Funktionalisierte Polyglycin-Poly(alkylenimin)-Copolymere, deren Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Formulierungen oder zur Komplexierung anionischer Wirkstoffe und Effektstoffe

Die Erfindung betrifft neue Copolymere, die als funktionalisierte Polyglycin- Polyalkylenimin-Copolymere beschrieben werden können und die sich durch eine sehr gute Abbaubarkeit auszeichnen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung und Verarbeitung diese Copolymeren durch Oxidation von Polyalkyleniminen gefolgt von einer Funktionaliserung von NH-Gruppen im teilweise oxidierten Polymerrückgrat. Diese Copolymeren lassen sich insbesondere zur Herstellung von Wirk- und Effektstoff-Formulierungen sowie zur Komplexierung anionischer Wirk- und Effektstoffe, insbesondere von genetischem Material, wie siRNA, mRNA, DNA und CRISPR / Cas einsetzen.

Biokompatible Polymere stellen hochattraktive Materialien für biomedizinische Anwendungen wie für die Arzneimittelabgabe dar. Poly(ethylenglykol) (PEG) ist derzeit das am häufigsten verwendete Polymer für solche Zwecke. Aufgrund seiner hohen Hydrophilie und des so genannten "verbergenden Verhaltens" löst es wenig Immunantwort im Körper aus und erhöht somit die Blut-Zirkuationszeit des Arzneimittels. Allerdings weist PEG verschiedene Nachteile auf, nämlich der Bildung toxischer Nebenprodukte, die Sequestrierung in Organen, und die Stimulation von Anti-PEG-Antikörpern.

Poly(2-n-alkyl-2-oxazoline) (PAOx) mit kurzen Seitenketten zeigen eine ähnliche Hydrophilie, Biokompatibilität und "verbergendes Verhalten" und scheinen daher vielversprechende Kandidaten für einen Ersatz von PEG zu sein, was darüber hinaus in einem detaillierten Vergleich ihres Lösungsverhaltens bestätigt wurde (vergl. Grube, M.; Leiske, M. N.; Schubert, U. S.; Nischang, I. POx as an alternative to PEG? A hydrodynamic and light scattering study. Macromolecules 2018, 51, 1905-1916). Im Gegensatz zu PEG weisen PAOx aufgrund ihrer Seitenketten- Modifizierbarkeit auch eine höhere strukturelle Vielseitigkeit auf.

PAOx mit längeren Seitenketten sind hydrophob und können zur Herstellung von amphiphilen Copolymeren, Materialien mit geringer Oberflächenenergie oder Beschichtungen mit geringer Haftung verwendet werden. Thermische und kristalline Eigenschaften können auch durch Variationen in den PAOx-Seitenketten angepasst werden (vergl. Hoogenboom, R.; Fijten, M. W. M.; Thijs, H. M. L.; van Lankvelt, B.

M.; Schubert, U. S. Microwave-assisted synthesis and properties of a series of poly(2-alkyl-2-oxazoline)s. Des. Monomers Polym. 2005, 8, 659-671 ; Rettler, E. F. J.; Kranenburg, J. M.; Lambermont-Thijs, H. M. L.; Hoogenboom, R.; Schubert, U. S. Thermal, mechanical, and surface properties of poly(2-/V-alkyl-2-oxazoline)s Macromol. Chem. Phys. 2010, 211, 2443-2448; Kempe, K.; Lobert, M.;

Hoogenboom, R.; Schubert, U. S. Synthesis and characterization of a series of diverse poly(2-oxazoline)s. J. Polym. Sei., Part A: Polym. Chem. 2009, 47, 3829- 3838; Beck, M.; Birnbrich, P.; Eicken, U.; Fischer, H.; Fristad, W. E.; Hase, B.; Krause, H.-J. Polyoxazoline auf fettchemischer Basis. Angew. Makromol. Chem. 1994, 223, 217-233; Rodriguez-Parada, J. M.; Kaku, M.; Sogah, D. Y. Monolayers and Langmuir-Blodgett films of poly(AT-acylethylenimines) with hydrocarbon and fluorocarbon side chains. Macromolecules 1994, 27, 1571-1577; Oleszko-Torbus,

N.; Utrata-Wesotek, A.; Bochenek, M.; Lipowska-Kur, D.; Dworak, A.; Watach, W. Thermal and crystalline properties of poly(2-oxazoline)s. Polym. Chem. 2020, 11, 15- 33; Demirel, A. L.; Tatar, G. P.; Verbraeken, B.; Schlaad, H.; Schubert, U. S.;

Hoogenboom, R. Revisiting the crystallization of poly(2-alkyl-2-oxazoline)s. J. Polym. Sei., Part B: Polym. Phys. 2016, 54, 721-729). Schubert und Kollegen berichteten zuvor von einer Abnahme der Glasübergangstemperatur (T _g ) mit zunehmender Seitenkettenlänge für eine Reihe von Poly(2-n-alkyl-2-oxazolinen) bis Poly(2-pentyl- 2-oxazolinen). Bei PAOx mit längeren Seitenketten wurden kristalline Eigenschaften mit einer von der Seitenkettenlänge unabhängigen Schmelztemperatur T _m beobachtet. PAOx sowie PEG gelten jedoch als nicht biologisch abbaubar. Für eine Vielzahl von Anwendungen in der Biomedizin und auf anderen Gebieten wäre die biologische Abbaubarkeit eine wichtige Eigenschaft, um beispielsweise eine Anreicherung von Polymeren mit Molmassen jenseits von 20.000 g mol' ¹ im Körper zu verhindern und das Polymer vollständig aus dem Organismus zu entfernen. Eine Strategie zur Lösung des Problems könnte darin bestehen, hydrolytisch empfindliche Gruppen in das Polymer-Rückgrat zu integrieren, z.B. Ester- oder Amid-Einheiten. Diese können unter z.B. sauren oder enzymatischen Bedingungen hydrolysiert werden, was zu einem Abbau des gesamten Polymers führen könnte. Es wurden bereits mehrere Routen untersucht, um Estergruppen in das PAOx-Rückgrat einzubauen. Vor kurzem wurde über die Synthese einer Reihe von Poly(esteramiden) mit lateralen Amidbindungen, hergestellt durch organokatalytische Ringöffnungspolymerisation von A/-Acetylierten-1 ,4-oxazepan-7-on-monomeren, berichtet (vergl. Wang, X.; Hadjichristidis, N. Organocatalytic ring-opening polymerization of /V-acylated-1 ,4- oxazepan-7-ones toward well-defined poly(ester amide)s: Biodegradable alternatives to poly(2-oxazoline)s. ACS Macro Lett. 2020, 9, 464-470). Die resultierenden Polymere können als alternierende Poly(ester-co-oxazoline) angesehen werden und daher als biologisch abbaubare PAOx-Alternativen. In der Reihe unterschiedlich abbaubarer Poly-(2-alkyl-2-oxazolin)- und Poly(2-aryl-2-oxazolin)-Analoga zeigten alle Polymere ein amorphes Verhalten und zeigten eine niedrigere T _g im Vergleich zu ihren nicht abbaubaren PAOx-Gegenstücken.

Kürzlich wurde von Polymeren berichtet, die aus den gleichen sich wiederholenden Einheiten bestanden, welche durch spontane zwitterionische Copolymerisation von 2-Oxazolin und Acrylsäure synthetisiert worden waren, um zu A/-acyatierten Poly(aminoester)-Makromonomeren zu gelangen. Eine nachgelagerte redoxinitiierte reversible Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragungs-Polymerisation (RRAFT) dieser Makromonomere führte zu biologisch abbaubaren Kammpolymeren (vergl. Kempe, K.; de Jongh, P. A.; Anastasaki, A.; Wilson, P.; Haddleton, D. M. Novel comb polymers from alternating /V-acylated poly(aminoester)s obtained by spontaneous zwitterionic copolymerisation. Chem. Commun. 2015, 51, 16213- 16216; de Jongh, P. A. J. M.; Mortiboy, A.; Sulley, G. S.; Bennett, M. R.; Anastasaki, A.; Wilson, P.; Haddleton, D. M.; Kempe, K. Dual stimuli-responsive comb polymers from modular A/-acylated poly(aminoester)-based macromonomers. ACS Macro Lett. 2016, 5, 321-325).

Andere Ansätze nutzten eine Amidierung von Diethanolamin, was zu unterschiedlichen Hydroxyethylsuccinamid-Monomeren führte, und anschließend eine Polykondensation dieser Monomeren mit Bernsteinsäure, was auf ähnliche Polymerstrukturen abzielte (vergl. Swanson, J. P.; Monteleone, L. R.; Haso, F.; Costanzo, P. J.; Liu, T.; Joy, A. A library of thermoresponsive, coacervate-forming biodegradable polyesters. Macromolecules 2015, 48, 3834-3842; Gokhale, S.; Xu, Y.; Joy, A. A library of multifunctional polyesters with "peptide-like" pendant functional groups. Biomacromolecules 2013, 14, 2489-2493).

