Méthode de pronostic d'hémopathies

La présente invention concerne une méthode de pronostic d'hémopathies, plus particulièrement le pronostic personnalisé, ou théranostic, des hémopathies.

La leucémie myéloïde chronique fait partie des maladies du sang regroupées sous le nom de « syndromes myéloprolifératifs ». Elle se caractérise par une production excessive et persistante au sein de la moelle osseuse des globules blancs anormaux (des polynucléaires neutrophiles pathologiques). Sans traitement adapté, elle évolue en leucémie aiguë, caractérisée par l'accumulation de cellules immatures dans la moelle osseuse.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une maladie relativement rare, puisque l'on compte environ 600 nouveaux cas par an en France. Elle est un peu plus fréquente chez l'homme que chez la femme. Sa fréquence augmente avec l'âge. Au moment du diagnostic, l'âge médian des patients est de 53 ans.

La maladie est liée à l'apparition d'une anomalie liée à une translocation entre les chromosomes 9 et 22 dans des cellules souches de la moelle osseuse, provoquant l'apparition d'un petit chromosome anormal, le chromosome Philadelphie (du nom de la ville des Etats-Unis où a eu lieu le congrès au cours duquel a été présenté pour la première fois l'anomalie chromosomique - en 1960). Cette anomalie induit l'assemblage par erreur d'un gène du chromosome 9, dénommée ABL, avec un gène du chromosome 22, nommé BCR. Cela produit le gène dit BCR-ABL qui est présent uniquement dans les cellules pathologiques. Ce gène produit une quantité anormalement élevée d'une enzyme, la tyrosine kinase Abelson (ABL) responsable de la production accrue des globules blancs porteurs du chromosome de Philadelphie. La leucémie myéloïde chronique évolue en trois phases :

• La phase chronique.

C'est à ce stade que la maladie est diagnostiquée chez la plupart des malades. Pendant cette phase, la leucémie évolue lentement et il n'y a pas ou peu de symptômes. Il y a encore peu de globules blancs immatures (leucoblastes) dans la moelle osseuse et dans le sang. Cette phase dure en moyenne de trois à quatre ans en l'absence de traitement.

• La phase d'accélération.

Elle correspond à une augmentation de la proportion de leucoblastes dans le sang et dans la moelle, ainsi qu'à une élévation de la charge BCR-ABL et l'apparition de nouvelles anomalies chromosomiques. Des symptômes, non spécifiques, sont plus fréquents, tels que fatigue, perte d'appétit, fièvre sans raison apparente. Si un traitement n'est pas mis en œuvre, la maladie évolue en quelques mois vers la phase aiguë, dite de transformation.

• La phase de transformation.

De chronique, la leucémie devient alors aiguë. La moelle osseuse est envahie par des leucoblastes et ne peut plus fonctionner correctement. Le pronostic de cette leucémie aiguë secondaire est très mauvais à court terme.

La prise en charge thérapeutique de la leucémie myéloïde chronique repose sur l'administration de médicaments appelés inhibiteurs de la tyrosine kinase.

L'objectif du traitement est de prévenir la transformation aiguë et sa finalité est l'éradication des cellules exprimant BCR-ABL et d'éviter la transformation en leucémie aiguë.

Au cours de la phase chronique, le traitement de première intention est constitué par l'imatinib mésylate (Glivec®). D'autres inhibiteurs de tyrosine kinase, dits de seconde génération ont été développés après l'imatinib mesylate: le nilotinib et le dasatinib. Ils sont potentiellement générateurs d'effets secondaires graves. Le nilotinib à une AMM en première ligne.

L'objectif du traitement est l'obtention d'une réponse moléculaire majeure le plus rapidement possible pour éviter une sélection clonale. Cette réponse moléculaire suit la rémission cytologique et cytogénétique.

II est donc nécessaire de fournir au patient un traitement approprié le plus rapidement possible au patient, permettant l'obtention rapide d'une réponse moléculaire majeure sans induire d'effet secondaire grave. Il existe plusieurs inhibiteurs de tyrosine kinase et un choix thérapeutique inadapté dans la première année aura par ailleurs un coût très élevé pour le système de santé.

Afin d'optimiser les choix thérapeutiques, des méthodes de pronostic visant notamment à évaluer le risque de résistance à un traitement par les inhibiteurs de tyrosine kinases (ITK) ont été développées. On peut citer par exemple la demande internationale WO 2012/049329 qui vise à prédire la réponse d'un patient à un traitement ITK en mesurant l'activité kinase sur différents substrats.

Toutefois, une telle méthode est difficile à mettre en œuvre simplement et de manière routinière.

Aussi, le besoin de fournir une méthode de pronostic personnalisé de la LMC demeure, puisqu'il n'existe pas de marqueur permettant d'optimiser simplement la décision thérapeutique entre un traitement ITK de première génération et un traitement ITK de seconde génération ou de générations ultérieures.

Un des buts de l'invention est de palier ces inconvénients.

Un autre but de l'invention est de proposer une méthode de pronostic ayant pour objectif de minimiser le risque d'échec thérapeutique.

Encore un autre but de l'invention est de réduire le coût de traitement en proposant en première intention le traitement le plus approprié au patient.

Aussi, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro de la réponse à une thérapie d'un individu atteint d'une leucémie myéloïde chronique, à partir d'un échantillon biologique leucémique issu dudit individu, ladite méthode comprenant : a. une étape de mesure du niveau d'expression des gènes d'au moins un sous- groupe de gènes choisis dans un groupe de gènes,

ledit groupe de gènes étant constitué de 25 gènes, lesdits 25 gènes comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ

ID NO : 1 à SEQ ID NO : 25,

ledit sous-groupe consistant en 7 gènes, lesdits 7 gènes comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 7,

une valeur du niveau d'expression mesuré étant obtenue pour chacun des gènes dudit sous-groupe,

b. une étape de comparaison de la valeur attribuée à l'étape précédente à chacun desdits gènes dudit sous-groupe à la valeur attribuée à chacun desdits gènes dudit sous-groupe obtenue à partir d'un échantillon biologique sain, afin d'obtenir un ratio pour chacun desdits gènes dudit sous-groupe du niveau d'expression dans l'échantillon biologique leucémique sur le niveau d'expression dans l'échantillon sain, et

c. une étape de détermination d'un score S selon la formule 1 suivante

S =∑ ratio i—∑ ratio j (formule 1 ),

où ratio i et ratio j représentent respectivement les ratios obtenus pour lesdits gènes dudit sous-groupe comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : i ou SEQ ID NO : j,

où i et j sont des entiers, i variant de 1 à 5 et j variant de 6 à 7, de sorte que :

- si S est inférieur à 1 , ledit individu aura au moins environ 40% de chances de présenter une rémission moléculaire majeure un an après le début d'une thérapie avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, et

- si S est supérieur ou égal à 1 , ledit individu aura moins d'environ 40% de chances de présenter une rémission moléculaire majeure un an après le début d'une thérapie avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération.

