本发明涉及抗肿瘤药物领域， 特别涉及一种新型抗 EB病毒所致肿瘤多肽及 其应用与制备方法。

背景技术

在抗生素研究领域，人们一直在致力于开发模 仿同种异株细菌之间互相杀伤 的工作方式来开发新型抗生素，自然界中有不 少细菌毒素直接在细菌胞膜上形成 离子通道来杀死细菌， 其模式标本就是大肠杆菌分泌的一种细菌毒素 一大肠菌 素。 其中大肠菌素 la自 1952年被 Jacob发现之后， 经过数代人的努力， 1996年 Qiu et al (Major transmemebrane movement soociated with colicin la channel gating. J. Gen. Physiology, 107:313-328 (1996) ) 终于揭示了大肠菌素 la在人工脂质双分 子膜上所形成离子通道开放和关闭时的跨膜立 体结构，为在分子水平上设计和制 备新型的抗菌素奠定了理论基础。 并相继有大肠菌素多肽与白色连珠球菌信息 素、葡萄球菌信息素等信号肽分子连接而成的 多肽分子能够通过信息素识别靶细 菌细胞，将大肠菌素引导到靶细菌细胞膜上形 成跨膜离子通道导致胞容物外泄致 死细胞。

恶性肿瘤是对人类健康的巨大威胁。全世界每 年死于恶性肿瘤的患者约有七 百万人， 其中中国就占有六分之一， 恶性肿瘤已是我国第二位的死亡原因。 由于 其病因、 发病机制、 临床表现尚未阐明， 故防治效果不理想。 现有抗肿瘤药物在 肿瘤治疗中占重要地位， 虽然对一些肿瘤已取得一定的疗效， 但仍存在着对肿瘤 细胞的选择性差， 免疫抑制及不良反应多而严重， 产生耐药性等缺陷。

EB病毒所致的非洲儿童恶性淋巴肉瘤， Hodgkin's淋巴肉瘤和鼻咽癌细胞表 面均带有特异的 EB病毒表面抗原， 因此， EB病毒表面抗原可以认为是该类肿 瘤细胞的一种特异性标志物。 在 EB 病毒所致的肿瘤药物上， 专利号为 ZL200410081446.8的发明，公开了大肠菌素与识别 EB病毒表面抗原的模拟抗体 结合形成的抗肿瘤多肽， 能够特异性杀死机体中的 EB病毒所致癌细胞， 而对正 常细胞没有伤害， 杀伤力是其他抗癌药物的若干倍， 克服了近年来使用的抗肿瘤 药物中存在的药物选择性差、产生耐药性、杀 死癌细胞的同时正常组织也受到严 重损伤等问题， Xiao-Qing Qiu等， 2007的文章中对比了一系列结构的模拟抗体 与大肠菌素构成的抗肿瘤多肽的杀肿瘤的能力 ， 发现 V _H CDR1- V _H FR ₂ -V _L CDR3 及 VLCDRI- VHFR ₂ -V _H CDR3两种结构的模拟抗体与大肠菌素构成� �抗肿瘤多肽 具有较好的杀伤能力 （Xiao-Qing Qiu et al.， 2007, Small antibody mimetics comprising two complementarity-determining regions and a framework region for tumor targeting, Nature Biotechnology 25, 921-929, 1 August 2007 ) ,这为进一步制 备抗 EB病毒所致肿瘤多肽提供了更多的候选模拟抗� ��。

但是在上述抗肿瘤多肽中，由于大肠菌素多肽 的熟睡端存在较易引起超敏反 应的氨基酸残基， 有可能导致含有大肠杆菌多肽的药物较易引起 机体异常的免 疫应答； 有研究报道， 很多癌症患者由于其代谢机制受到癌细胞干扰 而不正常， 对多肽类药物容易产生过敏反应， 而导致不能用药， 因此有必要对大肠菌素多肽 进行改进， 以获得更安全适合更多患者的抗癌药物。

发明内容

本发明根据上述领域存在的不足， 提供一种新型抗 EB病毒所致肿瘤多肽及 其应用与制备方法。 为治疗 EB病毒所致肿瘤提供高杀伤力、 高特异性， 且致敏 可能性较低的药物。

一种新型抗 EB病毒所致肿瘤多肽， 由可形成离子通道的大肠菌素变构多肽 与抗 EB病毒抗体多肽或者抗 EB病毒抗体的模拟抗体多肽可操作地连接构成� �� 所述可形成离子通道的大肠菌素变构多肽由野 生型大肠菌素 El、 Ia、 Ib、 A、 B、 N或其水性孔道结构域的肽链突变了氨基酸残� � G11A、 H22G、 A26G、 V31L和 H40D而获得，所述抗 EB病毒抗体多肽的氨基酸序列与 ATCC HB-168杂交瘤分 泌的抗体多肽相同。