Jedoch wurden nach unserem Kenntnisstand bisher keine Versuche unternommen, um Amidbindungen in ein Polyoxazolin-Rückgrat oder in ein Rückgrat anderer funktionalisierter Polyalkylenimine einzuführen zwecks Verbesserung der Abbaubarkeit.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung neuer funktionalisierter Copolymerer mit verbesserter Abbaubarkeit.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer einfachen Methode zur Herstellung dieser funktionalisierten Copolymere.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung von Copolymeren enthaltend 5 bis 75 mol % an Struktureinheiten der Formel (I), 5 bis 75 mol % an Struktureinheiten der Formel (II) und 20 bis 90 mol % an Struktureinheiten der Formel (III)

-NR ¹ -CHR ³ -CHR ⁴ - (I), -NH-CO-CHR ⁷ - (II), -NH-CHR ⁹ -CHR ¹⁰ - (III), oder von

Copolymeren enthaltend

5 bis 75 mol % an Struktureinheiten der Formel (IV),

5 bis 75 mol % an Struktureinheiten der Formel (V) und

20 bis 90 mol % an Struktureinheiten der Formel (VI)

-NR ¹ -CHR ³ -CHR ⁴ -CHR ⁵ - (IV), -NH-CO-CHR ⁷ -CHR ⁸ - (V),

-NH-CHR ⁹ -CHR ¹⁰ -CHR ¹¹ - (VI), worin

R ¹ einen Rest der Formel -CO-R ² , der Formel -CO-NH-R ² , der Formel -CH ₂ -CH(OH)-R ¹² oder der Formel -CH ₂ -CH(NH ₂ )-R ¹² bedeutet,

R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁷ , R ⁸ , R ⁹ , R ¹⁰ und R ¹¹ unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl bedeuten,

R ² ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, -C _m H _2m -X oder -(C _n H ₂ n-O)o-(CpH _2p -O)q-R ⁶ ,

R ⁶ Wasserstoff oder C-i-Cß-Alkyl ist,

R ¹² ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Aryl oder Aralkyl,

X ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Alkoxy, Amino, N- Alkylamino, N,N-Dialkylamino, Heterocyclyl mit mindestens einem Ringstickstoffatom, Guanidino, Carboxyl, Carbonsäureester, Schwefelsäureester, Sulfonsäureester oder Carbamidsäureester, m eine ganze Zahl von 1 bis 18 ist, n und p unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 4 sind, wobei n ungleich p ist, und o und q unabhängig ganze Zahlen von 0 bis 60 sind, wobei mindestens eines der o oder q ungleich 0 ist, wobei die Prozentangaben auf die Gesamtmenge der Struktureinheiten der Formel (I), (II) und (III) oder der Formel (IV), (V) und(VI) bezogen sind. Diese Copolymeren können ausgehend von gut zugänglichen Poly(alkyleniminen) hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft daher auch in einer ersten Variante ein Verfahren zur Herstellung dieser Copolymeren mit den Maßnahmen i) Umsetzung eines Polyalkylenimins, das wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (la) oder der Formel (IVa) vorzugsweise in einer Menge von mindestens 90 mol % enthält, mit einem Oxidationsmittel, wodurch ein Copolymer enthaltend die Struktureinheiten der Formel (la) und der Formel (II) oder enthaltend die Struktureinheiten der Formel (IVa) und der Formel (V) erhalten wird

-NH-CR ³ H-CR ⁴ H- (la), -NH-CO-CR ⁷ H- (II),

-NH-CR ³ H-CR ⁴ H-CR ⁵ H- (IVa), -NH-CO-CR ⁷ H-CR ⁸ H- (V), worin R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁷ und R ⁸ , die weiter oben definierte Bedeutung besitzen, und ii) Umsetzung des Copolymers aus Schritt i) mit einem Acylderivat der Formel (VII) oder mit einem Isocyanat der Formel (VIII) oder mit einem Epoxid der Fomel (IX) oder mit einem Aziridin der Fomel (X) zu einem Copolymer enthaltend die vorstehend definieten Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und (III) oder der Formeln (IV), (V) und (VI)

R ² -CO-R ¹³ (VII), R ² -NCO (VIII), o NH

R ¹² -CH-CH ₂ ^R "- ^CH ’ ^CH ’ (X), worin R ² und R ¹² die weiter oben definierten Bedeutungen besitzen und R ¹³ eine Abgangsgruppe, insbesondere Fluor, Chor, Brom, lod oder eine andere Abgangsgruppe eines aktivierten Carbonsäurederivats bedeutet.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung in einer zweiten Variante ein Verfahren zur Herstellung dieser Copolymeren mit den Maßnahmen iii) partielle Hydrolyse eines Polyoxazolins enthaltend wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (I) oder eines Polyoxazins enthaltend wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (IV)

-NR ¹ -CHR ³ -CHR ⁴ - (I), -NR ¹ -CHR ³ -CHR ⁴ -CHR ⁵ - (IV), zu einem Copolymer enthaltend wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (I) und der Formel (III) oder der Formel (IV) und der Formel (VI)

-NH-CHR ⁹ -CHR ¹⁰ - (III), -NH-CHR ⁹ -CHR ¹⁰ -CHR ¹¹ - (VI), worin R ¹ , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁹ , R ¹⁰ und R ¹¹ die weiter oben definierte Bedeutung besitzen, und iv) Umsetzung des Copolymeren aus Schritt iii) mit einem Oxidationsmittel, wodurch ein Copolymer enthaltend die Struktureinheiten der Formel (I), der Formel (II) und der Formel (III) oder enthaltend die Struktureinheiten der Formel (IV), der Formel (V) und der Formel (VI) erhalten wird

-NH-CO-CHR ⁷ - (II), -NH-CO-CHR ⁷ -CHR ⁸ - (V), worin R ⁷ und R ⁸ die weiter oben definierte Bedeutung besitzen.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass abbaubare funktionalisierte Polyglycin- Polyalkylenimin-Copolymere mit in das Polymerrückgrat integrierten Amidbindungen über einen einfachen Syntheseweg hergestellt werden können. Zu diesem Zweck können Polyalkylenimine partiell oxidiert werden und das resultierende Produkt kann über eine Umsetzung mit einem Epoxid, einem Aziridin, einem Isocyanat oder einem aktivierten Ester oder Acylhalogenid funktionalisiert werden. In einem alternativen Syntheseweg können Polyoxazoline oder Polyoxazine partiell hydrolisiert werden, wodurch Polyalkylenimineinheiten entstehen, welche in einem nachfolgenden Schritt teilweise oxidiert werden können.

In der ersten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte Polyalkylenimine enthalten üblicherweise mindestens 90 mol % an wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (la) oder der Formel (IVa) und sind kommerziell erhältlich oder können durch Hydrolyse von in 2-Position substitutierten Poly(2- oxazolinen) (POx), insbesondere vonPEtOx, bzw. von in 2-Position substituierten Poly(2-oxazinen) erhalten werden.

Als Ausgangsmaterialien für die Hydrolyse werden üblicherweise POx eingesetzt, die mindestens 20 mol %, vorzugsweise mindestens 50 mol % an wiederkehrenden von 2-Oxazolin abgeleiteten Struktureinheiten im Polymer enthalten. Während kommerziell erhältliche Polyalkylenimine verzweigt sind, werden durch die Hydrolyse von POx lineare Polyalkylenimine erhalten.

In einer zweiten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Hydrolyse von Polyoxazolinen oder Polyoxazinen auch teilweise erfolgen und führt zu Copolymeren, die wiederkehrende Struktureinheiten der Formeln (I) und (III) oder die wiederkehrende Struktureinheiten der Formeln (IV) und (VI) enthalten. Diese Copolymeren können oxidiert werden, was direkt zu den erfindungsgemäßen Copolymeren führt. In dieser Verfahrensvariante entfällt üblicherweise eine Reacylierung.

Ein bevorzugter einfacher Syntheseweg der Nachpolymerisation verläuft über die konsekutive Hydrolyse von Poly(2-ethyl-2-oxazolin) (PEtOx), eine partielle Oxidation und Reacylierung. Die Verwendung von PEtOx oder entsprechenden Poly(2-alkyl-2- oxazolinen) als klar definierte Ausgangsmaterialien ist vorteilhaft, da diese Polymeren durch kationische Ringöffnungspolymerisation (CROP) von handelsüblichen Monomeren gewonnen werden können. Die folgende Hydrolyse von PEtOx oder entsprechenden Poly(2-alkyl-2-oxazolinen) unter sauren Bedingungen, die zu linearem Poly-(ethylenimin) (PEI) führt, ist gut untersucht und dem Fachmann bekannt und kann auch teilweise erfolgen. Jedoch ist PEI nachteilig wegen seiner Zytotoxizität und, ebenso wie PEtOx, seiner Nichtabbaubarkeit. Englert et al. berichteten über die kontrollierte Oxidation von linearem PEI mit Wasserstoffperoxid, um die Abbaubarkeit durch Einbeziehung von Amidgruppen in das PEI-Rückgrat zu erhöhen (vergl. Enhancing the biocompatibility and biodegradability of linear poly(ethylene imine) through controlled oxidation; Macromolecules 2015, 48, 7420-7427). Die resultierende Struktur entspricht der Wiederholeinheit von Poly(glycin) und daher kann das Polymer als Poly(ethylenimin- co-glycin) (hier als oxPEI bezeichnet) betrachtet werden. Durch seine zusätzlichen hydrolytisch empfindlichen Amidgruppen zeigte das Polymer nicht nur eine erhöhte Abbaubarkeit, sondern auch eine verbesserte Biokompatibilität im Vergleich zum ansonsten zytotoxischen PEI.

Erfindungsgemäß wurde oxPEI mit einem nachfolgenden Reacylierungsschritt oder durch Umsetzung mit Isocyanaten oder mit Epoxiden oder mit Aziridinen funktionalisiert. Entsprechend kann anstelle von PEI auch das homologe Polypropylenimin (PPI) verwendet werden. Bei der Reacylierung von oxPEI mit Acylierungsreagenzien, wie Acylhalogeniden, konnten Poly(2-n-alkyl-2-oxazolin-stat- glycine) (hier als dP(AOx-co-EI) bezeichnet) hergestellt werden. Aufgrund der Anwesenheit von zusätzlichen Amidgruppen im Polymerrückgrat wurde vermutet und auch experimentell nachgewiesen, dass die resultierenden dP(AOx-co-EI) eine erhöhte Abbaubarkeit im Vergleich zu ihren Poly(2-n-alkyl-2-oxazolin)-Äquivalenten aufwiesen. Ähnliche Acylierungsreaktionen von PEI mit aktivierten Carbonsäurederivaten, wie Acylchloriden, Anhydriden oder A/-Hydroxysuccinimidestern wurden bereits auf verschiedene Weise berichtet (vergl. Mees, M. A.; Hoogenboom, R. Functional poly(2-oxazoline)s by direct amidation of methyl ester side chains.

Macromolecules 2015, 48, 3531-3538; Sedlacek, O.; Monnery, B. D.; Hoogenboom, R. Synthesis of definecj high molar mass poly(2-methyl-2-oxazoline). Polym. Chem. 2019, 10, 1286-1290; Englert, C.; Tauhardt, L.; Hartlieb, M.; Kempe, K.; Gottschaldt, M.; Schubert, U. S. Linear poly(ethylene imine)-based hydrogels for effective binding and release of DNA. Biomacromolecules 2014, 15, 1124-1131 ; Englert, C.;

Trutzschier, A. K.; Raasch, M.; Bus, T.; Borchers, P.; Mosig, A. S.; Traeger, A.; Schubert, U. S. Crossing the blood-brain barrier: Glutathione-conjugated poly(ethylene imine) for gene delivery. J. Controlled Release 2016, 241, 1-14; und Englert, C.; Prohl, M.; Czaplewska, J. A.; Fritzsche, C.; Preussger, E.; Schubert, U. S.; Traeger, A.; Gottschaidt, M. D-Fructose-decorated poly(ethylene imine) for human breast cancer cell targeting. Macromol. Biosci. 2017, 17, 1600502).