En d'autres termes, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro de la réponse à une thérapie d'un individu atteint d'une leucémie myéloïde chronique, à partir d'un échantillon biologique leucémique issu dudit individu, ladite méthode comprenant :

a. une étape de mesure de la quantité d'ADN complémentaires correspondant aux gènes d'au moins un sous-groupe de gènes choisis dans un groupe de gènes,

ledit groupe de gènes étant constitué de 25 gènes, lesdits 25 gènes comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 25,

ledit sous-groupe consistant en 7 gènes, lesdits 7 gènes étant identifiés par les molécules d'acides nucléiques comprenant ou consistant en les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 7,

une valeur du niveau d'expression mesuré étant obtenue pour chacun des gènes dudit sous-groupe,

b. une étape de comparaison de la valeur attribuée à l'étape précédente à chacun desdits gènes dudit sous-groupe à la valeur attribuée à chacun desdits gènes dudit sous-groupe obtenue à partir d'un échantillon biologique sain, afin d'obtenir un ratio pour chacun desdits gènes dudit sous-groupe du niveau d'expression dans l'échantillon biologique leucémique sur le niveau d'expression dans l'échantillon sain, et c. une étape de détermination d'un score S selon la formule 1 suivante

S =∑ ratio i—∑ ratio j (formule 1 ),

où ratio i et ratio j représentent respectivement les ratios obtenus pour lesdits gènes dudit sous-groupe comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : i ou SEQ ID NO : j,

où i et j sont des entiers, i variant de 1 à 5 et j variant de 6 à 7, de sorte que :

- si S est inférieur à 1 , ledit individu aura au moins environ 40% de chances de présenter une rémission moléculaire majeure un an après le début d'une thérapie avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, et

- si S est supérieur ou égal à 1 , ledit individu aura moins d'environ 40% de chances de présenter une rémission moléculaire majeure un an après le début d'une thérapie avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération. L'invention est basée sur la constatation surprenante faite par l'inventeur qu'au moins 7 gènes spécifiques comprenant ou étant constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 7, appartenant à un groupe de 25 gènes comprenant ou étant constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 25 sont suffisants pour déterminer le pronostic, à 1 an, c'est-à-dire un an après le début d'un traitement avec un inhibiteur de tyrosine kinases de première génération, suite au diagnostic de la leucémie myéloïde chronique, de patients atteints de leucémie myéloïde chronique et traités avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, i.e. traités avec de l'imatinib mesylate (Glivec®).

Les 25 gènes du groupe susmentionné sont des gènes codant des enzymes participant à la détoxification des cellules dans lesquelles des dérivés réactifs de l'oxygène s'accumulent.

La méthode de l'invention est mise en œuvre de la manière suivante :

- à partir d'un échantillon issus d'un patient, notamment un échantillon de sang, on extrait les acides nucléiques, de préférence les acides ribonucléiques (ARN), selon des méthodes connues de l'homme du métier,

- on mesure la quantité des acides nucléiques issus dudit échantillon et qui comprennent ou sont constitués des séquences SEQ ID NO : 1 à 7, cette mesure permet d'obtenir une valeur du niveau d'expression pour chacun desdits gènes,

- la valeur obtenue pour chacun des gènes précédents est comparée à la valeur obtenue pour les mêmes gènes issus d'un échantillon d'un individu indemne de toute affection hématologique, afin d'obtenir pour chacun desdits gènes des valeurs normalisées, ou ratios,

- lesdites valeurs normalisées sont sommées selon la formule 1 susmentionné, qui peut se rés

S = ratio ratio gène SEQ ID NO: j

où i varie de 1 à 5 et j varie de 5 à 6, afin d'obtenir le score S,

- on détermine le pronostic selon la valeur obtenue pour le score S obtenu à l'étape précédente.

Dans l'invention, on entend par « un échantillon biologique sain », ou par « un échantillon biologique indemne », un échantillon dont le matériel biologique qu'il contient provient d'un ou plusieurs individus sains, ou au moins dépourvu de toute affection hématologique.

Avantageusement, ledit échantillon sain est de même nature que l'échantillon testé. En d'autres termes, si l'échantillon testé est un échantillon de sang, l'échantillon sain sera également un échantillon de sang d'un autre individu. De la même manière, si l'échantillon est un échantillon de moelle osseuse, l'échantillon sain sera également un échantillon de moelle osseuse.

Il est à noter que si l'échantillon sain (ou indemne) peut correspondre à un ensemble d'échantillons issus d'individus indemnes d'affections hématologiques, l'échantillon du patient est unique, et ne correspond jamais à un mélange d'échantillons issus de patients différents.

Avantageusement, l'échantillon biologique, et donc l'échantillon biologique issu d'un individu sain, est un échantillon de sang total, de leucocytes, de cellules mononuclées circulantes ou de moelle osseuse.

Dans le contexte de l'invention, il est nécessaire de mesurer le niveau d'expression des gènes comprenant ou étant constitués des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 7. Il est toutefois possible, sans que cela n'altère la réponse pronostique obtenue, de mesurer l'expression d'un ou plusieurs autres gènes du groupe de gènes comprenant ou étant constitué par les séquences SEQ ID NO : 8 à 25, qui reflètent l'état d'oxydation de l'échantillon.

Lorsque la méthode de pronostic de l'invention est mise en œuvre, le score S permet de déterminer le pronostic, et notamment les chances de survie, d'un patient au bout d'un an, après traitement en première intention avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, notamment de l'imatinib, en particulier de l'imatinib mésylate :

- si le score S est inférieur à 1 , le patient qui est traité avec l'imatinib mésylate aura environ au moins 40% de chance de présenter, un an après le début du traitement avec ledit imatinib mésylate, une rémission moléculaire majeure, alors que

- si le score S est supérieur ou égal à 1 , le pronostic sera plus sévère et le patient qui est traité avec l'imatinib mésylate aura moins d'environ 40% de chance de présenter, un an après le début du traitement avec ledit imatinib mésylate, une rémission moléculaire majeure.

Par « réponse moléculaire majeure », on entend dans l'invention une disparition ou quasi disparition des cellules exprimant des transcrits BCR-ABL, et avantageusement un ratio BCR-ABL/ABL non recombiné inférieur ou égal à 0,1 %. L'objectif du traitement donné au patient étant une rémission complète de la maladie, il est bien entendu préférable que le transcrit BCR-ABL ne soit plus du tout détectable. Toutefois, il est actuellement considéré que le ratio susmentionné BCR-ABL/ABL non recombiné inférieur ou égal à 0, 1 % est très largement satisfaisant. Ceci correspond aux recommandations européennes de suivi des patients atteints d'une leucémie myéloïde chronique, comme cela a été publié dans Baccarani et al. 2013, Blood, 122(6), 872- 884. En résumé, ces préconisations sont : - si le taux de transcrit BCR-ABL/ABL mesuré par PCR quantitative est inférieur ou égal à 10% après trois mois de traitement, inférieur ou égal à 1 % après six mois de traitement et inférieur ou égal à 0, 1 % après douze mois de traitement avec un inhibiteur de tyrosine kinase, le traitement sera optimal,

- alors que si le taux de transcrit BCR-ABL/ABL mesuré par PCR quantitative est supérieur à 10% après six mois de traitement et supérieur à 1 % après douze mois de traitement avec un inhibiteur de tyrosine kinase, il est recommandé de changer le traitement.

Si le ratio BCR-ABL/ABL non recombiné est compris entre 0,1 et 10, on parlera alors de « réponse moléculaire intermédiaire ». Enfin si le ratio BCR-ABL/ABL non recombiné est supérieur à 10, on parlera de « mauvais répondeur » ou de « non répondeur ».

Dans l'invention, les gènes pour lesquels le niveau d'expression est mesuré sont représentés par leur ARN messager, obtenu lors de la transcription desdits gènes, ou de leur ADN complémentaire. Bien évidemment, la transcription de gènes est un processus bien connu de l'état de la technique qu'il ne sera donc pas nécessaire de rappeler.

Certains des gènes dont le niveau d'expression est mesuré dans le cadre de l'invention sont capables d'exprimer plusieurs variants, c'est à dire plusieurs molécules d'ARN messager qui diffèrent dans leur séquence. Ces variant sont généralement obtenu par épissage alternatif, ledit épissage permettant d'ajouter, supprimer ou modifier une ou plusieurs parties du produit d'expression dudit gène. Là encore, il n'est pas besoin d'expliquer le mécanisme d'épissage qui est bien connu de l'état de la technique.

