PRODROGUES PHOSPHOESTERS DE LA G E MCITABI N E COMME AGENTS ANTICANCEREUX

La présente invention concerne de nouvelles prodrogues de la gemcitabiπe utiles en tant qu'agents anti-cancéreux.

La gemcitabine, nucléoside anti-cancéreux, de formule :

est administrée sous une forme non phosphorylée, mais est phosphorylée in vivo sous la forme de métabolites monophosphate, diphosphate ou triphosphate actifs.

La gemcitabine a récemment enrichi la pharmacopée anticancéreuse et est actuellement largement utilisée dans le traitement de cancers du poumon, du pancréas ou de la vessie.

Le mode d'action de cet agent thérapeutique requiert, après sa pénétration membranaire, une métabolisation intracellulaire en ses formes phosphorylées (nucléotides), qui interfèrent alors avec divers systèmes enzymatiques impliqués dans la biosynthèse des acides nucléiques. La gemcitabine peut être administrée par voie intraveineuse, associée à d'autres agents anticancéreux ayant des mécanismes d'action différents. Les « cures » de chimiothérapie sont administrées à des intervalles variables selon les indications : une à trois cures de forte intensité en cas de leucémie aiguë, 6 à 12 cures administrées toutes les quatre semaines dans la majorité des autres indications. Les patients recevant de la gemcitabine pour le traitement d'une tumeur solide bénéficieront dans un certain nombre de cas de ces traitements, mais il ne s'agit jamais d'un traitement curatif et tous les patients décéderont de leur maladie.

Par ailleurs, l'utilisation clinique de la gemcitabine se heurte à l'apparition de phénomènes de résistance. Les mécanismes impliqués dans la résistance à la gemcitabine ne peuvent être ramenés à l'expression d'un seul système enzymatique. Ces mécanismes, bien que mal connus encore aujourd'hui, sont d'origine multifactorielle. La dernière décennie a vu le clonage de plusieurs gènes

clés impliqués dans l'action cytotoxique de ce composé : les transporteurs équilibratifs (hENT) et concentratifs (hCNT) de nucléosides, les enzymes inactivatrices telles que les 5'-nucléotidases et d'autres protéines. Pendant la même période des études réalisées sur des lignées rendues résistantes in vitro aux analogues de nucléosides cytotoxiques et sur des échantillons de patients atteints d'hémopathies malignes ou de tumeurs solides ont permis d'identifier les paramètres ayant une importance clinique. Les étapes « précoces » conduisant à l'accumulation intracellulaire de dérivés tri phosphates actifs peuvent ainsi être modifiées chez les patients atteints de néoplasies et être à l'origine de phénomènes de chimiorésistance aux analogues de nucléosides. Un déficit en hENTl, principal transporteur de la gemcitabine, est ainsi associé à une absence d'activité anticancéreuse de ces médicaments chez les patients atteints de cancer du pancréas. Un défaut de désoxycytidine kinase (dCK, enzyme impliquée dans la monophosphorylation d'analogues de la gemcitabine) a été observé par de nombreux investigateurs dans des divers modèles de résistance, tant dans des lignées rendues résistantes in vitro , que chez des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (LAM) ou de leucémie lymphatique chronique (LLC) et ne répondant pas favorablement aux traitements.

Un catabolisme extra- ou intracellulaire (désamination), un défaut de pénétration membranaire, ou encore un anabolisme (phosphorγlation) inefficace constituent autant de limitations à l'activité de la gemcitabine. En l'absence d'une concentration intracellulaire adéquate en ses formes phosphorylées, il n'est en effet pas possible d'obtenir une activité antimitotique satisfaisante.

Les inventeurs ont démontré, dans le cadre de publications antérieures "Sensitization of ara-C-resistant lymphoma cells by a pronucleotide analogue". CM. Galmarini, M. L. Clarke, CL. Santos, L. Jordheim, C Périgaud, G. Gosselin, E. Cros, 3. R. Mackey et C. Dumontet. IntemationaIJournai of Cancer, 2003, 1OZ (1), 149-154 ; "Characterization of a gemcitabine-resistant murine leukemic cell line: reversion of in vitro résistance by a mononucleotide prodrug". L.P. Jordheim, E. Cros, M.-H. Gouy, CM. Galmarini, S. Peyrottes, J.R. Mackey, C. Périgaud et C Dumontet. C/inica/ Cancer Research, 2004, 10 (16), 5614-5621), que l'utilisation in vitro de prodrogues nucléotidiques (pronucléotides) incorporant deux

groupements enzymolabiles protecteurs de la fonction phosphate de même nature et de type S-acyl-2-thioéthyle (SATE), tel que le composé de formule (A) suivant :

Nu: nucleoside analogue mononucleoside bis(SATE)phosphotriester conduisait à la libération intracellulaire sélective du premier meta bol i te phosphorylé (mononucléotide) d'un analogue de nucleoside.

A titre d'exemple de ce type de composés, on peut citer le pronucléotide de l'araC incorporant comme protections enzymolabiles de la fonction phosphate le groupement S-pivaloyl-2-thioéthyle (.BuSATE) de structure (B).

L'évaluation comparative de ce pronucléotide (B) dans deux lignées cellulaires résistantes à l'araC et à la gemcitabine, a démontré sa capacité à contourner, au moins en partie, les processus de résistance cellulaire. Ce résultat est associé à la libération sélective du 5'-mononudéotide (araCMP) au sein des cellules tumorales conduisant à une restauration des taux intracellulaires en formes phosphorylées.

Néanmoins, des études pharmacologiques réalisées chez l'animal avec un certain nombre de pronucléotides bis(SATE), ont montré la relative instabilité enzymatique de ce type de structures lors de leur administration par voie orale. Cette dégradation pré-systémique peut être associée à la présence d'une activité estérasique importante dans l'ensemble de l'appareil digestif et le foie. Ces études ont également mis en évidence la formation transitoire d'un 2- mercaptoéthylphosphodiester, comme illustré sur le SCHEMA 1 ci-après, qui montre le processus de décomposition de pronucléotides bis(SATE) et les métabolites observés lors d'études pharmacologiques dans différents modèles animaux.

SCHEMA 1 l ^ène étape (rapide) : perte du premier groupement enzymolabile

SATE I I

' „ décomposition chimique _ _λ fl activité estérasique spontanée fl fi

OSATE O ^"

5'-mononucléotlde 2-mercaρtoethyl phosphodi ester

O conjugués protéiques (dalrance)

Ce 2-mercaptoéthylphosphodiester est issu de la décomposition du second groupement SATE, et peut conduire à des conjugués protéiques via la création vraisemblable de ponts disulfures. L'identification de ce phosphodiester comme l'un des métabolites principaux lors de l'administration de pronucléotides bis(SATE) traduit une diminution de la vitesse de la SN, conduisant au 5'- mononucléotide, associée à la présence de la charge négative de la fonction phosphate.

L'invention se propose de fournir de nouvelles prodrogues de la gemcitabine qui permettent d'éviter un certain nombre des limitations associées à l'émergence de résistances lors de l'utilisation de cet analogue nucléosidique cytotoxique, en étant :

- résistants aux dégradations chimiques et enzymatiques (catabolisme) ;

- susceptibles de traverser les membranes cellulaires par un processus non dépendant de transporteurs (simple diffusion) ;

- capables de libérer intracellulairement le premier métabolite phosphorylé (mononucléotide) de manière indépendante à l'expression de kinases cellulaires (métabolisme).

Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont développé de nouvelles prodrogues de la gemcitabine à activité anti-tumorale, dites « mixtes », qui se

caractérisent par la présence de deux groupements enzymolabiles protecteurs de la fonction phosphate de nature différente.

En particulier, l'invention a pour objet les composés phosphoesters mixtes, à activité anti-tumorale, de formule (I):

dans laquelle :

- n est égal à 1, 2, 3 ou 4,

- Z représente O ou S

- Y représente un groupe choisi parmi les groupes alkyle ou aryle, lesdits groupes alkyle ou aryle pouvant éventuellement être substitués, par exemple par un ou plusieurs substituants choisis parmi -OH, -SH ou -NH ₂ ,

- Ri représente un groupe -NRaRb dans lequel Ra et Rb, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ou aryle, lesdits groupes alkyle ou aryle pouvant éventuellement être substitués, ou bien R ₃ et R _b sont liés entre eux pour former, avec l'atome d'azote auquel ils sont liés, une aminé cyclique choisie, par exemple, parmi les groupes pyrrolidinyle, pipéridinyle, morpholynyle, pipérazinyle, pyridyle éventuellement substitués.

A titre d'exemple selon l'invention, les composés de formule (I), peuvent présenter une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessous, lorsqu'elles ne s'excluent pas Tune l'autre :

- Y représente un groupe méthyle ou tetf-butyle,

- n est égal à 2,

- Ri représente un groupe -NR ₃ R _b avec R ₃ et R _b tels que définis pour la formule (I). Notamment, R ₃ représente un atome d'hydrogène et R _b représente un groupe benzyle ou benzyle substitué, isopropyle ou n-butyle,

La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant un composé de formule (I) tel que défini

précédemment, en combinaison avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne l'utilisation d'un composé de formule (I) tel que défini précédemment pour la préparation d'un médicament anti-tumoral ou anti-cancéreux, notamment destiné au traitement ou à la prévention de lésions tumorales bénignes, ou de cancers, incluant les hémopathies malignes et les tumeurs solides, y compris les tumeurs d'origine glandulaire, mésenchymateuse, génitale, cutanée et neurologique.

Dans le cadre de l'invention, certaines définitions des termes employés sont données ci-après :

Par alkyle, on entend un radical monovalent hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé, comportant, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, tert- butyle, sec-butyle, n-pentyle, n-hexyle.

Par groupe aryle, on entend un carbocycle mono-, bi- ou polycydique comprenant au moins un groupe aromatique. Les groupes aryles comprenant de 6 à 12 atomes de carbones sont préférés. En tant qu'aryle, on peut citer les groupes phényle, 1-naphtyle, 2-naphtyle, indanyle, indényle, biphényle, bicyclo[4.2.0]octa- 1,3,5-triène, les groupes phényle étant préférés.

Lorsqu'il est indiqué qu'un groupe est éventuellement substitué, sans plus de précision, cela signifie qu'il est porteur de un ou plusieurs substituants identiques ou différents, notamment choisis parmi les halogènes, nitrooxocarboxy, cyano, alkyle, trifluoroalkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, O-alkyl, O-aryl. Par atome d'halogène, on entend un atome de chlore, brome, iode ou fluor. Le terme alcényle correspond à un groupe alkyle tel que ci-dessus défini comprenant au moins une double liaison. Les exemples de groupe alcényle sont par exemple des groupes vinyle, allyle, isopropényle, l-,2- ou 3-butényle, pentényle, hexényle. Le terme alcynyle correspond à un groupe alkyle tel que ci-dessus défini comprenant au moins une triple liaison. Le terme cycloalkyle, désigne une chaîne hydrocarbonée saturée cyclique comprenant de 3 à 10 atomes de carbone, par exemple cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle, des groupes cycloalkyle pontés tels que les

groupes adamantyle, bicyclo[3.2.1]octanyle. Le terme hétérocycloalkyle désigne un cycloalkyle tel que ci-dessus défini, incorporant un ou plusieurs hétéroatomes, sélectionnés parmi les atomes d'azote, oxygène et soufre. A titre d'exemple de groupe hétérocycloalkyle, on peut citer les groupes pipéridine, pyrrolidine, azétidine, morpholine, tétrahydropyranne, tétrahydrothiophène.

Aussi, les groupes benzyle et benzyle substitué sont des exemples de groupe alkyle substitué.

A titre d'exemple de composé selon l'invention, on peut citer les prodrogues de la gemcitabine incorporant un groupement S-pivaloyl-2-thioéthyle (/BuSATE) et un résidu aminé dérivé de la /7-butylamine de formule (1.1), de Ilsopropylamine de formule (1.2), de la benzylamine de formule (1.3) :

et également les composés incorporant un groupement 5 ^L (2,2-diméthyl-3- hydroxypropionyl)-2-thioéthyle (Hydroxy-fBuSATE) et un résidu aminé dérivé de la benzylamine de formule (1.4) :

Dans le cas des composés selon l'invention tels que définis pour la formule (I), une décomposition en 5'-mononucléotide correspondant est observée, sous l'action successive d'estérases, puis probablement d'une « activité phosphoramidase » permettant d'éviter la formation de métabolites susceptibles de s'associer de manière covalente aux protéines sériques.

De plus, la grande variabilité structurale qui peut être apportée par la nature des groupements -{CH2)n-S-C(=Z)Y comme des substituants Ri permet de moduler la stabilité enzymatique de la prodrogue en relation avec sa lipophilie et ainsi optimiser ses propriétés pharmacocinétiques. En particulier, le choix des groupements Ri, et par exemple du groupe -NR ₃ R _b sélectionné, permet de moduler les propriétés physicochimiques du composé de formule (I), notamment sa solubilité dans l'eau et sa lipophilie, et sa stabilité en fonction des affinités des phosphoramidases.

Les composés de formule (I) selon l'invention pourront être utilisés en tant qu'agents anti-cancéreux. En effet, les composés selon l'invention sont insensibles aux problèmes de diffusion ou d'activation intracellulaire, ce qui permet d'élargir leur spectre d'indications par rapport aux nucléosides cytotoxiques classiques et augmenter significativement leur efficacité.

De façon générale, les composés selon l'invention pourront être utilisés pour préparer un médicament destiné au traitement, à titre curatif ou préventif, de tout type de cancer ou état précancéreux. En particulier, les composés de formule (I), pourront être utilisés pour la fabrication de médicaments anti-tumoraux ou anticancéreux, notamment destinés au traitement ou à la prévention de lésions tumorales bénignes, ou de cancers, incluant les hémopathies malignes et les tumeurs solides, y compris les tumeurs d'origine glandulaire, mésenchymateuse, génitale, cutanée et neurologique.

On pourra citer comme cancers pouvant être traités par les composés de la présente invention, les carcinomes, les hémopathies malignes des lignées myéloïdes et lymphoïdes, les tumeurs d'origine mésenchymateuse, les sarcomes, les tumeurs du système nerveux central et périphérique, les mélanomes, les séminomes, tératocarcinomes, ostéosarcomes, le xéroderma pigmentosum, le chératoacantum, les néoplasies endocrines, et le sarcome de Kaposi.

La présente invention a donc également pour objet les composés de formule (I), en tant que médicaments, ainsi que les compositions pharmaceutiques contenant une dose efficace d'un composé de formule (I), et des excipients convenables.

Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité. Les excipients pharmaceutiques acceptables étant, par exemple, définis par la Pharmacopée européenne.

Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale ou intraoculaire, les principes actifs de formule (I) ci-dessus, peuvent être administrés sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour la prophylaxie ou le traitement des troubles ou des maladies ci-dessus. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intranasale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse et les formes d'administration rectale. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des crèmes, pommades, lotions ou collyres.

Afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré, chaque dose unitaire peut contenir de 0,1 à 10000 mg, de composé selon l'invention en combinaison avec un support pharmaceutique. Cette dose unitaire peut être administrée 1 à 5 fois par jour de façon à administrer un dosage journalier permettant d'obtenir l'effet souhaité.

Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique, tel que la

gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique, ou d'autres matières appropriées ou encore on peut tes traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif.

On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.

Les compositions pharmaceutiques contenant un composé de l'invention peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple, des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops. Les supports liquides appropriés peuvent être, par exemple, l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau.

Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir ou pour l'administration sous forme de gouttes peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, acalorique de préférence, du méthylparaben et du propylparaben comme antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, comme la polyvinylpyrrolidone, de même qu'avec des édulcorants ou des correcteurs de goût.

Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylèneglycols. Pour une administration parentérale, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des mouillants pharmacologiquement compatibles, par exemple le propylèneglycol ou le butylèneglycol. Le principe actif peut être formulé également sous forme de microcapsules, éventuellement ave un ou plusieurs supports ou additifs, ou bien avec des matrices telles qu'un polymère ou une cyclodextrine (patch, formes à libération prolongée).

Les compositions de la présente invention peuvent contenir, à côté des produits de formule (I) par exemple des principes actifs qui peuvent être utiles

dans le traitement des troubles ou maladies indiquées ci-dessus. Ainsi, la présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant plusieurs principes actifs en association dont l'un est un composé selon l'invention.

L'invention a donc pour objet leur utilisation comme médicaments pouvant être utilisés seuls ou en combinaison avec des traitements tels que la chimiothérapie ou la radiothérapie mettant éventuellement en œuvre d'autres substances actives.

Par ailleurs, d'une façon générale, les mêmes préférences que celles indiquées précédemment pour les composés de formule générale (I) sont applicables mutatis mutandis aux médicaments, compositions pharmaceutiques et utilisation mettant en œuvre les composés selon l'invention.

Les exemples ci-après n'ont aucun caractère limitatif et permettent d'illustrer l'invention. Les composés selon l'invention sont préparés selon des techniques bien connues de l'homme de l'art. Une de ses méthodes est illustrée sur le SCHEMA 2 ci-après dans lequel n, Y et Z sont tels que définis pour les composés de formule (I), R' représente un groupe protecteur de la fonction hydroxy et R" un groupe protecteur de la fonction aminé :

SCHEMA 2

Les fonctions hydroxyles portées par le résidu osidique (sucre) et l'aminé exocyclique portée par les hétérocycles de ces nucléosides sont transitoirement protégées dans les intermédiaires (II) et (Ia). La condensation du composé (III) avec ces nucléosides convenablement protégés conduit aux dérivés (II). L'oxydation amidative de ces précurseurs avec des dérivés du type HNR ₉ R _b , génère donc des prodrogues totalement protégées, notées (Ia). Une dernière étape d'hydrolyse des groupements protecteurs est alors nécessaire pour conduire aux prodrogues recherchées (I).

Les composés de départ (IV) sont préparés selon des techniques bien connue de l'homme de l'art.

Ce procédé est illustré dans les exemples qui suivent.

EXEMPLE 1

Préparation de la orodroαue de la αerncitabine de formule fl.ll :

Intermédiaire (IV.1) : Le S-pivaloyl-2-thioéthanol est obtenu selon un protocole décrit dans une publication antérieure, I. Lefevbre, C. Périgaud et al., Journal of Médicinal Chemistry, 1995, 38, (20), 3941.

Intermédiaire (III.1) : .9 Pivaloyl-2-thioéthyl hydrogénophosphonate monoester, sel de sodium

Le S-pivaloyl-2-thioéthanol (IV, 1, 2,7 g, 16,76 mmol) est dissous dans un mélange de pyridine (16 mL) et de dioxane (50 mL) anhydres. A la solution résultante, est additionnée au goutte à goutte une solution de 2-chloro-5,6-benzo-l,2,3- dioxaphosphorin-4-one (4,0 g, 20,00 mmol) dans du dioxane anhydre (16 mL). Après 45 minutes d'agitation à température ambiante, une solution de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB, 8 mL, 1 M, pH 7) est ajoutée au mélange

réactionnel. Après 30 minutes d'agitation, le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite et deux co-évaporations au toluène sont effectuées. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (dichlorométhane / triéthylamine, 99/1, v/v) en utilisant comme éluant un gradient de méthanol de 0 à 10% dans du dichlorométhane contenant 1% de triéthylamine. Après passage sur une colonne de résine Dowex (50 WX2, forme Na ⁺ ) et lyophilisation, le sel de sodium du composé (III.1) est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (2,7 g, 64%).

RMN ¹ H (DMSOd ₆ , 400 MHz) δ 6,53 (d, IH, Jp. _H = 573, PH), 3,62 (m, 2H,

CH ₂ O) ₁ 2,96 (t, 2H, J = 6,6, SCH ₂ ), 1,16 (s, 9H, C(CH ₃ J ₃ )

RMN ¹³ C (DMSO-de, 100 MHz) δ 205,6 (Is, C=O), 60,9 (Id, CH ₂ O) ₁ 45,9 (Is,

C(CH ₃ J ₃ ), 29,3 (Id, 5CH ₂ ), 27,0 (Is, C(CHa) ₃ )

RMN ³¹ P (DMSO-de, 81 MHz) δ 2,3

SM FAB>0 (GT) /77/z497 (2M+H) ⁺ , 271 (M+Na) ⁺ , 249 (M+H) ⁺

FAB<0 (GT) m/z 473 (2M-Na) ^" , 225 (M-Na) ^" Microanalyse Calculée pour C ₇ Hi ₄ O ₄ PSNa : C : 33,87 ; H : 5,68 ; S : 12,92

Trouvée : C : 33,79 ; H : 5,69 ; S : 12,90

Lors de la synthèse du <>(5 ^: pivaloyl-2-thioéthyl) hydrogénophosphonate monoester, c'est le sel de triéthylammonium qui est obtenu après la colonne chromatographique sur gel de silice et qui peut-être directement utilisé dans les réactions de couplage. Ce sel de triéthylammonium est converti en sa forme sodée par passage sur résine échangeuse d'ions de type Dowex afin d'obtenir les caractérisations physico-chimiques.

Intermédiaire (ILl) : 0(5 ^L pivaloyl-2-thioéthyl)-α5'-(yv-4-0-3'-bis(te/t-butoxy carbonyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester

La /V-4-α-3'-bis(te/t-butoxycarbonyl)gemcitabine (obtenue selon Z. W. Guo, J. M. GaIIo, J. Org. Chem., 1999, 64, 8319) (0,5 g, 1,08 mmol) et le 0-(5-pivaloyl-2- thioéthyl) hydrogénophosphonate monoester, sel de triéthylammonium (III.1) (0,7 g, 2,16 mmol) sont co-évaporés avec de la pyridine, puis dissous dans de la pyridine anhydre (14 ml), puis du chlorure de pivaloyl (0,33 ml, 2,69 mmol) est alors additionné goutte à goutte. Après 12h, la réaction est arrêtée par ajout d'acétate d'ammonium (1 ml, 0,5 M), le mélange réactionnel est dilué dans du

dichlorométhane (10 ml) puis lavé avec de l'acétate d'ammonium (10 ml, 0,01 M). La phase organique est séchée sur Na2S04, filtrée puis évaporée sous pression réduite pour donner une huile jaune qui est ensuite coévaporée 3 fois avec du toluène. Une purification par chromatographie sur colonne, utilisant comme éluant un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle, 8/2,V/V+0,2% d'acide acétique, permet d'obtenir le C>-(5-pivaloyl-2-thioéthyl)-05'-(/V-4-0-3'-bis(te/t-buto xycarbo nyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester (ILl) (0,2 g, 36%) sous la forme d'une huile incolore.