Eine Re-Funktionalisiserung von oxPEI oder oxidiertem Poly(propylenimin) (oxPPI) wurde bislang noch nicht beschrieben.

Bei der Re-Funktionalisierung ist die Menge an Acylderivat der Formel (VII) oder an Isocyanat der Formel (VIII) oder an Epoxid der Fomel (IX) oder an Aziridin der Fomel (X) so zu wählen, dass der Anteil an Struktureinheiten der Formel (III) oder der Formel (VI) im resultierenden Copolymer zwischen 20 und 90 mol % liegt.

Unter „Copolymeren“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung die oben genannten organischen Verbindungen zu verstehen, die durch Wiederholung von bestimmten Einheiten (Monomereinheiten oder Wiederholungseinheiten) gekennzeichnet sind. Die erfindungsgemäßen Copolymere bestehen aus mindestens drei Arten verschiedener Wiederholungseinheiten. Polymere werden durch die chemische Reaktion von Monomeren unter Ausbildung von kovalenten Bindungen hergestellt (Polymerisation) und bilden durch Verknüpfen der polymerisierten Einheiten das sogenannte Polymerrückgrat. Dieses kann Seitenketten aufweisen, an denen sich funktionelle Gruppen befinden können. Erfindungsgemäße Copolymere bestehen aus mindestens drei unterschiedlichen Monomereinheiten, welche statistisch, als Gradient, alternierend oder als Block angeordnet sein können. Besitzen die Copolymere zum Teil hydrophobe Eigenschaften, können sie in wässriger Umgebung nanoskalige Strukturen (z.B. Nanopartikel, Mizellen, Vesikel) ausbilden. Unter „wasserlöslichen Verbindungen“ oder „wasserlöslichen Copolymeren“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Verbindungen bzw. Copolymere zu verstehen, die sich zu mindestens 1 g/L Wasser bei 25 °C lösen.

Unter „Wirkstoffen“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Verbindungen oder Gemische von Verbindungen zu verstehen, die auf einen lebenden Organismus eine gewünschte Wirkung ausüben. Dabei kann es sich z.B. um pharmazeutische Wirkstoffe oder um agrochemische Wirkstoffe handeln. Wirkstoffe können niederöder hochmolekulare organische Verbindungen sein. Bevorzugt handelt es sich bei den Wirkstoffen um höhermolekulare pharmazeutisch wirksame Substanzen, wobei inbesondere hydrophile Wirkstoffe aus Nukleinsäuren, insbesondere aus potentiell therapeutisch nutzbaren Nukleinsäuren (z.B. small interfering RNA, short hairpin RNA, micro RNA, plasmid DNA) von Interesse sind.

Unter dem Begriff „pharmazeutischer Wirkstoff“ wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung jede(s) beliebige anorganische oder organische Molekül, Substanz oder Verbindung verstanden, das (die) eine pharmakologische Wirkung aufweist. Der Begriff „pharmazeutischer Wirkstoff“ wird hierin mit dem Begriff „Arzneimittel“ synonym verwendet.

Unter „Effektstoffen“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Verbindungen oder Gemische von Verbindungen zu verstehen, die einer Formulierung zugesetzt werden, um dieser bestimmte zusätzliche Eigenschaften zu verleihen und/oder um deren Verarbeitung zu erleichtern. Die Begriffe „Effektstoffe“ und „Hilfs- und Zusatzstoffe“ werden im Rahmen dieser Beschreibung synonym verwendet.

Unter „Hilfs- und Zusatzstoffen“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Substanzen zu verstehen, die einer Formulierung zugesetzt werden, um dieser bestimmte zusätzliche Eigenschaften zu verleihen und/oder um deren Verarbeitung zu erleichtern. Beispiele für Hilfs- und Zusatzsstoffe sind Tracer, Kontrastmittel, Trägerstoffe, Füllstoffe, Pigmente, Farbstoffe, Parfums, Gleitmittel, UV- Stabilisatoren, Antioxidantien oder Tenside. Insbesondere ist unter „Hilfs-und Zusatzstoffen“ jede pharmakologisch verträgliche und therapeutisch sinnvolle Substanz zu verstehen, die kein pharmazeutischer Wirkstoff ist, jedoch zusammen mit einem pharmazeutischen Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden kann, um qualitative Eigenschaften der pharmazeutischen Zusammensetzung zu beeinflussen, insbesondere zu verbessern. Bevorzugt entfalten die Hilfs- und/oder Zusatzstoffe keine oder im Hinblick auf die beabsichtigte Behandlung keine nennenswerte oder zumindest keine unerwünschte pharmakologische Wirkung.

Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung sind unter „Polymerpartikel“ in Teilchenform vorliegende erfindungsgemäße Copolymere zu verstehen, welche gegebenenfalls noch weitere Inhaltsstoffe enthalten. Die Teilchen können in flüssiger Form in einer hydrophilen Flüssigkeit dispergiert vorliegen oder die Teilchen liegen in fester Form vor, entweder in einer hydrophilen Flüssigkeit dispergiert oder in Form eines Pulvers. Die Größe der Partikel kann mittels visueller Methoden, beispielsweise durch Mikroskopie, ermittelt werden; bei Teilchengrößen im Nanobereich können Lichtstreuung oder Elektronenmikroskopie herangezogen werden. Die Gestalt der Polymerteilchen kann beliebig sein, beispielsweise sphärisch, ellipsoid oder irrgulär. Die Polymerteilchen können auch Aggregate aus mehreren Primärteilchen bilden. Vorzugsweise liegen die Partikel aus erfindungsgemäßen Copolymeren in der Form von Nanopartikeln vor. Die Teilchen können neben den Copolymeren noch weitere Bestandteile enthalten, beispielsweise Wirkstoffe oder Hilfs- oder Zusatzstoffe.

Die Begriffe „Teilchen“ oder „Partikel“ werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung synonym verwendet.

Unter „Nanopartikeln“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Teilchen zu verstehen, deren Durchmesser kleiner als 1 pm ist und die aus einem oder mehreren Molekülen aufgebaut sein können. Sie zeichnen sich allgemein durch ein sehr hohes Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis aus und bieten damit eine sehr hohe chemische Reaktivität. Nanopartikel können aus erfindungsgemäßen Copolymeren bestehen oder enthalten neben diesen Copolymeren noch andere Bestandteile, wie z.B. Wirkstoffe oder Hilfs- oder Zusatzstoffe.

Die erfindungsgemäßen Copolymere können als lineare Polymere vorliegen oder es kann sich auch um verzweigte Copolymere handeln. Lineare Copolymere entstehen beispielsweise durch konsekutive Hydrolyse von PEtOx, gefolgt von partieller Oxidation zu oxPEI und von Reacylierung zu dP(AOx-co-EI). Verzweigte Copolymere entstehen beispielsweise durch partielle Oxidation von kommerziell erhältlichem PEI, das bekanntermaßen verzweigt ist, zu oxPEI gefolgt von Re- Funktionalisierung, z.B. von Reacylierung zu dP(AOx-co-EI).

Die Löslichkeit der erfindungsgemäßen Copolymere kann durch Co-Polymerisation mit geeigneten Monomeren und/oder durch Funktionalisierung beeinflusst werden. Dem Fachmann sind solche Techniken bekannt.

Die erfindungsgemäßen Copolymere können einen weiten Molmassenbereich umfassen. Typische Momassen (M _n ) bewegen sich im Bereich von 1.000 bis 500.000 g/mol, insbesondere von 1.000 bis 50.000 g/mol. Diese Molmassen können durch ¹ H-NMR-Spektroskopie des gelösten Polymers bestimmt werden.

Insbesondere lassen sich zur Bestimmung der Molmassen eine analytische Ultrazentrifuge oder chromatographische Methoden, wie die Größenausschlusschromatographie, einsetzen.

Bevorzugte erfindungsgemäße Copolymere weisen eine mittlere Molmasse (Zahlenmittel) im Bereich von 1.000 bis 50.000 g/mol, insbesondere von 3.000 bis 20.000 g/mol auf, ermittelt durch ¹ H-NMR-Spektroskopie oder durch Verwendung einer analytischen Ultrazentrifuge. Dabei handelt es sich vorzugsweise um lineare Copolymere. Verzweigte erfindungsgemäße Copolymere haben vorzugsweise eine höhere mittlere Molmasse, beispielsweise ein M _n im Bereich von 50.000 bis 500.000 g/mol, insbesondere von 80.000 bis 200.000 g/mol. Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (I) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 5 bis 75 mol %, vorzugsweise 20 bis 60 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und (III).

Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (II) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 5 bis 75 mol %, vorzugsweise 10 bis 60 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und (III).

Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (III) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 20 bis 90 mol %, vorzugsweise 21 bis 90 mol %, und insbesondere 30 bis 80 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und (III).

Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (IV) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 5 bis 75 mol %, vorzugsweise 20 bis 60 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (IV), (V) und (VI).

Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (V) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 5 bis 75 mol %, vorzugsweise 10 bis 60 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (IV), (V) und (VI).

Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (VI) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 20 bis 90 mol %, vorzugsweise 21 bis 90 mol %, und insbesondere 30 bis 80 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (IV), (V) und (VI).

R ¹ bedeutet einen Rest der Formel -CO-R ² oder der Formel -CO-NH-R ² oder der Formel -CH ₂ -CH(OH)-R ¹² oder der Formel -CH ₂ -CH(NH ₂ )-R ¹² , vorzugsweise einen Rest der Formel -CO-R ² . R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁷ , R ⁸ , R ⁹ , R ¹⁰ und R ¹¹ bedeuten unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, vorzugsweise Wasserstoff, Methyl oder Ethyl und insbesondere Wasserstoff.

R ² bedeutet Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, -C _m H _2m -X oder -(C _n H _2n -O)o- (CpH ₂ p-O) _q -R ⁶ , vorzugsweise Wasserstoff, C-i-C-is-Alkyl, Cyclohexyl oder Phenyl, insbesondere C-i-C-is-Alkyl und ganz besonders bevorzugt C4-Ci4-Alkyl.