Les gènes centraux du procédé selon l'invention sont les suivants :

- le gène CAT représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , codant la catalase,

- le gène SOD1 représente par la séquence SEQ ID NO : 2, codant la Superoxide dismutase [Cu-Zn],

- le gène GPX1 , représenté par la séquence SEQ ID NO : 3, et en particulier son variant 1 , GPX1 (1 ), codant la Glutathion peroxydase 1 ,

- le gène GPX4(1-2-3), représenté par la séquence SEQ ID NO : 4, et en particulier ses variants 1 à 3, codant la Glutathion peroxydase 4,

- le gène PDRX1 représenté par la séquence SEQ ID NO : 5, et en particulier ses variants 1 à 3, codant la Péroxyrédoxine,

- le gène SOD2(1 -2-3), représenté par la séquence SEQ ID NO : 6, codant pour la Superoxyde dismutase 2, et

- le gène GPX2 représenté par la séquence SEQ ID NO : 7, codant la Glutathion peroxydase 2.

En outre, comme indiqué précédemment, du fait de la présence de variants pour certains gènes, il est possible pour mesurer l'expression :

- du gène GPX4(1-2-3) de mesurer l'expression des acides nucléiques comprenant ou étant constitués des séquences SEQ ID NO : 4 et/ou SEQ ID NO : 8 et/ou SEQ ID

NO : 9,

- du gène PRDX1 de mesurer l'expression des acides nucléiques comprenant ou étant constitués des séquences SEQ ID NO : 5 et/ou SEQ ID NO : 10 et/ou SEQ ID NO : 11 , et

- du gène SOD2(1 -2-3) de mesurer l'expression des acides nucléiques comprenant ou étant constitués des séquences SEQ ID NO : 6 et/ou SEQ ID NO : 12 et/ou SEQ ID NO : 13.

Le tableau ci-dessus récapitule les gènes avantageux selon l'invention.

Les séquences indiquées ci-dessus correspondent aux séquences des ADN complémentaires correspondant aux gènes indiqués.

Les outils moléculaires utilisés dans l'invention pour mesurer l'expression des gènes présentant des variants sont tels qu'ils permettent de mesurer le niveau d'expression de l'ensemble des variants d'un même gène simultanément.

Aussi, dans le cadre de l'invention, lorsque l'on mesure le niveau d'expression du gène GPX4(1 -2-3) représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , on mesure en fait simultanément l'expression des variants dudit gène, c'est-à-dire que l'on mesure simultanément le niveau d'expression des molécules d'acides nucléique de séquence SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 9.

Afin de s'affranchir des variabilités liées aux expérimentations, le niveau d'expression de chacun des gènes d'intérêt de l'invention, c'est-à-dire au moins les gènes de séquence SEQ ID NO : 1 à 7, et de leur variants quand ils existent, choisis parmi les gènes de séquence SEQ ID NO : 1 à 25, est normalisé par rapport au niveau d'expression d'un ou plusieurs gènes dont le niveau d'expression n'est pas modulé (augmenté ou diminué) dans le cadre de la leucémie myéloïde chronique, ou plus généralement dans la cadre d'une quelconque pathologie.

Le ou les gènes permettant la normalisation sont communément les gènes dits « de ménage » (« housekeeping gènes » en anglais), qui correspondent à des gènes codant des protéines participant à l'architecture des cellules, comme l'actine ou la tubuline, ou encore des gènes codant des enzymes du métabolisme, comme par exemple le gène GAPDH codant la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase.

Ainsi en pratique, pour un gène donné, on mesure son niveau d'expression et on obtient une valeur 1 . En parallèle, on mesure le niveau d'expression de la GAPDH, et l'on obtient un score 2.

Le niveau d'expression normalisé dudit gène donné, lorsque l'on utilise par exemple la technique de northern blot, est alors obtenu par le ratio suivant : score1/score2.

Comme mentionné précédemment, le niveau d'expression des gènes étudiés dans la méthode de pronostic susmentionnée est comparé au niveau d'expression des mêmes gènes issus d'échantillons biologiques issus d'individus sains. Le niveau d'expression des gènes issus desdits échantillons biologiques sains est également normalisé par rapport à un ou plusieurs gènes « de ménage ».

Aussi, le ratio i tel que défini dans la formule 1 peut être redéfini de la manière suivante :

score 1 i (patient)

score2 (patient)

Ratio i =

s corel i{sain)

score! (sain)

où

- scorel i (patient) est le niveau d'expression mesuré pour le gène i dans l'échantillon issu de patient,

- score2 (patient) est le niveau d'expression mesuré pour le gène de ménage dans l'échantillon issu de patient,

- scorel i (sain) est le niveau d'expression mesuré pour le gène i dans l'échantillon issu d'un individu sain,

- score2 (sain) est le niveau d'expression mesuré pour le gène de ménage dans l'échantillon issu d'un individu sain.

Ainsi, la formule 1 peut se réécrire de la manière suivante :

scorel i (patient) scorel j (patient)

ssccoorree2 ( (ppaattiieenntt)) ^"1 score2 (patient)

ssccoorreell ii(Çssaaiiriri)) Z_i scorel jÇsairi)

score2 {sain) score2 {sain) où i et j sont des entiers, i variant de 1 à 5 et j variant de 6 à 7.

Une autre formulation serait la suivante : scorel 1 (patient) scorel 2 (patient) scorel 3 (patient) score2 (patient) score2 (patient) score2 (patient)

S =

scorel l{sain) scorel 2 (sain) scorel 3 (sain) scorel sain) scorel sain) scorel sain)

scorel 4 (patient) scorel 5 (patient)

score2 (patient) score2 (patient)

scorel 4{sain) scorel 5 {sain)

scorel {sain) scorel {sain)

/ scorel 6 (patient) scorel 7 (patient)

score2 (patient) score2 (patient)

scorel 6{sain) scorel 7 {sain)

scorel {sain) scorel {sain)

Dans le cas particulier de l'utilisation d'une méthode quantitative de mesure de l'expression des gènes, et notamment par PCR quantitative, on utilisera pour chaque gène deux échantillons indépendants, et le ratio sera calculé par le 2 ^"AACt où AACt = ACtéchantillonl - ACtéchantillon2 et ACt = Ct ARN - Ct ARN de référence (voir ci- après).

Une autre formulation sera

où i varie de 1 à 5 et j varie de 6 à 7, soit ς _ ^2 ^{~ Ctl} + 2 ^{~ t2} + 2 ^{~ t3} + 2 ^{~ t} + 2 ^{~ t5} ^

> -AACt6 i o -AACt7^

Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro telle que définie précédemment, dans laquelle

- si S est supérieur ou égal à 1 et inférieur ou égal à 2, ledit individu aura de 40% à 10% de chances de présenter une rémission moléculaire majeure un an après le début d'une thérapie avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération.

Avantageusement, il est possible d'affiner le pronostic du patient et de déterminer quelle sera sa réponse moléculaire majeur après un an de traitement avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, notamment l'imatinib mesylate.

Ainsi, si :

- le score S est inférieur à 1 , ledit individu aura au moins environ 40% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération,

- le score S est supérieur à 1 mais inférieur ou égal à 2, ledit individu aura de 40% à 10% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération.

Cela signifie que plus le score S augmente, plus le risque du patient de développer une résistance à l'inhibiteur de tyrosine kinase de première génération est grand, ou, en d'autres termes, plus les chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure diminuent.

Plus avantageusement, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro telle que définie précédemment, dans laquelle :

- si S supérieur à 2, ledit individu aura moins de 10% de chances de présenter une rémission moléculaire majeure un an après le début d'une thérapie avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération.

En d'autres termes, selon ce mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro telle que définie précédemment, dans laquelle, si :

- le score S est inférieur à 1 , ledit individu aura au moins environ 40% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération,

- le score S est supérieur à 1 mais inférieur ou égal à 2, ledit individu aura de 40% à 10% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, et

- S supérieur à 2, ledit individu aura moins de 10% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure s'il est traité s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération.

