Область техники Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, а именно к новым гомо- и гетеро-полиаминокислотным производным фуллерена С ₆ о формулы (I), а также к способу их по- лучения и созданию фармацевтических композиций на их основе.

где п = 2-5, х = 3, L = -(СН ₂ ) _т , при т = 2-5 или

-CO(CH ₂ ) _k CH(NH ₂ )-, где к = 1-2.

Предшествующий уровень техники

Применение производных фуллерена в медицине основано на липофильных свойствах фуллеренового ядра, позволяющих фулле- реновым производным проникать через клеточные мембраны, и способности фуллерена с высоким квантовым выходом генериро- вать синглетный кислород, расщепляющий ДНК. Эти свойства обеспечивают функциональным производным фуллерена проявле- ние цитотоксических, антивирусных и других свойств (Bedrov D., Smith G.D., Davande Н., "Passive transport of fullerenes through a lipid membrane." J.Phys.Chem., B, 2008, v. l 12., p.2078-84, Qiao R., Roberts A.E., "Translocation of fullerene and its derivatives across a lipid bilay- er", Nano Lett., 2007, v.7, p.614-9. Nelsen G.D., и др., "In vivo biology and toxicology of fullerenes and their derivatives", Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 2008, v.103, p.197-208, Pat US 6204391 , 2005, "Water soluble fullerenes with antiviral activity").

Основной проблемой, затрудняющей биологические исследо- вания производных фуллеренов и создания лечебных препаратов на их основе связано с нерастворимостью фуллеренов в воде, что за- трудняет их прямое введение в организм человека. Одним из воз- можных вариантов преодоления этих трудностей является введение молекул фуллерена в солюбилизирующие матрицы. Известны спо- собы получения водорастворимых форм фуллерена за счет образо- вания аддукта с поливинилпирролидоном (Kiselev O.I. et al. //Mol. Materials. 1998. V. 1 1. P. 121 ; Piotrovsky L.B. et al. //Ibidem. 2000. V. 13. P. 41). Показана его эффективность против вируса гриппа А- и В-типа.

Известен также способ получения фуллеренов, включающий смешивание предварительно растворенных в органическом раство- рителе фуллеренов с полимерной матрицей в хлороформе, выпари- вание смеси под вакуумом до полного удаления растворителей, рас- творение полученного комплекса в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4-7,6) с последующей обработкой продукта ультразвуком (RU 2162819, 02.10.01). При этом в качестве водорастворимой полимерной матрицы используют мембранные кефалины. Продук- ты, полученные в результате таких модификаций, являются неста- бильными композициями с ограниченными возможностями хране- ния.

Перспективным методом получения водорастворимых фулле- реновых композиций является химическая модификация сферы фуллерена введением гидрофильных солюбилизирующих лигандов. В международной заявке WO2005/070827 представлена серия ами- нокислотных производных фуллерена, полученных по реакции цик- лоприсоединения аминокислотных фрагментов к фуллерену, и про- дуктов их внедрения в биологически-активные органические суб- страты. Представленные в данном техническом решении методы синтеза многостадийны и нетехнологичны. Полученные соединения имеют низкую растворимость в воде.

В настоящее время получен большой ряд функционализиро- ванных фуллеренов, содержащих гидрофильные фрагменты как в боковой цепи присоединенных к фуллерену лигандов (детергент- ный тип комплексов), так и сферический тип производных, когда имеются полярные группы, распределенные по фуллереновой сфере (такой тип включает фуллеренолы, аминоаддукты).

Наиболее перспективными для использования являются ами- нокислотные производные фуллерена.

Аналогами настоящего изобретения являются соединения и способы их получения, описанные в международной заявке WO2009/00203, а также патенте РФ JY« 2236852.

В международной заявке WO2009/00203 описаны полифунк- циональные аминокислотные производные фуллерена формулы

, где R = Н, моно- или дигидроксиалкил, галоидалкил, моно- или динитроксиалкил, малеинимид; N-Z представляет собой фрагмент , β, γ, ω-аминокислоты общей формулы -NH-C _m H _2m - СООМ или C ₄ H ₈ N-COOM, где m = 2-5, а М представляет собой нитроксиалкильную группу, алкильную группу или соль щелочного металла, или дипептид. Данные соединения получены по реакции

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) эквимолярного присоединения аминокислот к фуллерену с после- дующим замещением активного водорода органическим биологиче- ски активным лигадом с образованием соединений типа. Получен- ные соединения, обладают ингибирующей активностью в отноше- нии метастазов опухоли, усиливают антилейкемическую активность циклофосфамида, и могут быть пригодны в качестве доноров моно- оксида азота или в качестве вазодилататоров быстрого действия для антигипертинезивной терапии.

Основным недостатком соединений по данной заявке являет- ся то, что они являются продуктами ковал ентного присоединения, содержат малое количество полярных групп и имеют низкую рас- творимость в воде.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является средство для ингибирования репродукции обо- лочечных вирусов и способ его получения (патент РФ Ν» 2236852). В результате взаимодействия фуллерена с солью аминокислоты в среде органического растворителя в присутствии полиалкиленокси- да получены фуллеренполикарбоновые анионы общей формулы C ₆ oH _n [NH(CH ₂ ) _m C(0)0 ^" ]n, где С ₆₀ - фуллереновое ядро, NH(CH ₂ ) _m C(0)0 ^" - аминокарбоновый анион; m равно целому числу от 1 до 5, п равно целому числу от 2 до 12.