所述模拟抗体多肽指所述抗 EB病毒抗体的重链 CDR1区、重链 CDR1-CDR2 连接肽段和轻链 CDR3的连接肽。

所述可形成离子通道的大肠菌素变构多肽由野 生型大肠菌素 la突变而来。 所述新型抗 EB病毒所致肿瘤多肽， 具有如 SEQ ID N0.29所示的氨基酸序 列。

编码所述新型抗 EB病毒所致肿瘤多肽的基因。 所述基因， 具有如 SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列。

含有上述基因的重组质粒。

上述新型抗 EB病毒所致肿瘤多肽的制备方法， 步骤如下： 将上述重组质粒 转化到表达系统中进行表达， 分离纯化表达的多肽。

上述新型抗 EB病毒所致肿瘤多肽在制备治疗和预防 EB病毒所致肿瘤的药 物中的应用。

一种大肠菌素 la的变构多肽， 其氨基酸序列如 SEQ ID N0.24所示。

编码大肠菌素 la的变构多肽的基因。

所述基因在制备多肽药物中的应用，指将所述 基因与诱导多肽的基因可操作 地连接并克隆到表达载体中，然后将表达载体 转化到表达系统中， 分离纯化表达 的多肽

本发明提供的新型抗 EB病毒所致肿瘤多肽， 由可形成离子通道的大肠菌素 变构多肽与抗 EB病毒的抗体多肽或者抗 EB病毒的抗体的模拟抗体多肽构成。 由于野生大肠菌素多肽分子中存在容易引起超 敏反应的氨基酸残基，本发明在可 形成离子通道结构的大肠菌素的多肽分子中， 选择性地突变了疏水区段部分容易 引起机体超敏反应的氨基酸残基， 如本发明的一个优选实施例中， 大肠菌素 la 的多肽突变位置为： G11A、 H22G、 A26G、 V31L和 H40D， 实验数据表明， 采 用大肠菌素 la多肽和变构的 la多肽分别注射免疫小鼠，注射变构的 la的小鼠产 生的血清效价要比前者低 1~2个数量级， 即免疫应答水平较低，证明变构的多肽 降低了引起机体过敏的可能性；同时变构多肽 仍然保留了在细胞膜上形成跨膜离 子通道的功能， 实验证明， 本发明的重组多肽对肿瘤细胞的杀伤能力未受 影响， 说明突变的氨基酸残基没有影响大肠菌素形成 离子通道的功能。本发明提供的新 型抗 EB病毒所致肿瘤多肽中， 抗 EB病毒的抗体多肽或者抗 EB病毒的抗体的 模拟多肽通过与 EB病毒所致的肿瘤细胞的表面特异性抗原识别� �� 大肠菌素变构 多肽引导至靶细胞膜上，大肠菌素变构多肽的 跨膜离子通道结构域疏水区段插入 肿瘤细胞膜中， 进而形成离子通道， 靶肿瘤细胞因内容物泄漏而被致死； 抗 EB 病毒的抗体多肽的氨基酸序列完全参照 ATCC HB-168杂交瘤细胞分泌单克隆抗 体的多肽的氨基酸序列。

本发明的实施例中优选采用上述抗 EB病毒抗体的模拟抗体多肽可操作地连 接在大肠菌素变构多肽的羧基端而获得分子量 较小的本发明的抗肿瘤多肽，即这 些小分子模拟多肽仅包括该抗 EB病毒的抗体多肽的 V _H CDR1区、 VLCDR3区， V _H CDR1-V _H CDR2 连接肽段和轻链 VLCDR3 区连接的肽链 V _H CDR1- V _H FR ₂ - V _L CDR3得到氨基酸序列如 SEQ ID N0.25所示的新型抗肿瘤多肽 1的模拟抗体， 模拟抗体仅包含不到 30个氨基酸，在分子量上远远小于天然抗体 150个氨基酸， 既达到了对抗原识别能力的要求又大幅度消减 了抗肿瘤多肽的分子量，有利于提 高本发明抗肿瘤多肽在组织中的穿透能力。

本发明的另一目的是提供编码本发明所述抗肿 瘤多肽的基因序列。本发明抗 肿瘤多肽的基因由编码大肠菌素变构多肽的基 因与编码抗 EB病毒的抗体多肽的 基因或者其模拟抗体多肽的基因可操作地连接 构成， 其中大肠菌素多肽和抗 EB 病毒抗体的基因序列是已知的，大肠菌素变构 多肽的基因是在大肠菌素多肽基因 的相应密码子上进行如下点突变而得： G11A、 H22G、 A26G、 V31L禾 B H40D。 由于密码子的兼并性，本领域技术人员可在不 改变氨基酸序列的前提下对编码本 发明所述的抗肿瘤多肽的核苷酸序列进行调整 。