R ⁶ ist Wasserstoff oder C-i-C ₆ -Alkyl, vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl

R ¹² bedeutet Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Aryl oder Aralkyl, vorzugsweise Wasserstoff, Ci-Cis-Alkyl, C ₂ -Ci ₈ -Alkenyl, Cyclohexyl oder Phenyl, insbesondere Wasserstoff, Ci-Cß-Alkyl oder C ₂ -C3-Alkenyl. m bedeutet eine ganze Zahl von 1 bis 18, vorzugsweise von 2 bis 12.

X bedeutet Hydroxyl, Alkoxy, Amino, A/-Alkylamino, /\/,A/-Dialkylamino, Heterocyclyl mit mindestens einem Ringstickstoffatom, Guanidino, Carboxyl, Carbonsäureester, Schwefelsäurerester, Sulfonsäureester oder Carbamidsäureester.

Unter einer Heterocyclylgruppe ist im Rahmen dieser Beschreibung ein cyclischer gesättigter oder ungesättigter einwertiger Rest mit fünf bis sieben Ringatomen, wovon ein bis drei der Ringatome Heteroatome anders als Kohlenstoff sind, mindestens eines davon ein Stickstoffatom ist, vorzugsweise Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel, und worin die restlichen Ringatome Kohlenstoffatome sind. Heterocylylgruppen können auch Ringsysteme mit zwei oder mehreren heterocyclischen Ringen bilden, die über kovalente Bindungen verknüpft sind, wie z.B. Bipyridylreste, oder die anneliert sind, wie z.B. Indenylreste. Ferner kann es sich bei Heterocyclylgruppen um Ringsysteme handeln, in denen ein oder mehrere heterocyclische Ringe auftreten, die mit Kohlenwasserstoffringen verbunden sind, z.B. Benzimidazolringe. Heterocyclylgruppen können aromatisch oder nicht-aromatisch sein. Heterocyclylgruppen können aus einem Ring bestehen. Beispiele dafür sind Piperidinyl-, Pyridyl-, Morpholinyl- oder Imidazolylreste.

Heterocyclylgruppen können aus mehreren Ringen bestehen. Beispiele dafür sind Benzimidazol- oder Indenylreste. n und p sind unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 4, wobei n ungleich p ist. Vorzugsweise ist n 2 und p ist 3. o und q sind unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 60, wobei mindestens eines der o oder q ungleich 0 ist. Vorzugsweise sind o und q unabhängig voneinander 1 bis 40, insbesondere 2 bis 10.

Die Reste R ² und R ¹² können Alkyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Alkylgruppen mit ein bis zwanzig Kohlenstoffatomen, die geradkettig oder verzweigt sein können. Beispiele dafür sind Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Heptadecyl, Octadecyl, Nonadecyl oder Eicosyl. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl und Propyl.

Rest R ¹² kann Alkenyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Alkenylgruppen mit zwei bis zwanzig Kohlenstoffatomen, die geradkettig oder verzweigt sein können. Die Doppelbindung kann sich an beliebigen Positionen in der Kette befinden, bevorzugt jedoch in alpha-Position. Beispiele für Alkenylreste sind Vinyl, Allyl, Butenyl, Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Octenyl, Nonenyl, Decenyl, Undecenyl, Dodecenyl, Tridecenyl, Tetradecenyl, Pentadecenyl, Hexadecenyl, Heptadecenyl, Octadecenyl, Nonadecenyl oder Eicosenyl. Besonders bevorzugt sind Vinyl und Allyl. Die Reste R ² und R ¹² können Cycloalkyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Cycloalkylgruppen mit fünf bis sechs Ringkohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt ist Cyclohexyl.

Die Reste R ² und R ¹² können Aryl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um aromatische Kohlenwasserstoffreste mit fünf bis zehn Ringkohlenstoffatomen. Bevorzugt ist Phenyl.

Die Reste R ²² und R ¹² können Aralkyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Arylgruppen, die über eine Alkylengruppe mit dem Rest des Moleküls verbunden sind. Bevorzugt ist Benzyl.

Rest X kann Alkoxy bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um C-i-Ce-Alkoxy- gruppen. Bevorzugt ist Ethoxy und insbesondere Methoxy.

Rest X kann Amino, A/-Alkylamino oder /V,/V-Dialkylamino bedeuten. Bei den Alkylgruppen handelt es sich in der Regel um Ci-C ₆ -Alkylgruppen. Bevorzugt ist Ethyl und insbesondere Methyl.

Rest X kann Heterocyclyl mit mindestens einem Ringstickstoffatom bedeuten. Bevorzugt sind Piperidinyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Purinyl, Morpholinyl, Imidazolyl, Benzimidazolyl, Adeninyl, Guaninyl, Cytosinyl, Thyminyl oder Uracilyl.

Rest X kann einen Carbonsäureester (-COOR), Sulfonsäureester (-SO ₃ R), Schwefelsäurester (-SO ₄ R) oder Carbamidsäurester (-NR'COOR oder -OCONRR ) bedeuten (R und R'jeweils einwertige organische Reste). Dabei handelt es sich in der Regel um Ester von Carbon-, Sulfon-, Schwefel- oder Carbamidsäuren mit aliphatischen Alkoholen, insbesondere mit aliphatischen Ci-Cß-Alkoholen. Bevorzugt sind Ethyl- und insbesondere Methylester. Bevorzugt sind Copolymere, die 15 bis 60 mol % an Struktureinheiten der Formel (I), 10 bis 60 mol % an Struktureinheiten der Formel (II) und 25 bis 75 mol % an Struktureinheiten der Formel (III) enthalten.

Ebenfalls bevorzugt sind Copolymere, worin R ¹ ein Rest der Formel -CO-R ² ist.

Weiterhin bevorzugt sind Copolymere, worin R ² C-i-C-is-Alkyl, insbesondere, CrCe- Alkyl, und ganz besonders bevorzugt CrC2-Alkyl ist.

Weiterhin bevorzugt sind Copolymere, worin R ² Cs-Cis-Alkyl, insbesondere C7-C12- Alkyl ist.

Eine weitere Gruppe bevorzugter Copolymerer ist dadurch gekennzeichnet, dass R ² Ci-Cis-Alkyl ist und R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁷ , R ⁸ , R ⁹ , R ¹⁰ und R ¹¹ Wasserstoff bedeuten.

Ferner sind Copolymere bevorzugt, worin R ⁶ Wasserstoff oder Methyl ist.

Weitere bevorzugte Copolymere sind dadurch gekennzeichnet, dass R ¹² Ci-C-i ₈ - Alkyl oder C2-Ci8-Alkenyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Vinyl oder Allyl ist.

Weiter bevorzugte Copolymere sind dadurch gekennzeichnet, dass n = 2 und p = 3 ist.

Die erfindungsgemäßen Copolymeren können aus den Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und (III) oder aus den Struktureinheiten der Formeln (IV), (V) und (VI) bestehen oder daneben noch weitere Struktureinheiten enthalten, die sich ableiten von Monomeren, welche sich mit bei der Herstellung von Polyalkyleniminen oder Polyoxazolinen eingesetzten Monomeren copolymerisieren lassen. Der Anteil solcher weiteren Struktureinheiten, bezogen auf die Gesamtmasse des Copolymeren, beträgt in der Regel bis zu 25 mol.-%. Diese weiteren Struktureinheiten können statistisch verteilt oder in Form von Blöcken im Copolymer angeordnet sein. Bevorzugte erfindungsgemäße Copolymere sind dadurch gekennzeichnet, dass diese mindestens 90 mol.-%, insbesondere mindestens 95 mol.-%, bezogen auf deren Gesamtmasse, an Struktureinheiten der Formel (I), der Formel (II) und der Formel (III) oder der Formel (IV), der Formel (V) und der Formel (VI) aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Copolymere weisen Endgruppen auf, die typischerweise bei der Herstellung von Poly(oxazolinen) bzw. von Poly(alkyleniminen) entstehen. Diese Endgruppen können durch Funktionalisierung modifiziert werden. Die dafür nötigen Techniken sind dem Fachmann bekannt.

Beispiele für omega-Endgruppen der Polyoxazolin oder Polyoxazin Ausgangsmaterialien der erfindungsgemäßen Copolymere sind Halogenatome, wie Fluor, Chlor, Brom oder lod; oder Azidgruppen -N ₃ ; oder Fluor(alkyl)-sulfonsäureester- gruppen, wie die Nonaflatgruppe -OSO2C4F9, die Trifluormethan-sulfonatgruppe -OSO2CF3 oder die Fluorsulfonatgruppe -OSO ₂ F; oder Aryl- bzw. Alkylsulfonsäuregruppen, wie die Tosylgruppe CH3-C6H4-SO2- oder die Mesylgruppe CH3-SO2-; die unsusbstituierte, einfach- oder zweifach substituierte Aminogruppe -NH ₂ , -NHR oder -NR ₂ (mit R = einwertiger organischer Rest), die Hydroxylgruppe -OH, die Thiolgruppe -SH, oder die Estergruppe -OCOR, die Thioestergruppe -SCOR; die Phthalimidgruppe oder die Cyanogruppe -CN sowie weitere funktionelle Gruppen, die durch Modifikation dieser Endgruppen erhalten werden können. Die erfindungsgemäßen Copolymere enthalten diese Reste als Endgruppen oder können die Hydrolyse- und / oder Oxidationsprodukte dieser Reste als Endgruppen enthalten.

Erfindungsgemäße Copolymere können über die Endgruppen kovalent mit anderen Wirk- oder Effektstoffen verknüpft sein.

Die erfindungsgemäßen Copolymeren können - wie oben dargelegt - durch partielle Oxidation von Polyalkyleniminen und durch Re-Funktionalisierung des oxidierten Produktes durch Umsetzung mit einem Epoxid, Aziridin, Isocyanat, einer aktivierten Carbonsäure oder einem Acylhalogenid hergestellt werden. Die Oxidation wird vorzugsweise in Lösung durchgeführt, insbesondere in wässriger oder alkoholisch-wässriger Lösung. Als Oxidationsmittel können an sich bekannte Oxidantien verwendet werden. Beispiele dafür sind Perverbindungen, Hypochlorite, Chlor oder Sauerstoff, insbesondere Wasserstoffperoxid.