L'inventeur a constaté de manière surprenante que le niveau d'expression d'au moins les 7 gènes de séquence SEQ ID NO : 1 à 7 variait selon le pronostic des patients traités avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération.

Ainsi, l'invention peut être avantageusement définie comme une méthode de pronostic in vitro de la réponse à une thérapie d'un individu atteint d'une leucémie myéloïde chronique, à partir d'un échantillon biologique leucémique issu dudit individu, ladite méthode comprenant :

a. une étape de mesure du niveau d'expression des gènes d'au moins un sous-groupe de gènes choisis dans un groupe de gènes, ledit groupe de gènes étant constitué de 25 gènes, lesdits 25 gènes comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 25,

ledit sous-groupe consistant en 7 gènes, lesdits 7 gènes comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 7,

une valeur du niveau d'expression mesuré étant obtenue pour chacun des gènes dudit sous-groupe,

une étape de comparaison de la valeur attribuée à l'étape précédente à chacun desdits gènes dudit sous-groupe à la valeur attribuée à chacun desdits gènes dudit sous-groupe obtenue à partir d'un échantillon biologique sain, afin d'obtenir un ratio pour chacun desdits gènes dudit sous-groupe du niveau d'expression dans l'échantillon biologique leucémique sur le niveau d'expression dans l'échantillon sain, et

une étape de détermi selon la formule suivante

S ratio j

où ratio i et ratio j représentent respectivement les ratios obtenus pour lesdits gènes dudit sous-groupe comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : i ou SEQ ID NO : j,

où i et j sont des entiers, i variant de 1 à 5 et j variant de 6 à 7,

de sorte que :

- si le score S est inférieur à 1 , ledit individu aura au moins environ 40% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération,

- si le score S est supérieur à 1 mais inférieur ou égal à 2, ledit individu aura de 40% à 10% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, et

- si S supérieur à 2, ledit individu aura moins de 10% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure s'il est traité s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération.

Encore plus avantageusement, l'invention concerne la méthode susmentionnée dans laquelle :

- si le score S est inférieur à 1 , ledit individu aura

- au moins environ 40% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, et

- moins d'environ 60% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire intermédiaire s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération,

- si le score S est supérieur à 1 mais inférieur ou égal à 2, ledit individu aura

- jusqu'à 40% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire intermédiaire s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, et

- jusqu'à environ 25% de chances après 1 an d'être mauvais répondeur s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération,

et

- si S supérieur à 2, ledit individu aura

- moins de 10% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire majeure s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération,

- jusqu'à environ 40% de chances après 1 an de présenter une rémission moléculaire intermédiaire s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, et

- environ 50% ou plus de chances d'être mauvais répondeur s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération.

On entend dans l'invention par « réponse moléculaire intermédiaire » la quantité de transcrits BCR-ABL dans les cellules de niveau intermédiaire, et avantageusement un ratio BCR-ABL/ABL non recombiné compris entre 0, 1 % et 10% inclus (]0, 1 %-10%]).

On entend dans l'invention par «mauvais répondeur», un patient dont la quantité de transcrits BCR-ABL dans les cellules est de niveau intermédiaire, et avantageusement avec un ratio BCR-ABL/ABL non recombiné supérieur à 10%.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro telle que définie précédemment, dans laquelle la valeur du niveau d'expression mesuré est obtenue par une mesure de l'expression desdits gènes du sous-groupe par une méthode de mesure quantitative, notamment la méthode de PCR quantitative. Afin de mesurer le niveau d'expression des gènes d'intérêt, il est possible d'utiliser différentes techniques connues de l'homme du métier :

- le northern-blot, est une méthode de biologie moléculaire permettant l'analyse de l'ARN. Elle dérive du Southern blot sauf qu'au lieu d'étudier de l'ADN, on étudie de l'ARN. L'ARN va être analysé par électrophorèse, permettant de séparer les ARN en fonction de leur taille. Puis ils sont détectés par une sonde d'ADN ou d'ARN. Le northern-blot permet d'apprécier la distribution des ARN dans les tissus et d'étudier leur abondance relative. On peut alors déduire de ces observations l'expression plus ou moins importante de certains gènes. L'utilisation de marqueurs radioactifs ou fluorescents permet de quantifier le niveau d'expression.

- Les puces à ADN : le principe des puces à ADN, dont l'utilisation s'est répandue depuis les années 1990, est apparenté au northern puisqu'il est fondé sur la fixation sur un support de fragments isolés d'ADN rétrostranscrits et l'hybridation avec une sonde faite à partir d'ADN.

- La PCR - quantitative : Le principe de la PCR quantitative dite « en temps réel » repose sur la possibilité de suivre la quantité d'ADN présente dans la réaction à tout instant et non à la fin de la PCR (PCR point final). Des sondes fluorescentes se fixent soit sur l'ADN double brin (technologie SYBR) soit sur une séquence d'ADN précise (technologie Taqman et Beacon). Ces sondes ne fluorescent qu'une fois fixées à l'ADN (soit à cause d'un "quencher" soit car la fluorescence nécessite un ADN double brin). Un seuil de fluorescence est établi par le programme de la machine de PCR en temps réel. Une fois que la quantité d'ADN permet aux sondes fluorescentes de dépasser ce seuil alors on obtient un numéro de cycle PCR appelé "Ct" pour "Cycle Threshold" ou cycle seuil. C'est cette valeur qui est à la base des calculs pour quantifier l'ADN de façon absolue ou relative. Il est important de connaître l'efficacité E de la PCR. Pour cela, on effectue une PCR en temps réel sur des échantillons de dilution croissante pour obtenir une courbe étalon correspondant au couple d'amorces utilisé (spécifiques du locus d'intérêt). Par exemple, une série de dilution au 1/2 (D_{n+1}=D_n/2) doit, en théorie, donner des courbes d'amplification décalées d'un cycle PCR à chaque fois. Si tel est le cas, la réaction a alors une efficacité égale à 2 (la quantité d'ADN double à chaque cycle). En pratique, le programme de la machine de PCR en temps réel peut calculer l'efficacité E de la réaction. Plus souvent, une PCR en temps réel sur une série de dilution avec une quantité d'ADN initiale connue permet de calculer l'efficacité de la réaction. Les Ct sont placés sur un graphe en échelle logarithmique et l'équation de la régression linéaire passant par ces points donne l'efficacité (c'est le coefficient directeur).

Pour des raisons pratiques et de spécificité, il sera avantageux dans le cadre de l'invention d'utiliser la PCR quantitative utilisant la technologie Taqman et Beacon : l'expression d'un gène est suivie par une amplification par un couple d'amorce spécifiques, et la présence d'une sonde quencher permettant de quantifier le nombre de molécules. Plus avantageusement, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro telle que définie précédemment, dans laquelle la valeur du niveau d'expression mesuré est obtenue par une mesure de l'expression desdits gènes du sous-groupe mise en œuvre en utilisant au moins les oligonucléotides comprenant ou constitués des séquences SEQ ID : 32 à 45, notamment les oligonucléotides comprenant ou constitués des séquences SEQ ID : 32 à 45 et les séquences suivantes : 5'-tggggaag-3', 5'-ctgctggg- 3', 5'-tgctggag-3', 5'-ggtggtgg-3', 5'-caggagaa-3', 5'-ctgcccca-3' et 5'-ctggctgg-3'.