Для получения этих соединений к раствору фуллерена в о-дихлорбензоле (толуоле или любом другом органическом раство- рителе) вносят аминокислоту в виде соли (калиевой или натриевой), затем добавляют солюбилизатор. Порядок внесения в реакционную среду аминокислоты и солюбилизатора не важен, можно вносить их в виде комплекса, предварительно смешав. В качестве солюбилиза- тора используют различные полиалкиленоксиды: полиэтиленглико- ли мол. массы от 150 до 400, и выше 400 (например, ПЭГ- 1500), а также диметиловый эфир полиэтиленгликоля мол. массы 500. Для увеличения скорости реакции добавляют любой сильный восстано- витель (щелочные металлы).

Соотношение фуллерена и аминокислоты увеличено более чем в 50 раз. Превращение в желаемую фармацевтически приемлемую соль, особенно натриевую или калиевую, выполнялось путем обработки кислоты подходящим основанием или путем добавления соли слабой летучей кислоты. В частности, не растворимая в воде фуллеренполикарбоновая кислота превращается в более предпочтительные фармацевтически приемлемые соли, такие как натриевая соль, которые растворимы в воде. Добавление соли слабой летучей кислоты происходит путем обработки раствора солью щелочного металла и слабой летучей кислоты. При концентрировании раствора путем выпаривания или лиофилизации слабая кислота удаляется, а фуллеренполикарбоновые кислоты выделяются в виде их солей щелочных металлов. Целевой продукт по данному изобретению характеризуется постоянством состава, содержание в целевом продукте основного вещества составляет всего 87,8%. В описании отсутствуют технологические регламенты, связанные с определением оптимальных количеств исходных со- единений, соотношений количеств используемых растворителей и, особенно, описания методов выделения искомых соединений.

Основными недостатками фуллеренаминокислотных произ- водных, полученных представленным в патенте методом получения является то, что данным способом получают смесь фуллеренкар- боксилатных анионов, как солевых, так и кислотных форм. Полу- чить индивидуальное соединение способом, описанным в патенте, не представляется возможным. Также фуллеренполиаминокислоты, полученные запатентованным способом, в кислотной форме прак- тически нерастворимы в воде. Получить стабильную фармацевти- ческую композицию с фуллеренполикарбоновыми анионами не удалось, т.к. в процессе хранения соединения выпадают в осадок.

Применение в синтезе большого избытка калиевой или на- триевой солей аминокислот и больших избытков растворителей приводит к возникновению экологических проблем, связанных с утилизацией отходов производства, а также к удорожанию процесса производства. Использование щелочных металлов для увеличения скорости реакции является технологически невозможным при ис- пользовании хлорированных ароматических растворителей.

Однако, представленные в патенте уникальные биохимиче- ские свойства препаратов на основе соединений фуллерена с ами- нокислотными фрагментами ставят задачу получения новых произ- водных фуллерена, разработки высокотехнологичного способа их промышленного получения, отличающегося простотой и эффектив- ностью процесса, чистотой, экологичностью и доступностью ис- ходных реагентов.

Раскрытие изобретения

Для решения данной задачи предлагается группа изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, а именно: го- мо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена, способ получения производных фуллерена и фармацевтические компози- ции, включающие гомо- и гетеро-полиаминокислотные производ- ные фуллерена в качестве действующего вещества. Варьируя соот- ношение реагентов и условия проведения процесса, по заявляемому способу можно получать различные производные фуллерена. Указанная задача решается гомо- и гетеро- полиаминокислотными производными фуллерена общей формулы (И):

C ₆₀ (H) _x {NH(CH ₂ ) _n COO-} _x {NH ₃ ⁺ (L)COOH)} _x , где п = 2-5, х = 3, L = -(СН ₂ ) _т ,где т = 1-5, ^ либо -CO(CH ₂ ) _k CH(NH ₂ )- , где к = 1-2.

В случае, когда т = п получают гомо-полиаминокислотные производные фуллерена, при m п - гетеро-полиаминокислотные - производные фуллерена.

Указанная задача решается способом получения гомо- и гете- ро-полиаминокислотные производных фуллерена, образующихся при взаимодействии фуллерена с 10-кратным мольным избытком безводных калиевых солей аминокислот в среде органического ароматического растворителя при добавлении к полученной сус- пензии межфазного катализатора при перемешивании и нагревании до температуры не выше 60°С до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка, который затем выделяют, раство- ряют в воде, после чего осуществляют обработку водных растворов калиевых солей фуллеренполиаминокислот 1Н раствором органи- ческих или минеральных кислот с последующим добавлением рас- творов аминокислот в полярных растворителях. В способе исполь- зуют свежеприготовленные безводные калиевые соли аминокислот в мелкодисперсном состоянии, а выделение твердого осадка калие- вых солей фуллеренполиаминокислот осуществляют фильтровани- ем, промывкой этиловым спиртом и высушиванием. В процессе экспериментов было выявлено, что фуллеренполиаминокислоты указанного состава могут быть получены только при использовании свежеприготовленных безводных калиевых солей аминокислот. В качестве межфазного катализатора используют метиловые эфиры полиэтиленоксидов молекулярной массы 200, 400, 500.

Указанная задача решается также созданием фармацевтиче- ских композиций, содержащих в качестве активного вещества гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена формулы (II), обладающих активностью против вируса герпеса, вируса гепа- тита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противо- опухолевой и противопсориатической активностью. Фармацевтиче- ские композиции могут быть выполнены в форме таблеток, капсул, мазей, эмульсий, суппозиториев, растворов, спреев.