Bevorzugt werden Perverbindungen eingesetzt. Beispiele dafür sind Wasserstoffperoxid, Persäuren, organische Peroxide oder organische Hydroperoxide, insbesondere Wasserstoffperoxid.

Bevorzugt werden Verfahren, bei denen das verwendete Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid ist.

Die Menge an Oxidiationsmittel wird so gewählt, dass der gewünschte Anteil an oxidierten Struktureinheiten im Polymerrückgrat entsteht.

Die Reaktionstemperatur liegt im Allgemeinen zwischen 10 und 80°C, insbesondere im Bereich von 20 bis 40 °C.

Die Reaktionsdauer bei der Oxidation beträgt im Allgemeinen zwischen 5 Minuten und 5 Tagen.

Die Re-Funktionalisierung des oxidierten Produktes erfolgt durch Umsetzung mit einem Acylderivat der oben beschriebenen Formel (VII) oder mit einem Isocyanat der oben beschriebenen Formel (VIII). oder mit einem Epoxid der oben beschriebenen Formel (IX) oder mit einem Aziridin der oben beschriebenen Formel (X).

Beispiele für geeignete Acylderivate sind Acylhalogenide, Carbonsäureanhydride oder mittels bekannter Kopplungsreagenzien aktivierte Carbonsäuren, beispielsweise N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester), Dicyclohexylcarbodiimidester (DCC- Ester) oder 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidester (EDC-Ester). Beispiele für geeignete Isocyanate sind Monoalkylisocyanate, wie Methanisocyanat oder Ethanisocyanat, Cyclohexylisocyanat oder Phenylisocyanat.

Beispiele für geeignete Epoxide sind Ethylenoxid, Propylenoxid, 1 ,2-Epoxybut-3-en oder 1 ,2-Epoxypent-4-en.

Beispiele für geeignete Aziridine sind Azacyclopropan, 1 ,2-Azapropan, 1 ,2-Azabut-3- en oder 1 ,2-Azappent-4-en.

Die Reaktionstemperatur liegt im Allgemeinen zwischen 10 und 80°C, insbesondere im Bereich von 20 bis 40 °C.

Die Reaktionsdauer bei der Re-Funktionalisierung beträgt im Allgemeinen zwischen 5 Minuten und 5 Tagen, insbesondere zwischen 12 und 48 Stunden.

Vorzugsweise werden als Poly(alkylenimine) Copolymere eingesetzt, die durch alkalische oder insbesondere durch saure Hydrolyse von Poly(2-oxazolinen), insbesondere von Poly(2-alkyl-2-oxazolinen) erhalten wurden. Diese Copolymere sind linear und werden als klar definierte Ausgangsmaterialien eingesetzt, die sich von Polymeren ableiten, welche durch CROP von handelsüblichen Monomeren gewonnen werden können.

Poly(oxazoline) sind bekannte Verbindungen. Diese werden üblicherweise durch kationische Ringöffnungspolymerisation von 2-Oxazolinen in Lösung und in Gegenwart eines Initiators hergestellt. Beispiele für Initiatoren sind Elektrophile, wie Ester von aromatischen Sulfonsäuren Salze oder Ester von aliphatischen Sulfonsäuren oder Carbonsäuren oder aromatische Halogenverbindungen. Es können auch mehrfach-funktionelle Elektrophile als Initiatoren eingesetzt werden. Dabei können neben linearen Poly(oxazolin)en auch verzweigte oder sternförmige Moleküle entstehen. Beispiele für bevorzugte Initiatoren sind Ester der Arylsulfonsäuren, wie Methyltosylat, Ester der Alkansulfonsäuren, wie Methyltriflat, oder Mono- oder Dibrommethylbenzol. Die Polymerisation wird üblicherweise in einem polaren aprotischen Lösungsmittel durchgeführt, beispielsweise in Acetonitril.

Als Oxazoline zur Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Poly(oxazoline) werden 2-Oxazoline (4,5-Dihydrooxazole) mit einer C=N-Doppelbindung zwischen dem Kohlenstoffatom 2 und dem Stickstoffatom eingesetzt. Diese können am 2-, 4- und/oder 5-Kohlenstoffatom substituiert sein, vorzugsweise am 2-Kohlenstoffatom.

Bevorzugt werden 2-Oxazoline eingesetzt, welche an 2-Position einen Substituenten enthalten. Beispiele für solche Substituenten sind Methyl oder Ethyl.

Neben den 2-Oxazolinen können bei der Herstellung der erfindungsgemäß als Ausgangsmaterialien eingesetzten Poly(oxazoline) noch weitere mit 2-Oxazolinen copolymerisierbare Monomere eingesetzt werden.

Anstelle von Oxazolinen können auch 2-Oxazine zur Herstellung homologer Poly(oxazine) verwendet werden.

Die Hydrolyse von Poly(oxazolinen) wird vorzugsweise in Lösung durchge-führt, insbesondere in wässriger oder alkoholisch-wässriger Lösung. Als Säuren können anorganische oder organische Säuren verwendet werden. Vorzugsweise werden Mineralsäuren eingesetzt. Beispiele dafür sind Salzsäure, Schwefelsäure oder Salpetersäure, vorzugsweise Salzsäure. Als Basen eignen sich beispielsweise Alkalihydroxide, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid.

Die Reaktionstemperatur liegt im Allgemeinen zwischen 20 und 180°C, insbesondere im Bereich von 70 bis 130 °C.

Die Reaktionsdauer bei der sauren Hydrolyse beträgt im Allgemeinen zwischen 5 Minuten und 24 Stunden. Bevorzugt werden also Verfahren, bei denen das in Schritt i) eingesetzte Polyalkylenimin durch Hydrolyse, insbesondere durch saure Hydrolyse eines Poly(oxazolins) erhalten wird.

Die erfindungsgemäßen Copolymere können zur Herstellung von Formulierungen eingesetzt werden, welche pharmazeutische oder agrochemische Wirkstoffe enthalten.

Infolge ihrer guten biologischen Abbaubarkeit eignen sie sich hervorragend für Anwendungen im Bereich der Wirkstoffabgabe. Diese Verwendungen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die erfindungsgemäßen Copolymeren können in Abhängigkeit von deren Funktionalisierung wasserlöslich oder nicht-wasserlöslich sein. Mit Formyl-, Acetyl- Propionyl- oder Butionylgruppen funktionalisierte Copolymere sind im Allgemeinen wasserlöslich. Mit längeren Alkanoylketten funktionalisierte Copoylmere hingegen sind nicht wasserlöslich.

Nicht wasserlösliche erfindungsgemäße Copolymere können in hydrophilen Flüssigkeiten dispergiert vorliegen, beispielsweise als Emulsionen oder als Suspensionen.

Vorzugsweise liegen die erfindungsgemäßen Copolymeren in der Form von Partikeln vor, insbesondere in der Form von Nanopartikeln.

Die Erfindung betrifft daher auch Partikel, insbesondere Nanopartikel enthaltend die oben beschriebenen Copolymere.

Bevorzugt sind Nanopartikel deren mittlerer Durchmesser D ₅₀ weniger als 1 pm, vorzugsweise 20 bis 500 nm beträgt.

Ganz besonders bevorzugt sind Partikel die einen oder mehrere pharmazeutische oder agrochemische Wirkstoffe enthalten. Besonders bevorzugte Partikel enthalten neben dem erfindungsgemäßen Copolymer mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff sowie geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.

Die Partikel können als Pulver in fester Form vorliegen oder sie können in hydrophilen Lösungsmitteln dispergiert vorliegen, wobei die Teilchen im Dispergiermedium in flüssiger Form oder insbesondere in fester Form vorliegen.

Bevorzugt bilden die Partikel eine disperse Phase in einer Flüssigkeit enthaltend Wasser und/oder mit Wasser mischbare Verbindungen.

Der Anteil der Partikel in einer Dispersion kann einen weiten Bereich umfassen. Typischerweise beträgt der Anteil der Partikel in dem Dispersionsmedium 0,5 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-%.

Die erfindungsgemäßen Partikel können durch Fällung, vorzugsweise durch Nanofällung hergestellt werden. Dazu werden die erfindungsgemäßen Copolymere, welche durch die Anwesenheit hydrophober Gruppen wenig oder nicht hydrophil sind in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Aceton gelöst. Diese Lösung wird in ein hydrophiles Dispergiermedium eingetropft. Dieses erfolgt vorzugsweise unter starkem Rühren. Dadurch kann die Herstellung kleinerer Partikel gefördert werden. Das Copolymer wird im Dispergiermedium in feinverteilter Form abgeschieden.

Alternativ können die erfindungsgemäßen Partikel auch durch Emulgieren erzeugt werden, vorzugsweise durch Nanoemulsion. Dazu werden die erfindungsgemäßen Copolymere, welche durch die Anwesenheit hydrophober Gruppen wenig oder nicht hydrophil sind, in einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Dichlormethan oder Ethylacetat, gelöst. Diese Lösung wird mit einem hydrophilen Dispergiermedium kombiniert, wodurch sich vorzugsweise zwei flüssige Phasen ausbilden. Anschließend wird dieses Gemisch durch Energieintrag emulgiert, vorzugsweise durch Beschallen mit Ultraschall.

Zusätzlich zu dem erfindungsgemäßen Copolymer können bei dessen Dispergierung im Dispergiermedium ein oder mehrere Wirkstoffe und/oder ein oder mehrere Hilfs- und Zusatzstoffe zugegen sein. Alternativ können diese Wirkstoffe und/oder Hilfs- und Zusatzstoffe nach dem Dispergieren des Copolymers in der hydrophilen Flüssigkeit hinzugefügt werden.

Die Abtrennung der Polymerpartikel aus der hydrophilen Flüssigkeit kann auf unterschiedliche Weisen erfolgen. Beispiele dafür sind Zentrifugation, Ultrafiltration oder Dialyse.

Die erfindungsgemäß hergestellte Polymerdispersion kann nach der Herstellung weiter aufgereinigt werden. Gängige Verfahren beinhalten das Reinigen mittels Dialyse, mittels Ultrafiltration, mittels Filtration oder mittels Zentrifugieren.

Die erfindungsgemäßen Copolymeren lassen sich hervorragend zur Komplexbildung mit anionischen Verbindungen einsetzen. Derartige Komplexe können in gelöster Form vorliegen, vorzugsweise jedoch in der Form von Partikeln und insbesondere in der Form von Nanopartikeln.