本发明所述的重组质粒，是指将装载了野生大 肠菌素基因的原始载体进行双 链核苷酸点突变，在目标突变位置上插入突变 密码子， 获得含有大肠菌素变构多 肽的基因的突变载体， 相同的点突变技术将编码抗 EB病毒的抗体的模拟抗体基 因经插入到大肠菌素变构多肽基因的羧基端， 得到本发明的重组质粒。原始载体 _P SELECT™-1购于 Promega公司， 其中装载了大肠菌素 la和 Immunity蛋白基 因， 点突变操作按照 Stmtegene公司试剂盒说明书； 本发明针对点突变制备大肠 菌素变构多肽， 其中突变了 5 个密码子， 因此设计了 5 对引物序列 （Seq ID No.l~10 )； 本发明实施例中针对模拟抗体基因设计了 6 对引物序列 （Seq ID No.ll~22 )。

本发明还提供了制备本发明所述抗肿瘤多肽的 方法， 是将上述获得的重组质 粒转染入大肠杆菌 BL21(DE3)工程菌中，筛选出阳性克隆， 分离纯化阳性克隆表 达的蛋白即能得到为本发明新型抗 EB病毒所致肿瘤多肽。

本发明提供的新型抗 EB病毒所致肿瘤多肽， 可在制备治疗或预防 EB病毒 所致肿瘤的药物中应用。可以通过将本发明中 获得的新型抗生素的多肽添加到药 学上可接受的载体或者赋形剂或可选的其它成 分而制成临床上适用的药物组合 物。

本发明还提供了大肠菌素 la变构多肽的氨基酸序列和基因序列， 该变构多 肽不仅可用于本发明中， 还可以与其他引导多肽构成抗体多肽， 本发明实施例 3 的实验数据一方面证明了含有该变构多肽的多 肽药物具有较低的抗原性，也证明 该变构多肽与其他引导多肽构成抗体多肽具有 杀菌能力，而制备方法是本领域的 常规实验操作。

本发明提供的新型抗肿瘤多肽， 具有专利号 ZL200410081446.8的发明所公 开的抗肿瘤多肽的优点， 即高特异性的靶向性和对正常细胞的安全性， 不易产生 耐药性等优点，同时本发明的抗肿瘤多肽通过 对大肠菌素多肽中易引起超敏反应 的氨基酸残基进行了突变， 降低了含该变构多肽的抗肿瘤多肽的免疫原性 ， 即降 低了引起过敏反应的可能性，改进了现有该类 多肽的药物使用安全性和杀肿瘤效 果， 还为其他含大肠菌素多肽的药物提供了改进的 参考。 附图说明

图 1.含有模拟抗体多肽 V _H CDR1- V _H FR ₂ - V _L CDR3的基因和大肠菌素 la变构多 肽基因的重组质粒 pCHCEBll的结构示意图

图 2.含有模拟抗体多肽 V _H CDR1- V _H FR ₂ - (Rev) V _L CDR3的基因和大肠菌素 la 变构多肽基因的重组质粒 PCHCEB22的结构示意图

图 3 .大肠菌素 la变构多肽的致敏效果实验 1

(A) 昆明小鼠腹腔注射致死剂量的耐甲氧西林金葡 菌 （ATCC BAA42) , 随 机分组为 （1 ) 对照组， （2) 氨苄青霉素组， （3) 抗金葡菌多肽 (ZL 01128836.1) 组， （4) 抗金葡菌多肽 1组。

(B) 14天后， 再取昆明小鼠一批作为对照和氨苄青霉素组， 抗金葡菌多肽组 及抗金葡菌多肽 1组存活鼠作为抗金葡菌多肽组及抗金葡菌多� � 1组重复上述试 验。

(C) 41 天后， 再取昆明小鼠一批作为 （1) 对照组、 （2) 左氧氟沙星组和 （3) 头孢曲松钠组，（4) 抗金葡菌多肽组及 （5) 抗金葡菌多肽 1组存活鼠作为抗绿脓 杆菌多肽 2组及抗绿脓杆菌多肽 1组。。

图 4.大肠菌素 la变构多肽的低致敏效果实验 2 (A) 抗金葡菌多肽 /抗绿脓杆菌多肽 2组血清， 1:50,000 滴度；

(B) 抗金葡菌多肽 1/抗绿脓杆菌多肽 1组血清， 1:50,000 滴度。

( 1 ) 第一周， （2) 第二周， （3) 第 7周血清。 （4) 阴性对照。 图 5. 新型抗肿瘤多肽对 EB病毒所致人恶性淋巴肉瘤 (Burkitt's lymphoma)体外 杀伤效果比较

(A) 对照组， （B) 新型抗肿瘤多肽 1处理组， （C) 新型抗肿瘤多肽 2处理组。 图 6. 新型抗肿瘤多肽对 EB病毒所致 Burkitt's人恶性淋巴肉瘤细胞和其它肿瘤 细胞的体外杀伤作用