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 7.77 (m, IH, H-6), 7.23 (m, IH, H-5), 6.40 (m, IH, H-IO, 6-89 (d, IH, % _w = 720, PH), 5.08 (m, IH, H-30, 4.39 (m, 2H, H-5' et H-5"), 4.27 (m, IH, H-40, 4.11 (pq, 2H, J = 6.6, CH ₂ O), 3.08 (t, 2H, J = 6.6, CH ₂ S), 1.44 (s, 18H, CH ₃ Boc), 1.17 (s, 9H, CH ₃ SATE)

RMN ¹³ C (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 204.5 (CO SATE), 162.3 (C-4), 153.4 (CO Boc), 150.4 (C-2), 150.0 (CO Boc), 143.4 (C-6), 122.7, 119.2, 115.7 (C-20, 94.8 (C-5), 84.3 (C[CH ₃ J ₃ ), 83.4 (C-IO, 81.9 (C[CHs) ₃ ), 77.1 (C-40, 71.2 (C-30, 63.6 (CH ₂ O), 62.2 (C-50, 45.5 (C(CH ₃ J ₃ ), 28.3 (CH ₂ S), 27.2 (CH ₃ ), 26.4 (CH ₃ ) RMN ³¹ P (CDCI ₃ , 121 MHz) δ 8.0, 8.9 SM FAB>0 (G-T) m/z 672 (M+ H) ⁺ , 408 (M-GemC) ⁺

FAB<0 (G-T) m/z 670 (M-H) ^" , 526 (M- tBuSATE) ^"

Intermédiaire (Ia.l) : /V-(λ-butylamino)-0(5 ^L ρivaloyl-2-thioéthyl)-<>5'-(/V-4-0 3'-bis-(te/t-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate diester Le 0-(Spivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(/V-4-0-3'-bis(fe/*-butoxyca rbonyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester (ILl) (0,6 g, 0,894 mmol) est co-évaporé 2 fois avec de la pyridine anhydre, puis dissout dans du tétrachlorure de carbone (22 ml). A cette solution, de la n-butylamine (0,27 mL, 2,68 mmol) est additionnée goutte à goutte. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante. Après Ih 15, le mélange réactionnel est dilué avec du dichlorométhane (86 ml) et lavé avec une solution d'acide chlorhydrique (86 ml, 0.1 N, pH = 1) jusqu'à ce que le pH de la solution aqueuse soit acide (pH≈l). La phase organique est neutralisée avec une solution aqueuse de NaHCO ₃ puis lavée avec de l'eau (86 ml) et séchée

sur Na ₂ S0 ₄ , puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Une purification par chromatographie sur colonne, en éluant avec un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole {7/3, v/v) donne le /V-isopropylamino-L>(5φivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(/V- 4-£>3'-bis-(te/t-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate (Ia.l) (0,550 g, 83%) sous la forme d'une huile incolore.

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 400 MHz) δ 7.81 (dd, 2H, J = 7.1, H-6 et NH), 7.24 (d, IH, J = 7.1, H-5), 6.38 (m, IH, H-IO, 5.12 (m, IH, H-30, 4.25 (m, 3H, H- 4', H-5' et H-5"), 4.02 (m, 2H, CH ₂ O), 3.08 (m, 2H, CH ₂ S), 2.87 (m, 3H, CH ₂ N et NH), 1.41 (m, 2OH, OZ ₂ CH ₂ N et CH ₃ Boc), 1.27 (m, 2H, CH ₂ CH3), 1.21 (s, 9H, CH ₃ SATE), 0.86 (m, 3H, CH ₃ />Bu)

RMN ¹³ C (CDCI ₃ , 100 MHz) ô 205.7 (CO), 163.2 (C-4), 154.5 (C-2), 151.4 (CO Boc), 150.9 (CO Boc), 144.5 (C-6), 123.0, 120.4, 117.8 (C-20, 95.6 (C-5), 84.7 (αCH ₃ ) ₃ ), 84.6 (C-IO, 83.0 (C(CH ₃ J ₃ ), 78.4 (C-40, 72.6 (C-30, 65.0 (CH ₂ O), 63.7 (C-50, 46.5 (3CH ₃ J ₃ ), 41.2 (CH ₂ N), 31.7 (OH ₂ CH ₂ N), 28.7 (CH ₂ S), 27.9, 27.5, 27.3 (CH ₃ Boc et tBu), 19.7 (CH ₂ CH ₃ ), 13.7 (OH ₃ CH ₂ ) RMN ³¹ P (CDCI ₃ , 121 MHz) δ 9.6, 9.4 SM FAB>0 (G-T) m/z 743 (M +H) ⁺ , 643 (M-BoC) ⁺

FAB<0 (G-T) m/z 741 (M-H) ^' , 597 (M-tBuSATE)-, 523 (M-tBuSATE- nBuNH) ^" , 497 (M-tBuSATE-Boc) ^"

Prodrogue (1.1) : /V-(/>butylamino)-0(5-pivaloyl-2-thioéthyl)-05'-gemcitab ine phosphoramidate diester

A une solution agitée de λ/-^-butylamino)-C>-(S-pivaloyl-2-thioéthyl)-C>-5'-( λ^4-0 3'-bis-(tetf-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate (Ia.l) (0.55 g, 0,74 mmo!) dans du dichlorométhane anhydre (7 ml), une solution de TFA (7 ml, 50% dans le dichlorométhane v/v) est ajoutée au goutte à goutte à O ⁰ C. La réaction est complète après Ihl5 à température ambiante. Le mélange réactionnel est co- évaporé 2 fois avec du CH ₂ CI ₂ et 4 fois avec de l'éthano!. La purification du résidu sur une colonne RP18 utilisant comme éluant un gradient de 20% à 50% en volume de CH ₃ CN/H ₂ O permet d'obtenir le dérivé (1.1) désiré (0,264 g, 66%) sous la forme d'un solide blanc.