Die Erfindung betrifft daher auch Komplexe aus den oben beschriebenen Copolymeren und Verbindungen mit anionischen Gruppen, beispielsweise mit Carboxylgruppen, Sulfatgruppen, Sulfonatgruppen oder Phosphatgruppen.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus auch Partikel, insbesondere Nanopartikel enthaltend Komplexe aus den oben beschriebenen Copolymeren und Verbindungen mit anionischen Gruppen, beispielsweise mit Carboxylgruppen, Sulfatgruppen, Sulfonatgruppen oder Phosphatgruppen. Als Verbindungen mit anionischen Gruppen lassen sich insbesondere Nukleinsäuren oder Proteine einsetzten.

Besonders bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung Partikel enhaltend Komplexe gebildet aus Nukleinsäuren und den Copolymeren enthaltend die oben beschriebenen Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und (III) oder der Formeln (IV), (V) und (VI).

In den erfindungsgemäßen Komplexen und Partikeln können als Nukleinsäuren DNA und/oder RNA und deren Modifikationen eingesetzt werden.

Es können beliebige DNA-Typen eingesetzt werden. Beispiele dafür sind A-DNA, B- DNA, Z-DNA, mtDNA, antisense DNA, bakterielle DNA und virale DNA.

Es können auch beliebige RNA-Typen eingesetzt werden. Beispiele dafür sind hnRNA, mRNA, tRNA, rRNA, mtRNA, snRNA, snoRNA, scRNA, siRNA, miRNA, antisense RNA, bakerielle RNA und virale RNA.

In den erfindungsgemäßen Komplexen und Partikeln können auch Kombinationen von DNA und RNA eingesetzt werden.

Es wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen Partikel Nukleinsäure- Copolymer-Komplexe enthalten, welche über das gesamte Volumen des Partikels verteilt sind. Im Gegensatz zu vorbekannten Partikeln mit ausge-prägter Kern- Schale-Struktur und mit einer Konzentration der Nukleinsäure-Polymer-Komplexe in der äußeren Hülle sind bei den erfindungsgemäßen Partikeln Nukleinsäure- Copolymer-Komplexe sowohl im Innern als auch in den äußeren Bereichen der Nanopartikel zu finden. Solche Partikel werden nachstehend auch „Polyplexe“ genannt.

Die erfindungsgemäßen Komplexe und Partikel lassen sich durch deren N/P- Verhältnis charakterisieren. Darunter versteht man das molare Verhältnis von basischen Stickstoffatomen im Copolymer zu den Phosphatgruppen in der Nukleinsäure.

Das N/P-Verhältnis in den erfindungsgemäßen Partikeln kann in weiten Bereichen schwanken. Typischerweise beträgt das N/P-Verhältnis in den erfindungsgemäßen Partikeln, zwischen 1 und 200, vorzugsweise zwischen 2,5 und 100, besonders bevorzugt zwischen 5 und 50, und ganz besonders bevorzugt zwischen 10 und 30.

Bevorzugte erfindungsgemäße Partikel weisen mittels DLS bestimmte Durchmesser von bis zu 50 pm auf. Bevorzugt sind Nanopartikel mit mittels DLS bestimmten Durchmessern zwischen 50 und 1000 nm .

Bevorzugt sind erfindungsgemäße Partikel, die keine Hilfs- oder Zusatzstoffe, insbesondere keine Schutzkolloide und/oder Tenside enthalten.

Die erfindungsgemäßen Polyplexe enthaltenden Partikel können durch Fällung hergestellt werden. Dazu werden die erfindungsgemäß verwendeten kationischen Copolymere, welche durch die Anwesenheit polarer Gruppen abhängig vom pH Wert hydrophil sind, in Wasser oder in einer wässrigen Pufferlösung gelöst. Dabei wird ein pH-Wert der wässrigen Lösung von 3 bis 6,5 eingestellt, z.B. durch Verwendung eines Acetatpuffers oder eines anderen geeigneten Puffers wie beispielsweise Citratpuffer, Lactatpuffer, Phosphatpuffer und Phosphat-Citrat-Puffer Außerdem werden die Nukleinsäuren in Wasser gelöst, wobei der pH der wässrigen Nukleinsäurelösung vorzugsweise auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,5 eingestellt wird, besonders bevorzugt auf einen Wert zwischen 6,8 und 7,5. Dazu eignet sich besonders eine Pufferlösung enthaltend HEPES, TRIS, oder nur Salze. Beide Lösungen werden miteinander kombiniert, wobei die Mengen an Nukleinsäuren und an kationischem Copolymer so gewählt werden, dass sich ein gewünschtes N/P- Verhältnis einstellt. Nach dem Vermischen beider Lösungen wird die Mischung bewegt, beispielsweise für eine kurze Zeit, wie zwischen 2 und 20 Sekunden. Das kann durch Rühren und/oder durch Vortexen erfolgen. Vorzugsweise werden die entstandenen Partikel vor der weiteren Verwendung einige Zeit stehen gelassen, beispielsweise zwischen 5 und 20 Minuten, um eine Bindung zwischen Polymer und Nukleinsäuren zu ermöglichen . Die erfindungsgemäßen Partikel werden im Dispergiermedium in feinverteilter Form ausgefällt.

Zusätzlich zu dem kationischen Copolymer und der Nukleinsäure können bei deren Fällung im Dispergiermedium ein oder mehrere Hilfs- und Zusatzstoffe zugegen sein. Alternativ können diese Hilfs- und Zusatzstoffe nach dem Dispergieren des Nukleinsäure-Copolymer-Komplexes in der wässrigen Phase hinzugefügt werden.

Als Dispergiermedium wird Wasser eingesetzt. Diesem können Puffersubstanzen, Salze, Zucker oder Säuren und Basen zugesetzt sein, um den gewünschten pH- Wert oder die Osmolarität einzustellen.

Die erfindungsgemäßen Partikel eignen sich hervorragend zum Gentransfer von Zellen also zum Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen. Dazu werden die Nukleinsäuren enthaltenden Partikel, einzelnen Zellen, Geweben oder einer Zellkultur hinzugefügt und von den Zellen durch Endozytose aufgenommen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der oben beschriebenen Partikel zum Gentransfer in Zellen, also zum Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen.

Die folgendenBeispiele erläutern die Erfindung ohne diese zu begrenzen.

Materialien

Alle Chemikalien und Lösungsmittel wurden von kommerziellen Lieferanten gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet, sofern nicht anders angegeben. 2-Ethyl-2- oxazolin (EtOx, 99+%) und Triethylamin (NEta, 99,7%) wurden von Acros Organics bezogen. 2-Ethyl-2-oxazolin wurde über Calciumhydrid getrocknet und unter Argonatmosphäre destilliert. Methyltosylat und (MeOTs, 98%) (98%) wurden von Sigma Aldrich erhalten. Methyltosylat wurde über Bariumoxid getrocknet und unter Argonatmosphäre destilliert. Salzsäure (37%) wurde von Fisher Chemicals bezogen Wässrige Wasserstoffperoxidlösung (30% w/w) wurde von Carl Roth erhalten. Acetylchlorid (ca. 90 %) wurde von Merck Schuchardt bezogen. Propionylchlorid (>98,0%), wurde von Tokyo Chemical Industry (TCI) gekauft. N, N-Dimethylformamid (DMF) und Acetonitril wurden in einem Lösungsmittelreinigungs-system getrocknet (MB-SPS-800 von M Braun).

Durchführung von Messungen

Proton ( ¹ H) Kernspinresonanzspektren (NMR) wurden auf einem Bruker AC 300 MHz bzw. einem Bruker AC 400 MHz Spektrometer gemessen. Die Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei entweder D ₂ O oder d ₄ -Methanol als Lösungsmittel verwendet wurden. Chemische Verschiebungen (<5) werden in Teilen pro Million (ppm) relativ zum verbliebenen nicht deuterierten Lösemittelresonanzsignal angegeben. Die Infrarotspektroskopie (IR) wurde auf einem Shimadzu IRAffinity-1 CE-System durchgeführt, das für die Messung in einem erweiterten Bereich mit einer einfach reflektierenden ATR-Küvette mit Diamantkristall des Typs Quest ATR ausgestattet war.

Die Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde in N,N-Dimethylacetamid (DMAc) mit Hilfe eines Agilent Systems der 1200-er Serie durchgeführt, das mit einem PSS-Entgaser, einer G1310A-Pumpe, einem G1329A-Autosampler, einem Techlab-Ofen, einem G1362A-Brechungsindexdetektor (RID) und einer PSS GRAM- guard/30/1000 A-Säule (10 pm Partikelgröße) ausgestattet war. Als Eluent wurde DMAc mit 0,21 Gew.-% LiCI eingesetzt. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 ml min' ¹ und die Ofentemperatur betrug 40 °C. Für die Berechnung von Molmassen wurden Polystyrol (PS) Standards von 400 bis 1 .000.000 g mol’ ¹ verwendet.

Allgemeine Synthesemethoden

Synthese von Poly(2-ethyl-2-oxazolin), PEtOx. PEtOx wurde durch kationische Ringöffnungspolymerisation (CROP) von EtOx synthetisiert. In einer Scale-Up-Chargenmethode wurden MeOTs (124 g, 0,665 mol) und EtOx (3965 g, 40,00 mol, 60,2 Äquiv.) unter Argonatmosphäre in trockenem MeCN (5860 ml) in einem 10 L Normag-Reaktor aufgelöst, um ein Monomer-zu- I nitiatorverhältnis [M]:[l] von 60:1 zu erreichen. Nach einer Reaktionszeit von 6,5 h unter Rückflussbedingungen wurde die Polymerisation mit 270 ml entionisiertem Wasser beendet. Nach der Entnahme von aliquoten Teilen zur Bestimmung des Monomerumsatzes (99,7%) mittels ¹ H NMR-Spektroskopie wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, der Rückstand in Dichlormethan (20 L) gelöst und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (10 L) und wässriger Natriumchloridlösung (2 x 10 1) gewaschen. Die organische Phase wurde über eine Mischung aus Natriumsulfat (15 kg) und Magnesiumsulfat (4 kg) getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das Produkt wurde schließlich im Vakuum 14 Tage lang getrocknet (Ausbeute: 3848 g) und mittels ¹ H- NMR-Spektroskopie (300 MHz, D ₂ O) und SEC analysiert.