(A) EBV病毒阳性的 Burkitt's 人恶性淋巴肉瘤细胞，

(B) EBV病毒阴性的 Burkitt's 人恶性淋巴肉瘤细胞，

(C) EBV病毒阳性的爱滋病人 （AIDS) 恶性淋巴肉瘤细胞。

( 1 ) 对照组， （2) 新型抗肿瘤多肽 1处理组。。 图 7 新型抗肿瘤多肽对 EB病毒所致 Burkitt's人恶性淋巴肉瘤细胞种植到裸鼠体 内生长出的实体肿瘤的杀伤作用

(A)对照组 。

(B) 新型抗肿瘤多肽 1处理组的 SCID免疫缺陷鼠，鼠双腋下均接种 Burkitt's 人恶性淋巴肉瘤细胞。 左边箭头， EBV病毒阴性的淋巴肉瘤， 右边箭头， EBV 病毒阳性的淋巴肉瘤。

图 8 新型抗肿瘤多肽对 EB病毒所致 Burkitt's人恶性淋巴肉瘤细胞种植到裸鼠体 内生长出的实体肿瘤的杀伤作用

(A)对照鼠 EBV病毒阴性的淋巴肉瘤切片， （B) 对照鼠 EBV病毒阳性的淋巴 肉瘤切片， (C) 新型抗肿瘤多肽 1处理鼠 EBV病毒阴性的淋巴肉瘤切片， (D) 新 型抗肿瘤多肽 1处理鼠 EBV病毒阳性的淋巴肉瘤切片。 具体实施方式

结合附图， 通过对本发明较佳实施例的描述具体说明本发 明。 本发明所用的原始质粒： pSELECT ^TM -l购于 Promega公司。

工程菌： E.coW BL-21(DE3) 工程菌， 购于 Novagen公司。

实施例 1. 构建含编码突变大肠菌素 la的基因的重组质粒

原始质粒为原始质粒为装载了大肠菌素多肽 la和 immunity 蛋白基因的 pSELECT ^TM -l质粒 （8.3 kb ) (购于 Promega公司）， 经双链寡聚核苷酸点突变技 术（QuickChange™Kit， Strategene公司）分别将编码突变氨基酸的基因� �： SEQ ID NO 1 -10所示的寡聚核苷酸引物序列与野生型大肠菌 素 la的基因可操作地连 接， 获得如 SEQ ID N0.23所示编码大肠菌素 la变构多肽的基因， 同时得到突变 质粒； 再将编码模拟抗体的基因 SEQ ID N0.26或 SEQ ID N0.28插入到突变质 粒中大肠菌素 la变构多肽的基因的 1626位密码子之后， 制备出到新型抗 EB病 毒所致肿瘤多肽的两种重组质粒 pCHCEB ll (如图 1所示）， pCHCEB22 (如图 2所示），为制备重组质粒中编码抗 EB病毒抗体的模拟抗体基因所设计的 6条寡 聚核苷酸引物序列如 SEQ ID N011-22所示。 重组质粒转染入 E.coli BL21(DE3) 工程菌 （购于 Novagen公司） 里制备多肽， 获得序列表中 SEQ ID N0.25 (在后 面的实施例中称为"新型抗肿瘤多肽 )和 SEQ ID N0.27 (在后面的实施例中称 为"新型抗肿瘤多肽 2" ) 所示。

双链寡聚核苷酸点突变程序按 Strategene QuickChang Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)试剂盒进行。

1 . 准备点突变反应物：

5ul 10X buffer

2ul (10 ng) 装载了野生型大肠菌素变构多肽和 immunity 蛋白基因的原始质粒 pSELECT™- l o

1.25 ul (125 ng)设计的 5'-3'寡聚核苷酸引物

1.25 ul (125 ng)设计的 3'-5'寡聚核苷酸引物

1 ul dNTP

双蒸水 50 ul

1 ul pfu

(除质粒、 引物和双蒸水外， 均为试剂盒所备试剂）

2. 进行 PCR扩增， 扩增条件： 变性 95°C, 35秒， 退火 53 °C, 70秒， 延伸 68 °C, 17分， 共 20个循环;

3. 加入 Dpn 1内切酶 1 ul 消化母体 DNA链 （37 °C, 1小时）， 取 1 ul反应物 与 XLl-Blue感受态细胞 50 ul冰孵 30分钟， 热冲击 42 °C， 45秒， 再置 入冰中 2分钟；

4. 加入 NZY培基 0.5 ml, 220 rpm, 37 °C摇菌 1小时， 取 50-100 ul 反应物铺 板 （LB培基加 1 %琼脂加 50 ug/ml氨苄青霉素， 37 °C过夜）；

