技术领域

本发明属于新基因的制备， 特别是指一种预防大肠杆菌病的基因 t sh-Ser及其制备以及利用其编码的蛋白。

背景技术

大肠杆菌病是由大肠杆菌的某些致病性血清型 菌株引起的疾病总称。 禽 大肠杆菌病是指部分或全部由禽致病性大肠杆 菌 （APEC )所引起的局部或全 身性感染的疾病， 包括大肠杆菌性败血症，大肠杆菌性肉芽肿（ Hjar re病）、 气囊病（慢性呼吸道疾病即 CRD )、 大肠杆菌性蜂窝织炎（即炎性过程）、 肿 头综合症、 大肠杆菌性腹膜炎、 大肠杆菌性输卵管炎、 大肠杆菌性骨髓炎 / 滑膜炎（即火鸡骨髓炎综合征）、 大肠杆菌性全眼球炎及大肠杆菌性脐炎 /卵 黄囊感染。 大肠杆菌在哺乳动物主要引起肠道疾病， 而当禽类受到高致病性 大肠杆菌感染而使其防御能力不足以抵抗或完 全丧失时， 常会引起典型的继 发性局部或全身性感染。 大肠杆菌病给养禽业造成了严重的损失， 是禽病调 查中最常报道的疾病及酮体废弃的主要原因。 有资料显示： 禽肉加工中 43% 肉鸡酮体的报废与大肠杆菌性败血症有关。

现有技术主要是通过利用抗生素来进行致病性 大肠杆菌的治疗， 但是由 于抗生素的滥用， 随着细菌耐药性的增强， 大肠杆菌病也越来越难以防治。 从食品安全角度考虑， 导致直接食用这些禽畜类产品的人群感染大肠 杆菌病 的几率增加。 抗生素的用量越来越大， 致使农产品药残量增大， 导致人间接 性的食用大量的养殖用药， 这都给人类健康造成隐患。 另外传统疫苗都是通 过改变培养条件， 或在不同寄主动物上传代的办法使致病微生物 的毒性减 弱； 或是通过物理化学的方法将它们灭活。 但这样的疫苗都不理想。 因为弱 化的菌株可能发生回复突变而变成有毒的， 或者失去免疫原性， 灭活不适当 的疫苗还会引起疾病的流行。 因此， 迫切需要发展一种性能更佳的新型预防 大肠杆菌病的广谱菌苗。

有研究表明， 禽大肠杆菌的外膜蛋白在致病性和免疫方面都 起着重要的 作用。 赵香汝和杨汉春的研究（赵香汝， 杨汉春.不同血清型禽大肠杆菌外膜 蛋白免疫原性研究 [J] .张家口农专学报. 1999， 第 15卷第 4期： 4- 6. )表明不 同血清型禽大肠杆菌混合的外膜蛋白免疫， 无论对同型或异型菌株的攻击， 都有一定的保护作用。 李晓霞和邱玉玉的研究（李晓霞， 邱玉玉， 王海蓉.肠 致病性大肠杆菌外膜蛋白免疫保护性研究 [J].中国免疫学杂志.2007， 第 23 卷第 4期： 394- 397.)表明肠致病性大肠杆菌外膜蛋白可以诱导� ��对大肠杆菌 的特异性体液免疫和细胞免疫应答。

禽致病性大肠杆菌中的 tsh基因在应用中主要是其翻译表达的蛋白将大 肠杆菌粘附于正常的体细胞表面， 在文献 （陈祥， 刘静， 高嵩， 潘志明， 焦 新安， 刘秀梵.禽病原性大肠杆菌 0和 基因缺失的构建 [J].生物工程学 报.2008, 24 ( 3 ) : 401-408.)报道中出现过将 tsh基因敲除后， 大肠杆菌 病的发病率将会降低的说明， 但未见用单一细分的 h基因及其翻译的蛋白 对于对大肠杆菌病预防的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种预防大肠杆菌病的 基因 tsh-Ser。

本发明的目的之二在于提供一种预防大肠杆菌 病的基因 tsh- Ser 的制备 方法。

本发明的目的之三在于提供一种预防大肠杆菌 病的基因 tsh-Ser 编码的 蛋白。

本发明的整体技术构思是：

预防大肠杆菌病的基因 tsh-Ser, 其 DNA序列为： gctaggaaatgtgttcataagtctgtcagacgtctgtgtttcccggttttattactgatc ccggta ctat tctctgcaggaagtcttgcgggaacggtcaataatgaactcgggtatcagt tat ttcgtgat gaatttgtcggtacgctggataaggcagctatgcctgatttcagtgctgtggattcggaa atcggt gtggcgacactgataaacccgcagtatatcgccagcgtgaaacataacgggggatataca aacgtt agct ttggtgatggtgaaaaccgttacaatatcgtggaccggaataatgcgccgtcactggatt tt catgccccccggctggataaactggtgacagaggttgcccctactgcggtgacggcgcag ggggca gtggctggcgcatatctggataaggagcgctatcctgttttttatcgtctggggtctggt actcag tatattaaggacagtaacggacagctgacaaaaatgggaggtgcatattcctggctgacc ggcggg

