〔1:タンパク質複合体〕
 本発明は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)と 特定のポリペプチドとのタンパク質複合体を 提供する。本明細書中で使用される場合、用 語「複合体」は複数の物質があわさって一体 をなしているものが意図され、「複合体化」 は「一体化」と交換可能に使用される。なお 、複合体を形成する複数の物質は、近接して 相互作用していればよく、互いに結合してい ても結合していなくてもよい。好ましい実施 形態において、本発明に係るタンパク質複合 体は、GPCRと特定のポリペプチドとが近接し� �相互作用している状態であり、その結果、� �ガンド親和性が改変されたGPCRとして機能す� ��。

 本明細書において、特定のポリペプチドと� ��互作用してリガンド親和性が改変されるGPCR としてアドレナリン受容体(特に、α _1A サブタイプ)を例に挙げて本発明を説明する� �、本発明を構成するGPCRはアドレナリン受容� ��に限定されないことを、本明細書を読んだ� ��業者は容易に理解する。また、当業者であ� ��ば、本発明を構成するGPCRの配列情報を容易 に入手し得る。

 受容体として最も初期に同定されたアド� ��ナリン受容体(AR)は、生体において最も重要 な受容体の1つであり、自律神経系(交感神経� ��)の働きを司ることが知られている。アドレ ナリン受容体は、アドレナリン、ノルアドレ ナリンなどが結合することにより、様々な部 位において平滑筋の収縮および代謝の亢進を 引き起こし、血圧および脈拍の上昇、瞳孔の 散大、血中ブドウ糖の上昇といった生体反応 を惹起する。

 研究の進歩や様々な新しい薬物の開発に伴� ��、アドレナリン受容体は様々なタイプに分� ��されることが明らかになってきた。アドレ� ��リン受容体は、古くは、イソプロテレノー� ��、フェントラミンなどの薬物に対する反応� ��の違いからα受容体とβ受容体に分類され、 さらに、薬理学的なサブタイプ(α ₁ 受容体、α ₂ 受容体、β受容体)に分類された。各受容体は 、組織ごとに異なった分布を示し、異なった 働きをしていることが知られている。例えば 、α ₁ アドレナリン受容体は、血管平滑筋、前立腺 などの収縮において特に重要な働きをするこ とが知られており、脳など中枢神経系にも分 布して意識および情動の調節に関与している ことが知られている。

 ヒトゲノム解析が終わり、多くのタンパク� ��の構造および機能が遺伝子レベルで示され� ��ようになった。α ₁ アドレナリン受容体の遺伝子においてもα _1A 、α _1B 、α _1D の3つのサブタイプが同定された。これらの� �伝子によるサブタイプ分類は、薬理学的な� �ブタイプ分類とよく一致することが知られ� �いる。このように、基本的には1つの遺伝子� ��ら1種類のサブタイプ受容体タンパク質が生 成されると考えられている。

 しかし、α ₁ アドレナリン受容体において、薬理学的なサ ブタイプのいずれにも属さない受容体が存在 することが、以前より指摘されている。この 未知のα ₁ サブタイプは、代表的なα ₁ 遮断薬(例えば、prazosin)に対する親和性が低� �ため、α _1L サブタイプと呼ばれるが、その遺伝子は未だ クローニングされていない。

 α ₁ アドレナリン受容体の分類および薬物選択性 を表1に示す。

 なお、表1に示した各化合物の効果について の典拠を以下に示す。
1. Muramatsu, I. et al. Pharmacol. Commun., 6: 23 ( 1995)
2. Ford, AP. et al. Mol. Pharmacol., 49: 209 (1996)
3. Murata, S. et al. J. Urol., 164: 578 (2000)
4. Hiraizumi-Hiraoka, Y. et al. J. Pharmacol. Exp. T her., 310: 995 (2004)
5. Murata, S. et al. Br. J. Pharmacol., 127: 19 (1 999)。