5. 18 小时后挑菌， 提取质粒后测序确定突变成功；

6. 将完成多个位点突变的最终获得的重组质粒 50 ng 与制备的 E.coli BL-21(DE3)工程菌感受态细胞 40 ul冰孵 5分钟， 42 °C热冲击 30秒， 再置 入冰中 2分钟， 加入 Novagen公司 SOC培养液 160 ul后 220 rpm, 37 °C 摇菌 1小时后铺板 （LB培基加 1 %琼脂， 加 50 _U g/ _m l氨苄青霉素） 37 °C 过夜。

7. 挑取单克隆菌落大量增菌， 8-16升 FB培基， 250 rpm, 30 °C， 4-5小时， 热冲 击 250 rpm, 42 °C, 30分钟， 250 rpm, 37 °C, 2小时；离心沉淀菌体， 4 °C， 6000g, 20分钟， 取 4°C， 50mM硼酸缓冲液 （2mM EDTA +2mM DTT) 50-80ml悬浮 菌体， 加入 0.2M PMSF 250毫升后， 使用超声破碎（4 °C， 400W, 2分钟，）， 高速离心沉淀破碎的菌体 （4 °C， 75,000g, 90分钟）， 取上清加入硫酸链霉素 500万单位沉淀 DNA， 15000g, 4 °C, 10分钟离心沉淀后， 取上清装入分子 量 15,000透析袋于 4 °C， 50 mM硼酸缓冲液 4升透析过夜后， 再次 15000g, 4 °C， 10分钟离心沉淀， 取上清上样于 CM离子交换柱， 经 0.1-0.3 M NaCl + 50 mM硼酸缓冲液梯度洗脱即可得到重组抗肿瘤多� ��。

点突变设计的引物序列如下：

Seq ID NO. 1 突变大肠菌素基因中 G11A所设计的寡聚引物 5 ' -3 '

cgt att aca aat ccc GCA gca gaa tcg ctg ggg

Seq ID NO. 2 突变大肠菌素基因中 G11A所设计的寡聚引物 3 ' _5 '

ccc cag cga ttc tgc TGC ggg att tgt aat acg

Seq ID NO. 3 突变大肠菌素基因中 H22G所设计的寡聚引物 5 ' -3 '

gat tea gat ggc GGT aaa tta tgg gtg

Seq ID NO. 4 突变大肠菌素基因中 H22G所设计的寡聚引物 3 ' -5 '

cac cca taa ttt ACC gcc ate tga ate

Seq ID NO. 5 突变大肠菌素基因中 A26G所设计的寡聚引物 5 ' -3 '

gaaa ttatgGGTgt tgatatttat

Seq ID NO. 6 突变大肠菌素基因中 A26G所设计的寡聚引物 3 ' -5 ' ataaatatacaacACCcataatttc

Seq ID NO. 7 突变大肠菌素基因中 V31L所设计的寡聚引物 5' -3'

gt t gat att tat CTC aaccctc cacgtgtc

Seq ID NO. 8 突变大肠菌素基因中 V31L所设计的寡聚引物 3 ' -5，

gacacgtggagggttGAGataaatatcaac

Seq ID NO. 9 突变大肠菌素基因中 H40D所设计的寡聚引物 5' -3'

cgtgtcga tgtctttGATggtaccccgc ctgcat

Seq ID NO. 10 突变大肠菌素基因中 H40D所设计的寡聚引物 3' -5'

atgcaggcggggtaccATCaaagacatcgacacg

Seq ID NO. 11重组质粒 pCHCEBl l中 V„CDR1基因引物 5， -3，

gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGTCAGtaa ata aaa tat aag aca ggc

Seq ID NO. 12重组质粒 pCHCEBl l中 V _H CDR1基因引物 3' -5，

gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att cgc

Seq ID NO. 13重组质粒 pCHCEBl 1 中 V _H FR ₂ 基因引物 5 ' _3'

8'8't atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaa tat aag aca ggc

Seq ID NO. 14重组质粒 pCHCEBl l中 V _H FR ₂ 基因引物 3' -5，

gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg cac cca atg cat acc

Seq ID NO. 15重组质粒 pCHCEBl 1 中 （Rev) V^DRS 基因引物 5' -3，

aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc ACC TAC CCC TAC TCC TAC GGT CAG GGT taa ata aaa tat aag aca ggc

Seq ID NO. 16重组质粒 pCHCEBl l中 (Rev) V _L CDR3 基因引物 3' -5，

gcc tgt ctt ata ttt tat tta ACC CTG ACC GTA GGA GTA GGG GGT ggc cac cca etc cag acc ttt

Seq ID NO. 17重组质粒 pCHCEB22中 V„CDR1基因引物 5' -3，

gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaa tat aag aca ggc

Seq ID NO. 18重组质粒 pCHCEB22中 V„CDR1基因引物 3， -5，

gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att cgc

Seq ID NO. 19重组质粒 pCHCEB22中 V _H FR ₂ 基因引物 5' _3'

ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ataaaa tat aag aca ggc

Seq ID NO. 20重组质粒 pCHCEB22 中 V _H FR ₂ 基因引物 3' -5，

gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg cac cca atg cat acc

Seq ID NO. 21重组质粒 pCHCEB22 中 V _L CDR3基因引物 5' -3，

aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc GGT CAG GGT TAC TCC TAC CCC TAC ACC taa ata aaa tat aag aca ggc

Seq ID NO. 22重组质粒 pCHCEB22中 V _L CDR3基因引物 3' -5，

gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT GTA GGG GTA GGA GTA ACC CTG ACC ggc cac cca etc cag acc ttt 实施例 2.重组质粒 pCHCEBll、 pCHCEB22制备的新型抗肿瘤多肽的免疫效果观 察

取实施例 1制备获得重组质粒 pCHCEBll、 pCHCEB22制备得到的新型抗 肿瘤多肽 1， 新型抗肿瘤多肽 2， 发明人的前期专利中的抗肿瘤多肽 1、 抗肿瘤 多肽 2 (ZL200410081446.8)各一份免疫小鼠： 上述各蛋白与佐剂混合后， 基础 量和追加量为腹腔注射每只 50 μ _§ (0.5 ml) 1 次。间隔两周，免疫 5 针。 ELISA 间接法检测小鼠血清效价，本发明制得的新型 抗肿瘤多肽 1和 2所免疫小鼠血清 效价为 10— ³ 至 10— ⁴ 而抗肿瘤多肽 1、抗肿瘤多肽 2所免疫小鼠的血清效价为 10— ⁴ 至 10— ⁵ 。

可见本发明新型抗肿瘤多肽造成宿主致敏反应 的可能性要比含野生型大肠 菌素 la的抗肿瘤多肽造成宿主致敏反应的可能性低� ��至两个数量级。 实施例 3.构成新型抗肿瘤多肽的大肠菌素 la变构多肽的低致敏效果实验

取实施例 1中大肠菌素 la变构多肽 （其水性孔道结构域的肽链中突变了氨 基酸残基 G11A、 H22G、 A26G、 V31L和 H40D) 的突变质粒， 在其氨基端或 羧基端可操作地连接金黄色葡萄球菌信息素 AgrDl( YSTCDFIM )， 制备出两种 抗菌多肽。 AgrDl连接在变构的大肠菌素 la羧基端制备而得的多肽命名为抗金 葡多肽 1， AgrDl连接在变构的大肠菌素 la氨基端制备而得的多肽命名为抗绿脓 杆菌多肽 1。取野生型大肠菌素 la的质粒，在其氨基端连接金黄色葡萄球菌信� �� 素 AgrDl制备出抗绿脓杆菌多肽 2。

实验 1 : 取昆明小鼠一批， 腹腔注射致死剂量耐甲氧西林金葡菌 （ATCC BAA42) , 随机分组为 （1 )对照组， （2)氨苄青霉素组， （3)抗金葡菌多肽组，

(4) 抗金葡菌多肽 1组。 每组小鼠均为 10只。

处理方法：

腹腔注射致死剂量耐甲氧西林金葡菌 （ATCC BAA42) —小时后， 对照组： 尾静脉注射 0.5毫升 0.3 M NaCl + 50 mM硼酸缓冲液一次； 氨苄青霉素组： 尾静脉注射氨苄青霉素 2.5 mg/kg—次；

抗金葡菌多肽组： 尾静脉注射发明人发明的抗金葡菌多肽 （ZL 01128836.1) 6 mg/kg一次；

抗金葡菌多肽 1组： 尾静脉注射抗金葡菌多肽 1 6 mg/kg—次。

结果： 对照组及氨苄青霉素组鼠在两天内全部死亡。 抗金葡菌多肽组及抗 金葡菌多肽 1组有 85 %的鼠存活。

实验 2: 实验 1的第 14天后， 再取昆明小鼠一批作为对照和氨苄青霉素组， 抗金葡菌多肽组及抗金葡菌多肽 1 组存活鼠作为抗金葡菌多肽组及抗金葡菌多 肽 1组重复上述试验。对照组及氨苄青霉素组鼠� �两天内全部死亡。抗金葡菌多 肽组有 75 %的鼠存活， 抗金葡菌多肽 1组有 90 %的鼠存活。

实验 3: 实验 1的 41天后， 再取昆明小鼠一批作为对照组、左氧氟沙星组 和 头孢曲松钠组，抗金葡菌多肽组及抗金葡菌多 肽 1组存活鼠作为抗绿脓杆菌多肽 2组及抗绿脓杆菌多肽 1组。