Фармацевтические композиции по предложенному техниче- скому решению содержат соединение общей формулы (II) в количе- стве, эффективном для достижения желаемого результата, и могут быть введены в виде стандартных лекарственных форм (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах), содержащих соедине- ния предложенного технического решения в качестве активного ин- гредиента в смеси с носителем или наполнителем, пригодным для внутримышечного, внутривенного, перорального, сублингвального, ингаляционного, местного, назального, ректального и вагинального введения. Активный ингредиент может быть включен в компози- цию вместе с обычно используемыми нетоксичными фармацевти- чески приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, драже, суппозиториев, эмуль- сий, суспензий, мазей, гелей и любых других лекарственных форм.

Конкретный уровень дозировок и частота приема лекарства для каждого конкретного пациента будет зависеть от большого чис- ла факторов, включая активность конкретного производного фулле- рена, метаболическую стабильность и длительность действия, ско- рость выделения, возраст пациента, вес тела, общее состояние здо- ровья, пол, лекарственные комбинации, а также тяжесть заболева- ния у индивида, подвергаемого лечению.

Для орального применения в виде суспензий композиции го- товят согласно методам, широко известным в области приготовле- ния фармацевтических рецептур, и они могут содержать микрокри- сталлическую целлюлозу или ее производные для обеспечения мас- сы, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспенди- рующего агента, метилцеллюлозу в качестве усилителя вязкости и подслащивающие агенты и/или отдушки, известные в этой области. В форме таблеток такие композиции могут содержать микрокри- сталлическую целлюлозу, кальций фосфат, крахмал, стеарат магния и лактозу и/или другие эксципиенты, связующие вещества, расши- рители, дезинтеграторы, разбавители и смазывающие вещества, из- вестные в данной области.

При применении в виде назальных аэрозолей или путем инга- ляции такие композиции готовят методами, хорошо известными в области фармацевтических рецептур, и они могут выпускаться в виде растворов на физиологическом растворе, с использованием бензойной кислоты или других подходящих консервантов, промо- торов адсорбции для усиления биоприменимости, и/или других со- любилизирующих или диспергирующих агентов, известных в дан- ной области.

Растворы или суспензии для инъекций могут формироваться согласно известным методам, с использованием нетоксичных, па- рентерально применимых разбавителей или растворителей, таких как маннит, 1 ,3-бутандиол, вода, раствор Рингера или изотониче- ский раствор хлористого натрия или подходящих диспергирующих или смачивающих и суспендирующих агентов, таких как стериль- ные, мягкие, устойчивые масла, включая синтетические моно- или диглицериды, или жирные кислоты, включая олеиновую кислоту.

При ректальном или вагинальном применении в виде свечей такие композиции могут готовиться путем смешивания лекарства с таким нераздражающим эксципиентом, как масло какао, синтетиче- ские глицеридные сложные эфиры или полиэтиленгликоли, которые являются твердыми веществами при обычных температурах, но сжижаются и/или растворяются в полости тела с выделением лекар- ства.

При местном применении в виде мазей, гелей, кремов, лини- ментов и т.д. такие композиции могут готовиться путем смешива- ния активных ингредиентов с приемлемой мазевой основой.

В качестве мазевой основы могут быть использованы жиро- вые, углеводородные или гидрофильные основы, например вазелин, вазелиновое масло, парафин, воск, ланолин, полиэтиленгликоль и др.

В качестве основы для гелей могут быть использованы ме- тилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, оксипро- пилцеллюлоза, полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, карбопол, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт и т.д.

Технический результат изобретения состоит в том, что полу- чены новые гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фул- лерена формулы: C ₆₀ (H) _x {NH(CH ₂ ) _n COO ^' } _x {NH ₃ ⁺ (L)COOH)} _x , где п = 2-5, х = 3, L = -(СН ₂ ) _т , где т = 1-5, либо -CO(CH ₂ ) _k CH(NH ₂ )-, где к = 1-2, характеризующиеся тем, что соединения содержат ковалент- но-связанные аминокислотные группы и полярные ионные формы аминокислот, разработан новый промышленный способ получения аминокислотных производных фуллерена С ₆ о с различным соотно- шением компонентов с использованием реакции нуклеофильного присоединения к фуллерену аминокислоты с образованием продук- тов полиприсоединения. Предложены фармацевтические компози- ции, содержащие в качестве активного вещества гомо- и гетеро- полиаминокислотные производные фуллерена формулы (II), обла- дающие активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, ви- русов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью. Фармацевтические компо- зиции выполнены в форме таблеток, капсул, мазей, суппозиториев, растворов, спреев.

Соединения обладают новыми свойствами:

- растворимостью в смеси диметилсульфоксид-вода (1 : 100, 1 :200); - высокой био доступностью;

- высокой эффективностью воздействия на инфицированные клет- ки;

- низкой токсичностью.

Заявляемый способ позволяет получить различные гомо- и ге- теро-полиаминокислотные производные фуллерена в зависимости от соотношения реагентов и условий проведения процесса. Способ основан на использовании в стадии синтеза оптимальных соотно- шений исходных реагентов (1 : 10), минимальных количеств органи- ческого растворителя и межфазного катализатора, с последующем выделением заявляемых композиций с использованием концентри- рованных растворов органических и минеральных кислот, с после- дующим введением аминокислот ряда NH ₂ LCOOH, где L = -(СН ₂ ) _т , либо -CO(CH ₂ ) _k CH(NH ₂ ), что приводит к количественному получе- нию фуллеренаминокислотных композиций определенного состава и возможности применения заявляемого способа для их промыш- ленного синтеза, отличающегося эффективностью и экологично- стью.

Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими при- мерами.