Mn.theor. ^— 6000 g mol , M _n NMR ^— 6300 g mor ¹ ; DP = 60.

Synthese von linearem Poly(ethylenimin), PEI.

Die Synthese von PEI wurde nach einem angepassten Verfahren auf der Grundlage von zuvor veröffentlichten Methoden durchgeführt (Van Kuringen, H. P.; Lenoir, J.; Adriaens, E.; Bender, J.; De Geest, B. G.; Hoogenboom, R. Partial hydrolysis of poly(2-ethyl-2-oxazoline) and potential implications for biomedical applications?

Macromol. Biosci. 2012, 12, 1114-1123; Tauhardt, L.; Kempe, K.; Knop, K.; Altunta§, E.; Jäger, M.; Schubert, S.; Fischer, D.; Schubert, U. S. Linear polyethyleneimine: Optimized synthesis and characterization - On the way to “pharmagrade” batches.

Macromol. Chem. Phys. 2011, 212, 1918-1924). PEtOx (80,0 g, 12,5 mmol) wurde in wässriger Salzsäure (6 M, 600 ml) gelöst und 24 h auf 90 °C erhitzt. Flüchtige Stoffe wurden unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in entionisiertem Wasser (1600 ml) gelöst. Wässrige NaOH (3 M, 300 mL) wurde in Portionen zugegeben, um einen pH-Wert von 10 zu erreichen, was zur Ausfällung des Polymers führte. Anschließend wurde das Polymer abfiltriert und durch Umkristallisieren in Wasser (800 ml) gereinigt. PEI wurde als weißer Feststoff erhalten (Ausbeute: 47,5 g)

¹ H NMR (300 MHz, CD ₃ OD): Hydrolysegrad (DH) = 99%.

Synthese von Poly(ethylenimin-stat-glycin), oxPEI.

Die Synthese von oxPEI wurde nach einer angepassten Methode nach Englert et al. Durchgeführt (Englert, C.; Hartlieb, M.; Bellstedt, P.; Kempe, K.; Yang, C.; Chu, S. K.; Ke, X.; Garcia, J. M.; Ono, R. J.; Fevre, M.; Wojtecki, R. J.; Schubert, U. S.;

Yang, Y. Y.; Hedrick, J. L. Enhancing the biocompatibility and biodegradability of linear poly(ethylene imine) through controlled oxidation. Macromolecules 2015, 48, 7420-7427). PEI (45,0 g, 17,0 mmol) wurde in Methanol (1100 ml) unter Rühren gelöst und wässrige Wasserstoffperoxidlösung (72 ml, 30% w/w, 0,7 Äquiv. pro Amineinheit) wurden tropfenweise zugegeben. Nach 3-tägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und das Produkt im Vakuum 7 Tage lang bei Raumtemperatur und 1 Tag lang bei 70 °C getrocknet. oxPEI wurde als brauner Feststoff gewonnen (Ausbeute: 29,1 g). ¹ H NMR (300 MHz, D ₂ O): Oxidationsgrad (DO) = 54%.

Allgemeine Synthesevorschrift für Poly(2-n-alkyl-2-oxazolin-staf-glycin)e, dP(AOx-co-EI). oxPEI wurde unter Vakuum 2 h lang bei 70 °C vorgetrocknet und anschließend in trockenem DMF (6 ml pro g Polymer) unter Argonatmosphäre gelöst. Triethylamin (1 Äquiv. pro Amineinheit) wurde hinzugefügt, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von Acylchlorid-Lösungen (0,5 Äquiv. pro Amineinheit) in trockenem DMF (6 mL pro g Polymer). Dabei wurde das Gemisch im Eisbad gekühlt. Zusätzliches trockenes DMF (6 ml pro g Polymer) wurde verwendet, um Rückstände von den Kolbenwänden abzuspülen. Nach Erreichen der Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch weitere 24 Stunden lang gerührt. Die Reinigung wurde in Abhängigkeit von der Löslichkeit der Produkte angepasst. Einzelheiten zur Herstellung einzelner dP(AOx-co-EI) sind im nachstehenden experimentellen Teil zu finden.

Bestimmung des Hydrolysegrads

Der Hydrolysegrad DH wurde nach Gleichung (1 ) aus den Integralen der ¹ H NMR- Spektren von PEI berechnet. Dabei bedeutet D das Integral der Methylengruppen der Ethylenimineinheiten und A bedeutet das Integral der Methylgruppen der verbleibenden EtOx-Einheiten.

Bestimmung des Oxidationsgrads

Der Oxidationsgrad DO wurde aus den Integralen der Polymerrückgratsignale der ¹ H NMR-Spektren von oxPEI nach Gleichung (2) berechnet. Dabei bedeutet F das Integral der Methylengruppe der Glycineinheiten, A bedeutet das Integral der Methylgruppen der verbleibenden EtOx-Einheiten und D bedeutet das Integral der Methylengruppen der Ethylenimineinheiten.

Durchfühung der Titration

Titrationen zur Bestimmung der restlichen Aminogruppen wurden mit einem automatisierten Metrohm OMNIS Titrator durchgeführt, der mit einer Metrohm Ecotrode plus pH-Elektrode ausgestattet war. Alle Messungen wurden in einem dynamischen Titrationsmodus durchgeführt, der die Titrationsgeschwindigkeit an die Änderung des pH-Wertes während der Titration anpasste. Eine typische Messung wurde wie folgt durchgeführt: Das Polymer wurde in entionisiertem Wasser gelöst, um eine Polymerlösung mit einer Konzentration von 3 mg ml' ¹ zu ergeben. Die Polymerlösung wurde durch Zugabe einer halbkonzentrierten wässrigen HCI-Lösung tropfenweise angesäuert, um einen pH-Wert von 2 zu erreichen. Anschließend wurde die Lösung unter Rühren gegen wässrige 0,1 M Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 12 titriert. Die Äquivalenzpunkte wurden aus der ersten Ableitung der Titrationskurve bestimmt.

Durchführung von Abbaustudien.

Für den Abbau unter sauren Bedingungen wurde das Polymer (20 mg) in 6 mol L’ ¹ HCl (2 ml) gelöst und 48 h lang bei 90 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit wässriger Natriumhydroxidlösung neutralisiert und das Wasser wurde unter reduziertem Druck entfernt.

Herstellungsbeispiel H1: Synthese von Poly(2-methyl-2-oxazolin-co- ethyleneimin-co-glycin), dP(MeOx-co-EI)

P(MeOx-co-EI) ₆ wurde gemäß der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 500 mg oxPEI, 614 pl (446 mg, 4,41 mmol, 1 Äquiv. pro Amineinheit) Triethylamin und 157,2 pl (173 mg, 2,20 mmol, 0,5 Äquiv. pro Amineinheit) Acetylchlorid verwendet wurden. Das ausgefällte Triethylammoniumsalz wurde nach der Reaktion abfiltriert und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert Das Rohprodukt wurde in Methanol gelöst und dreimal in eiskaltem Diethylether (ca. -80 °C) ausgefällt.

Auflösen in entionisiertem Wasser, gefriertrocknen und trocknen im Vaccum bei 40°C ergaben dP(MeOx-co-EI) als braunen Feststoff (Ausbeute: 406 mg).

Herstellungsbeispiel H2: Synthese von Poly(2-ethyl-2-oxazolin-co- ethyleneimin-co-glycin), dP(EtOx-co-EI) P(EtOx-co-EI) wurde gemäß der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 500 mg oxPEI, 614 pl (446 mg, 4,41 mmol, 1 Äquiv. pro Amineinheit) Triethylamin und 192,2 pl (204 mg, 2,20 mmol, 0,5 Äquiv. pro Amineinheit) Propionylchlorid verwendet wurden. Triethylammoniumchlorid, das während der Reaktion gebildet wurde, wurde abfiltriert und die Lösung under reduziertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst und achtmal in eiskaltem Diethylether (ca. -80 °C) ausgefällt. Das Rohprodukt wurde in entionisiertem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Nach Trocknen im Vaccum bei 40°C wurde dP(EtOx-co-EI) als brauner Feststoff erhalten (Ausbeute: 415 mg).

Beispiel C1: Charakterisierung der Polymere durch ¹ H-NMR Spektroskopie

Der erste Schritt bestand in der Synthese einer erheblichen Menge von PEtOx als klar definiertes Ausgangsmaterial über CROP (vergl. allgemeine Synthesemethoden, Synthese von PEtOx). Zu diesem Zweck wurde ein Syntheseprotokoll in einem 10 L Normag-Reaktor entwickelt, das fast 4 kg PEtOx mit einem Polymerisationsgrad (DP) von 60 und einer engen Dispersität (D) von 1 ,14 ergab, bestimmt durch SEC in DMAc. Da die CROP durch Zugabe von Wasser beendet wurde, enthielt das resultierende PEtOx zwei isomere Endgruppen, die von einem nucleophilen Angriff auf die 2- oder 5-Stellungen des Oxazolinringes herrührten, was jedoch in beiden Fällen zu Hydroxylendgruppen bei Hydrolyse zu linearem Poly(ethylenimin) (PEI) führte. Die Hydrolyse wurde unter sauren Bedingungen durchgeführt (vergl. allgemeine Synthesemethoden, Synthese von PEI). Um eine vollständige Hydrolyse zu erhalten, wurde die Reaktion über Nacht mit einem Überschuss von 6 M HCl durchgeführt. Die erfolgreiche Synthese wurde durch das ¹ H-NMR-Spektrum bestätigt, welches das Ver-schwinden der den Ethylsubstituenten von PEtOx zugeordneten Signale deutlich zeigte. Darüber hinaus bestätigte eine klare Hochfeldverschiebung des Rückgrat-signals die Bildung von PEI. Der Hydrolysegrad (DH) wurde mit 99% bestimmt, berechnet durch das Verhältnis der Integrale im ¹ H NMR-Spektrum (vergl. allgemeine Synthesemethoden, Synthese und Charakterisierung von dP(AOx-co-EI), Gleichung (1)). Als nächstes wurde oxPEI durch Oxidation von PEI mit Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel hergestellt. Die Oxidation erfolgte im Polymerrückgrat und es bildeten sich so statistisch verteilte Rückgrat-Amidgruppen. Die Struktur des resultierenden oxPEI entspricht der sich wiederholenden Einheit von Poly-(glycin) neben nicht betroffenen Ethylenimineinheiten. Daher kann das Polymer auch als Poly(ethylenimin-staf-glycin)-Copolymer bezeichnet werden. Mit dem Ziel, 50% der Aminogruppen durch Oxidation im PEI zu erzeugen wurden 0,7 Äquivalente Wasserstoffperoxid pro Aminogruppe verwendet. Der Oxidationsgrad (DO), der durch das Integralverhältnis im ¹ H-NMR-Spektrum als 54% bestimmt wurde (vergl. allgemeine Synthesemethoden, Synthese und Charakterisierung von dP(AOx-co-EI), Gl. (2)), bestätigte die erfolgreiche Synthese. Die Methylengruppensignale, die den Ethylenimin- und den Glycin-Wiederholeinheiten zugeordnet sind, traten in unmittelbarer Nähe im ¹ H-NMR-Spektrum auf und überlappten einander teilweise Das NH-Protonensignal zeigte die Bildung einer Amidgruppe an, was das Vorhandensein von Glycineinheiten ebenso bestätigte.