小鼠腹腔注射致死剂量多重耐药绿脓杆菌 （四川大学华西医院试验医学系临 床分离株 13578) —小时后，

对照组尾静脉注射 0.5毫升 0.3 M NaCl + 50 mM硼酸缓冲液一次，

左氧氟沙星组尾静脉注射左氧氟沙星 5 mg/kg一次，

头孢曲松钠组尾静脉注射头孢曲松钠 30 mg/kg—次，

抗绿脓杆菌多肽 2组尾静脉注射绿脓杆菌多肽 2 8 mg/kg一次，

抗绿脓杆菌多肽 1组尾静脉注射抗绿脓杆菌多肽 1 8 mg/kg一次。 对照组和 左氧氟沙星组鼠在一天内全部死亡。 头孢曲松钠组有 25 %的鼠存活。 抗绿脓杆菌 多肽 2组有 60%的鼠存活。 抗绿脓杆菌多肽 1组鼠全部存活， 说明宿主抗体对变 构多肽杀伤效用的干扰比对野生型多肽的干扰 要低。

见附图 3 。

在试验第一周、第二周和第 7周分别采取上述抗金葡菌多肽 /抗绿脓杆菌多肽 2组和抗金葡菌多肽 1/抗绿脓杆菌多肽 1组存活鼠的血清进行 ELISA间接法检 测其血中的抗体， 酶标板的孔中分别包被野生型大肠菌素 la和大肠菌素 la变构 多肽， 100 ng/ well, 一抗分别为抗金葡菌多肽 /抗绿脓杆菌多肽 2组和抗金葡菌 多肽 1/抗绿脓杆菌多肽 1组存活鼠血清， 2抗为山羊抗小鼠标记抗体， 阴性对照 以 5%牛奶 -PBS为一抗， 1:50,000滴度的所得结果如下 （见附图 4)

A (抗金葡多肽 /抗绿脓多肽 2组) (抗金葡多肽 1/抗绿脓多肽 1 ) 1 (第 1周） 0.914 0.254

2 (第 2周） 1.623 0.598

3 (第 7周） 2.911 1.41

4 (对照） 0.065 0.069

可见本发明所制备的大肠菌素 la变构多肽造成宿主致敏反应的可能性要比 野生型大肠菌素 la造成宿主致敏反应的可能性低；

实施例 4 新型抗肿瘤多肽对 EBV所致人恶性淋巴肉瘤 (Burkitt's lymphoma)体 外杀伤效果

EB病毒阳性及阴性细胞株： 为美国 ATCC标准细胞株。

细胞培养： 取出 0.1 ml复苏培养的 Raji细胞悬浮液， 缓缓加入含 3 ml 1640液 体培养基 (加 10%血清)的培养皿中 (稀释比例为 1:30)， 混合均匀， 放入 37°C C0 ₂ 培养箱中培养。 实验使用一株 EB病毒阳性细胞株： ATCC CCL-86 (即全世界细 胞培养室使用的标准人 Burkitt's恶性淋巴肉瘤细胞, Raji细胞， 1963年分离自 12 岁非洲男性患儿）。

受试细胞共分 3组， 第一组为空白组， 即加入抗肿瘤多肽空白保存液

(10mMPB+0.2M NaCI磷酸盐缓冲液 （ρΗ7·4) ；)。

第二组为加入 20(Vg/ml的新型抗肿瘤多肽 1 (质粒为 pCHCEBll, 保存液为 lOmMPB + 0.2M NaCI磷酸缓冲液 pH7.4)。

第三组为加入 20(Vg/ml的新型抗肿瘤多肽 2 (质粒为 pCHCEB22, 保存液为 lOmMPB + 0.2M NaCI磷酸缓冲液 pH7.4)。

细胞在培养 24小时后， 分别加入上述各组处理物于培养皿中， 在加入处理 物后的第 72小时加入 100 uMol碘化丙啶 （Propidium Iodide, PI) 20 ul, 10分钟 后在荧光显微镜下观察。 结果显示空白组细胞生长良好， 唯新型抗肿瘤多肽 1 组中绝大部分细胞被 PI染成了红色， 提示这些细胞膜已被抗肿瘤多肽破坏,造成 肿瘤细胞死亡。 从细胞死亡数量来比较， 两种新型抗肿瘤多肽中新型抗肿瘤多 肽 2效果较差， 见附图 5。 实施例 5. 新型抗肿瘤多肽对 EB病毒所致 Burkitt's人恶性淋巴肉瘤细胞和其它 肿瘤细胞的体外杀伤作用之多重荧光染色观察 。 细胞培养条件同实施例 2。实验共使用三株细胞， EB病毒阳性细胞株： ATCC CCL-86 (Raji 细胞， Burkitt's 恶性淋巴肉瘤细胞）； ATCC CRL-2230, 46岁男性 爱滋病人 （AIDS) 恶性淋巴肉瘤细胞株 , ΕΒ病毒和 Kaposi肉瘤病毒 （HHV8) 均 阳性； EB病毒阴性细胞株： ATCC CRL-1648 (CA-46, 细胞分离自美国型 Burkitt's 恶性淋巴肉瘤病人的腹水）。