 近年、薬理学的機能実験および薬理学的結� ��実験によって、種々の哺乳動物の下部尿路� ��(ヒト前立腺など)においてα _1L サブタイプの活性が検出されている。α _1L サブタイプの機能を明らかにすることは、α ₁ アドレナリン受容体を標的とした、哺乳動物 の下部尿路系に対する従来の治療をより発展 させるために重要である。しかしながら、こ のようなα _1L サブタイプ活性は、組織をホモジナイズして 行う従来の結合実験では検出されなかった。 ホモジナイズした組織からはα _1L サブタイプ活性が検出されないということは 、組織からのα _1L サブタイプの精製が非常に困難であることを 意味する。α _1L サブタイプの実体を明らかにしない限り、α _1L サブタイプの機能解析、特に受容体の活性を 調節する薬剤(アゴニスト、アンタゴニスト� �ど)を開発することは非常に困難である。

 本発明者らは、実体が不明なα _1L サブタイプが、α _1A サブタイプ分子に何らかの副次的な分子が結 合することによって構成されていると考えた 。すなわち、α _1L サブタイプを構成しているα _1A サブタイプ分子とその副次的な分子は、組織 をホモジナイズすることによって両者間の相 互作用が解かれ、その結果、α _1L サブタイプがα _1A サブタイプにその特性を変化させると考えた 。鋭意検討を行った結果、本発明者らは、特 定のタンパク質がα _1A サブタイプに結合すること、およびこのタン パク質をα _1A サブタイプとともに培養細胞に共発現させる とα _1L サブタイプの表現型が発現することを確認し た。すなわち、本発明者らは、α _1L サブタイプがタンパク質複合体からなること を見出し、この複合体を構成するタンパク質 を特定することにより、本発明を完成するに 至った。

 一実施形態において、本発明は、アドレナ� ��ン受容体のα _1L サブタイプを形成するタンパク質複合体を提 供する。すなわち、本実施形態に係るタンパ ク質複合体は、アドレナリン受容体のα _1L サブタイプである。本実施形態によれば、実 体が明らかになったα _1L サブタイプの関連するあらゆる疾患に対する 治療を提供することができる。

 本実施形態に係るタンパク質複合体を構� ��するポリペプチドは、CRELD(cysteine-rich with E GF-like domains)1αタンパク質としてすでに公知� ��あり、そのミスセンス変異が房室中隔欠損� ��関連することが示唆されている(Gene 293: 47- 57 (2002)、Am. J. Hum. Genet. 72: 1047-1052 (2003))� ��このポリペプチドの配列情報はNCBIアクセッ ション番号NM_015513として提供され、本明細書 において配列番号1(アミノ酸配列)および配列 番号2(塩基配列)として示される。すなわち、 本実施形態に係るタンパク質複合体を構成す るポリペプチドは、配列番号1に記載のアミ� �酸配列からなるポリペプチドであっても、� �列番号2に記載の塩基配列からなるポリヌク� ��オチドにコードされるポリペプチドであっ� ��もよい。

 なお、本実施形態に係るタンパク質複合� ��を構成するポリペプチドは、配列番号1に記 載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限 定されず、その活性を保持した変異体ポリペ プチドであってもよい。変異体ポリペプチド としては、例えば、配列番号1に記載のアミ� �酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が� ��失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列� ��らなり、かつGPCRと複合体化してそのGPCRの� �ガンド親和性を改変する活性を有するポリ� �プチドが挙げられる。

 当業者は、当該分野の技術常識を用いれ� ��、特定のポリペプチドのアミノ酸配列にお� ��て1もしくは数個のアミノ酸を欠失、置換も しくは付加した変異体ポリペプチドを容易に 作製し得る。また、当業者は、本明細書の記 載および技術常識に基づけば、その変異体ポ リペプチドが元のポリペプチドと同じ活性を 保持しているか否かを、容易に確認し得る。