RMN ¹ H (DMSOcI ₆ , 400 MHz) δ 7.55 (d, IH, J = 7.5, H-6), 7.50, 7.45 (2s, 2H, NH2), 6.44 (t, IH, J = 6.1, OH), 6.18 (t, IH, J = 8.0, H-I ⁷ ), 5.80 (dd, IH, J = 7.5, H-5), 5.11 (m, IH, NH), 4.13 (m, 3H, H-3', H-5' et H- 5'0, 4.01 (m, IH, H-4% 3.93 (m, 2H, CH ₂ O), 3.09 (t, 2H, J = 6.4, CH ₂ S), 2.75 (m, 2H, CH ₂ N), 1.37 (m, 2H, OZiCH ₂ N), 1.27 (m, 2H, CH ₂ CH ₃ ), 1.18 (s, 9H, CH ₃ tBu), 0.84 (t, 3H, J = 7.3, CH ₃ nBu)

RMN ¹³ C (DMSO-de, 100 MHz) ô 205.2 (CO), 165.4 (C-4), 154.3 (C-2), 141.0 (C-6), 126.0, 122.6, 119.2 (C-20, 94.7 (C-5), 83.8 (C-IO, 78.3 (C-40, 69.4 (C-3'), 63.7 (C-5' et CH ₂ O), 45.9 (αCH ₃ ) ₃ ), 40.3 (CH ₂ N), 33.3 (CH ₂ CH ₂ N), 28.4 (CH ₂ S), 26.8 (CH ₃ tBu), 19.2 (CH ₂ CH ₃ ), 13.6 (CH ₃ nBu)

RMN ³¹ P (DMSO-de, 121 MHz) δ 10.7, 10.0

SM FAB>0 (G-T) m/z 534 (M+H) ⁺ , 399 (M-tBuSATE) ⁺

FAB<0 (G-T) m/z 541 (M-H) ^"

EXEMPLE 2

Préparation de la prodroαue de la qemcitabine de formule fl.2^ :

Intermédiaire (Ia.2) : /V"(isopropylamino)-(>(S ^L pivaloyl-2-thioéthyl)-05'-(/V-4- 0-3'-bis-(te/ï-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate diester Le 0(S-pivaloyl-2-thioéthyl)-(->5'-(/V-4-C>-3'-bis(te/t- butoxycarbonyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester (ILl) (0,6 g, 0,894 mmol) est co-évaporé 2 fois avec de la pyridine anhydre, puis dissout dans du tétrachlorure de carbone (22 ml). A cette solution, de l'isopropylamine (0,23 ml_, 2,68 mmol) est additionnée goutte à goutte. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante. Après Ihl5, le mélange réactionnel est dilué avec du dichlorométhane (86 ml) et lavé avec une solution d'acide chlorhydrique (86 ml, 0,1 N, pH = 1) jusqu'à ce que le pH de la solution aqueuse soit acide (pH≈l). La phase organique est neutralisée

avec une solution aqueuse de NaHC03 puis lavée avec de l'eau (86 ml) et séchée sur Na ₂ SO ₄ , puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Une purification par chromatographie sur colonne, en éluant avec un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole (7/3, v/v) donne le λAisopropylamino-(>(5-pivaloyl-2-thioéthyl)-<>5'- (/V- 4-0-3'-bis-(te/t-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate (Ia.2) (0,323 g, 50%) sous la forme d'une huile incolore.

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 400 MHz) δ 7.81 (dd, 2H, J = 7.6, H-6 et NH), 7.21 (m, IH, H-5), 6.34 (m, IH, H-I ¹ ), 5.17 (m, IH, H-30, 4.24 (m, 3H, H-4', H-5' et H-5"), 4.01 (m, 2H, CH ₂ O), 3.32 (m, IH, NCH), 3.08 (m, 2H, CH ₂ S), 2.75 (m, IH, NH), 1.44 (s, 18H, CH ₃ Boc), 1.16 (s, 9H, CH ₃ SATE), 1.10 (m, 6H, CH ₃ iPr)

RMN ¹³ C (CDCI ₃ , 100 MHz) δ 205.7 (CO), 163.1 (C-4), 154.5 (C-2), 151.4 (CO Boc), 150.9 (CO Boc), 144.5 (C-6), 122.9, 120.4, 117.7 (C-2 ⁷ ), 95.6 (C-5), 84.7 (αCH ₃ ) ₃ ), 84.0 (C-IO, 83.0 (4CHs) ₃ ), 78.3 (G40, 72.6 (C-30, 65.0 (CH ₂ O), 63.7 (C-50, 46.5 (C[CH ₃ ) ₃ ), 44.1 (CHN), 29.7 (CH ₂ S), 28.7, 27.9, 27.5 (CH ₃ Boc et tBu), 25.3 (CH ₃ iPr) RMN ³¹ P (CDCI ₃ , 121 MHz) δ 8.6, 8.3 SM FAB>0 (G-T) m/z 1457 (2M+H) ⁺ , 729 (M+H) ⁺ , 629 (M-BoC) ⁺

FAB<0 (G-T) m/z 1455 (2M-H) ^" , 727 (M-H) ^" , 583 (M-tBuSATE) ^" , 483 (M-tBuSATE-Boc)-

Prodrogue (1.2) : /V-(isopropylamino)-0(5-pivaloyl-2-thioéthyl)-05'- gemcitabine phosphoramidate diester

A une solution agitée de yv-^isopropylamino)-0(5 ^L pivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(/V-4- 0-3'-bis-(te/t-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate (Ia.2) (0.270 g, 0,37 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (4 ml), une solution de TFA (4 ml, 50% dans le dichlorométhane v/v) est ajoutée au goutte à goutte à 0 ⁰ C. La réaction est complète après Ihl5 à température ambiante. Le mélange réactionnel est co- évaporé 2 fois avec du CH ₂ CI ₂ et 4 fois avec de l'éthanol. La purification du résidu sur une colonne RP18 utilisant comme éluant un gradient de 20% à 60% en volume de CH ₃ CN/H ₂ O permet d'obtenir le dérivé (1.2) désiré (0,170 g, 87%) sous la forme d'un solide blanc.

RMN ¹ H (DMSO-C _-6 , 400 MHz) δ 7.55 (d, IH, J = 7.6, H-6), 7.41, 7.37 (2s, 2H, NH2), 6.40 (t, IH, J = 6.1, OH), 6.18 (t, IH, J = 8.0, H-IO, 5.78 (dd, IH, J = 7.6, H-5), 5.03 (m, IH, NH), 4.21-4.12 (m, 3H, H-3', H-5' et H-5"), 4.05 (m, IH, H-40, 3.94 (m, 2H, CH ₂ O), 3.24 (m, IH, CHN) 3.11 (t, 2U ₁ J = 6.4, CH ₂ S), 1.20 (s, 9H, CH ₃ tBu), 1.10, 1.08 (2s, 6H, CH ₃ iPr)

RMN ¹³ C (DMSO-de, 100 MHz) δ 205.2 (CO), 165.6 (C-4), 154.5 (C-2), 141.0 (C-6), 122.6, 119.2 (C-20, 94.7 (C-5), 83.2 (C-IO, 78.3 (C-40, 69.5 (C-3 ⁷ ), 63.7 (C-5' et CH ₂ O), 46.0 (3CHs) ₃ ), 43.1 (CHN), 28.4 (CH ₂ S), 26.9 (CH ₃ tBu), 24.9, 24.8 (CH ₃ iPr)

RMN ³¹ P (DMSO-de, 121 MHz) δ 10.1, 9.9

SM FAB>0 (G-T) m/z 1057 (2M+H) ⁺ , 529 (M+H) ⁺

EXEMPLE 3

Préparation de la prodroαue de la qemcitabine de formule (1.31 :