T6S000/fT0ZN3/X3d ctgagtcctgacctgactcttcagaatcagatgt tgtacagcctgtttaacgggtaccgcaatatc t agcgggagcctgaatgcaccggatgccaccgtcagcatgacagacacccagtggtcgatg aac

cc ttcacgacactgacaacagataatctggacgcggt tcagtcagcat t tgtc tgcgtacagac

acagctgataatctgttcagggcatcaacacgggt tgtgggattcagtgatgtcacccccatcctt agtgtcagaaaagaggacgggaaaaaagagtgggtcctcgatggttaccaggttgcacgt aacgac ggccagggtaaggctgccgccacattcatgcacatcagctataacaacttcatcactgaa gttaac aacctgaacaaacgcatgggcgatttgagggatattaatggcgaagccggtacgtgggtg cgtctg ctgaacggttccggctctgctgatggcggtttcactgaccactataccctgctgcagatg ggggct gaccgtaagcacgaactgggaagtatggacctgt t taccggcgtgatggccacctacactgacaca ga tgcgtcagcagacctgtacagcggtaaaacaaaa tea tggggtggtggtt tctatgccagtggt ctgaactttgccggagctggtaaacagaacttccgcagccattcactgtatgcaggtgca gaagtc ggataccgttatcatctgacagatacgacgtttgttgaacctcaggcggaactggtctgg ggaaga ctgcagggccaaacatttaactggaacgacagtggaatggatgtctcaatgcgtcgtaac agcgtt aatcctctggtaggcagaaccggcgttgtttccggtaaaaccctcagtggtaaggactgg agtctg acagcccgtgccggcctgcattatgagttcgatctgacggacagtgctgacgttcatctg aaggat gcagcgggagaacatcagattaatggcagaaaagacagtcgtatgctttacggtgtgggg ttaaat gcccggtttggcgaca tacgcgtctggggctggaagttgaacgctctgcatttggtaaatacaac acagatgatgcgataaacgctaatattcgt tattcat tctga。

预 防 大 肠 杆 菌 病 的 基 因 tsh-Ser 的 制 备 方 法 ， 以 5， -atgaacagaatt tatt-3' 为上游弓 |物 zxl, 以 5， - gaatgaataacgaa-3' 为 下游引物 zx2，以 078血清型大肠杆菌的质粒 DNA为模板，采用 PCR扩增方法获 得。

tsh Ser编码的蛋白， 其氨基酸序列如下：

AlaArgLysCysValHisLysSerValArgArgLeuCysPheProValLeuLeuLeuIle ProVal jQSSiHdsvXlOJaS^IV^lvnsisXqdsvuivIWJdUiOJmusviXxBivsTHoniBAO Jd

siH^IOieA^dniOd-ilJm^lVusv-ias^SuiOdsvimoJdaqdJAiXi -i^I-im-issUTO XiOsAiXiOjasniOJQSdJxXiousvngiBivi^AS^IsvBlvS vnai^lV-i^ldsvng jqi

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T6SOOO/ClOiN3/X3d ^CZC8l/1-T0i OAV 本发明的具体工艺步骤和工艺条件还有：

制备方法中的步骤 A是选用 OMEGA公司提供的质粒提取试剂盒（ P 1 a sm i d Mini Kit I D6943-01*)，并按照其说明书进行， 提取出 078 血清型大肠杆 菌的质粒 DNA。

步骤 B是选用全式金公司提供的 PCR试剂盒，并按照其说明书进行； 通过 PCR 扩增来获得目的基因。 设计上游引物为 zxl: 5' -atgaacagaatttatt

-3' ，下游引物为 zx2: 5， -gaatgaataacgaa-3' 为特异引 以 078血清型 大肠杆菌质粒 DNA为模板， 釆用 PCR扩增方法获得。

PCR反应体系如下：

反应物 用量

10 X Buffer (含 Mg ²⁺ ) 2.5μΙ

2.5mmol/L dNTP 2. Ομί

20mmol/L zxl 0.5μί

20mmol/L zx2 0.5 pL

DNA模板 2.5 M L

2.5U/mL Taq酶 0.5

ddH ₂ 0 16. 5 L

总体积 25. Ομί

PCR反应条件为： 96°C预变性 5分钟， 94'C变性 1分钟： 50°C退火 30-60 秒， 72°C延伸 1-2分钟， 30个循环； 72°C延伸 10分钟后， 置于 4°C冰箱保 存。