 また、本実施形態に係るタンパク質複合� ��を構成するポリペプチドをコードするポリ� ��クレオチドは、配列番号2に記載の塩基配列 からなるポリヌクレオチドに限定されず、複 合体化したGPCRのリガンド親和性を改変する� �性を保持しているポリペプチドをコードす� �変異体ポリヌクレオチドであればよい。変� �体ポリヌクレオチドとしては、例えば、(1)� �列番号2に記載の塩基配列において1もしくは 数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された 塩基配列からなるポリヌクレオチド、(2)配列 番号2に記載の塩基配列の相補配列からなる� �リヌクレオチドとストリンジェントな条件� �でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド� �あるいは(3)配列番号2に記載の塩基配列から� ��るポリヌクレオチドと70%、好ましくは80%、� ��り好ましくは85%、またはそれ以上の配列同� ��性を有しているポリヌクレオチドが挙げら� ��るがこれらに限定されない。

 当業者は、当該分野の技術常識を用いれ� ��、特定のポリヌクレオチドの塩基配列にお� ��て1もしくは数個の塩基を欠失、置換もしく は付加した変異体ポリヌクレオチド、特定の ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件 下でハイブリダイズし得る変異体ポリヌクレ オチド、または特定のポリヌクレオチドと70% 以上の配列同一性を有している変異体ポリヌ クレオチドを容易に作製し得る。また、当業 者は、本明細書の記載および技術常識に基づ けば、その変異体ポリヌクレオチドがコード するポリペプチドが、元のポリヌクレオチド がコードするポリペプチドと同じ活性を保持 しているか否かを、容易に確認し得る。

 本明細書中で使用される場合、用語「ス� ��リンジェントなハイブリダイゼーション条� ��」は、ハイブリダイゼーション溶液(50%ホル ムアミド、5×SSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三� ��トリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5 ×デンハート液、10%硫酸デキストラン、およ� ��20μg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む)中にて4 2℃で一晩インキュベーションした後、約65℃ にて0.1×SSC中でフィルターを洗浄することが� ��図される。

 なお、具体的なハイブリダイゼーション� ��順は、当該分野において周知の方法(例えば 、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第3版,J.Sa mbrookおよびD.W.Russll編,Cold Spring Harbor Laborator y,NY(2001)」(本明細書中に参考として援用され� ��。)に記載されている方法)に従って行われ� �ばよい。

 このように、本発明に係るタンパク質複� ��体を構成するGPCRとしてアドレナリン受容体 を例に挙げて本発明を説明したが、本発明に 係るタンパク質複合体は、GPCRと、(1)配列番� �1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチ� ��;(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列におい� �1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もし� ��は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ� ��合体化したGタンパク質共役型受容体のリガ ンド親和性を改変する活性を有するポリペプ チド;(3)配列番号2に記載の塩基配列からなる� ��リヌクレオチドにコードされるポリペプチ� ��;(4)配列番号2に記載の塩基配列において1も� ��くは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加� ��れた塩基配列からなるポリヌクレオチドに� ��ードされるポリペプチドであり、かつ複合� ��化したGタンパク質共役型受容体のリガンド 親和性を改変する活性を有するポリペプチド ;(5)配列番号2に記載の塩基配列の相補配列か� ��なるポリヌクレオチドとストリンジェント� ��条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレ� ��チドにコードされるポリペプチドであり、� ��つ複合体化したGタンパク質共役型受容体の リガンド親和性を改変する活性を有するポリ ペプチド;あるいは(6)配列番号2に記載の塩基� ��列からなるポリヌクレオチドと70%以上の配� ��同一性を有しているポリヌクレオチドにコ� ��ドされるポリペプチドであり、かつ複合体� ��したGタンパク質共役型受容体のリガンド親 和性を改変する活性を有するポリペプチドと が、複合体化していればよいといえる。すな わち、本発明に係るタンパク質複合体を構成 するGPCRはアドレナリン受容体に限定されず� �ドーパミン受容体、ムスカリン受容体また� �エンドセリン受容体であってもよい。また� �当業者であれば、本発明を構成するGPCRの配� ��情報を公知のデータベースから容易に入手� ��得るので、当業者は、本明細書の記載およ� ��技術常識に基づいて、所望のタンパク質複� ��体を容易に作製し得る。