每株细胞分为二个实验组， 第一组为加入新型抗肿瘤多肽空白保存液 (10mMPB+0.2M NaCI磷酸盐缓冲液（pH7.4) 第二组为加入 20(Vg/ml的新型抗 肿瘤多肽 1(质粒为 pCHCEBll), 保存液为 lOmMPB + 0.2M NaCI磷酸缓冲液 ρΗ7·4。

细胞在培养 24小时后， 分别加入上述各组处理物于培养皿中， 在加入处理 物后的第 72小时分别加入 50 uMol FITC 20ul及 50 uMol Rodamin-123 20ul两种 荧光染料。 10分钟后在 Olympus IX-71荧光显微镜下观察。

结果显示： EB病毒阴性的肿瘤细胞株被新型抗肿瘤多肽 1处理后仍生长良 好。 而 EB病毒阳性的各肿瘤细胞株被新型抗肿瘤多肽 1处理后， 绝大多数细胞 出现线粒体及胞核结构消失， 明显肿胀和坏死， 细胞几乎全部死亡。 显然多重荧 光染色的结果比实施例 4碘化丙啶染色的结果更为精确的展示了新型� �肿瘤多 肽 1对 EB病毒阳性肿瘤细胞的强大杀伤作用， 见图 6。

EB病毒阴性的肿瘤细胞生长良好， 表明新型抗肿瘤多肽并不攻击细胞膜上 不带有 EB病毒表面抗原的细胞。这提示本发明新型抗� ��瘤多肽具有理想的靶向 特异性和安全性。 实施例 6.新型抗肿瘤多肽对 EB病毒所致 Burkitt's人恶性淋巴肉瘤细胞种植到裸 鼠体内生长出的实体肿瘤的杀伤作用

SCID 免疫缺陷小鼠购自中国科学院上海实验动物中 心，鼠喂养按标准伺养 要求， 水、 垫草和伺料均经高温或紫外线灭菌。 在相对无菌条件下伺养一周， 无 异常后进行接种实验。

收集指数生长期的 Raji (ATCC CCL-86) 禾卩 1648 (ATCC CRL-1648)细胞悬 液于 50毫升离心管中， 4°C离心， 弃上清后， 用 1640液体培养基（加小牛血清） 重悬细胞， 使之达到 1.0 X 10 ⁷ /ml个细胞。 在鼠左腋处皮下注射 Raji细胞悬液 0.1ml, 在鼠右腋处皮下注射 1648细胞悬液 0.1ml 。

注射细胞后 3— 4日肿瘤即长到约 2 x 2 mm， 将荷瘤裸鼠随机分为： ( A 组） 抗肿瘤多肽空白保存液 (10mM PBS+0.2M NaCI 磷酸盐缓冲液 (pH7.4) )为对照组；

(B组） 新型抗肿瘤多肽 1(质粒为 pCHCEBll)治疗组， 300 μ _§ /鼠 (以 25克 重计算 )/日， 连续 20日；

每组 10只荷瘤鼠， 给药方式为腹腔注射， 每天注射 2次， 每次 0.5 ml ， 连 续给药 20天。。每天观察鼠活动情况，并作记录，隔� ��精确测量肿瘤大小并照相。

结果显示： （见图 7) B 组新型抗肿瘤多肽组的鼠肿瘤生长明显受到抑 制， 其中 7只鼠的瘤块消失，其余 3只的瘤块明显小于对照组。新型抗肿瘤多肽� �鼠 体内可以有效地抑制 EBV病毒阳性淋巴肉瘤细胞所致的实体瘤块生长 。 但对同 体鼠内接种的 EBV病毒阴性淋巴肉瘤细胞所致的实体瘤块却无 抑制作用。

实施例 7.体内实体肿瘤消除实验的病理观察.

瘤体病理组织学观察： 实施例 6实验到期后处死小鼠， 取出瘤体于 10%福 尔马林中固定， 石蜡切片， HE染色常规光镜观察。

镜下观察对照组鼠的实体肿瘤增殖旺盛； 新型抗肿瘤多肽组鼠的 EBV病毒 阳性实体肿瘤细胞显著减小，标本中縮小的肿 瘤细胞团中几乎均为坏死的肿瘤细 胞， 周边可见大量淋巴细胞浸润。 病理组织学结果提示在 20 日处理期限中， 新 型抗肿瘤多肽几乎杀灭了实体肿瘤中的所有肿 瘤细胞 （见图 8、 D)。