Варианты осуществления изобретения

Пример 1. Получение фуллеренполиаминокапроновой кисло- ты формулы C ₆ o(H3){NH(CH2) ₅ COO ^" } 3{NH ₃ ⁺ (CH ₂ ) ₅ COOH} 3.

К раствору 7,2 г (0,01 моля) фуллерена С ₆ о в 400 мл о- дихлорбензола добавляют 17 г (ОД моля) свежеполученной тонко измельченной безводной калийной соли ε-аминокапроновой кисло- ты. К полученной суспензии при перемешивании и нагревании не выше 80°С прибавляют в течение 2-х часов смесь о-дихлобензола и метилового эфира полиэтиленгликоля 400 в соотношении 2,5: 1. Ре- акционную смесь перемешивают при температуре не выше 60°С в течение 2-3 часов до полного обесцвечивания раствора и формиро- вания твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают несколькими порциями этилового спирта и высушива- ют в вакууме при температуре не выше 60°С. Выделенную калие- вую соль фуллеренаминокислоты растворяют в 2 л дистиллирован- ной воды. В раствор медленно при перемешивании добавляют 1Н раствор соляной кислоты до рН 5, 1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта. Затем водный слой декантируют. К осадку, представляющему собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, медленно при перемешивании добавляют раствор аминокапроновой кислоты в смеси диметилсульфоксида с водой (1 : 10). Смесь пере- мешивают до полного растворения. Затем растворители удаляют отгонкой в вакууме. Твердый остаток высушивают при температуре не выше 60°С в вакуумном сушильном шкафу.

Выход целевого продукта количественный по отношению к исходному фуллерену. Соединение представляет собой темно- коричневое твердое вещество, растворимое в смеси диметилсуль- фоксид:вода - 1 :200, ограниченно растворимое в смесях СНзС1чГ:Н ₂ 0 - 1 : 1 и ДМФА-Н ₂ 0.

Термогравиметрический анализ продукта показывает наличие в комплексе 3 молей слабосвязанной аминокапроновой кислоты, отщепляющейся с разложением при температуре 200°С. Термиче- ское разложение фуллеренполиаминокислоты проходит при темпе- ратуре 345°С с выделением фуллерена и продуктов его окисления. Количество твердого остатка после разложения соединения, пред- ставляющего собой по данным дифракционного анализа незаме- щенный фуллерен, соответствует соотношению С60: аминокислот- ный фрагмент как 1 : 6.

Кислотный гидролиз соединения 0, 1 молярным раствором НС1 приводит к выделению гидрохлорида аминокапроновой кисло- ты в количестве 3 молей на моль исходного вещества.

Адсорбция соединения на поверхности силикагеля приводит к расщеплению ионных связей и выделению свободной аминокапро- новой кислоты. Последующим фотометрическим анализом продук- тов реакции аминокапроновой кислоты с нингидрином определено количество ионносвязанных аминокислотных групп. Их количество соответствует составу заявляемых соединений.

Электронный спектр поглощения продукта не содержит полос поглощения свободного фуллерена. ИК-спектр продукта содержит полосы поглощения, характер- ные для Ν-замещенных аминокислот: группа -СООН- 1704 см ^"1 , 1658 см ^'1 , группы NH ₃ ⁺ - 3100, 2550, 2000 см ^"1 , -Ν-Η-валентные ко- лебания 3300 см ^"1 , Ν-Η-деформационные 1552 см ^"1 , полосы погло- щения С _б о-NH-R- 1 104 см ^"1 , 930 см ^"1 , 830 см ^"1 .

Элементный анализ продукта показывает следующие соотно- шения элементов: %С=76,84; %Н=4,80; %N=5,15, для брутто- формулы C96H ₇₅ N ₆ Oi 2 (молекулярная масса 1503) рассчитано: %С = 76,49, %Н = 4,90, %N = 5,57.

Пример 2. Получение Ы-фуллерен-у-аминомасляной кислоты с β-аланином формулы: С ₆ о(Нз){КН(СН ₂ )зСОО ^" }з(КН ₃ ⁺ СН ₂ -СН ₂ - СООН) ₃ .

К раствору 7,2 г (0,01 моля) фуллерена С ₆ о в 400 мл о- дихлорбензола добавляют 14 г (0,1 моля) свежепо лученной безвод- ной калиевой соли γ-аминомасляной кислоты. К полученной сус- пензии при перемешивании и нагревании не выше 60°С прибавляют в течение 2-х часов смесь о-дихлобензола и метилового эфира по- лиэтиленгликоля 400 в соотношении 3 : 1. Реакционную смесь пере- мешивают при температуре не выше 60°С в течение 2-3 часов до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают нескольки- ми порциями этилового спирта и высушивают в вакууме при тем- пературе не выше 60°С. Выделенный продукт растворяют в дистил- лированной воде. В раствор медленно при перемешивании добав- ляют 1Н раствор соляной кислоты до рН 5, 1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта. Затем водный слой декантируют. К осадку, представляющему собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, медленно при перемешивании добавляют спиртовый раствор 2,7 г (0,03 моля) β-аланина. Смесь перемешивают в течение 2 часов до полного растворения осадка. После удаления растворителя вы- делено 12 г продукта.

Соединение представляет собой темно-коричневое твердое вещество, растворимое в смеси диметилсульфоксид:вода - 1 :200, ограниченно растворимое в смесях CH ₃ CN:H ₂ 0 - 1 : 1 и ДМФА-Н ₂ 0.

Термогравиметрический анализ продукта показывает наличие в комплексе 3 молей слабосвязанного β-аланина, отщепляющегося при температуре 210°С. Термическое разложение всего комплекса проходит при температуре 335°С с выделением фуллерена в коли- честве соответствующем соотношению С _б о^аминокислотные фраг- менты как 1 : 6.

Кислотный гидролиз полученного соединения 0,01 молярным раствором НС1 приводит к образованию гидрохлорида β-аланина в количестве 3 молей на моль исходного вещества.

Спектры продукта в растворах в диметилсульфоксиде и в 0, 1 Н водном растворе NaOH содержат полосы поглощения в области 217, 260, 335 нм, характерные для производных фуллерена и не со- держат полос поглощения свободного фуллерена.

ИК-спектр соединения содержит полосы поглощения, харак- терные для Ν-замещенных аминокислот и катионных форм амино- кислот: группы -СООН ^" 1717 см ^"1 , 1710 см ^"1 , 1658 см ^"1 , группы NH ₃ ⁺ 3100, 2550, 2000 см ^"1 , Ν-Η-валентные колебания 3400 см ^"1 , N-H- валентные колебания - 3400 см ^"1 , N-H- деформационные - 1552 см ^"1 , полосы поглощения С _б о-NH-R- 1 104 см ^"1 , 930 см ^"1 , 830 см ^"1 .

Элементный анализ продукта показывает следующие соотно- шения элементов: %С=75,24; %Н=3,80; %N=6,25, для брутто- формулы C ₈ iH48N ₆ 0 ₁₂ (молекулярная масса 1296) рассчитано: %С = 75,00, %Н = 3,70, %N = 6,48.

Пример 3. Получение Ы-фуллерен-г-аминокапроновой кисло- ты с глутамином формулы: C6o(H ₃ ){NH(CH ₂ ) ₅ COO ^"

} ₃ {NH ₃ ⁺ (CO)(CH ₂ )2CH(NH ₂ )COOH} 3.

Процесс проводят так же, как в примере 1. Только на стадии обработки осадка после осаждения кислой формы фуллерен- аминокапроновой кислоты добавляют раствор 4,5 г глутамина в смеси диметилсульфоксид-вода. Растворители удаляют отгонкой в вакууме.

Элементный анализ твердого продукта показывает следую- щие соотношения элементов: %С=71 ,34; %Н=4,80; %N=8,25, для брутто-формулы C9 ₃ H ₆₉ N ₉ Oi ₅ (молекулярная масса 1551) рассчита- но: %С = 71,95, %Н = 4,50, %N = 8,12.

ИК-спектр соединения содержит полосы поглощения, харак- терные для Ν-замещенных аминокислот и катионных форм амино- кислот: группы -СООН- 1714 см ^"1 , 1707 см ^"1 , -C=O(NH-C ₆₀ ) 1658 см ^' , группы NH ₃ ⁺ 3000, 2550, 2000 см ^"1 , N-H -валентные колебания 3400 см ^'1 , N-H- деформационные 1552 см ^"1 , полосы поглощения С ₆ о~ NH-R- 1.104 см ^"1 , 930 см ^"1 , 830 см ^"1 .

Кислотный гидролиз соединения приводит к выделению глу- тамин гидрохлорида в количестве 3 молей на моль исходного веще- ства.

Была изучена противовирусная активность соединений в от- ношении ВИЧ, ВПГ, вируса гриппа, а также противоопухолевая ак- тивность. В приведенных ниже примерах препарат, полученный способом, описанным в примере 1 , назван по тексту препарат Ns 1 (фуллеренполиаминокапроновая кислота). Пример 4. Исследование активности препарата фуллеренпо- лиаминокапроновой кислоты в отношении вируса иммунодефицита человека.

Исследования проводились в лаборатории вирусов иммуно- дефицита с испытательным Центром по экспертной оценке проти- вовирусных и дезинфекционных средств (ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН).

К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали вирусом в дозе 0,01 ТЦИД ₅₀ /клетка. Инкубировали культуры клеток при 37°С в атмосфере с 5% С0 ₂ и 98% влажности 4-5 дней. Учет ре- зультатов проводили окрашиванием клеток с помощью красителя и световой микроскопии: исследование цитопатического эффекта ви- руса (ЦПД) и вирусиндуцируемого синцитийобразования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).

Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкрестовой ^' системе знаками + или - соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю.

++++ - 100%^ гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение

+++ - 75% ^Μ гибель клеток в каждой из четырех лунок,

++ - 50% ^Μ гибель клеток в каждой из четырех лунок,

+ - 25% ^ая гибель клеток в каждой из четырех лунок,

+- - начало дегенерации,

-отсутствие цитодеструкции.

Результаты исследования представлены в таблицах 1-2. Полученные данные (таблица 1 , 2) показали, что исследован- ные препараты фуллеренполиаминокапроновой кислоты обладали противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефи- цита человека типа 1. ЭК ₅₀ (50%-эффективная концентрация) пре- парата 0,9 мкг/мл. Препарат в концентрациях 0,5-10 мкг/мл не об- ладал цитотоксическим действием на клетки.

Пример 5. Исследование противогерпетической активности препарата фуллеренполиаминокапроновой кислоты в эксперимен- тах in vitro. Исследование выполнялось ГУ НИИ вирусологии им.Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва.

В процессе исследования были изучены цитотоксическая и противогерпетическая активность препарата в клеточных культурах Vero.

В исследовании были использованы: перевиваемая культура клеток почки обезьян (VERO), полученная из коллекции культур тканей Института вирусологии им. И.Д. Ивановского РАМН; вирус герпеса простого (Herpes simplex virus), тип 1 , штамм Л ₂ , размно- женный в клетках Vero. Клетки инфицировали вирусом в дозе 100 ТЦИД ₅₀ /0,2мл и 1000 ТЦИД ₅₀ /0,2мл.

Для исследования представлен образец субстанции в виде по- рошка темного цвета.

Препарат первоначально растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в соотношении 1 :20, а затем готовили рабочие концентра- ции на среде ИГЛА MEM. Оценку активности испытанных образ- цов проводили по степени защиты клеток от вирусиндуцированного цитотоксического действия ВПГ микроскопическим методом и ме- тодом МТТ по оптической плотности. Результаты исследования. Исследована токсичность веществ в использованных концентрациях, а также растворителя (1 ,5мл ДМСО в 50мл воды).

Препарат в конечных концентрациях от 50 до 1000 мкг/мл до- бавляли к монослою клеточной культуры VERO и инкубировали в атмосфере 5,0 % С0 ₂ при 37°С в течение 24-48 часов. Монослой клеток окрашивали 0,4% раствором трипанового синего и исследо- вали под микроскопом.

Образец в концентрации до 100 мкг/мл не оказывал токсиче- ского действия на культуру клеток VERO, при концентрации 200 мкг/мл появляются признаки токсического действия - отмечается гибель 25% клеток. Концентрации в 500 мкг/мл и более уже ток- сичны для Vero клеток (табл. 3).

Исследование защитных свойств образца проводили при од- ной схеме введения - за час до инфицирования, и при двух дозах вируса - 100 ТЦИД ₅₀ и 1000 ТЦИД ₅₀ .

Результаты представлены в таблицах 3 - 7.

Проведенные исследования показали, что введение за 60 ми- нут образца препарата до инфицирования клеточной культуры ви- русом герпеса простого в дозе 100 ТЦИД ₅₀ полностью защищает клетки от цитодеструктивного действия вируса при всех испытан- ных концентрациях - от 5,0 мкг/мл и выше (см. табл. 4 и 5).

При увеличении инфицирующей дозы вируса герпеса до 1000 ТЦИД ₅ о/0,2мл (см. табл. 6 и 7), образец препарата обеспечивает полную защиту чувствительной культуры клеток от цитодеструк- тивного действия вируса при данной схеме испытания (инфициро- вание клеток вирусом через 60 минут после внесения препарата в культуральную среду). Пример 6. Изучение активности фуллеренполиаминокапроно- вой кислоты (препарат N° 1) в отношении вируса гриппа A/IIV- Moscow/01/2009 (HlNl)swl.

Исследования проводились в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва. В задачу исследований входило изучение противовирусной активности этих препаратов в культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl.

Препарат разводили в ДМСО (5 мг субстанции + 0,5 мл ДМСО) с последующим добавлением 4,5 мл среды для культур кле- ток MEM, получая, таким образом, сток в концентрации 1 ,0 мг/мл. В последующем проводили разведения стоков средой MEM до ра- бочих концентраций 6,5 мкг/мл - 12,5 -25,0 - 50,0 - 100 мкг/мл.

Определение противовирусной активности веществ проводи- ли по снижению репродукции вируса гриппа в культуре клеток MDCK, выявляемой ИФА.

С этой целью клетки МДСК выращивали в 96-луночных планшетах до полного монослоя, отмывали от ростовой среды и вносили вещества в двукратной концентрации в 100 мкл среды MEM. Инфицирование вирусом в рабочей дозе 100-1000 ТЦИД ₅₀ проводили в двух режимах: через 2 часа после внесения веществ и одномоментно. Планшеты инкубировали в термостате с С0 ₂ в тече- ние 24 часов при 37°С. После инкубации среду удаляли и клетки фиксировали 80% ацетоном в PBS в течение 15 минут, хорошо вы- сушивали и осуществляли постановку ИФА, проводя последова- тельно адсорбцию специфических реагентов - моноклональных ан- тител, конъюгата и субстрата (ортофенилендиамин). Реакцию учи- тывали по оптической плотности при 492 нМ на спектрофотометре фирмы «Биоком». Каждое разведения вируса исследовали в 3-х по- вторах, для которых вычисляли среднее значение оптической плот- ности (ОП). Процент ингибирования определяли, как отношение между разницей ОП опыта и ОП клеточного контроля, разделенное на разницу ОП вирусного контроля и ОП клеточного контроля, ум- ноженное на 100%. На основании полученных данных определены значения минимальной концентрации вещества, вызывающей 50,0% ингибирование вирусной репродукции (МИК ₅₀ ).

Оценку подавления репродукции вируса гриппа A(H1N1) проводили в 3-х опытах при разной множественности заражения. Результаты представлены в табл. 8 (протоколы 3 опытов) и табл. 9 (средние значения полученных результатов 3 опытов).

Как видно из таблицы 9, четко прослеживается зависимость степени репродукции и концентрации препарата: с повышением концентрации - снижается репродукция вируса. Кроме того, значи- тельных отличий в показателях при разных режимах инфицирова- ния (через 2 часа после внесения препарата или одномоментно) не отмечено.

Таким образом, полученные результаты изучения активности разных разведений препарата в отношении вируса гриппа A/IIV- Moscow/01/2009 (HlNl)swl выявили высокую активность подавле- ния его репродукции в культуре клеток MDCK. При этом режимы внесения препаратов за 2 часа до инфицирования или одновременно с инфицированием не влияли на их активность в культуре клеток MDCK.

Пример N-? 7. Изучение противовирусной активности фулле- ренполиаминокапроновой кислоты (препарат N° 1) на модели грип- позной пневмонии мышей. Исследования выполнялись в центре химии лекарственных средств (ЦХЛС-ВНИХФИ), г. Москва.

В работе использовали препарат в виде темно-коричневого кристаллического порошка. Для перорального применения готови- ли необходимые дозы препарата, растворяя навески в 1% растворе крахмала, сваренного на воде. Для внутрибришинного и внутри- мышечного применения навески препарата растворяли в 1,5% рас- творе ДМСО.

В работе был использован вирус гриппа А/Аичи/2/69 (H3N2), адаптированный к мышам. Данный вирус широко используется для определения эффективности противовирусных препаратов на моде- ли гриппозной пневмонии мышей и был получен из музея вирусных штаммов и клеточных культур ГУ НИИ вирусологии РАМН. Для подготовки инфицирующего материала мышей заражали интрана- зально аллантоисным вирусом, после проявления признаков болез- ни их забивали и в стерильных условиях получали гомогенат легоч- ной ткани. Далее этот гомогенат использовали для заражения 10- дневных куриных эмбрионов, из которых получали аллантоисный вирус и после титрования на его мышах использовали для инфици- рования животных.

Белых беспородных мышей (самки) массой 12-14 г получали из питомника «Андреевка» (Московская обл.) и содержали на стан- дартном рационе в регламентированных условиях вивария.

Предварительно взвешенные мыши (самки нелинейные, сред- ний вес 12-14 г) инфицировались интраназально под легким эфир- ным наркозом вирусом гриппа А/Аичи/2/69 (H3N2) (10ЛД ₅₀ в 100 мкл). В предварительном опыте было проведено определение ЛД ₅₀ путем титрования аллантоисного вируса на таких же мышах, кото- рые затем использовались в основном опыте. Была использована следующая схема лечения исследуемым препаратом: за 24 часа до инфицирования, за 1 час до инфицирования, через 24 часа и далее 1 раз в день через 24 часа в течение 5 дней. Для перорального введе- ния использовали одноразовый инсулиновый шприц со специаль- ной иглой (лаваж), каждую дозу вводили в объеме 100 мкл. Для внутрибрюшинного и внутримышечного лечения также каждую до- зу вводили в объеме 100 мкл. Группа вирусного контроля представ- ляла собой 10 мышей, инфицированных вирусом, но не леченных препаратами. Также в опыте было две группы по 10 неинфициро- ванных мышей, которым вводили внутрибрюшинно и внутримы- шечно по 100 мкл 1,5% ДМСО, который использовался в качестве растворителя препаратов. В остальных группах также изначально было по 10 животных. За леченными и контрольными животными велось ежедневное наблюдение, в первые 5 дней после инфициро- вания мыши взвешивались каждый день, далее - через день. Химио- терапевтическую активность препарата на модели гриппозной пневмонии мышей оценивали по трем критериям: показатель защи- ты от смертельной вирусной инфекции, увеличение средней про- должительности жизни и уменьшение снижение веса в группах жи- вотных, леченных препаратом по сравнению с контрольной груп- пой.

Лечение фуллеренаминокапроновой кислотой было эффек- тивно, уменьшая смертность мышей от гриппозной пневмонии и потерю их веса, и увеличивая среднюю продолжительность жизни по сравнению с вирусным контролем. Эффективность данного ле- чения зависела от дозы препарата и способа лечения. Результаты представлены в таблицах 10 - 1 1. Наиболее эффективным по всем трем параметрам (показатель защиты от смертности, средняя продолжительность жизни и потеря веса) было лечение фуллеренполиаминокапроновой кислотой внут- римышечно, которое в дозах 100 и 200 мг/кг/день предотвращало гибель 60-70% зараженных животных и потерю их веса, а также увеличивало продолжительность их жизни почти в 2 раза. Внутри- брюшинное лечение фуллеренполиаминокапроновой кислотой бы- ло эффективно только в дозах 50 и 100 мг/кг/день. Гибель живот- ных, значительное снижение средней продолжительности жизни и веса мышей при внутрибрюшинном лечении их фуллеренполиами- нокапроновой кислотой в дозе 200 мг/кг/день дают основание пола- гать, что данная доза при этом способе введения является токсич- ной для инфицированных мышей.

Пример N2 8. Изучение противоопухолевого действия фулле- ренполиаминокапроновой кислоты (препарат N° 1) при перевивае- мых опухолях лейкоза L1210, аденокарциномы молочной железы Са-755 и карциномы Льюиса.

Исследования выполнялись в Институте токсикологии, г. Санкт-Петербург, 2006 г. в соответствии с «Методическими ука- заниями по изучению противоопухолевой активности фармаколо- гических веществ» («Руководство по экспериментальному (докли- ническому) изучению новых фармакологических веществ», Мин- здрав РФ, Ремедиум. М., 2000 г., с. 319-325).

Штаммы опухолевых клеток лейкемии L1210, аденокарцино- мы молочной железы Са-755, а также штамм опухолевых клеток карциномы Льюиса (3LL) получены из НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова МЗ РФ (г. Санкт-Петербург).

В исследовании использованы следующие тест- системы: Мыши линии DBA/2 с перевитыми клетками лейкемии L1210. Возраст мышей 6-8 недель, масса 19-25 г.

Мыши самцы линии С 57 BL/6j с перевитыми клетками Са- 755. Возраст мышей 6-8 недель, масса 19-25 г.

Мыши самцы линии С 57 BL/6j с перевитыми клетками 3LL.

Возраст мышей 6-8 недель, масса 18-24 г.