 〔2:タンパク質複合体を含有している脂質� �〕
 本発明はまた、GPCRと特定のポリペプチドと のタンパク質複合体の作製方法を提供する。 本発明に係るタンパク質複合体の作製方法は 、GPCRおよび特定のポリペプチドを脂質膜上� �共存させる工程を包含することを特徴とし� �いる。すなわち、本発明は、タンパク質複� �体を含有している脂質膜およびその作製方� �を提供する。

 本発明に係る脂質膜は、上述したタンパ� ��質複合体を含有していることを特徴として� ��る。本発明に係る脂質膜は、天然由来の脂� ��膜であっても、人工の脂質膜であってもよ� ��。脂質膜が天然由来である場合、脂質膜は� ��体膜であることが意図され、脂質膜が人工� ��ある場合は、脂質膜は脂質平面膜またはリ� ��ソームであることが意図される。

 1つの局面において、本発明に係る脂質膜 は、本発明に係るタンパク質複合体を構成す るポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ドが導入された形質転換体の生体膜であり得 る。このような形質転換体は、上記ポリペプ チドが生体膜状に発現され得るように、上記 ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを生物 中に導入することによって取得される。なお 、形質転換体に用いられる生物は、原核生物 であっても真核生物であってもよい。

 他の局面において、本発明に係る脂質膜� ��、本発明に係るタンパク質複合体を構成す� ��ポリペプチドを含有している脂質二重層で� ��り得る。脂質二重層は、極性脂質(特にリン 脂質)が二層となった膜状の構造である。脂� �二重層構造が二次元構造として安定化する� �は球状であるが、末端を水分子から隔離す� �ば平面構造になり得る。本明細書中で使用� �れる場合、人工的に作製される脂質二重層� �うち球状のものをリポソーム、平面状のも� �を脂質平面膜という。当該分野において、� �工的な脂質二重層は、膜タンパク質(例えば� ��チャネルタンパク質)の活性をin vitroで測定 する際に使用されている。このように、当業 者は、脂質平面膜を容易に作製し得、目的の タンパク質(ポリペプチド)を脂質平面膜に保� ��させ得る。また、リポソームは、ベジクル� ��も称される脂質人工膜であり、脂質(例えば 、リン脂質)の懸濁液を激しく攪拌して分散� �せた後に超音波処理を施すことにより作製� �れ得る。当該分野において、リポソームを� �いた研究は広く行われており、細胞膜モデ� �として利用されたり、薬物送達(DDS)の手段の 一つとして利用されたりしている。このよう に、当業者は、リポソームを容易に作製し得 、目的のタンパク質(ポリペプチド)をリポソ� ��ムに保持させ得る。

 一実施形態において、本発明は、アドレナ� ��ン受容体のα _1L サブタイプを含有している脂質膜を提供する 。上述したように、アドレナリン受容体のα _1L サブタイプは、アドレナリン受容体のα _1A サブタイプとCRELD1αタンパク質とのタンパク� ��複合体である。アドレナリン受容体のα _1A サブタイプおよびCRELD1αタンパク質はいずれ� ��膜結合型のタンパク質であり、上述したよ� ��に、ホモジナイズ(膜破壊)することによっ� �互いの相互作用が解かれてしまう。すなわ� �、両者を脂質膜上に配置しかつ保持するこ� �により、互いの相互作用が発現される。

 本実施形態に係る脂質膜が生体膜である場� ��、本実施形態に係る脂質膜の作製方法は、� ��ドレナリン受容体のα _1L サブタイプを発現する形質転換体を作製する 方法でもあり得、アドレナリン受容体のα _1A サブタイプとCRELD1αタンパク質とを共発現す� ��工程を包含すればよいといえる。アドレナ� ��ン受容体のα _1A サブタイプの配列情報はNCBIアクセッション� �号U03866またはNM_000680として提供され、本明� �書において配列番号3(アミノ酸配列)および� �列番号4(塩基配列)として示される。すなわ� �、本実施形態に係るタンパク質複合体の作� �方法は、配列番号2に記載の塩基配列からな� ��ポリヌクレオチドを含むベクターと配列番� ��4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチ ドを含むベクターとを用いて宿主を形質転換 する工程を包含すればよい。