Da die verbleibenden Aminogruppen weiter funktionalisiert werden können, stellte das resultierende oxPEI die Plattform für die Synthese verschiedener abbaubarer Polymere dar. Hier wurde eine nachfolgende Reacylierung mit den aliphatischen Acylchloriden Acetylchlorid und Propionsäurechlorid angewendet, um Amideinheiten wieder einzuführen, die äquivalent zu den /V-Acylethylenimin-Strukturen in PAOx waren. Die resultierenden Polymerstrukturen ähneln PAOx mit zusätzlichen, statistisch verteilten Poly-(glycin)-Einheiten und Polyethylenimin-Einheiten, die in das Polymerrückgrat integriert sind. Daher können sie auch als Poly(2-n-alkyl-2-oxazolin- staf-ethylenimin-stat-glycin)-Copolymere oder aufgrund der Abbaubarkeit der Glycineinheit als abbaubare Poly(2- alkyl-2-oxazolin-stat-ethylenimin)-analoga angesehen werden. Der beschriebene synthetische Ansatz ermöglichte somit die Herstellung von Polymeren mit gleicher Kettenlänge und gleichem DO, wobei nur EtOx als kommerziell erhältliches Monomer eingesetzt wurde.

Die Charakterisierung des gereinigten dP(AOx-co-EI)mittels ¹ H NMR-Spektroskopie deutete auf eine Abnahme der den PEI-Wiederholeinheiten zugeordneten Signale hin, während Signale, die den Alkylseitenketten zugeschrieben werden, ihre teilweise Umwandlung in die entsprechenden /V-Acylethyleniminstrukturen bestätigten.

Beispiel C2: Charakterisierung der Polymere durch IR-Spektroskopie

Ein weiterer struktureller Nachweis wurde durch IR-Spektroskopie gewonnen. Abbildung 1 zeigt ATR-IR Spektren von dP(MeOx-co-EI) und dP(EtOx-co-EI) im Bereich der Wellenzahlen von 600 bis 4000 cm’ ¹ einschließlich der Zuordnung der wichtigsten Banden. Die IR-Spektroskopie von PEtOx, PEI, Poly(glycin) sowie oxPEI wurde zuvor in der Literatur beschrieben, was eine einfache Zuordnung von Schwingungsbanden ermöglichte. Die Bande bei 3235 und 3246 cm’ ¹ imkann der NH-Schwingung der Aminogruppe zugeordnet werden. Die Schwingungsbande bei 1647 und 1650 cm’ ¹ kann der Amid I Bande zugeschrieben werden, die hauptsächlich auf die Carbonylvalenzschwingung zurückzuführen ist. Die Bande verschwand während der Hydrolyse zu PEI aufgrund der Spaltung der Carbonyl- gruppen tragenden Seitenkette fast vollständig. Während der Oxidation zu oxPEI und der folgenden Reacylierung zu dP(EtOx-co-EI) wurden Amidgruppen wieder eingeführt, was zu einer Erhöhung der Carbonyl-Vibrationsbande führte. Die Amid II Bande bei 1543 cm’ ¹ , hauptsächlich durch die Deformationsschwingung der NH- Bindung verursacht, wurde bei PEtOx nicht beobachtet, das nur tertiäre Amidgruppen ohne NH-Bindungen aufwies, und zeigte den strukturellen Unterschied zwischen PEtOx und dP(MeOx-co-EI) bzw. dP(EtOx-co-EI) . Signale von Carbonsäurederivaten, die auf mögliche Abbauprodukte zurückzuführen sind, werden bei etwa 1710 cm’ ¹ erwartet. Jedoch konnten solche Signale in den Spektren von oxPEI oder dP(MeOx-co-EI) bzw. dP(EtOx-co-EI), nicht beobachtet werden.

Beispiel C3: Charakterisierung der Polymere durch SEC

Eine Überlagerung der SEC Elugramme der beiden Polymere in DMAc ist in Abbildung 2 dargestellt. dP(EtOx-co-EI) (M _n = 2700, D =1 .72) war im Vergleich zu dP(MeOx-co-EI) (M _n = 2200, D = 1.51 ) zu niedrigeren Elutionsvolumina und somit höheren Molmassen verschoben.

Beispiel C4: Charakterisierung der Polymere durch Titration

Beide Polymere konnten bei Raumtemperatur in Wasser gelöst werden. Titrationen in wässriger Lösung wurden durchgeführt, um die Anwesenheit der Aminogruppen im Polymerrückgrat zu bestätigen. Obwohl die Titration von Aminogruppen eine qualitative Bewertung ermöglichte, wurde aufgrund von Wasserrückständen die Ergebnisse beeinflussen würden, keine genaue quantitative Analyse durchgeführt. Die Titrationskurven von dP(MeOx-co-EI) und dP(EtOx-co-EI) sind zusammen mit der jeweiligen ersten Ableitung in Abbildung 3 und 4 dargestellt. Die Polymerlösungen wurden vor der Titration mit halbkonzentriertem HCl angesäuert. Die entsprechenden pH-Werte der Äquivalenzpunkte sind ebenfalls angezeigt.

Die Ansäuerung der wässrigen Polymerlösungen mit halbkonzentriertem HCl vor den Titrationen führte zum Auftreten von zwei Äquivalenzpunkten (EP) für Aminogruppen enthaltende Polymere bei der Titration mit verdünnter Natriumhydroxidlösung. Der erste EP entspricht der Neutralisierung des HO- Überschusses, während der zweite EP sich auf die Neutralisation der Aminogruppen bezieht. In den Titrationskurven von dP(MeOx-co-EI) und dP(EtOx-co-EI) wurden zwei EP beobachtet, was auf die zurückbleibenden Aminogruppen nach der anteiligen Funktionalisierung von oxPEI zurückzuführen ist.

Beispiel C5: Charakterisierung der Polymere durch Abbaustudien mittels sauerer Hydrolyse

Ein wichtiger Vorteil von dP(AOx-co-EI) im Vergleich zu PAOx ist deren Fähigkeit, durch die zusätzlichen Rückgrat-Amidgruppen potenziell abbaubar zu sein. Um das zu bestätigen wurden dP(MeOx-co-EI) und dP(EtOx-co-EI), mit 6 M HCl bei 90 °C für 2 Tage behandelt. Diese Bedingungen ähneln denen, die für die Hydrolyse von PEtOx zu PEI angewendet wurden, bei der kein Abbau des PEtOx- oder des PEI- Polymer-Rückgrats auftritt.

In Abbildung 5 und 6 sind die Überlagerungen der ¹ H NMR Spektren von dP(MeOx- co-EI) und dP(EtOx-co-EI) vor (unteres Spektrum) und nach (oberes Spektrum) der Behandlung mit HCl dargestellt. Die individuellen Spektren sind aus Gründen der besseren Übersichtlichkeit vertikal übereinander gelegt.

Abbildung 5 und 6 zeigen den erfolgreichen Abbau der Polymere unter diesen Bedingungen. Vor der Behandlung mit HCl zeigten die Polymere breite Signale, die für Polymere typisch sind, während die Signale des degradierten Polymere scharf waren, wie es bei kleinen Molekülen üblicherweise beobachtet wird.

Die Aufspaltung der EtOx-Seitenkettensignale von dP(EtOx-co-EI) bei 1 ,34 ppm bzw. 2,49 ppm in ein Triplett bzw. ein Quartett deutete auf die Abspaltung der Seitenkette vom Polymerrückgrat hin, wodurch Propionsäure erhalten wird. Dies bestätigte nicht unbedingt den Abbau der Polymerkette selbst und wurde auch für PEtOx bei der Behandlung mit HCl gefunden. Während jedoch die Spektren von PEtOx nach der Behandlung nur das Rückgratsignal des verbliebenen PEI aufwiesen, traten verschiedene scharfe Signale bei chemischen Verschiebungen des ehemaligen dP(EtOx-co-EI)-Rückgrats auf. Das Singulett bei 3,67 ppm kann der Methyleneinheit des Glycins zugeordnet werden, das bei Abbau gebildet wird, während die Tripletts im Bereich von 3,65 ppm und 3,21 ppm den verbleibenden Ethylenimineinheiten zugeschrieben werden können. Darüber hinaus erschien ein scharfes Signal bei 8,77 ppm, das bereits für oxPEI nach dem Abbau berichtet worden war und das auf weiteren Abbauprodukten zurückzuführen sein könnte. Gleichzeitig verschwand das breite Amidsignal bei etwa 8,0 ppm, was auf die Hydrolyse der zugehörigen Rückgrat-Amidgruppen hindeutet. Die Überlagerung der Spektren von dP(MeOx-co- El)vor und nach der Behandlung mit HCl zeigten ähnliches Verhalten. Durch die Abspaltung der Seitenkette als Essigsäure wurde ein Singulett bei 2,17 ppm erhalten. Des Weiteren zeigte sich die Aufspaltung der breiten Polymerrückgratsignale in ein scharfes Singulett bei 3,61 ppm, das wie bereits oben beschrieben Glycin zugeordnet werden kann. Mehrere Tripletts im Bereich von 3,58 bis 2,95 ppm waren die auf Abbauprodukte der Ethylenimineinheiten zurückzuführen.