Intermédiaire (Ia.3) : /V-(benzylamino)-(>(S-pivaloyl-2-thioéthyl)-t>5'-(/V- 4-0 3'-bis-(te/?-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate diester Le (>(5-pivaloyl-2-thioéthyl)-O-5'-(/V-4-(>3'-bis(fe/t ^L butoxycarbonyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester (II.1) (0,1 g, 0,156 mmol) est co-évaporé 2 fois avec de la pyridine anhydre, puis dissout dans du tétrachlorure de carbone (3.7 ml). A cette solution, de la benzylamine (0,05 ml_, 0,47 mmol) est additionnée goutte à goutte. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante. Après Ih 15, le mélange réactionnel est dilué avec du dichlorométhane (15 ml) et lavé avec une solution d'acide chlorhydrique (15 ml, 0,1 N, pH = 1) jusqu'à ce que le pH de la solution aqueuse soit acide (pH≈l). La phase organique est neutralisée avec une solution aqueuse de NaHCO ₃ puis lavée avec de l'eau (15 ml) et séchée

sur Na ₂ SO-j, puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Une purification par chromatographie sur colonne, en éluant avec un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle (7/3, v/v) donne le /V-benzylamino-CK^pivaloyl- 2-thioéthyl)-0-5'-(λM-0-3'-bis-(te/t-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphor- amidate (Ia.3) (0,084 g, 70%) sous la forme d'une huile incolore. RMN ¹ H (CDCI ₃ , 400 MHz) ô 7.77 (m, IH, H-6), 7.26 (m, 5H, Ph), 7.20 (m, IH, H-5), 6.38 (m, IH, H-IO, 5.08 (m, IH, H-30, 4.22 (d, 2H, J= 6.1, CH ₂ O), 4.05 (m, 4H, H-5', H-5" et CH ₂ N), 3.50 (m, IH, H-4 ¹ ), 3.04 (m, 2H, CH ₂ S), 1.43 (s, 18H, CH ₃ BoC), 1.15 (s, 9H, CH ₃ SATE) RMN ³¹ P (CDCI ₃ , 121 MHz) ô 9.1, 8.8 SM FAB>0 (G-T) m/z 777 (M+H) ⁺ , 677 (M-BoC) ⁺

FAB<0 (G-T) /77/Z775 (M-H) ^"

Prodrogue (1.3) : /^(benzylaminoJ-Ot^pivaloyl^-thioéthyO-OS'-gemcitabine phosphoramidate diester

A une solution agitée de Mφenzylamino)-<>(£pivaloyl-2-thioéthyl)-<>5'- (/V-4-C> 3'-bis-(te/t-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate (Ia.3) (0.041 g, 0,052 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (0,5 ml), une solution de TFA (0,5 ml, 50% dans le dichlorométhane v/v) est ajoutée au goutte à goutte à O ⁰ C. La réaction est complète après Ih 15 à température ambiante. Le mélange réactionnel est co-évaporé 2 fois avec du CH ₂ CI ₂ et 4 fois avec de l'éthanol. La purification du résidu sur une colonne chromatographie en utilisant comme éluant avec un mélange dichlorométhane/éthanol (9/1, v/v) permet d'obtenir le dérivé (1.3) désiré (0,026 g, 72%) sous la forme d'un solide blanc.

RMN ¹ H (DMSOd ₆ , 400 MHz) δ 7.71 (d, IH, J = 6,9, H-6), 7.41, 7.04 (2s, 2H, NH2), 7.3 (m, 5H, Ph), 6.50 (s, IH, OH), 6.16 (m, IH, H-IO, 5.91 (d, IH, J = 6.9, H-5), 5.78 (m, IH, NH), 4.15 (m, 3H, H-3', H-5' et H- 5'0, 3.96 (m, 5H, H-4', CH ₂ O et CH ₂ N) 3.05 (t, 2H, J = 6.3, CH ₂ S), 1.17 (s, 9H, CH ₃ )

RMN ³¹ P (DMSO-d ₆ , 121 MHz) δ 10.1, 9.9 SM FAB>0 (G-T) m/z 1053 (2M+H) ⁺ , 577 (M+H) ⁺

EXEMPLE 4

Préparation de la prodroαue de la αemcitabine de formule (IA) :

Intermédiaire (IV.2) : Le 2,2-diméthyl-3-triphénylméthoxy-5-2-éthylthio propanoate est obtenu selon un protocole décrit dans une publication antérieure, A.-L. Villard, et ai, Bioorganic and Médicinal Chemistry, 2008, 16, 7321.

Intermédiaire (III.2) : 0-[S-(2,2-diméthyl-3-£>triphénylméthoxy-propionyl)-2- thioéthyl] hydrogénophosphonate monoester, sel de triéthylammonium

A une solution de 2,2-diméthyl-3-triphénylméthoxy-S ^L 2-éthylthiopropanoate (IV.2, 9,5 g, 22,6 mmol) dans de la pyridine anhydre (30 ml_) est ajoutée une solution d'acide phosphoreux (18,5g, 225,9 mmol) dans de la pyridine (113 ml_). A la suspension résultante est additionnée au goutte à goutte du chlorure de pivaloyle (15,3 mL, 124,2 mmol). Après 3 heures d'agitation à température ambiante, une solution de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB, 40 mL, 1 M, pH 7) est ajoutée au mélange réactionnel. La solution est diluée avec de l'acétate d'éthyle (250 mL) et une solution de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB, 250 mL, 0,5 M, pH 7). Le mélange est décanté et la phase aqueuse est extraite à l'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur Na ₂ SU ₄ , filtrées puis évaporées sous pression réduite pour donner une huile jaune qui est ensuite coévaporée avec du toluène. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (dichlorométhane / triéthylamine, 99/1, v/v) en utilisant comme éluant un gradient de méthanol de 0 à 10% dans du dichlorométhane contenant 1% de triéthylamine. Le <>[S-(2,2-dimethyl-3-α triphénylméthoxy-propiony!)-2-thioéthyl] hydrogénophosphonate monoester (sel

de triéthylammonium, III.2) est obtenu sous la forme d'une huile jaune (9,77 g, 74%).

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 7,31 (m, 6H, Ph), 7,16 (m, 9H, Ph), 6,70 (d, IH,

Jp. _H = 634, PH), 3,85 (m, 2H, CH ₂ O), 3,08 (m, 4H, CZi ₂ OTr, 5CH ₂ ), 2,94 (q, 6H, J= 7,3, CH ₂ H) ₁ 1,18 (t, 9H, J= 7,3, C^CH ₂ N), 1,07 (s, 6H, CH ₃ )

RMN ¹³ C (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 203,6 (Is, C=O), 142,6, 127,7, 126,7, 126,1 (Ph),

85,3 (C(Ph) ₃ ), 66,1 (CH ₂ OTr), 61,5 (CH ₂ O), 49,3 (C(CH ₃ J ₂ ), 44,5 (CH ₂ N), 28,4 (SCH ₂ ), 21,8 (C(CH ₃ ) ₂ ), 7,5 (CH ₃ CH ₂ N)

RMN ³¹ P (CDCI ₃ , 121 MHz) δ 3,4

SM FAB>0 (GT) m/z 586 (M+ H) ⁺ , 243 (Tr) ⁺

FAB<0 (GT) m/z 483 (M-HNEt ₃ ) ^" , 259 (TrOH) ^" , 181 (M-TrOSATE) ^"

Intermédiaire (II.2) : 0[5-(2 _/ 2-diméthyl-3-Otriphénylméthoxypropionyl)-2- thioéthyl]-0-5'-(/V-4-(>3'-bis(te/t-butoxycarbonyl) gemcitabine hydrogénophospho -nate diester