 上記ベクターは、目的のポリヌクレオチ� ��を作動可能に連結した発現ベクターである� ��とが好ましい。本明細書中で使用される場� ��、用語「作動可能に連結」は、目的のペプ� ��ド(またはタンパク質)をコードするポリヌ� �レオチドが、プロモータなどの制御領域の� �御下にあって、このペプチド(またはタンパ� ��質)を宿主中で発現し得る形態にあることが 意図される。目的のペプチドをコードするポ リヌクレオチドを発現ベクターに「作動可能 に連結」して所望のベクターを構築する手順 は当該分野において周知である。また、発現 ベクターを宿主に導入する方法もまた、当該 分野において周知である。よって、当業者は 、容易に所望のペプチドを宿主内に生成させ ることができる。

 本明細書中で使用される場合、用語「形� ��転換体」は、細胞、組織または器官だけで� ��く、生物個体もまた意図される。形質転換� ��対象となる生物としても、特に限定されな� ��が、各種微生物、植物および動物が挙げら� ��る。なお、本発明に係る形質転換体は、少� ��くとも、本発明に係るタンパク質複合体を� ��成するポリペプチドをコードするポリヌク� ��オチドが導入されており、これらのポリペ� ��チドを発現していればよいといえる。すな� ��ち、発現ベクター以外の手段によって生成� ��れた形質転換体も、本発明の技術的範囲に� ��まれる点に留意すべきである。また、本発� ��に係る形質転換体は、本発明に係るタンパ� ��質複合体を構成するポリペプチドが安定的� ��発現していることが好ましいが、目的のポ� ��ペプチドが一過性に発現するものであって� ��よい。なお、本実施形態に係るタンパク質� ��合体を共存させた形質転換体を用いれば、� ��主細胞内のセカンドメッセンジャーの動態� ��観察することによりこの複合体の作働薬ま� ��は拮抗薬をスクリーニングすることができ� ��。

 本実施形態に係る脂質膜が人工の脂質膜で� ��る場合、本実施形態に係る脂質膜の作製方� ��は、アドレナリン受容体のα _1L サブタイプを含有している脂質平面膜または リポソームを作製する方法でもあり得、より 詳細には、アドレナリン受容体のα _1A サブタイプとCRELD1αタンパク質とを人工の脂� ��膜上に再構成する工程を包含すればよいと� ��える。当業者は、当該分野の技術常識に従� ��ば、膜タンパク質を人工の脂質膜上に容易� ��再構成することができる。本実施形態に係� ��タンパク質複合体を共存させた人工の脂質� ��を用いれば、この複合体のリガンド親和性� ��測定することができる。

 〔3:脂質膜の利用〕
 上述した脂質膜の作製方法が、タンパク質� ��合体の作製方法であり得、GPCRのリガンド親 和性を改変する方法でもあり得ることを、当 業者は容易に理解する。すなわち、本発明は 、GPCRのリガンド親和性を改変する方法を提� �する。

 また、本発明に係る脂質膜を用いれば、� ��ガンド親和性が改変されたGPCRの作働薬また は拮抗薬をスクリーニングすることができる 。すなわち、本発明は、リガンド親和性が改 変されたGPCRの作働薬または拮抗薬をスクリ� �ニングする方法を提供する。

 本発明に係るスクリーニング方法は、上� ��したタンパク質複合体を脂質膜上に生成す� ��工程、およびこのタンパク質複合体を候補� ��子とともにインキュベートする工程を包含� ��ることを特徴としている。なお、本明細書� ��で使用される場合、「インキュベートする� ��は複数の物質を共存させかつ互いに十分接� ��し得る状態に置くことが意図される。

 好ましい実施形態において、本発明に係る� ��クリーニング方法は、目的のGPCRを含有して いる形質転換体(例えば、アドレナリン受容� �のα _1L サブタイプを発現させた細胞)を候補因子と� �もにインキュベートする工程を包含する。� �実施形態に係るスクリーニング方法では、� �胞におけるセカンドメッセンジャーの変動(� ��えば、Gタンパク質がGsまたはGiの場合はcAMP� ��、Gqの場合はイノシトール3リン酸およびCa ²⁺ 濃度)を測定することにより、目的のGPCR(例え ば、アドレナリン受容体のα _1L サブタイプ)の作働薬または拮抗薬をスクリ� �ニングすることができる。