Dans l'invention, il est avantageux de déterminer le niveau d'expression desdits 7 gènes de séquence SEQ ID NO : 1 à 7, et des variants envisagés ci-dessus, représentés par les séquences SEQ ID NO : 26 à 31 , avec les oligonucléotides suivants :

En d'autres termes, ce mode de réalisation avantageux concerne une méthode de pronostic in vitro telle que définie précédemment, dans laquelle la valeur du niveau d'expression mesuré est obtenue par une mesure de l'expression desdits gènes du sous-groupe mise en œuvre en utilisant au moins les oligonucléotides comprenant ou constitués des séquences SEQ ID : 32 à 45, tels que

- Les oligonucléotides SEQ ID NO : 32 et 33 permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 1

- Les oligonucléotides SEQ ID NO : 34 et 35 permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 2

- Les oligonucléotides SEQ ID NO : 36 et 37 permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 3

- Les oligonucléotides SEQ ID NO : 38 et 39 permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 4

- Les oligonucléotides SEQ ID NO : 40 et 41 permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 5

- Les oligonucléotides SEQ ID NO : 42 et 43 permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 6, et

- Les oligonucléotides SEQ ID NO : 44 et 45 permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 7, et notamment dans laquelle la valeur du niveau d'expression mesuré est obtenue par une mesure de l'expression desdits gènes du sous-groupe mise en œuvre en utilisant au moins les oligonucléotides comprenant ou constitués des séquences SEQ ID : 32 à 45, tels que

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 33 et 5'-tggggaag- 3' permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 1

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35 et 5'-ctgctggg-3' permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 2

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 et 5'-tgctggag- 3' permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 3

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39 et 5'-ggtggtgg- 3' permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 4

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 et 5'-caggagaa- 3' permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 5

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43 et 5'-ctgcccca- 3'permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 6, et

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45 et 5'-ctggctgg-3' permettent de mesurer l'expression du gène de séquence SEQ ID NO : 7.

Il est en outre avantageux de normaliser l'expression de chacun des gènes susmentionnés avec l'expression de la GAPDH en utilisant les oligonucléotides de séquence SEQ ID NO : 46 et 47, et de séquence 5'-tggggaag-3'.

Avantageusement, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro telle que définie précédemment, où la valeur du niveau d'expression mesuré est obtenue par une mesure de l'expression desdits gènes du sous-groupe, ladite mesure utilisant les oligonucléotides suivants :

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 32 et 33 pour mesurer l'expression du gène comprenant ou étant constitué par la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 1 ,

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 34 et 35 pour mesurer l'expression du gène comprenant ou étant constitué par la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 2

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 36 et 37 pour mesurer l'expression du gène comprenant ou étant constitué par la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 3

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 38 et 39 pour mesurer l'expression du gène comprenant ou étant constitué par la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 4

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 40 et 41 pour mesurer l'expression du gène comprenant ou étant constitué par la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 5

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 42 et 43 pour mesurer l'expression du gène comprenant ou étant constitué par la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 6, et

- les oligonucléotides SEQ ID NO : 44 et 45 pour mesurer l'expression du gène comprenant ou étant constitué par la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 7.

L'invention concerne en outre une méthode de diagnostic personnalisé ou théranostic in vitro, d'un individu atteint d'une leucémie myéloïde chronique, comprenant

b. une étape de mesure du niveau d'expression d'au moins un sous-groupe de gènes choisis dans un groupe de gènes,

ledit groupe de gènes étant constitué de 25 gènes, lesdits 25 gènes comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 25,

ledit sous-groupe consistant en 7 gènes, lesdits 7 gènes comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 7,

une valeur du niveau d'expression mesuré étant obtenue pour chacun des gènes dudit sous-groupe,

c. une étape de comparaison de la valeur attribuée à l'étape précédente à chacun desdits gènes dudit sous-groupe à la valeur attribuée à chacun desdits gènes dudit sous-groupe obtenue à partir d'un échantillon biologique sain, afin d'obtenir un ratio pour chacun desdits gènes dudit sous-groupe du niveau d'expression dans l'échantillon biologique leucémique sur le niveau d'expression dans l'échantillon sain, et

d. une étape de détermination d'un score S selon la formule suivante

S = ratio j

où ratio i et ratio j représentent respectivement les ratios obtenus pour lesdits gènes dudit sous-groupe comprenant ou étant constitués par les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO : i ou SEQ ID NO : j,

où i et j sont des entiers, i variant de 1 à 5 et j variant de 6 à 7, de sorte que

- si S est inférieur à 1 , la leucémie myéloïde chronique dudit individu est une leucémie myéloïde chronique susceptible de répondre préférentiellement à un traitement comprenant un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, et

- si S est supérieur à 2, la leucémie myéloïde chronique dudit individu est une leucémie myéloïde chronique susceptible de répondre préférentiellement à un traitement comprenant un inhibiteur de tyrosine kinase de seconde génération ou de génération ultérieure.

Dans cette méthode de diagnostic personnalisé, notamment in vitro, de l'invention, il est possible de déterminer quel type de traitement il sera avantageux de fournir au patient atteint de leucémie myéloïde chronique afin d'obtenir une réponse moléculaire majeure. L'inventeur a fait la constatation surprenante selon laquelle lorsque que l'on mesure le niveau d'expression des gènes appartenant au groupe de gènes représentés par les acides nucléiques de séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 7, et que l'on applique la formule 1 susmentionnée, il est possible de déterminer quel sera le meilleur traitement à proposer au patient. En effet, lorsque S, tel que calculé comme indiqué précédemment, est

- inférieur ou égal à 1 , le patient aura plus de 40% de chances de présenter une réponse moléculaire majeure à 1 an après le début du traitement s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, notamment avec de l'imatinib mesylate, Le traitement à l'imatinib mesylate est donc recommandé et approprié pour le patient.

- supérieur ou égal à 2, le patient aura moins de 10% de chances de présenter une réponse moléculaire majeure à 1 an après le début du traitement s'il est traité avec un inhibiteur de tyrosine kinase de première génération, notamment avec de l'imatinib mesylate. Il sera donc approprié de proposer au patient un autre traitement et notamment de lui proposer un traitement à base d'inhibiteur de tyrosine kinase de seconde génération ou de génération ultérieure.

Dans le cas particulier où 1 <S<2, le praticien est confronté à un choix entre le traitement avec un inhibiteur de première génération et de seconde génération ou de génération(s) ultérieure(s). Dans cette situation, le praticien s'aidera alors des éléments cliniques, des co-morbidités en lien avec les effets secondaires potentiels et des scores pronostic clinico-biologiques (Score de Sokal...).

Avantageusement, l'invention concerne une méthode telle que définie précédemment, dans laquelle l'inhibiteur de tyrosine kinase de première génération est l'imatinib ou l'un de ses sels.

L'imatinib mésylate est un inhibiteur compétitif sélectif et puissant de ΓΑΤΡ pour son site de liaison sur abl, induisant une inhibition de l'activité tyrosine kinase. C'est aujourd'hui le traitement de première intention. Il est utilisé à la dose de 400 mg/j per os. Il permet d'obtenir des réponses hématologiques classiquement en un à trois mois.

En absence de réponse hématologique complète à 3 mois, on parlera d'échec de traitement. Le taux de rémission hématologique à 5 ans est de plus de 98% et le taux de rémission complète cytogénétique à 5 ans est supérieur à 87%.

Les effets secondaires sont fréquents mais d'intensité modérée: nausées, diarrhée, crampes, œdèmes et éruptions cutanées. Ils sont exacerbés chez les sujets âgés. Cependant, ils conduisent rarement à l'arrêt du traitement.

En raison du risque de neutropénie et de thrombopénie, une surveillance régulière de l'hémogramme doit être pratiquée tous les quinze jours pendant les 3 premiers mois. Il existe des résistances dites primaires et d'autres secondaires (acquises).

Les résistances primaires sont définies comme une situation de non réponse sur le plan hématologique, cytogénétique et moléculaire après des durées de traitement précises. Celles-ci impliquent alors de proposer d'autres alternatives de traitement ou d'augmenter les doses.