La /\A4-C^3'-bis(terf^butoxycarbonyl)gemcitabine (obtenue selon Z. W. Guo, J. M. GaIIo, J. Org. Chem., 1999, 64, 8319) (4,2 g, 9,1 mmol) et le O[5 ^L (2,2-dimethyl- 3-CMriphénylméthoxypropionyl)-2-thioéthyl] hydrogénophosphonate monoester (sel de triéthylammonium, III.2), (8,0 g, 13,6 mmol) sont co-évaporés avec de la pyridine, puis dissous dans de la pyridine anhydre (140 ml), puis du chlorure de pivaloyl (2,8 ml, 22,7 mmol) est alors additionné goutte à goutte. Après 3h, la réaction est arrêtée par ajout d'acétate d'ammonium (25 ml, 0,5 M), le mélange réactionnel est dilué dans du dichlorométhane (250 ml) puis lavé avec de l'acétate d'ammonium (250 ml, 0,01 M). La phase organique est séchée sur Na ₂ SO _-I , filtrée puis évaporée sous pression réduite pour donner une huile jaune qui est ensuite coévaporée 3 fois avec du toluène. Une purification par chromatographie sur colonne, utilisant comme éluant un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle, 7/3,v/v + 0,2% d'acide acétique, permet d'obtenir le O-[5 ^L (2,2-Dimethyl-3-C? - triphénylméthoxypropionyl)-2-thioéthyl]-C>-5'-(/V-4-c& gt;3'-bis(te/t-butoxycarbonyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester (II.2) (6,9 g, 72%) sous la forme d'une mousse blanche.

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 7,85 (d, IH, J= 6,3, H-6), 7,31 (m, 16H, Ph et H- 5), 6,91 (d, IH, ¹ Jp- _H = 719, P-H) 6,50 (m, IH, H-IO, 5,15 (m, IH, H-

30, 4,34 (m, 3H, H-4', H-5' et H-5"), 4,21 (m, 2H, CH ₂ O), 3,22 (m, 4H, CH ₂ OTr et CH ₂ S), 1,53 (s, 18H, CH ₃ Boc), 1,25 (s, 6H, CH ₃ SATE)

RMN ¹³ C (CDCI ₃ , 75 MHz) ô 203,4 (CO SATE), 163,7 (C-4), 153,8 (C-2), 151,8 (CO BOC) ₇ 151,1 (CO Boc), 145,1 (C-6), 143,4, 128,2, 127,8, 127,0 (Ph), 121,1 (C-20, 95,3 (C-5), 85,8 (4Ph) ₃ ), 83,9 (C(CH ₃ J ₃ , C-IO, 81,3 (αCH ₃ ) ₃ ), 76,6 (C-40, 72,5 (C-30, 69,5 (CH ₂ OTr), 63,6 (C-50, 63,5 (CH ₂ O), 50,3 (C(CH ₃ J ₂ ), 28,4 (CH ₂ S), 27,7, 27,1 (CH ₃ ), 22,3 (CH ₃ )

RMN ³¹ P (CDCI ₃ , 121 MHz) δ 8,4, 8,8

SM FAB>0 (G-T) /77/Z930 (M+H) ⁺ , 243 (Tr) ⁺

FAB<0 (G-T) λ7/z928 (M-H) ^" , 526 (M- TrOSATE) ^"

Intermédiaire (Ia.4) : /V-(benzylamino)-0[S ^L (2,2-diméthyl-3-C»-triphényl méthoxyρroρionyl)-2-thioéthyl]-05'-(/V-4-C>-3'-bis-(� �s/*-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate diester

Ae CV[S-(2,2-diméthyl-3-αtriphénylméthoxypropionyl)-2-thio� �thyl]-C>-5'-(/V-4-α-3'- bis(te/t-butoxycarbonyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester (II.2) (1,0 g, 1,07 mmol) est co-évaporé 2 fois avec de la pyridine anhydre, puis dissout dans du tétrachlorure de carbone (25,5 ml). A cette solution, de la benzylamine (0,35 ml_, 3,22 mmol) est additionnée goutte à goutte. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante. Après Ih 15, le mélange réactionnel est dilué avec du dichlorométhane (100 ml) et lavé avec une solution d'acide chlorhydrique (100 ml, 0,1 N, pH = 1) jusqu'à ce que le pH de la solution aqueuse soit acide (pH≈l). La phase organique est neutralisée avec une solution aqueuse de NaHCO ₃ puis lavée avec de l'eau (100 ml) et séchée sur Na ₂ SO- _I , puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Une purification par chromatographie sur colonne, en éluant avec un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle (7/3, v/v) donne le /V- benzylamino-0[5 ^L (2,2-diméthyl-3-0-triphénylméthoxypropionyl)-2-thioéthyl ]-0 5'-(/V-4-03'-bis-(tert-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate (Ia.4) (0,907 g, 82%) sous la forme d'une mousse blanche.

RMN ¹ H (DMSO-d ₆ , 300 MHz) ô 10,6 (s, IH, NH), 8,01 (d, IH, J = 6,5, H-6), 7,28 (m, 2OH, Tr et Ph), 7,08 (d, IH, J = 6,5, H-5), 6,30 (m, IH, H- 10, 5,78 (m, IH, NHBn), 5,25 (m, IH, H-30, 4,42 (m, IH, H-40, 4,23

(m, 2H, H-5' et H-5"), 3,95 (m, 4H, CH ₂ O et CH ₂ N), 3,05 (m, 4H, CH ₂ Otr et CH ₂ S), 1,45 (s, 18H, CH ₃ ), 1,11 (s, 6H, CH ₃ )

RMN ¹³ C (DMSO-Cl ₆ , 100 MHz) δ 201,2 (CO), 161,4 (C-4), 151,5 (CO, Boc), 149,4 (C-2), 148,8 (CO, Boc), 142,5 (C-6), 141,1, 138,1, 125,9, 124,8, 124,4 (C-Ph), 118,8 (C-20, 93,0 (C-5), 83,5 (C(Ph) ₃ ), 82,5 (C- 10, 81,6, 79,1 (αCH ₃ ) ₃ ), 74,5 (C-40, 70,5 (C-30, 67,2 (CH ₂ O), 61,7 (C-5'), 48,1 (αCH ₃ ) ₂ ), 41,9 (CH ₂ O), 39,8 (CH ₂ N), 26,1 (CH ₂ S), 24,8, 24,5 (CH ₃ Boc), 20,1 (CH ₃ tBu)

RMN ³¹ P (DMSO-Ci ₆ , 121 MHz) δ 10,2, 10,0

SM FAB>0 (G-T) m/z 1035 {M+H) ⁺ , 793 (M-Tr) ⁺ , 464 (diBocGemC) ⁺ ,

243 (Tr) ⁺

FAB<0 (G-T) m/z 1033 (M-H) ^" , 791 (M- Tr) ^" , 631 (M- TrOSATE) ^" , 531 (M- TrOSATE-Boc) ^"

Prodrogue (1.4) : /V-(benzylamino)-0(5 ^L (2,2-diméthyl-3-hydroxypropionyl)-2- thioéthyl)-0-5'-gemcitabine phosphoramidate diester

A une solution agitée de λ/-^benzylamino)-0(5-(2,2-diméthyl-3-0 triphénylméthoxypropionyl)-2-thioéthyl)-0-5'-(/V-4-03'-bi s-(te/t-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate (Ia .4) (4,2 g, 4,06 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (45 ml), une solution de TFA (45 ml, 50% dans le dichlorométhane v/v) est ajoutée au goutte à goutte à 0 ⁰ C. La réaction est complète après Ih 15 à température ambiante. Le mélange réactionnel est co-évaporé 2 fois avec du CH ₂ CI ₂ et 4 fois avec de l'éthanol. La purification du résidu sur une colonne chromatographique de gel de silice en utilisant comme éluant avec un mélange dichlorométhane/éthanol (9/1, v/v) suivie d'une chromatographie sur phase inverse RP18 en utilisant comme éluant un gradient d'acétonitrile 20% vers 50% dans l'eau, permet d'obtenir le dérivé (1.4) désiré (1,59 g, 66%) sous la forme d'un solide blanc.