 アドレナリン受容体のα _1L サブタイプの作働薬は、失禁治療薬、散瞳薬 、緑内障治療薬、中枢刺激薬として利用可能 であり、アドレナリン受容体のα _1L サブタイプの拮抗薬は、排尿障害治療薬、レ イノー病治療薬、微小循環障害治療薬、降圧 薬、中枢抑制薬、腎血流改善薬、利尿薬とし て利用可能である。また、アドレナリン受容 体のβ _1L サブタイプは心臓病に関連し、ドーパミンD2� ��容体やムスカリン受容体は中枢神経疾患に� ��連することが知られているので、これらの� ��働薬または拮抗薬もまた有用である。

 〔4:ノックダウン細胞およびその利用〕
 本発明はまた、GPCRとタンパク質複合体を形 成するポリペプチドをノックダウンした形質 転換体およびその作製方法を提供する。本発 明に係る形質転換体の作製方法は、内因性の ポリペプチドの発現を阻害する工程を包含す ることを特徴としている。

 例えば、GPCRと複合体化してタンパク質複 合体を形成するポリペプチドの1つであるCRELD 1αタンパク質は種々の細胞に発現している。 よって、内因性のCRELD1αタンパク質の発現を� ��害した形質転換体は、上記タンパク質複合� ��の機能を解析したり標的化合物(例えば、作 働薬または拮抗薬)をスクリーニングしたり� �る際に用いるコントロール細胞として非常� �有用である。本項で述べるノックダウン細� �は単独で利用されてもよいが、上述のタン� �ク質複合体またはタンパク質複合体含有脂� �膜とともに利用されることが好ましい。な� �、対象の細胞に発現しているGタンパク質共� ��型受容体は、内因性であっても外因性であ� ��てもよい。

 1つの局面において、本発明は、Gタンパク� �共役型受容体が発現している細胞において� �因性のCRELD1αタンパク質の発現を阻害する工 程を包含し得る。これにより、細胞に発現し ていたGタンパク質共役型受容体のリガンド� �和性を改変することができる。すなわち、� �発明に係る形質転換体の作製方法は、リガ� �ド親和性が改変されたGタンパク質共役型受� ��体を発現している形質転換体の作製方法で� ��り得、Gタンパク質共役型受容体のリガンド 親和性を改変する方法でもあり得る。一実施 形態において、本発明は、アドレナリン受容 体のα _1L サブタイプを発現している細胞における内因 性のCRELD1αタンパク質の発現を阻害する工程� ��包含し得る。これにより、α _1L サブタイプの表現型を示す細胞をα _1A サブタイプの表現型を示す細胞に改変し得る 。

 内因性のCRELD1αタンパク質の発現を阻害� �る手法としては、RNAi法を用いることが好ま� ��い。RNAi法は当該分野において周知の技術で あり、例えば、配列番号5に示される塩基配� �からなるオリゴヌクレオチドを目的の細胞� �導入することによって内因性のCRELD1αタンパ ク質の発現を首尾よく阻害することができる 。なお、配列番号5に示される塩基配列から� �るオリゴヌクレオチドを目的の細胞に導入� �るためのベクターを用いる場合は、配列番� �6に示される塩基配列からなるオリゴヌクレ� ��チドをアンチセンスに用いることが好まし� ��が、これに限定されない。

 本発明はさらに、上述した形質転換体を� ��いることを特徴とする、リガンド親和性が� ��変されたGタンパク質共役型受容体の作働薬 または拮抗薬をスクリーニングする方法を提 供する。

 本発明は上述した各実施形態に限定され� ��ものではなく、請求項に示した範囲で種々� ��変更が可能であり、異なる実施形態にそれ� ��れ開示された技術的手段を適宜組み合わせ� ��得られる実施形態についても本発明の技術� ��範囲に含まれる。

 また、本明細書中に記載された学術文献� ��よび特許文献の全てが、本明細書中におい� ��参考として援用される。