Tandis que les résistances secondaires sont définies par une perte de la réponse initiale ou par transformation. Plusieurs mécanismes de résistance ont été mis en évidence: modification de la biodisponibilité intracellulaire de l'imatinib, sur-expression du gène MDR (multidrug résistance), amplification de BCR-ABL, mutations du domaine kinase d'abl (>50 mutations différentes), mécanismes BCR-ABL indépendants. Dans ces cas, une augmentation de la posologie peut parfois être efficace (600 voire 800mg/j) ou un changement vers un inhibiteur de tyrosine kinase (ITK) dit de deuxième génération ou de générations ultérieures.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle l'inhibiteur de tyrosine kinase de seconde génération est le dasatinib ou le nilotinib, ou l'un de leurs sels.

Le dasatinib (Sprycel®) est un ITK dit de 2ème génération, ayant montré son efficacité chez des patients intolérants ou ayant des mécanismes de résistance par mutations acquises au Glivec®. Il est utilisé à la dose de 100mg/j. En plus de bloquer l'activité kinase de BCR-ABL, il inhibe d'autres voies de transduction comme les kinases de la famille des SRC. Contrairement à l'imatinib, le dasatinib se lie à la fois au domaine kinase de ABL dans sa conformation active et inactive, ce qui explique sa grande efficacité. La plupart des mutations de sensibilité diminuée à l'imatinib sont sensibles au dasatinib, à l'exception d'une mutation du site ATP d'ABL, associée à une résistance complète (Thréonine en Isoleucine au niveau du codon 315, T315I).

Plus récemment, cette molécule a obtenu une AMM pour une utilisation en deuxième ligne.

Parmi les effets indésirables, on note surtout des rétentions hydriques (épanchements pleuraux, péricardiques), une toxicité hématologique, diarrhée. Ainsi cette molécule est à éviter en cas d'antécédents d'hypertension, de cardiopathie ou de maladie respiratoire. Quelques cas d'hypertension artérielle pulmonaire ont été rapportés.

Le nilotinib (Tasigna®) est, comme le dasatinib, un ITK dit de 2 ^eme génération, ayant montré son efficacité chez des patients intolérants ou ayant des mécanismes de résistance par mutations acquises au Glivec®. Il s'agit d'un analogue de l'imatinib plus puissant. Il peut cibler également d'autre protéine kinase comme les récepteurs c-Kit. Comme l'imatinib, le nilotinib se lie à la conformation inactive de la kinase. Il est préconisé à la dose de 400mg 2 fois par jour à 12h d'intervalle, et à distance des repas. Les aliments entraînent une modification de sa biodisponibilité.

Le nilotinib est bien toléré, les principaux effets indésirables sont l'augmentation de la lipase, de la bilirubine, de la glycémie, une hypophosphatémie, une toxicité cutanée ainsi qu'une toxicité hématologique moins importante que le dasatinib. On évitera d'utiliser le nilotinib chez les patients ayant des antécédents de pancréatite ou de diabète mal équilibré, ainsi que les patients présentant des artériopathies

Les inhibiteurs de tyrosine kinase de génération ultérieure sont notamment : le bosutinib, le ponatinib ou des composés en phase de développement clinique, tel que le bafetinib.

L'invention concerne en outre un kit, ou trousse, comprenant,

a. au moins les oligonucléotides comprenant ou constitués des séquences SEQ ID : 32 à 45, en particulier les oligonucléotides comprenant ou constitués des séquences SEQ ID : 32 à 45 ainsi que les oligonucléotides constitués des séquences suivantes : 5'-tggggaag-3', 5'-ctgctggg-3', 5'-tgctggag-3', 5'-ggtggtgg-3', 5'-caggagaa-3', 5'- ctgcccca-3' et 5'-ctggctgg-3', et

b. les acides nucléiques d'un ou plusieurs échantillons biologiques sains, notamment les acides nucléiques d'un ou plusieurs échantillons de cellules polynucléaires ou neutrophiles du sang périphérique d'un ou plusieurs individus non leucémiques, c'est-à-dire d'un ou plusieurs individus n'étant pas affecté par une leucémie.

L'échantillon biologique sain est tel qu'il est défini précédemment.

Avantageusement, le kit, ou la trousse, comprend :

a. au moins les oligonucléotides comprenant ou constitués des séquences SEQ ID : 32 à 45, en particulier les oligonucléotides comprenant ou constitués des séquences

SEQ ID : 32 à 45 ainsi que les oligonucléotides constitués des séquences suivantes : 5'-tggggaag-3', 5'-ctgctggg-3', 5'-tgctggag-3', 5'-ggtggtgg-3', 5'-caggagaa-3', 5'- ctgcccca-3', 5'-ctggctgg-3', 5'-ctggctgg-3' et 5'-tggggaag-3', et

b. les acides nucléiques d'un échantillon biologique sain, notamment les acides nucléiques d'un échantillon de cellules polynucléaires ou neutrophiles du sang périphérique d'un individu non leucémique.

Les acides nucléiques de l'échantillon sain sont avantageusement des ARNs conservés dans des conditions limitant leur dégradation.

La trousse ou le kit peut en outre contenir des instructions sur un support approprié permettant de mettre en œuvre la méthode de diagnostic ou de théranostic susmentionnées. Il peut s'agir par exemple d'instructions définissant le programme de PCR quantitative (nombre de cycles, températures etc .), et aussi un produit programme d'ordinateur sur un support approprié permettant de réaliser le calcul de S, à l'aide de la formule susmentionnée.

Un autre aspect de l'invention porte sur un logiciel ou un produit programme d'ordinateur conçu pour mettre en œuvre la méthode susmentionnée et/ou comprenant des portions/moyens/instructions de code de programme pour l'exécution de ladite méthode lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur. Avantageusement ledit programme est compris dans un support d'enregistrement de données lisible par ordinateur. Un tel support n'est pas limité à un support d'enregistrement portable tel qu'un CD-ROM mais peut également faire part d'un dispositif comprenant une mémoire interne dans un ordinateur (par exemple des RAM et/ou ROM), ou de dispositif à mémoires externes tels des disques durs ou des clefs USB, ou un serveur à proximité ou à distance.

Avantageusement, l'invention concerne le produit programme d'ordinateur susmentionné, pour la mise en œuvre des étapes b et c de la méthode de pronostic telle que définie précédemment.

L'invention sera mieux comprise à la lumière des quatre figures et de l'exemple suivants.

Brève description des figures

La figure 1 représente un graphique montrant le niveau d'expression des 25 gènes testés chez les 35 patients testés. Le niveau contrôle (correspondant à l'expression des gènes dans des échantillons sains est normalisé à 1 . L'échelle est logarithmique.

Les gènes sont les suivants : #1 : SOD2, #2 : GLRX1 (1 -2), #3 : GSR, #4 : PRDX5(1- 3), #5 : PRDX3(1 -3), #6 : TXN, #7, CAT, #8 : SOD1 , #9, GPX1 (1 ), #10 : GPX4(1-2-3), #11 : PRDX2(1 ), #12 : PRDX1 (1 -2-3), #13 : GPX1 (2), #14 : GPX3, #15 : GPX7, #16 : TXN2, #17 : PRDX5(2), #18 : GLRX2(2), #19 : GLRX5, #20 : PRDX2(3), #21 : PRDX4, #22 : GLRX3, #23 : PRDX6, #24 : GPX2 et #25 : GLRX2(1 ).

La figure 2 représente un graphique montrant le niveau d'expression des 25 gènes testés chez les 35 patients, et regroupés selon leur réponse moléculaire : A : réponse moléculaire majeure, B : réponse moléculaire intermédiaire et C : mauvais répondeurs. La figure 3 est un histogramme montrant la répartition en pourcentage des types des réponses moléculaire selon le score S calculé. Les régions en noir correspondent à une réponse moléculaire majeure, les régions en hachuré correspondent à une réponse moléculaire intermédiaire, et les régions grises correspondent aux mauvais répondeurs. La figure 4 est un graphique représentant les valeurs du score S (ordonnée) en fonction de la distribution des patients selon la réponse moléculaire à l'imatinib mesylate obtenue un an après le diagnostic (en abscisse de gauche à droite : majeure, intermédiaire ou non répondeur). EXEMPLE :

Matériel et Méthodes

1 - Isolement des polynucléaires sanguins

Les polynucléaires du sang périphérique sont isolés par centrifugation sur Ficoll de densité d=1 , 077.

