade cicatricial em lesões de pacientes com úlcera venosa tratados com o produto à base da presente invenção (Produto B) em relação ao tra tamento com o Produto C.

[100] Os critérios de inclusão dos pacientes foram:

• ser maior de 18 anos;

• não ter diagnóstico médico de úlcera arterial ou mista; · não ter diagnóstico médico de desnutrição grave, anemia severa;

• não ser fumante, alcoólatra ou drogadito;

• não ter infecção tratada com antibioticoterapia de largo es pectro; • não ter necrose na lesão e não ter reação adversa a produ tos à base de plantas medicinais da família Asteraceae.

[101 ] Os critérios de exclusão foram:

• não realizar o curativo de acordo com o protocolo;

• utilizar outro produto na lesão além do que seja o orientado;

• não comparecer nas consultas previstas.

[102] O cicatrizante à base do Produto B (diluição de 1 :1 em água ultra pura) tem apresentação líquida, sendo realizada a aplicação tópica por spray duas vezes ao dia, pelo próprio paciente ou seu cuidador, em sua residência.

[103] Durante a primeira consulta, profissionais médicos e de en fermagem, participantes do estudo clínico, orientam e realizam, passo a passo, o procedimento de aplicação e troca de curativos. Inicialmente, é realizada a limpeza da lesão com soro fisiológico, seguindo com a aplicação do produto e secagem total do produto sobre o leito da lesão.

[104] Após a secagem é realizada a cobertura da lesão com cura tivo físico (gaze não aderente) e bandagem. É orientada a realização desse procedimento duas vezes ao dia até o retorno do paciente para revisões periódicas e acompanhamento médico a cada 30 dias.

[105] A cada consulta do paciente, as lesões foram fotografadas, segundo critérios de preservação da privacidade do sujeito da pesquisa, bem como mensuradas, a partir dos aplicativos do Programa Image J (Distribuição do National Institute of Health (NIH) dos EUA), utilizando gabarito específico para normalização das áreas quando são realizadas as mensurações.

[106] Para se mensurar a lesão, foram tiradas fotos com equipa mento fotográfico, com resolução de 13 megapixels e que, após a coleta da imagem, são acessadas pelo Programa Image J para margeamento da lesão e contagem de pixels por região.

1. Critérios da fotografia: a. A lesão deve ser fotografada com um gabarito pró xima ao ferimento. O gabarito possui 1 ,5 cm de diâmetro (176,714587 mm ² ) é adesivo, descartável e permite corrigir di ferenças de luminosidade e distâncias.

b. As fotografias subsequentes devem utilizar o mesmo tipo de gabarito, sempre com resolução mínima de 5 mega- pixels, sem utilizar o recurso de aproximação;

c. As fotos devem ser realizadas perpendicularmente às lesões, em uma distância aproximada de 50 cm;

2. O programa utilizado para o processamento e análise da imagem é o IMAGE J, de domínio público.

3. Cálculo da área da lesão: Para o cálculo da área da lesão, temos a partir da Tabela 11 , que: TABELA 11. CÁLCULO DA ÁREA DA LESÃO

Fórmula:

AL = (176,714587 x ALP) / AGP

[107] É calculado o valor de contração da lesão em milímetros quadrados (mm ² ) por semana (CLs), sendo utilizada a diferença da área inicial da lesão (Ai) em relação à área final da lesão (Af) dividida pelo tempo decorrido entre as imagens obtidas em semanas. O cálculo do percentual de redução por semana (%RE/sem) é feito a partir da fórmula abaixo:

%RE/sem = (CLs /Ai) x 100 [108] As análises comparativas ocorrem por meio da combinação dos valores médios obtidos da contração do ferimento por semana (CLs) e o percentual da velocidade de cicatrização por semana (%RE/sem), entre os diferentes parâmetros. O método utilizado é o teste t de Student e utilizando-se o programa GraphPad Prism. Valores de p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.

[109] Foram recrutados 11 pacientes que somaram 12 ferimentos. Os valores obtidos por planimetria, da mensuração da área de cicatriza ção dos 12 ferimentos, estão dispostos na Tabela 12.

TABELA 12. DADOS QUANTITATIVOS OBTIDOS DA ANÁLISE POR PLANIMETRIA.