本发明中的引物由申请人自行设计， 主要基于产物的特异性好、 引物精 简不冗长、 不易引起错配等技术考虑。

本发明中的 tsh-Ser基因和大肠杆菌 01血清型的温度敏感血凝素 tsh基 因很相似。 经过序列比对， 该基因与国际基因库上收录的从美国火鸡体内 分 离得到的大肠杆菌 01 血清型基因序列的同源性为 99% , 序列比对表明： 第 1900 位的碱基由 G 突变为 A, 氨基酸国际基因库中的氨基酸序列由甘氨酸 (Gly ) 突变为丝氨酸（Ser) 。 后续的实验表明， 碱基突变之后该基因对大 肠杆菌病产生很好的预防作用。

tsh- Ser基因与 tsh基因同源性、 广谱性及免疫效果比较对照 与 01血清型来源的 能够免疫的致病性

免疫效果 t sh基因的同源性 血清型 （广谱性）

从美国火鸡分离的 01

100% 01 80% 血清型的 t sh基因

01 100%

02 100%

057 100% 从中国鸡分离的 078血

99% 065 100% 清型的 t sh-Ser基因

078 100%

085 100%

092 100% 由上表可知如下结果:

1、 本发明中的 t sh-Ser基因和 01血清型来源的 t sh基因相比具有较高的 同源性 （99% ) 。

2、 本发明中的 t sh-Ser基因和 01血清型来源的 t sh基因相比， 能够对更 多血清型的大肠杆菌 （01、 02、 057、 065、 078、 085、 092 血清型） 产生免 疫。

3、 与 01血清型来源的 t sh基因相比， 本发明中的 t sh- Ser基因对更多血 清型的大肠杆菌（01、 02、 057、 065、 078、 085、 092血清型）的免疫效果均 为 100%。

本发明与现有技术相比所具有的实质性特点和 显著技术进步在于：

1、 通过 PCR方法从致病性大肠杆菌 078血清型上获得了基因 t sh- Ser , 与发致病性大肠杆菌 01血清型上获得的 t sh基因相比， 该基因的一个碱基突 变之后， 其密码子所代表的氨基酸由甘氨酸突变为丝氨 酸。

2、 由于基因 t sh-Ser发生突变导致蛋白结构和功能产生了变化 。 使该基 因对 6种血清型大肠杆菌（01、 02、 057、 065、 078、 085、 092血清型）均能 产生免疫性， 所以具有较高的广谱性。

3、 基因 t sh-Ser 对 6 种血清型大肠杆菌 （01、 02、 057、 065、 078、 085、 092血清型）的免疫效果均为 1 00%， 因此该基因对易感大肠杆菌病的动 物具有更好的免疫效果， 相比现有的 t sh 基因具有更为广阔的工业开发前 景。

附图说明

本发明的附图有：

图 1致病性大肠杆菌 078血清型来源的基因经 PCR后， 该 t sh-Ser基因 的 1%琼脂糖凝胶电泳图。

图 1 中 M 为 DL8000 Marker (指示范围为 8000， 5000, 3000, 1500,

1000, 500 ) ； 扩增得到的 tsh片段长度 4134bp, 与预期大小相符。

图 2 PCR反应两端条件的反应产物经 1%琼脂糖凝胶电泳图。

图 2 中 DL8000 Marker (指示范围为 8000, 5000, 3000， 1500, 1000,

500 ) ； 扩增得到的片段长度 4134bp, 与预期大小相符。

具体实施方式

附图给出了本发明的实施例， 以下结合附图对本发明的实施例作进一步 描述， 但不作为对本发明的限定， 本发明的保护范围以权利要求记载的内容 为准， 任何依据说明书做出的等效技术手段替换， 均不脱离本发明的保护范 围。

实施例 1

A、 用营养肉汤活化培养 078血清型大肠杆菌， rc, 200转 /分钟， 培养

18小时， 获得 078血清型大肠杆菌培养物； 利用 OMEGA试剂盒（Plasmid Mini Kit I D6943-01*)并按照试剂盒中所规定的搡作步骤提� �质粒 DNA, 以提取 的质粒 DNA作为 PCR反应的模板；

B、 PCR反应体系如下:

反应物 用量

10 X Buffer (含 Mg ²⁺ ) 2.5 μΙ

2.5mmol/L dNTP 2. Ομί

20mmol/L zxl 0.5 μί

20mmol/L zx2 0.5 μί

DNA模板 2.5 pL

2.5U/mL Taq畴 0.5 ML

ddH ₂ 0 16.5 L

总体积 25. Ομί

C、 预防大肠杆菌病的基因 tsh- Ser的制备方法， 以 5， -atgaacagaatt tatt-3' 为上游弓 I物 zxl, 以 5， -gaatgaataacgaa-3' 为下游引物 zx2, 以 078血清型大肠杆菌为模板， 釆用 PCR扩增方法获得。 PCR反应条件为： 96°C 预变性 5分钟， 94°C变性 1分钟； 5(TC退火 30秒， 72°C延伸 1分钟， 30个循 环； 72°C延伸 10分钟后， 置于 4°C冰箱保存。

PCR产物经过 1%琼脂糖凝胶电泳， 电泳图如图 2(左边第一条泳道）所示。 实施例 2

A、 用营养肉汤活化培养 078血清型大肠杆菌， 37°C, 200转 /分钟， 培养 18小时， 获得 078血清型大肠杆菌培养物； 利用 OMEGA试剂盒（Plasmid Mini Kit I D6943-01*) 并按照试剂盒中所规定的搡作步骤提取质粒 DNA， 以提取 的质粒 DNA作为 PCR反应的模板；

B、 PCR反应体系如下：

反应物 用量

10 X Buffer (含 Mg ²⁺ ) 2.5 μ L

2.5画 ol/L dNTP 2. Ομί

20mmol/L zxl 0.5pL

20mmol/L zx2 0.5 ML

DNA模板 2.5 μ L

2.5U/mL Taq酶 0.5 _M L

ddH ₂ 0 16.5pL

总体积 25. OML

C、 预防大肠杆菌病的基因 tsh-Ser的制备方法， 以 5， -atgaacagaattta tt-3' 为上游引物 zxl， 以 5， -gaatgaataacgaa-3' 为下游引物 zx2， 以 078 血清型大肠杆菌质粒 DNA为模板， 采用 PCR扩增方法获得。 PCR反应条件为： 96°C预变性 5分钟， 94 变性 1分钟； 50°C退火 45秒， 72°C延伸 1.5分钟， 30个循环； 72°C延伸 10分钟后， 置于 4 冰箱保存。

PCR产物经过 1%琼脂糖凝胶电泳， 电泳图如图 1所示。

实施例 3

A、 用营养肉汤活化培养 078血清型大肠杆菌， 37°C, 200转 /分钟， 培养 18小时， 获得 078血清型大肠杆菌培养物； 利用 OMEGA试剂盒（Plasmid Mini Kit I D6943-01*)并按照试剂盒中所规定的操作步骤提� �质粒 DNA, 以提取 的质粒 DNA作为 PCR反应的模板；

B、 PCR反应体系如下：

反应物 用量 10 x Buffer (含 Mg ²⁺ ) 2.5 μΙ

2.5隱 ol/L dNTP 2.0μΙ

20tnmol/L zxl 0.5 _M L

20mmol/L zx2 0.5 ί

DNA模板 2.5 M L

2.5U/mL Taq酵 0.5 L

ddH ₂ 0 16.5μί

总体积 25. Ομί

C、 预防大肠杆菌病的基因 tsh- Ser的制备方法， 以 5， -atgaacagaatt tatt-3' 为上游引物 zxl， 以 5， -gaatgaataacgaa-3' 为下游引物 zx2， 以 078血清型大肠杆菌为模板， 采用 PCR扩增方法获得。 PCR反应条件为： 96°C 预变性 5分钟， 94°C变性 1分钟； 5(TC退火 60秒， 72°C延伸 2分钟， 30个循 环； 72°C延伸 10分钟后， 置于 4'C冰箱保存。

PCR产物经过 1%琼脂糖凝胶电泳， 电泳图如图 2(左边第二条泳道)所示。 实施例 1-3得到的 DNA序列和氨基酸序列如前述。 由实施例 1、 实施例 2 和实施例 3的 PCR产物经过 1%琼脂糖凝胶电泳图可知： 当 PCR的退火温度在 30-60秒、 延伸时间范围分别在 1-2分钟时， 当 PCR的退火温度在 45秒、 延 伸时间范围在 1.5 分钟时， PCR产物的特异性最好， 没有出现拖尾现象； 当 PCR的退火温度范围在 30秒和 60秒、 延伸时间分别在 1.5分钟向 1分钟和 2 分钟延伸时， PCR 产物的特异性降低， 出现拖尾现象。 拖尾现象的出现会使 PCR产物和开环的质粒进行连接时降低形成阳性 重组质粒的成功率。