2- Extraction des ARN

Les ARN sont extraits à partir de 5.10 ^e cellules. Ces dernières ont été lavées deux fois en PBS, suivit de l'ajout de 1 mL de Trizol® (Invitrogen). Les tubes sont agités (vortex®) pendant 15 min pour bien lyser les cellules. 200 μί de chloroforme sont ajoutés pour obtenir 3 phases, suite à un passage au vortex tube par tube pendant 45 sec et à une centrifugation de 15 min à 12000 g à 4°C. La phase aqueuse supérieure contenant les ARN, la phase intermédiaire renfermant les protéines et la phase inférieure correspondant au chloroforme et phénol. Une deuxième extraction au chloroforme est réalisée sur la phase supérieure contenant les ARN. Puis, 500 μί d'isopropanol sont ajoutés à la phase supérieure de la deuxième extraction au chloroforme. Il est nécessaire de retourner les tube une dizaine de fois pour que l'isopropanol précipite les ARN, puis ces derniers sont centrifugés 10 min à 12000 g. Un premier lavage des ARN est effectué sur le culot du tube auquel est ajouté 1 mL d'éthanol 75 % suivant une centrifugation de 5 min à 7500 g. Un deuxième lavage est réalisé avec 500 μί d'éthanol 75 %. Le surnageant est éliminé une nouvelle fois par retournement et les tubes sont déposés à l'envers sur des compresses pendant au moins 20 min pour que tout l'éthanol s'évapore. L'ARN est ensuite dissout dans 40 μί d'eau DEPC et les tubes ont été mis 1 h à -20°C pour une meilleure dissolution des ARN.

3- Dosage des ARN, analyse de leur pureté et de leur qualité

La concentration des ARN est évaluée par la lecture de l'absorbance à 260 nm à l'aide du spectrophotomètre NanoDrop®. La détermination de la contamination des ARN s'effectue en faisant le rapport de l'absorbance à 260 nm sur celle à 280 nm. L'ARN est considéré comme exempt de contamination pour un rapport A260/A280 compris entre 1 ,9 et 2, 1 . La qualité des ARN est ensuite vérifiée par Bioanalyzer selon les recommandations du fabricant.

4- Reverse Transcription (RT) :

La transcription inverse (Reverse Transcription, RT) est la réaction de synthèse d'un brin d'ADN avec pour matrice un brin d'ARN. La transcriptase inverse est une ADN polymérase ARN dépendante synthétisant un brin d'ADN dit complémentaire (ADNc) d'un brin d'ARN. De plus, cette enzyme ne peut synthétiser l'ADNc qu'à partir d'une zone double brin crée par l'hybridation de l'ARN avec une amorce. La RT est réalisée avec le kit « SuperScript® VI LO™ cDNA synthesis kit » (Invitrogen). Une réaction est réalisée avec un tube de 5 μg d'ARN précédemment aliquoté. L'incubation des tubes 10 min à 70°C permet de linéariser l'ARN pour une meilleure synthèse de l'ADNc. Puis, 50 μί du mélange réactionnel suivant sont ajoutés à chaque tube : 20 μί d'eau DEPC, 20 μί de tampon 5 X VI LO contenant des amorces aléatoires, du MgCI ₂ , des dNTPs et un tampon optimisé pour la RT, 10 μί de SuperScript® Enzyme Mélange réactionnel 10 X contenant la SuperScript® I II RT (ADN polymérase ARN dépendante réduisant l'activité des RNaseH) et un inhibiteur des RNase le RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor. Les tubes sont incubés 10 min à température ambiante puis 1 à 3 h à 42°C qui est la température optimale pour que la SuperScript® I II RT synthétise l'ADNc. Les brins d'ARN matrice sont détruits en incubant les tubes 5 min à 85°C.

Pour vérifier que la qualité de la RT, une PCR de contrôle est réalisée pour le gène codant pour la β-actine, présent dans toutes cellules non musculaires. Le mélange réactionnel suivant est préparé pour une réaction : 35,6 μί d'eau DEPC (Invitrogen), 5 L de tampon 10 X (Roche), 1 μί de dNTPs (Amersham Biosciences), 1 μί d'amorce forward, 1 μί d'amorce reverse (Invitrogen), 2 μί de MgCI2 (Roche) et 0,4 μί de Taq (EuroBio). Mélange réactionnel auquel 4 μί de produit de RT sont ajoutés. La PCR est réalisée sur le thermocycler BIO-RAD C1000™ Thermal Cycler selon le programme : 95°C pendant 3 min (94°C pendant 3 sec, 60°C pendant 30 sec, 72°C durant 30 sec) ceci répété 34 fois, 72°C durant 2 min et 12°C ensuite. La migration a est effectuée sur gel d'agarose imprégné de BET, la révélation est faite sous UV.

5- PCR en temps réel

La PCR en temps réel est réalisée sur un faible nombre de cycles et en utilisant un fluorochrome dont la fluorescence est proportionnelle à la quantité d'ADN .

Le type de fluorescence détectée ici provient des sondes. L'utilisation de sondes se liant au brin d'ADN correspondant au gène d'intérêt, permet d'obtenir des courbes de florescence proportionnelle à la quantité d'ADN. En effet, une sonde est composée d'ADN complémentaire au gène cible et comprend à une extrémité, un fluorophore et à l'autre extrémité un "quencher" ou fluorophore extincteur. Lorsque les amorces se fixent de manière spécifique au brin d'ADN et que la Taq polymérase progresse le long du brin d'ADN (où est fixée la sonde), le fluorophore est libéré et émet sa fluorescence. Au fur et à mesure des cycles, la fluorescence émise va croître et sera proportionnelle à la quantité d'amplicons formés.

Les sondes, ont une séquence permettant de détecter des motifs de 8 à 9 nucléotides dont la prévalence dans le transcriptome permet une couverture optimale des gènes. Avec ce type de sonde, la spécificité de la PCR provient des primers. Le cycle-seuil ou Ct (threshold cycle) correspond au cycle au cours duquel la fluorescence de l'ADN amplifié devient significativement différente du bruit de fond. Ce seuil permet de comparer toutes les amplifications pendant la phase exponentielle. Pour que cette relation existe, il est nécessaire que le rendement de l'amplification soit de 100 %, autrement dit, que l'efficacité E du système soit de 1. En effet, si E est différent de 1 , la relation entre le Ct et la quantité initiale NO d'ARN n'est plus linéaire, et toute quantification est alors impossible. L'efficacité E d'une PCR peut être définie en traçant une courbe sur laquelle est représentée le Ct en fonction de la dilution du couple d'amorces. D'après l'équation suivante, la pente de la droite correspond à -1/(log(1 +E)). À partir de cette équation on peut écrire E=10-1/pente-1 . Donc, lorsque l'efficacité E de la PCR est de 1 , la pente de la droite est égale à -1/log2=-3,32. Les couples d'amorces doivent présenter des efficacités E supérieures à 0,85, seuil arbitraire en dessous duquel la PCR n'est plus quantitative. D'autre part, pour comparer la quantité d'ARN présente dans deux échantillons différents, il faut un autre ARN invariant servant de référence c'est-à-dire dont l'efficacité d'amplification soit proche de l'efficacité d'amplification de l'ARN étudié. Ces ARN sont rétro transcrits à partir de gènes dits « gènes de ménages » c'est-à-dire dont la transcription ne varie pas ou peu. Pour comparer les quantités relatives d'ARN d'intérêts entre deux échantillons, il faut dans un premier temps normaliser la quantité d'intérêt relativement à la quantité d'ARN de référence. Cette mesure, appelée ACt correspond au calcul suivant :

ACt = Ct ARN - ct ARN de référence. Puis on calcule le AACt = ACtéchantillonl - ACtéchantillon2 pour obtenir la variation relative exprimée par le nombre 2 ^"AACt .