Trata¬

Area Area Trata¬

TLAT mento

Paciente Inicial Final mento CLs %RE/Sem

(dias) (sema(mm ² ) (mm ² ) (dias)

nas)

LCC 545,0 898,5 89,2 30,0 4.3 188,8 21 ,0

RPK 485,0 1396,3 880.6 23,0 3.3 157,0 11 ,2

VBSS 730,0 1308,2 790.9 29,0 4,1 124.9 9,5

ALL 1825,0 1578,2 799.3 60,0 8,6 90.9 5,8

AGG 730,0 2055,9 1277,2 95,0 13.6 57,4 2,8

RMM 1825,0 702,5 221.6 62,0 8,9 54,3 7,7

GLO 730,0 652,1 424.1 32,0 4.6 49.9 7,6

ATC 10950,0 863,7 638,5 35,0 5,0 45,0 5,2

NSH -2 1095,0 517,2 5,3 105,0 15,0 34.1 6,6

CAC 240,0 137,8 0,0 30,0 4.3 32.2 23,3

DRD 180,0 264,3 38.9 51 ,0 7.3 30.9 11 ,7

NSH -1 1095,0 794,1 355.3 105,0 15,0 29.3 3,7

Média 1702,5 930,7 460.1 54,8 7,8 74,5 9,7

Desvio Padrão 2960,4 559,4 416,0 31 ,0 4,4 54,1 6,5

[110] O valor médio da contração da lesão para os 12 casos estudados de úlceras venosas tratadas à base do Produto B foi de 74,5 mm ² por semana, o que corresponde a 10,6 mm ² por dia. O percentual de redu ção médio obtido foi de 9,7 mm ² por semana ou 1 ,4 mm ² por dia. Os valores máximos e mínimos para a contração da lesão por semana fo ram 188,8 mm ² e 29,3 mm ² . Os valores máximos e mínimos para o per centual de redução por semana foram 23,3% e 2,8%, respectivamente. [111] As Figuras 6 a 9 exemplificam quatro casos do tratamento com o produto à base do Produto B.

[112] A análise comparativa dos resultados obtidos da nova formulação Produto B em relação ao Produto C, foi realizada utilizando-se dados da publicação de Buzzi e colaboradores em 2016, na qual foi analisada a eficácia de cicatrização em pacientes com úlcera venosa, utilizando o produto Produto C. Os dados obtidos pelo trabalho de Buzzi e a análise comparativa do novo produto Produto B estão ilustrados na Tabela 13. TABELA 13. ANÁLISE COMPARATIVA DOS VALORES DE

CONTRAÇÃO DA LESÃO (mm ² /SEMANA) DAS DIFERENTES FORMULAÇÕES TESTADAS EM PACIENTES COM ÚLCERA

VENOSA.

Observação. Os valores referentes à condição de tratamento Produto C foram obtidas do trabalho de Buzzi e colaboradores em 2016 ¹⁸ . O valor de significância (P -Value) foi calculado a partir das comparações dos valores médios de contração do ferimento (mm ² /semana) das diferentes formulações utilizando o teste t de student, p<0,05.

[113] A análise comparativa evidenciou diferença significativa (p=0,0099) da contração da lesão venosa entre os produtos analisados.

A formulação à base de Produto B foi o que apresentou maior contração por semana, sendo o valor médio de 74,5 mm ² , em relação ao Produto C que teve o valor médio de 42,7 mm ² .

[114] A análise comparativa apontou diferença significativa entre as formulações, observando-se ser 1 ,74 vezes (74%) superior para a contração (mm ² /semana) com uso do produto à base de Produto B em relação ao Produto C.

Conclusão dos testes

[115] Com base nos dois testes apresentados pode-se concluir que: • O teste de eficácia de análise do processo de cicatrização in vitro ( scratch assay) utilizado para avaliar as três formulações quanto ao Percentual de Fechamento revelou duas formulações com potencial na aceleração do processo de migração celular. As formulações que se destacaram e, significativamente, se mostraram diferentes em relação ao controle foram: Produto A e Produto B. As formulações Produto A e Produto B são formulações novas denominadas Produto A e Produto B, e foram as mais promissoras e mais eficazes em relação às outras for mulações testadas, inclusive quando comparada ao Produto C;

• O balanço dos componentes da fórmula juntamente com os agentes extratores em conjunto com os bioativos (monoésteres triterpe- nóides) presentes no Produto B conduziram a aceleração do processo de cicatrização in vitro que, comparativamente ao Produto C demons trou ser 57% superior;

• O Produto B demonstrou alta eficácia na redução dos feri mentos de pacientes com úlcera venosa;

• O valor médio de contração foi de 74,5 mm ² por semana, sendo o percentual de redução médio obtido de 9,7% por semana;

• A análise comparativa apontou diferença significativa entre as formulações, observando-se ser 74% superior para a contração (mm ² /semana) com uso do produto à base de Produto B em relação ao Produto C.

[1 16] Tendo sido descritos exemplos de concretizações preferi das, deve ser entendido que o escopo da presente invenção abrange outras possíveis variações, sendo limitado tão somente pelo teor das reivindicações apensas, aí incluídos os possíveis equivalentes.