RMN ¹ H (DMSO-de, 400 MHz) ô 7,54 (m, 3H, H-6 et NH ₂ ), 7,28 (m, 5H, Ph), 6,44 (s, IH, OH), 6,17 (t, IH, J = S ₁ H-IO, 5,76 (m, 2H, H-5 et NH), 4,96 (s, IH, OH), 4,16 (m, 3H, H-3', H-5' et H-5'0, 3,97 (m, 3H, H-4' et CH ₂ N), 3,89 (m, 2H, CH ₂ O), 3,70 (s, 2H, QH ₁ QH), 3,04 (m, 2H, CH ₂ S), 1,11 (s, 6H, CH ₃ )

RMN ¹³ C (DMSOd ₆ , 100 MHz) ô 204,5 (CO), 165,7 (C-4), 154,5 (C-2), 141,6 (C-6), 140,9, 128,7, 127,6, 127,3 (C-Ph), 120,5 (C-20, 95,3 (C-5), 84,2 (C-IO, 78,8 (C-4 ⁷ ), 69,9 (C-3 ⁷ ), 68,8 (CH ₂ ), 66,8 (CH ₂ OH), 64,4 (C-50 _ι 52,2 (αCH ₃ ) ₂ ), 44,7 (CH ₂ N), 28,7 (CH ₂ S), 22,3 (CH ₃ )

RMN ³¹ P (DMSO-de, 121 MHz) δ 10,1, 9,9

SM FAB>0 (G-T) m/z 1035 (M +H) ⁺ , 793 (M-Tr) ⁺ , 464 (diBocGemC) ⁺ ,

243 (Tr) ⁺

FAB<0 (G-T) m/z 1033 (M-H)-, 791 (M- Tr) ^" , 631 (M- TrOSATE) ^" , 531 (M- TrOSATE-Boc) ^"

Microanalyse Calculée pour C ₂₃ H _3I F ₂ N ₄ O ₈ PS : C : 46,62 ; H : 5,27 ; N: 9,46; S 5,41

Trouvée : C : 46,94 ; H : 5,53 ; N: 8,77; S : 4,83

L'évaluation de l'activité antitumorale des composés (1.1) à (1.4) dans différentes lignées cellulaires résistantes à la gemcitabine (Tableau 1), montre leur capacité à contourner, au moins en partie, les processus de résistance cellulaire.

L'évaluation de l'activité cytotoxique des composés est réalisée par un test de cytotoxicité in vitro sur lignées tumorales. Ces lignées sont cultivées en conditions stériles pendant 72 heures dans un milieu de culture avec 10% de sérum de veau foetal en présence de différentes concentrations du composé d'intérêt. Au bout de 72 heures, la prolifération cellulaire est évaluée par mesure de l'activité métabolique par réduction de MTT en cristaux de formazan. Ces cristaux sont solubilisés dans un mélange isopropanol/HCI IN (90:10, v:v) et des valeurs de densité optique sont obtenues par spectrophotométrie. Ces valeurs permettent la détermination des concentrations inhibitrices 50%, correspondant à la concentration de composé provoquant une inhibition de croissance de 50% par rapport au contrôle (lignée identique cultivée en absence de composé).

Messa et Messa/IOK

Messa est une lignée d'une patiente atteinte de sarcome des tissus mous. Messa 1OK a été produite par exposition prolongée à la gemcitabine et est dépourvue de déoxycytidine kinase (Jordheim LP, Galmariπi CM, Dumontet C. Gemcitabine

résistance due to deoxycytidine kinase deficiency can be reverted by fruitfly deoxynucleoside kinase, DmdNK, in human utérine sarcoma cells. Cancer Chemother Pharmacol. 2006; 58: 547-54.)

L1210 et L1210 IQK

L1210 est une lignée de leucémie murine. L1210 1OK a été produite par exposition prolongée à la gemcitabine et est dépourvue de deoxycytidine kinase (Jordheim LP, Cros E, Gouy MH, Galmarini CM, Peyrottes S, Mackey J, et al. Characterization of a gemcitabine-resistant murine leukemic cell line: reversion of in vitro résistance by a mononucleotide prodrug. Clin Cancer Res. 2004; 10: 5614-21)

CEM et CEM R

CEM est une lignée de leucémie humaine. CEM R est une lignée résistante dépourvue de transporteur pour les analogues de nucléosides. Ces deux lignées ont été fournies par les auteurs ayant décrit cette lignée (Gourdeau H, Clarke ML, Ouellet F, Mowles D, Selner M, Richard A, Lee N, Mackey JR, Young JD, Jolivet J, Lafrenière RG, Cass CE. Mechanisms of uptake and résistance to troxacitabine, a novel deoxycytidine nucleoside analogue, in human leukemic and solid tumor cell lines.Cancer Res. 2001 Oct l;61(19):7217-24.)

MCF7 et MCF7 IK

MCF7 est une lignée de cancer du sein humaine. MCF7 a été développée par les inventeurs et présente un niveau augmenté d'expression de la ribonucléotide réductase, une cible importante de la gemcitabine (Jordheim LP, Guittet O, Lepoivre M, Galmarini CM, Dumontet C. Increased expression of the large subunit of ribonucléotide réductase is involved in résistance to gemcitabine in human mammary adenocarcinoma cells. Mol Cancer Ther. 2005; 4: 1268-76)

A2780 et AG6000

A2780 est une lignée de cancer de l'ovaire. AG6000 est une lignée dépourvue de déoxycytine kinase. Ces lignées ont été fournies par les auteurs ayant décrit cette lignée (Al-Madhoun AS, van der WiIt CL, Loves WJ, Padron JM, Eriksson S, Talianidis I, Peters GJ. Détection of an alternative^ spliced form of deoxycytidine

kinase mRNA in the 2'-2'-difluorodeoxycytidine (gemcitabine)-resistant human ovarian cancer cell line AG6000. Biochem Pharmacol. 2004 Aug 15;68(4):601-9.)

Tableau 1. Chimio sensibilité d'une lignée cellulaire non résistante (Messa wt) et résistante (10K) exposées à différentes concentrations de gemcitabine ou d'une prodrogue (I)

Le composé asymétrique (1.3) est légèrement plus actif que la gemcitabine dans les modèles de résistance présentant un déficit en dCK (Tableau 2a et 2B). Dans le modèle MCF7 IK , les composés (1.3) et son dérivé hydroxylé (1.4) sont comparables à la gemcitabine (Tableaux 2a, 2b et 3a, 3b). Tableau 2a

Tableau 2b

Tableau 3a

Les composés (1.1) et (1.2) sont plus actifs que la gemcitabine dans des modèles de déficience en dCK (Tableau 4a, 4b).

Tableau 4a

Tableau 4b

Les IC ₅ O sont obtenues en moyennant les résultats obtenus sur trois expériences et sont exprimées en μM ± déviation standard. IC ₅₀ et les valeurs du ratio de résistance relative sont obtenues à partir des courbes d'effet de concentrations, générées par ordinateur. RR: ratio de résistance relative (IC ₅₀ Messa 10K/ Messa wt). n.m. : non mesurable.