L'étape de PCR en temps réel est réalisée en utilisant le kit « LightCycler® 480 Probes Master» de Roche.

Pour une réaction, le mélange réactionnel suivant est préparé : 1 ,4 μί d'eau « PCR grade », 5 μί de pré-mélange réactionnel 2 X (contenant l'ADN polymérase Taq Man, le MgCI ₂ , les dNTPs), 0,25 μί de chaque amorces du gène à quantifier, 0,1 μί de sonde UPL. L'ADNc est dilué au 1/3 et une gamme étalon de ce dernier est réalisée de 10-1 à 10-3 puis diluée au 1/3 aussi, pour évaluer l'efficacité de la PCR en temps réel. Les mélange réactionnel et ADNc ont été distribués en plaque 384 puits par le biais d'un système de pipetage automatique : epMotion® de vaudau-eppendorf. 7 μί de mélange réactionnel et 3 μί d'ADN dilué au 1/3 sont distribués pour une réaction. La PCR en temps réel est effectuée avec le LightCycler® 480 de Roche avec le programme suivant : incubation à 95°C pendant 5 min pour éviter les interactions entre les amorces et donc améliorer la sensibilité, 45 cycles de PCR à 95°C pendant 10 sec et 60°C durant 30 sec et pour finir un refroidissement à 40°C pendant 30 sec. La longueur d'onde d'excitation des sondes est de 465nm et celle de détection de 510nm. Les résultats obtenus à partir du LightCycler® 480 sont analysés avec le logiciel « LightCycler® 480 Software ».

La qRT-PCR est effectuée sur 7 gènes (isoformes): SOD1 , SOD2, CAT, SOD1 , GPX1 (1 ), GPX4(1-2-3), PRDX1 (1-2-3) avec calcul des ACt (vs. GAPDH). Le calcul du AACt (ACt- ACtm) est effectué pour chacun des gènes. Le coefficient de variation par rapport au témoins sains est ensuite déterminé : RQ = 2exp(-AACt) pour chacun des gènes. Le score S du patient est calculé en utilisant les RQ calculés pour chaque gène, selon la formule suivante :

S =∑ RQ[CAT,SOD1 ,GPX1 (1 ),GPX4(1 -2-3),PRDX1 (1 -2-3)] -∑ RQ[SOD2,GPX2]. Oligonucléotides utilisés

Résultats

L'inventeur est parti de l'hypothèse de départ selon laquelle le mauvais pronostic d'une leucémie myéloïde chronique serait lié à la fréquence en cellules souches leucémiques. Les cellules souches leucémiques présentent un taux réduit de dérivés réactifs de l'oxygène (ou ROS). Aussi, pour maintenir un taux faible de ROS, les cellules souches leucémiques devraient présenter une activité métabolique de détoxification des ROS élevée.

Un des moyens d'augmenter le métabolisme de détoxification des ROS est de modifier le niveau d'expression des gènes codant les enzymes impliquées dans ce processus. Dans un premier temps, l'inventeur a mesuré par PCR quantitative le niveau d'expression de 25 gènes codant les principales enzymes participant à la détoxification des ROS (et représentés par les séquences SEQ ID NO : 1 à 25, ou les variants de ces séquences lorsqu'ils existent) dans plusieurs échantillons biologiques (qui sont des

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP échantillons sanguins de donneurs non atteints de leucémie, desquels ont été purifiés les polynucléaires neutrophiles) en normalisant ce niveau d'expression à celui de la GAPDH.

Cette mesure du niveau d'expression a permis d'établir un niveau d'expression standard dans les cellules saines.

Dans un second temps, l'inventeur a réalisé, les mêmes types de mesures des niveaux d'expression sur des échantillons lors du diagnostic de 35 patients atteints de leucémie myéloïde chronique par le Service d'Hématologie Biologique du centre hospitalier universitaire de Tours en France.

Les niveaux d'expression de chacun des 25 gènes, pour chacun des 35 patients, ont été comparés au niveau d'expression desdits 25 gènes dans les échantillons sains.

La figure 1 montre cette comparaison.

On constate de cette figure que l'expression des 25 gènes varie par rapport au niveau d'expression mesuré dans les échantillons sains, avec pour certains gènes une grande variabilité entre les patients. C'est le cas notamment pour les gènes SOD2 : #1 , CAT : #7, SOD1 : #8, GPX1 (1 ) : #9, GPX4(1 -2-3) : #10, PRDX1 (1-2-3) : #12 et GPX2 : #24.

Les 35 patients étant suivis régulièrement sur le long terme, l'inventeur a pu accéder aux données de ceux-ci, notamment leurs réponses moléculaires après un an de traitement avec de l'imatinib mésilate.

Parmi les 35 patients, 10 présentaient une réponse moléculaire majeure à 1 an, 16 présentaient une réponse moléculaire intermédiaire et 9 étaient mauvais répondeurs audit traitement.

En regroupant les patients selon les catégories de réponse susmentionnées, l'inventeur a pu constater que le niveau d'expression desdits 7 gènes susmentionnés variait selon la réponse moléculaire. Les résultats sont présentés à la figure 2.

Sur cette base, l'inventeur a proposé pour chaque patient de sommer les valeurs de niveau d'expression pour les gènes dont l'expression était plus élevée dans les mauvais répondeurs, et d'y retrancher le niveau d'expression dont l'expression était plus faible dans les mauvais répondeurs.

Aussi, l'inventeur a proposé la formule

S =∑ RQ[CAT,SOD1 ,GPX1 (1),GPX4(1 -2-3),PRDX1(1 -2-3)] -∑ RQ[SOD2,GPX2].

Rétrospectivement, avec les données issues des échantillons de chaque patient prélevés au diagnostic avant le traitement avec l'imatinib mesylate, l'inventeur a pu calculer le score S.

Les données sont regroupées dans les tableaux suivants : Patients ayant une réponse moléculaire majeure à 1 an

Patients ayant une réponse moléculaire intermédiaire à 1

Patients mauvais répondeurs à 1 an

En reclassant les patients selon le score S, l'inventeur a pu constater de manière surprenante que :

si S<1 , environ 40% des patients auront une réponse moléculaire majeure à 1 an, et environ 60 % des patients auront une réponse moléculaire intermédiaire à 1 an. En d'autres termes, 100% des patients auront une réponse moléculaire, et aucun ne sera mauvais répondeur,

si 1 <S<2, environ 30 % des patients auront un réponse moléculaire majeure à 1 an, environ 40% des patient auront une réponse moléculaire intermédiaire à 1 an, et surtout environ 30% des patients seront de mauvais répondeurs. En d'autres termes, environ 70% des patients présenterons une réponse moléculaire, et

si S>2, seuls 10% des patients auront une réponse moléculaire majeure, environ 30% des patients auront une réponse moléculaire intermédiaire, et plus de 50 % des patients seront des mauvais répondeurs. En d'autres termes, seuls environ 40% des patients répondront au traitement à l'imatinib.

Les résultats obtenus pour les 35 patients sont présentés dans le tableau suivant :

RMM : réponse moléculaire majeure, RMI : réponse moléculaire intermédiaire, R : réponse, MR : mauvais répondeur. La figure 3 est une représentation graphique de ces résultats, présentant la répartition des réponses moléculaires à un an (noir: majeure ; hachuré : intermédiaire ; gris : non répondeur) en fonction du score S.

La figure 4 quant à elle montre la distribution des patients selon leur score S.

L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier.