本发明属于医药技术领域， 涉及一种蟾毒灵脂质体及其制备方法和应用。 背景技术

癌症是全球发病率最高的疾病之一。 WHO数据显示， 仅 2008年癌症病 死人数就高达 7.6亿， 其中 60%来自低收入或中等收入国家， 且该数字在未 来将继续增加。 在超过 200种癌症中， 乳腺癌、 肺癌、 肠癌及胰腺癌患者数 占所有新增病例的 54%。 目前， 癌症的治疗方法根据癌症的类型及阶段， 主 要包括手术、 放疗、 化疗及以上方法联合运用等。 其中， 临床化疗药物种类 较多， 作用机制主要为针对肿瘤细胞快速分裂的特性 杀死细胞。 因此药物在 杀死快速分裂的癌细胞时， 也能杀死其它正常的快速分裂的细胞， 如骨髓、 消化道及毛囊中的细胞， 产生了严重的副作用， 损伤了正常组织。 据此， 亟 需研发毒副作用小、 抗肿瘤疗效高的新型治疗药物。 提高药物对肿瘤的选择 性， 减少其在正常组织的分布是抗肿瘤新药研发的 主要策略。

蟾毒灵（3β,14-二羟 -5β,20(22)-蟾蜍二烯羟基内酯， 5β,20(22)-蟾蜍二烯羟 基内酯 -3β, 14-二醇）是中药蟾酥的主要抗肿瘤成分， 是中华大蟾蜍或黑框蟾 蜍的耳后腺分泌的白色浆液，可从蟾酥中提取 。还可根据专利 US 3134772 和 US 3687944进行人工合成。 蟾毒灵是一种类地高辛的免疫活性成分， 显示出 各种生物活性， 如强心、 麻醉和刺激血管等。 自 1994年蟾毒灵抗肿瘤作用发 现至今 ( Numazawa S, et al. J Cell Physiol, 1994,160(1): 113-20 ) , 已进行了大 量研究， 发现其具有广谱抗肿瘤作用。 此外， 蟾毒灵与其他化疗药物联用， 如索拉菲尼等， 对肿瘤细胞显示出化疗增敏作用 （ Gao Y, et al. Mol Biol Rep. 2012, 39(2): 1683-9 ) 。 近年来， 更多的研究发现蟾毒灵可诱导细胞凋亡从而 抑制多种癌细胞的增殖， 如肝癌、 骨瘤、 结肠癌、 肺癌、 胰腺癌、 卵巢癌、 胃癌、 前列腺癌及白血病细胞等 （Han KQ, et al. World J Gastroenterol. 2007,13(24):3374-9; Amano Y, et al. J Steroid Biochem Mol Biol. 2009,114(3-5): 144-51; Li D, et al. Anticancer Drugs. 2009,20(l):59-64; Yu CH, et al. Cancer Sci. 2008,99(12):2467-76; Takai N, et al. Int J Mol Med. 2008,21(5):637-43; Yeh JY, et al. Prostate. 2003,54(2): 112-24; Yin JQ, et al. Acta Pharmacol Sin. 2007,28(5):712-20; Zhu Z et al. Int. J. Mol. Sci. Int J Mol Sci. 2012, 13(2) :2025-35; Xie CM, et al. Free Radic Biol Med. 2011,51(7): 1365-75 ) 。 蟾毒灵可通过激活细胞死亡受体及线粒体通路 触发癌细胞凋亡 （Sun L, et al. Evid Based Complement Alternat Med. Epub 2011 Jim 18 )。 这些研究提示蟾毒 灵可作为化疗药物用于癌症的治疗。 然而， 蟾毒灵由于毒性大、 水溶性差、 半衰期短、 治疗窗窄， 毒性剂量与治疗剂量接近等问题， 严重制约了其临床 应用 ( Gong LL et al. Food and Drug. 2007,9(10):51-3 ) 。 此外， 由于其在体内 的广泛分布， 更引起了其它临床副作用， 如血管刺激性、 过敏性休克、 高热、 窦性心动过缓等 ( Dasgupta A, et al. Life Sci. 1998,63(9):781-8; Bick RJ, et al. Life Sci. 2002,72(6) :699-709; Kostakis C, Byard RW. Forensic Sci Int. 2009,188:el-e5 ) 。

目前， 将蟾酥溶于生理盐水制得的华蟾素注射液已在 中国用于临床癌症 的治疗。已有报道吉西他滨 奥沙利铂与华蟾素合用可增强晚期胆囊癌病人 的 化疗作用 ( Qin TJ, et al. World J Gastroenterol. 2008,14(33):5210-6 ) 。 另有研 究显示， 对肝癌及胰腺癌病人使用 8倍于标准剂量 （20 ml/m ² /或 20〜25 ml/ 人 /天，含蟾毒灵 14.3±0.03 ng/ml )的华蟾素注射液未产生明显毒性（Meng Z. et al. Cancer. 2009,115(22):5309-18 ) , 这意味着成年病人每天耐受的蟾毒灵有 效治疗剂量可高达 2.3 μ _§ 。 但是， 华蟾素注射液是蟾酥中生物碱的混合物溶 液， 并且因为蟾毒灵水溶性较差， 含有的蟾毒灵含量很低。

因此， 研发延长蟾毒灵在肿瘤病灶内持续时间、 提高肿瘤靶向性、 减少 毒副作用的新剂型十分必要。脂质体是一种内 水相的封闭的磷脂双分子结构， 我们使用脂质体作为蟾毒灵的药物载体， 可通过磷脂膜装载蟾毒灵解决其水 溶性差的问题。此外，用 PEG修饰的脂质体可将蟾毒灵被动靶向至肿瘤部 位， 减小其毒副作用。

近 20年来， 脂质体已经被广泛用于包载抗肿瘤药物。 已有多种用于临床 或即将用于临床的抗肿瘤脂质体药物， 如阿霉素脂质体（ Doxil/Caelyx 分别 由 Alza/Johnson and Johnson在美国或 Schering-Plough在其他国家销售）、 柔 红霉素脂质体（DaunoXome, Gilead ) 、 阿糖胞苷脂质体（ DepoCyte, Skye Pharma/Enzon/Mundipharma出品 )、顺钼脂质体 ( Lipoplatin, Regulon出品 ) , 其中阿糖胞苷脂质体可用于治疗脑膜淋巴瘤。 脂质体可通过磷脂膜结构提高 水溶性差的抗癌药物的溶解度， 通过 PEG修饰实现肿瘤的被动靶向及通过结 合载体实现肿瘤的主动靶向。

传统的脂质体， 是通过磷脂分散在水相中形成的， 因此两亲性及脂溶性 药物可插入脂质体的磷脂膜结构中， 而亲水性药物则是直接包入脂质体的内 部水相。 脂质体载体对所包含药物的药代动力学、 组织分布及毒副作用都产 生较大的影响。 如， 临床实验证明在保持抗肿瘤活性的同时使用阿 霉素脂质 体比阿霉素单体的毒性作用明显减小 （ Safra T. Oncologist. 2003,8 Suppl 2: 17-24 ) 。

但由于脂质体可被巨噬细胞快速捕获， 给药后其在体内的停留时间只有 几小时。 为了提高脂质体在体内循环的半衰期， 可将糖脂或亲水性聚合物如 PEG应用于脂质体。 将生物相容性的聚合物 PEG结合在脂质体上， 使其具有 保护性的亲水的表面， 被称为 "二代脂质体 "或"隐形脂质体"。 PEG在脂质体 表面形成了位阻效应， 可阻碍调理素及血浆蛋白的吸附， 减少巨噬细胞受体 与磷脂膜上磷酸基团的结合， 从而延迟其在血液循环中的保留时间。

此外， 通过化学修饰磷脂基团或者结合蛋白、 多肽或其他大分子在脂质 体表面， 可改变脂质体的药代动力学属性。 PEG脂质体结合载体如小分子、 肽类或单克隆抗体已广泛的用于肿瘤治疗， 如结合叶酸的柔红霉素和阿霉素 脂质体（ p _an XQ, Lee RJ. Anticancer Res. 2005,25(1Α):343-6; Shmeeda H, et al. Mol Cancer Ther. 2006,5(4):818-24 ) 层粘性蛋白脂质体 ( Zalipsky S, et al. Bioconjug Chem. 1995,6(6):705-8 ) 或结合了 OV-TL3 单克隆抗体的脂质体 ( Vingerhoeds MH, et al. Br J Cancer. 1996,74(7): 1023-9 ) 。

目前尚未见任何关于蟾毒灵脂质体的报道。 有鉴于此， 特提出本发明。 发明内容

本发明的第一目的在于提供一种蟾毒灵脂质体 ， 从而进一步提高蟾毒灵 制剂的疗效， 推广蟾毒灵在肿瘤防治中的应用。

为实现第一目的， 本发明釆用如下技术方案：

一种蟾毒灵脂质体， 由脂质体双分子层和蟾毒灵组成， 所述脂质体双分

本发明的蟾毒灵脂质体双分子层优选同时包含 磷脂、甾醇和 PEG修饰物。 其中磷脂的含量占脂质体双分子层总重量的 20〜80 %, 优选 40-60%。 可选用 的磷脂为卵磷脂、磷脂酰胆碱（ PC )、磷脂酰乙醇胺（ PE )、磷脂酰甘油（ PG )、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝氨酸、 鞘磷脂 （SM ) 、 二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC)、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 (DPPE)、 二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC) 或上述一种或 多种的混合物。

本发明所述甾醇的含量占脂质体双分子层总重 量的 10〜30% , 优选 15-20%。 可选用的甾醇为胆固醇、 表胆甾醇、 麦角固醇或豆甾醇， 优选所用 的甾醇为胆固醇。

本发明所述 PEG修饰物的含量占脂质体双分子层总重量的 2〜50%,优选 20-40%, 可选用的 PEG修饰物为 PEG-PE、 甲氧基聚乙二醇（ mPEG)-PE、 胆 固醇的 PEG修饰物、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)-PEG或上述一种或多种 的混合物。

本发明的蟾毒灵脂质体脂质双分子层和蟾毒灵 的重量比为（5 ~ 20 ) ： 1 , 优选 ( 8〜12 ) ： 1。

本发明的第二目的在于提供上述蟾毒灵脂质体 的制备方法。

本发明的蟾毒灵脂质体可釆用常规方法来制备 得到， 但考虑到制备工艺 对制剂本身的影响， 本发明优选釆用薄膜法、 注入法、 薄膜法加冻融法、 注 入法加冻融法中任一种方法制备。

本发明所述薄膜法制备包括下述步骤： 将蟾毒灵和脂质体双分子层材料 (即磷脂、 甾醇和 PEG修饰物）分别或同时溶解于非极性或弱极性 溶剂中， 混合均匀， 用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂以在瓶壁形成 均匀薄膜， 再加入 蒸馏水或缓冲溶液对薄膜进行水化， 后经匀质、 搅拌、 涡旋和 /或超声， 得到 蟾毒灵脂质体。 其中匀质、 搅拌、 涡旋和超声即可同时进行， 也可仅选择其中的部分操 作。上述操作中，所述的旋转蒸发温度为 20〜60 °C。所述的水化时间为 15〜240 min, 水化温度为 20〜65 °C。 所述的超声时间为 5〜60min; 优选所述的旋转蒸 发温度为 30 -40°C。 所述的水化时间为 60-90 min, 水化温度为 35-50 °C。 所 述的超声时间为 20-40min。

本发明所述的蟾毒灵与有机溶剂的质量体积比 为 0.1〜lmg/ml, 所述的非 极性或弱极性溶剂为甲醇、 乙醇、 氯仿、 乙酸乙酯、 正己烷、 乙腈或上述一 种或多种混合液。 优选为氯仿和 /或甲醇。 所述缓冲溶液的 pH值为 6.4-7.4。

本发明所述注入法包括下述步骤： 将脂质体双分子层材料（磷脂、 甾醇 和 PEG修饰物）和蟾毒灵溶于有机溶剂中， 溶解完全后用注射器将其注入至 蒸馏水或缓冲溶液， 20〜60 °C搅拌 0.5〜4h将有机溶剂除尽， 得到蟾毒灵脂质 其中， 将有机溶剂除尽后也可以进一步匀质、搅拌、 涡旋和 /或超声处理, 以提高包封率。

具体地， 依据溶剂的种类又主要包括乙醇注入法和乙醚 注入法。

乙醇注入法包括下述步骤： 将脂质体双分子层材料（磷脂、 甾醇和 PEG 修饰物） 和蟾毒灵溶于乙醇中， 溶解完全后用注射器将其注入至蒸馏水或缓 冲溶液， 搅拌将乙醇除尽， 可选进一步匀质、 搅拌、 涡旋或超声， 得到脂质 乙醚注入法包括下述步骤： 将脂质体双分子层材料（磷脂、 甾醇和 PEG 修饰物） 和蟾毒灵溶于乙醚或乙醚、 甲醇混合物中， 溶解完全后用注射器注 入蒸馏水或缓冲溶液， 搅拌将乙醚除尽， 可选进一步匀质、 搅拌、 涡旋或超 声， 得到脂质体。

上缓冲溶液为生理盐水、 磷酸盐缓冲液 （PBS ) 、 三氨基甲烷盐酸盐 ( Tris-HCl ) 溶液、 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)溶液或甘露醇溶液。

为了进一步增加包封率， 本发明还可以釆用薄膜法加冻融法和注入法加 冻融法来制备蟾毒灵脂质体。

本发明所述的薄膜法加冻融法和注入法加冻融 法包括下述步骤： 将以所 述薄膜法或注入法制备得到的蟾毒灵脂质体， 在 0 ~ -80°C冰箱或液氮中冷冻 2〜24 h, 置室温溶解， 再放入 0 ~ -80°C冰箱或液氮中冷冻， 置室温溶解， 重 复 2 ~ 8次， 得到冻融后的蟾毒灵脂质体。 优选将以所述薄膜法或注入法制备 得到的蟾毒灵脂质体， 在 -20〜- 40°C冰箱或液氮中冷冻 5-10 h, 置室温溶解， 再放入 -20〜- 40 °C冰箱或液氮中冷冻， 置室温溶解， 重复 4-6次。

上述方法中， 水相可以是蒸馏水或缓冲液溶液， 如生理盐水、 PBS、 Tris-HCl溶液、 HEPES溶液或甘露醇溶液等。 缓冲液 pH 为 5.0-9.5之间。

本发明所述脂质体制备完后可通过挤压过膜控 制其粒径分布。 可通过 5μιη、 Ιμιη, lOO nm, 200 nm或其它所需孔径的膜得到相应粒径的脂质体� �� 具 体的操作为本领域技术人员所掌握。

本发明的第三目的在于提供含有上述蟾毒灵脂 质体的药物组合物。

本发明的蟾毒灵脂质体可制备癌症治疗药物。 如， 制成片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 丸剂、 糖浆剂、 水剂或混悬剂用于口服给药。

本发明所述的片剂由蟾毒灵脂质体、 稀释剂、 粘合剂、 润滑剂组成。 所 述粘合剂选自糊精、 PVP胶浆、 明胶浆中的一种或多种。 所述稀释剂选自微 晶纤维素、 淀粉、 乳糖中的一种或多种。 所述润滑剂选自滑石粉、 硬脂酸镁 中的一种。

上述片剂中， 优选各原料的重量比为： 蟾毒灵脂质体： 淀粉： 乳糖： 糊 精： 硬脂酸镁为 0.1〜10： 0.5〜50： 0.4-40: 0.1-20: 0.1-2, 其中， 蟾毒灵脂 质体的重量以蟾毒灵原料计。

本发明所述片剂可以釆用现有技术的制备方法 得到， 但更理想地， 釆用 如下方法制备而成： 取蟾毒灵脂质体溶于适量水中， 冷冻干燥， 后加入淀粉, 乳糖， 混合均匀， 再加入糊精水溶液制软材， 筛滤制粒， 置 50°C条件下干燥, 再整粒加入硬脂酸镁， 混合均匀， 压片， 即得。 此处的 "适量" 为本领域技 术人员可以理解，本发明以 g/ml计，优选釆用蟾毒灵的重量 2-10倍体积的水。 如以 5g蟾毒灵作为原料制备蟾毒灵脂质体， 制剂过程中将其溶于 50ml水。 此外， 具体的冷冻干燥、 压片等为本领域技术人员所掌握， 本发明对此不作 特别限定。 作为本发明的另一种实施方式， 所述组合物还可以为冻干粉针剂， 所述 冻干粉针剂由蟾毒灵脂质体、 分散剂和冻干辅料组成。 所述分散剂选自伯罗 沙姆、 吐温 -80、 司盘 -65 中的一种， 优选伯罗沙姆。 所述冻干辅料选自甘露 醇、 注射用乳糖、 注射用葡萄糖、 右旋糖酐、 蔗糖中的一种或多种， 优选蔗 糖。

本发明所述冻干粉针剂中， 优选各原料的重量比为： 蟾毒灵脂质体： 伯 罗沙姆： 蔗糖为 0.1〜20： 0.4〜40： 0.1〜40, 其中， 蟾毒灵脂质体的重量是以蟾 毒灵原料计。

上述冻干粉针剂可优选但并不局限于釆用如下 方法制备而成： 取蟾毒灵 脂质体， 溶于适量水中， 加入分散剂和冻干辅料， 溶解完全后， 用微孔滤膜 过滤， 分装， 充氮， 灌封即得。 所述的分散剂和冻干辅料优选为伯罗沙姆、 蔗糖。

对于非肠道给药或静脉注射、 腹腔注射、 肌肉注射或皮下注射给药， 生 理盐水可作为药学上可接受的溶媒。 其他溶媒包括蒸馏水、 缓冲液、 0.3%甘 氨酸溶液等。 该制剂可通过紫外照射或过膜等常规方法灭菌 后， 冻干保存。 为了达到生理环境要求， 还需加入药学上可接受的 pH调节剂及压力调节剂， 如氯化钠、 醋酸钠或钾盐等。

为了提高脂质体稳定性，还可参考专利 US5605703和 EP1325739加入磷 脂氧化抑制剂， 包括维生素或其衍生物、 丁基羟基甲苯（BHT ) , chroman, ferrioxamine等上述一种或多种的混合物。

为了提高口服生物利用度， 还可加入多糖高分子包括壳聚糖、 淀粉、 葡 聚糖、 普鲁兰多糖、 果胶或上述一种或多种的混合物。

此外， 本发明进一步要求保护上述的蟾毒灵脂质体在 制备治疗癌症药物 中的应用。

蟾毒灵是一种有效的抗癌药物， 但其毒性较大限制了应用。 发明人首次 发现蟾毒灵脂质体能增强抗癌作用的同时减少 毒性。 经静脉注射、 腹腔注射、 肌肉注射、 皮下注射或口服的方式作用于哺乳动物， 蟾毒灵脂质体较蟾毒灵 单体抗癌作用增强， 毒副作用减少。 本发明所述的蟾毒灵脂质体可被用来治疗癌症 ， 如肝癌、 肺癌、 卵巢癌、 前列腺癌、 结肠癌、 胰腺癌、 胃癌或白血病。

药物的剂量需依据疾病的诊断情况及临床医师 的判断给药， 一般为

0.01〜50mg/kg, 最好在 0.1〜5mg/kg。

釆用上述技术方案， 本发明得到了一种蟾毒灵脂质体、 其制备方法、 组 合物及应用。 所述蟾毒灵脂质体具有良好的稳定性， 较蟾毒灵单体或其他制 剂能够显著提高其在防治癌症中的疗效。 此外， 本发明所述制备方法简单， 生产成本低， 有利于推广应用。 具体实施方式

以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。

实施例 1 薄膜法

5mg蟾毒灵溶于 5ml乙醇中， 40mg磷脂， 15mg胆固醇， 5mgDSPE-PEG 溶于氯仿中， 将有机溶液混合于圆底烧瓶中， 30°C减压旋转蒸发除去残留有 机溶剂以在瓶壁形成均匀薄膜。 向该均匀薄膜中再加入 5ml PBS ( 5 mM, pH 6.4-7.4 ) , 50°C水化 lh后超声 0.5h, 即得。

制得的脂质体在 1L水中透析 24h, 取少量脂质体加甲醇破乳， 用 HPLC 法测量包封率。 该蟾毒灵脂质体包封率为 58.7%。 （包封率即磷脂中包入的 药量占加入总药量的比例）

实施例 2 薄膜法

与实施例 1相比， 区别点仅在于本实施例用生理盐水代替 PBS, 该蟾毒 灵脂质体包封率为 57.3%。

实施例 3 薄膜法

与实施例 1相比，区别点仅在于本实施例用 6% 甘露醇水溶液代替 PBS, 该蟾毒灵脂质体包封率为 38.4%。

实施例 4 薄膜法

与实施例 1相比， 区别点仅在于本实施例加入 PBS ( 5 mM, pH 6.4-7.4 ) 的体积为 40ml, 60°C水化 3h, 该蟾毒灵脂质体包封率为 49.3%。

实施例 5 薄膜法 4mg蟾毒灵、 5mg胆固醇、 40mg大豆磷脂及 5mg mPEG-PE溶解在 10ml 氯仿： 甲醇（2 : 1 )中，将溶液减压旋转蒸发除去残留有机溶剂� �加入 lml PBS ( 5 mM, pH 6.4〜7.4 ) , 剧烈涡旋， 冰浴中超声 20min即得。 该蟾毒灵脂质体 包封率为 52.5%。

实施例 6 薄膜法

与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例大豆磷脂用量为 10mg, 该蟾毒 灵脂质体包封率为 38.64%。

实施例 7 薄膜法

与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例磷脂为蛋黄卵磷脂， 该蟾毒灵 脂质体包封率为 51.45%。

实施例 8 薄膜法

与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例用胆固醇琥珀酸单酯盐 的 PEG 修饰物 （CHEMS-PEG )代替 mPEG-PE, 该蟾毒灵脂质体包封率为 54.08%。

实施例 9 薄膜法

与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例中脂质体双分子层和蟾 毒灵的 重量比为 8 : 1 , 具体为 6.25mg蟾毒灵、 5mg胆固醇、 40mg大豆磷脂及 5mg mPEG-PE, 该蟾毒灵脂质体包封率为 65.47%。

实施例 10 薄膜法

与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例中脂质体双分子层和蟾 毒灵的 重量比为 12 : 1 , 具体为 4.17mg蟾毒灵、 5mg胆固醇、 40mg大豆磷脂及 5mg mPEG-PE, 该蟾毒灵脂质体包封率为 53.86%。

实施例 11 薄膜法

与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例中脂质体双分子层和蟾 毒灵的 重量比为 5 : 1 , 具体为 10mg蟾毒灵、 5mg胆固醇、 40mg大豆磷脂及 5mg mPEG-PE, 该蟾毒灵脂质体包封率为 34.39%。

实施例 12 薄膜法

与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例中脂质体双分子层和蟾 毒灵的 重量比为 20 : 1 , 具体为 2.5mg蟾毒灵、 5mg胆固醇、 40mg大豆磷脂及 5mg mPEG-PE, 该蟾毒灵脂质体包封率为 30.54%。

实施例 13 注入法

将 4mg蟾毒灵、 6mg胆固醇、 30mg磷脂及 4mg mPEG-PE溶解在 10ml 乙醇中， 超声 20min至溶解完全。 溶液用注射器注入 20ml PBS (5 mM, pH 6.4〜7.4)中， 50 °C搅拌 3h, 除去乙醇， 即得。该蟾毒灵脂质体包封率为 83.3%。

实施例 14 注入法

4mg蟾毒灵、 15mg胆固醇、 40mg磷脂及 5mg mPEG-PE溶解在 10ml乙 醚中，超声 20min溶解完全。溶液用注射器注入 20ml 6%甘露醇溶液中， 50 °C 搅拌 3h, 除去乙醚， 即得。 该蟾毒灵脂质体包封率为 56.8%。

实施例 15 薄膜法 +冻融法

4mg蟾毒灵、 6mg胆固醇、 30mg磷脂及 4mg mPEG-PE溶解在 10ml氯 仿： 甲醇（2 : 1 )中，将溶液减压旋转蒸发除去残留有机溶剂� �加入 lml PBS(5 mM, pH 6.4-7.4) , 剧烈涡旋， 冰浴中超声 20min。 -20°C冰箱冷冻 5 h, 放置 室温溶解，再放入冰箱冷冻，重复 4次，即得。该蟾毒灵脂质体包封率为 61.8%。

实施例 16 注入法 +冻融法

4mg蟾毒灵、 15mg胆固醇、 40mg磷脂及 5mg mPEG-PE溶解在 10ml乙 醚中，超声 20min溶解完全。溶液用注射器注入 20ml 6%甘露醇溶液中， 50 °C 搅拌 3h, 除去乙醚。 -80°C冰箱冷冻 4 h, 放置室温溶解， 再放入冰箱冷冻， 重复 2次， 即得。 该蟾毒灵脂质体包封率为 56.8%。

实施例 17

与实施例 16 相比， 区别点仅在于： 本实施例中脂质体处方为： 蟾毒灵 4mg、 豆甾醇 6mg、 卵磷脂 30mg, mPEG-PE5mg。 该蟾毒灵脂质体包封率 为 45.2%。

实施例 18粉针剂

取 5g蟾毒灵， 按实施例 1所述的方法制备脂质体， 定容于 1000ml水中， 加入 20g伯罗沙姆， 100g蔗糖， 溶解完全后， 过 0.22μηι微孔滤膜， 分装成 500瓶， 每瓶 2ml, 冷冻干燥， 充氮， 灌封即得。

实施例 19 与实施例 18相比， 区别点仅在于本实施例中， 各原料的用量为： 蟾毒灵 脂质体：伯罗沙姆：蔗糖为 1： 4 : 50。

实施例 20

与实施例 18相比， 区别点仅在于本实施例中， 各原料的用量为： 蟾毒灵 脂质体：伯罗沙姆：蔗糖为 2 : 4 : 4。

实施例 21

与实施例 18相比， 区别点仅在于本实施例中， 各原料的用量为： 蟾毒灵 脂质体： 司盘 -65 : 甘露醇为 1 : 2 : 40。

实施例 21

与实施例 18相比， 区别点仅在于本实施例中， 各原料的用量为： 蟾毒灵 脂质体： 吐温 -80： 甘露醇为 2 : 3 : 4。

实施例 22 注射剂

取 5g蟾毒灵， 按实施例 1所述的方法制备脂质体， 定容于 10000ml生理 盐水中， 过 0.22μηι微孔滤膜， 分装成 100瓶， 每瓶 100 ml, 充氮， 灌封即得。

实施例 23颗粒剂

取 5g蟾毒灵， 按实施例 1所述的方法制备脂质体， 定容于 50ml水中， 冷冻干燥， 加入 50g淀粉， 35g糖粉， 混合均匀， 后加入混合均匀的乙醇、 糊精、 水（40 : 2 : 60 )粘合（含 5g糊精）， 制软材， 过 16目筛， 50°C烘干， 整粒， 分装成 100袋， 即得。

实施例 24 片剂

取 5g蟾毒灵， 按实施例 1所述的方法制备脂质体， 定容于 50ml水中， 冷冻干燥， 加入 40g淀粉， 10 g 乳糖， 混合均匀， 后加入 2%糊精的水溶液 共 150ml制软材， 20目筛制粒， 50°C干燥， 20目筛整粒， 加入 0.2g硬脂酸 镁， 混合均匀， 压成 100片， 即得。

实施例 25

与实施例 24相比， 区别点仅在于， 本实施例处方为： 蟾毒灵脂质体： 淀 粉： 乳糖： 糊精：硬脂酸镁为 0.5： 20： 0.4： 6： 2。

实施例 26 与实施例 24相比， 区别点仅在于， 本实施例处方为： 蟾毒灵脂质体： 淀 粉： 乳糖： 糊精：硬脂酸镁为 10： 50： 40： 20： 2。

实施例 27

与实施例 24相比， 区别点仅在于， 本实施例处方为： 蟾毒灵脂质体：淀 粉：乳糖：糊精：硬脂酸镁为 5： 12： 20： 10： 1。

实施例 28

与实施例 24相比， 区别点仅在于， 本实施例处方为： 蟾毒灵脂质体：淀 粉：乳糖： 明胶浆：硬脂酸镁为 5： 30： 10： 10： 0.5。

实施例 29

与实施例 24相比， 区别点仅在于， 本实施例处方为： 蟾毒灵脂质体：淀 粉：微晶纤维素： PVP胶浆：滑石粉为 5： 33： 5： 6： 1.5。

以下通过试验例来进一步阐明本发明所述脂 质体稳定性及对癌症的治疗 效果。

试验例 1： 蟾毒灵脂质体稳定性实验

将实施例 1制得的蟾毒灵脂质体置于 4°C及 37°C条件下， 经过不同时间 后， 测定各指标。 各指标变化情况如表 1。 从结果可见， 蟾毒灵脂质体 4°C及 37°C分别放置 24 h, 稳定性 ^好； 75%湿度， 37°C保存 3个月， 粒径和表面 电位均无明显变化， 包封率略有降低， 总 稳定性较好。

温度 /时间 lh 2h 4h 8h 24h

4°C 粒径 (nm) 187土 10 180土 7.2 185土 11 197±4.7 188土 10 电位（mV ) -14.4土 3.3 -13.3土1.3 -13.7±1.8 -13.3土1.8 -12.9土 1.2

37°C 粒径 (nm) 183土 9.2 179土 12 189土 6.8 190土 5.8 183土 0.8 电位（mV ) -15.7土 0.4 -14.3土0.7 -13.2土 3 -13.7土 1.4 -13土 2.8 将实施例 1制得的蟾毒灵脂质体置于 37°C条件下， 75%RH (湿度)， 经过 不同时间后， 测定各指标。 各指标变化情况如表 2。

表 2: 性质 /时间 （月） 0 1 2 3 粒径 ( nm ) 184±7.5 179土 5.3 182土 3.7 180土 4.8 电位 (mV) -14.8土 3.1 -14.3土 2.9 -13.9土 4.1 -14.5±5.2 包封率 67.3% 64.7% 65.2% 61.9% 对其他实施例重复上述稳定性试验， 结果表明， 本发明所制备的蟾毒灵 脂质体总体稳定性均良好， 其中实施例 1的效果最佳。

试验例 2: 蟾毒灵和蟾毒灵脂质体对肿瘤细胞的生长抑制 作用

人宫颈癌 HeLa、 肺癌 A549、 胃癌 SGC7901、 肝癌 HepG2、 髓性白血病 HL-60和结肠癌 SW1116细胞置于 DMEM或 RPMI 1640培养液（含 10 %灭 活的胎牛血清、 100 U.mr ¹ 青霉素和 100 mg.r ¹ 链霉素） 中， 37 °C、 5 %C0 ₂ 孵箱中培养。 取对数生长期的细胞， 以 3χ10 ³ /孔的密度接种于 96孔板， 每孔 100 μΐ, 在 37°C、 5 % C0 ₂ 饱和湿度条件下培养 24h。 试验设阴性对照组 （培 养液） 、 不同浓度给药组。 每个培养孔加入 1〜300 nmol/1的蟾毒灵或蟾毒灵 脂质体（按实施例 1方法制备） ， 37 °C、 5 %C0 ₂ 饱和湿度孵箱内培养 48h 后， 每孔加入 MTT液（5 g/l ) 20 μ1, 培养 4 h后， 离心， 吸弃培养液， 每孔 加入 150 μΐ二甲基亚砜， 轻度振荡溶解结晶，置自动酶标仪 570 nm波长处测 OD 值， 按下列公式计算细胞生长的抑制率： 细胞生长抑制率 /%= (给药组 OD值-空白对照 OD值） / (对照组 OD值-空白对照 OD值 ) xl00。 IC ₅₀ (细 胞增殖 50%抑制时药物浓度）值由数学方法计算所得。 数据以 Y ±SEM表 示， 釆用 t检验或方差分析进行统计学处理， PO.05表示两组间具有显著性 差异。

从表 3、 4结果可见， 在 l〜300 nmol/l浓度范围内， 蟾毒灵或蟾毒灵脂质 体均能明显抑制 6种肿瘤细胞的增殖， 抑制作用具有浓度依赖性。 蟾毒灵和 蟾毒灵脂质体的 IC _5Q 值差异不明显， 表明蟾毒灵和蟾毒灵脂质体的体外抗肿 瘤作用相当。

表 3 蟾毒灵对肿瘤细胞增殖的抑制作用

浓度 抑制率 （％)

(nmol/1) HeLa A549 SGC-7901 HepG2 HL60 SW1116 0 0.0±0.0 0.1±0.6 0.4±0.3 0.2±0.7 0.1±0.8 0.1±0.6

1 3.8±2.0 2.0±0.2 3.1±0.5 5.3±2.2* 1.6±0.1 1.9±0.3

3 9.6±8.2* 8.5±1.0* 3.9±0.8* 6.1±2.3* 4.4±0.7* 2.7±0.1 *

10 33.9±4.5* 25.3±3.8* 23.7±3.6* 30.2±2.9* 33.8±6.1 * 18.0±3.9*

30 56.3±8.2* 44.2±7.1 * 45.9±6.5* 49.8±8.3* 52.4±8.0* 42.7±6.3*

100 90.3±10.7* 52.3±8.3* 85.6±10.2* 69.8±7.5* 88.7±9.8* 73.1±8.8*

300 95.1±6.9* 63.8±7.9* 97.9±11.3* 87.7±9.6* 98.0±10.2* 99.4±11.6*

IC ₅₀ 17.1 78.8 23.5 33.0 21.1 30.6

*尸<0.05 , 与 Ο ηι tno l/l组比较。

表 4 蟾毒灵脂 t体对肿瘤细胞增殖的抑制作用

浓度 抑制率 （％)

(nmol/1) HeLa A549 SGC-7901 HepG2 HL60 SW1116

0 1.0±0.3 0.2±0.3 0.0±0.1 0.3±0.6 1.1±0.5 0.5±0.7

1 5.7±0.9 3.8±0.7 3.6±0.9 7.2±1.1 * 2.3±0.1 2.2±0.3

3 11.1±0.2* 6.6±1. " 4.7±0.9* 9.9±1.8* 6.2±0.8* 12.7±0.9*

10 38.3±5." 29.4±3.5 * 20.2±2. " 35.8±6.0* 28.0±3.7* 20.6±4.5*

30 62.7±7.3* 41.1±6.8 * 47.3±5." " 45.6±3.4* 44.1±6.7* 46.7±6.3*

100 94.1±11.5 * 55.2±7.3 ^: * 87.3±9. ^ 73.3±8.6* 79.9±8.2* 81.6±9.8*

300 98.3±10.1 * 67.0±8.7 * 96.4±12.0 * 90.5±10.3 ^: * 94.5±10.5* 99.3±11.2*

IC ₅₀ 14.1 72.2 24.8 26.5 27.8 23.0

* <0.05 , 与 O ni tno 1/1组比较。

试验例 3: 蟾毒灵和蟾毒灵脂质体的急性毒性评价

雄性 Balb / c小鼠 （20-25克） ， 购自第四军医大学实验动物中心。 蟾蜍 灵先用无水乙醇溶解， 再用生理盐水稀释至 0.2 mg/ml, (乙醇终浓度小于 1 % )。蟾毒灵脂质体（按实施例 1方法制备）直接溶于生理盐水得到 0.2 mg/ml 的溶液。 每组 10只动物分别以 0.5 , 1 , 2, 4和 6 mg/kg剂量腹腔注射蟾毒灵 或蟾毒灵脂质体（所述剂量为脂质体中蟾毒灵 的量， 脂质体的实际用量需经 包封率换算所得） ， 观察小鼠的死亡率， 毒性作用， 和其它不良反应， 如腹 泻、体重减轻和行为变化，连续观察 7天。使用 Bliss法计算半致死剂量（ LD ₅₀ )。 结果表明， 蟾毒灵和蟾毒灵脂质体的 LD _5Q 的分别为 2.0 mg/kg和 4.2 mg/kg; 蟾蜍灵脂质体的毒性和致死率低于蟾蜍灵。

试验例 4: 蟾毒灵、 华蟾素注射液和蟾毒灵脂质体对肝癌的体内治 疗作 用比较

人肝癌 HepG2细胞置于 DMEM培养液（含 10 %灭活的胎牛血清、 100 U-ml" ¹ 青霉素和 lOO mg ¹ 链霉素）中， 37 °C、 5 %C0 ₂ 孵箱中培养。雄性 BALB / c裸鼠 （6周龄） ， 饲养于无特殊病原体条件下。 蟾毒灵脂质体按实施例 1 方法制备。 取对数生长期的细胞， 用 PBS制成细胞悬液， 每鼠右后背部接种 0.2 ml ( 2xl0 ⁷ 个） 。 待肿瘤长至 100 mm ³ ( 1周左右） 时， 小鼠随机分为 4 组， 每组 8只， 每天分别腹腔注射 0.9%生理盐水（对照组） 、 相同剂量的蟾 毒灵或蟾毒灵脂质体（实施例 1 , 1 mg/kg, 所述剂量为脂质体中蟾毒灵的量， 脂质体的实际用量需经包封率换算所得） ， 华蟾素注射液 （lml/kg, 该剂量 为临床常用剂量换算为小鼠给药剂量所得） 。 自注射药物开始， 每 2天观察 小鼠饮食、 活动及体质量等一般状况， 用圆规和游标卡尺测量瘤块的最长径 和与其垂直的短径， 按照公式： V ( mm ³ ) = (长径 X短径 ² ) /2计算瘤体积。 14天后， 用戊巴比妥钠麻醉过量致死， 完整剥离瘤体并称重， 计算抑瘤率， 肿瘤抑制率（％)= (对照组平均瘤重一给药组平均瘤重） /对照组平均瘤重 χΐοο。 数据以 士 SEM表示， 釆用 t检验或方差分析进行统计学处理， PO.05表示 两组间具有显著性差异。

结果如表 5所示： 给药前， 三组的肿瘤体积没有明显差异。 但 14天时， 对照组小鼠肿瘤生长迅速， 肿瘤体积平均达到 4097.2±821.6 mm ³ ; 比较而言， 华蟾素注射液、 蟾毒灵、 蟾毒灵脂质体可显著性降低肿瘤的生长， 肿瘤体积 分别为 3191.5士 551.8、 3205.6士 711.5、 2356.1士 503.3 mm ³ ( P < 0.05 ) 。 华蟾素 注射液、 蟾毒灵和蟾毒灵脂质体的抑瘤率分别为 22.1%、 21.8 %和42.5 %。 可见， 蟾毒灵脂质体比蟾毒灵单体和华蟾素注射液具 有更强的抗肿瘤作用。 此外， 通过小鼠体重的监测和肺、 肝脏和肾脏的毒性观察， 表明此剂量的蟾 毒灵脂质体无明显的毒性。

表 5 蟾毒灵、 华蟾素注射液和蟾毒灵脂质体对 HepG2肝癌的体内治疗 治疗时间 肿瘤体积 （ _m m ³ )

(天） 蟾毒灵 蟾毒灵脂质体 对照组 华罎素注射液

0 410.5±75.3 421.2±76.8 413.8±87.2 405.2±63.8

2 1055.8±203.0 879.3±168.9 1215.5±286.7 989.6±179.3

4 1621.0±303.8 1327.9±296.8* 1870.2±379.3 1493.2±225.7

6 2215.9±338.1 * 1576.3±315.2* 2853.5±492.1 2026.0±286.1

8 2115.7±349.7* 1328.6±300.8* 2966.0±415.3 2090.8±315.3

10 2565.4±385.2* 1807.7±349.8* 3417.1±519.8 2397.1±320.0

12 2691.9±407.1 * 1889.5±387.2* 3402.9±534.8 2673.8±397.9

14 3205.6±711.5* 2356.1±503.3* 4097.2±821.6 3191.5±551.8

*尸 <0.05 , 与对照组比较。

试验例 5: 蟾毒灵、 华蟾素注射液和蟾毒灵脂质体对 L1210 白血病荷瘤 小鼠的治疗作用比较

鼠系 L1210 白血病细胞瘤株于 ICR小鼠腹腔传代。蟾毒灵脂质体按实施 例 1方法制备。 雄性 ICR小鼠， 体重 20±2g, 每笼 5只， 饲养于 12小时光 照和 12小时黑暗交替动物房中， 25°C恒温， 自由摄食。 小鼠无菌条件下分别 腹腔接种 lxlO ⁵ 个 L1210 白血病细胞悬液， 随机分成 4组， 每组 10只。 24 h 后各组每天分别腹腔注射 0.9%生理盐水（对照组） 、 相同剂量的蟾毒灵或蟾 毒灵脂质体（实施例 1所得， l mg/kg, 所述剂量为脂质体中蟾毒灵的量， 脂 质体的实际用量需经包封率换算所得） ， 华蟾素注射液 （lml/kg, 该剂量为 临床常用剂量换算为小鼠给药剂量所得）。 观察并记录小鼠 35天内的生存情 况， 计算生命延长率。 生命延长率（％ ) = (给药组平均生存时间 /对照组平 均生存时间 - 1 ) xl00。 数据以 Y 士 SEM表示， 釆用 t检验或方差分析进行 统计学处理， PO.05表示两组间具有显著性差异。

结果见表 6, 模型组动物的平均生存时间仅为 16.7±1.9天。 华蟾素注射 液、 蟾毒灵和蟾毒灵脂质体组动物的生存时间明显 延长， 分别为 40.7、 36.5 和 58.1%; 平均生存时间分别为 23.5±3.8、 22.8士 3.1和 26.4士 3.6天。 蟾毒灵脂 质体比蟾毒灵单体和华蟾素注射液对 L1210 白血病荷瘤小鼠具有更强的生 命延长作用。

表 6 蟾毒灵、 华蟾素注射液和蟾毒灵脂质体对 L1210白血病荷瘤小鼠 的平均生存时间和生命延长率的影响

组别 平均生存时间 （天） 生命延长率 （％)

对照组 16.7±1.9 - 蟾毒灵 22.8±3.1 * 36.5

蟾毒灵脂质体 26.4±3.6* 58.1

华蟾素注射液 23.5±3.8* 40.7

*尸<0.05 , 与对照组比较。

以其他实施例得到的产品重复上述试验， 得到相同结论， 此处由于篇幅 所限， 不再一一赘述。 虽然， 上文中已经用一般性说明、 具体实施方式及试验， 对本发明作了 详尽的描述， 但在本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域 技术人员而言是显而易见的。 因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这 些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。

工业实用性

本发明提供了一种蟾毒灵脂质体， 由脂质体双分子层和蟾毒灵组成， 所 述脂质体双分子层中包含磷脂、 甾醇和 PEG修饰物。 本发明所述的脂质体可 用于肿瘤的治疗， 尤其是肝癌、 肺癌、 卵巢癌、 前列腺癌、 结肠癌、 胰腺癌、 胃癌或白血病的治疗。 本发明提供的制备工艺简单， 所制得蟾毒灵脂质体与 蟾毒灵单体相比， 可增加抗肿瘤作用， 同时减小毒副作用， 具有良好的工业 实用性。