Оценка противоопухолевого действия проводилась на осно- вании:

- оценки накопления асцита по регистрации прибавки веса живот- ных;

- оценки продолжительности жизни животных;

- оценки опухолевого роста. Проводили измерение большего разме- ра опухоли (длина) и перпендикулярного ему меньшего размера (ширина). Рассчитывали объем опухоли и торможение опухолевого роста рассчитывали по формуле. Оценочным критерием являлся день достижения каждой индивидуальной опухолью объема 500 мм ³ .

Результаты влияния препарата на развитие лейкемии L1210 представлены в таблице 12.

В таблице 13 приведена средняя продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями лейкемии L1210 и кон- трольной группы, а также данные увеличения продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой в %.

Как видно из таблицы 13 средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками лейкемии L1210 составила 6,0±0,21 дней. Введение препарата дос- товерно увеличило продолжительность жизни мышей до 10,7±0,37 дней и 10,60±0,37 дней, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 78,33% и 76,67% для доз препарата 100 мг/кг и 200 мг/кг соответственно, однако различия между опытными группами оказались статистически недостовер- ными.

В процессе эксперимента проводилось ежедневное взвешива- ние животных с целью оценки накопления асцита и изучения срав- ниваемых препаратов на данный процесс.

Результаты оценки прибавки веса представлены в таблице 14. Как видно из таблицы 14 препарат достоверно уменьшал на- копление асцита у мышей с перевитыми опухолями лейкемии L1210. Прибавка веса тела у мышей, получавших исследуемый пре- парат, была достоверно меньше, чем в контрольной группе, причем у животных, получавших исследуемый препарат в дозе 250 мг/кг, средняя прибавка веса была достоверно ниже (в 1 ,5 раза) по сравне- нию с таковым показателем у животных, получавших препарат в дозе 100 мг/кг.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что препарат проявляет выраженное противо- опухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток лейкемии L1210 у мышей, что проявилось в достоверном увеличении про- должительности жизни (78,33% и 76,67%) для доз 100 и 250 мг/кг и достоверном торможении накопления асцита экспериментальных животных (78-43%). Признаков интоксикации на фоне введения ис- следуемого препарата не зарегистрировано. Анализ полученных данных выявил достоверные различия между дозой препарата 100 мг/кг и дозой 250 мг/кг - увеличение дозы препарата приводит к достоверному уменьшению накопления асцита у эксперименталь- ных ивотных. По другим показателям контраст (отличие средних для групп, получавших разные дозы исследуемого препарата) был на уровне ошибок, вызванных естественным разбросом данных.

Результаты влияния препарата на развитие аденокарциномы молочной железы Са-755 представлены в таблице 15.

В таблице 16 приведена средняя продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями аденокарциномы молочной железы Са-755 и контрольной группы, а также данные увеличения продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой в %.

Как видно из таблицы 16 средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками опухолями аденокарциномы молочной железы Са-755 составила 37,9+0,74 дней/ Введение препарата достоверно увеличило продол- жительность жизни мышей до 71 ,9±2,58 дней и 73,4+0,92 дней, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 89,71% и 93,67% для доз препарата 100 мг/кг и 200 мг/кг соответственно, однако различия между опытными груп- пами оказались статистически недостоверными.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что препарат проявляет выраженное противо- опухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток аденокар- циномы молочной железы Са-755 у мышей, что проявилось в дос- товерном увеличении продолжительности жизни (89,71% и 93,67%) для доз 100 и 250 мг/кг. Признаков интоксикации на фоне введения исследуемого препарата не зарегистрировано.

Проведена оценка влияния препарата на средние величины объема опухолей карциномы Льюиса в различные дни после пере- вивки. В контрольной группе опухоли развились у 21 из 26 мышей (80,8%), первые опухоли были зарегистрированы на 7 день после перевивки и регистрировались до 40 дня. Первые опухоли в группе с воздействием препарата в дозе 100 мг/кг были зарегистрированы на 7 день после перевивки и регистрировались до 60 дня; в группе с воздействием препарата в дозе 250 мг/кг были зарегистрированы на 8 день после перевивки и регистрировались до 60 дня. Препарат оказывал выраженный противоопухолевый эффект на развитие кар- циномы легких Льюиса; процент торможения в группе препарата - 100 мг/кг по сравнению с контрольной группой на 10-17 дни досто- верно составлял 71,77% и 58,5%, в группе препарата - 250 мг/кг по сравнению с контрольной группой на 10-17 дни - 84,37% и 54,2% соответственно.

В таблице 17 представлено влияние препарата на рост карци- номы Льюиса, анализировались сроки достижения опухолью разме- ра 500 мм ; в контрольной группе данный показатель колебался от 12 до 20 дней, а в экспериментальных группах - от 17 до 28 дней. Как видно из данной таблицы, препарат достоверно увеличивал этот показатель на 22-27% по сравнению с контролем.

Гибель мышей контрольной группы наступала в результате прогрессирования опухолевого роста основного очага, а также вследствие обширного метастатического поражения легких. Инди- видуальная продолжительность жизни мышей в контрольной груп- пе колебалась от 28 до 39 дней, в группах с препаратом от 51 до 60 дней. В таблице 18 представлено влияние препарата на среднюю продолжительность жизни мышей после перевивки опухоли. Как видно из таблицы 18 препарат достоверно увеличивал среднюю продолжительность жизни примерно на 70% по сравнению с кон- трольной группой, разница между опытными группами статистиче- ски недостоверна.

Индивидуальные вес легких и количество метастазов в легких у мышей контрольной группы и опытных групп с воздействием сравниваемых препаратов представлены в таблице 19.

Как видно из таблицы 19 препарат достоверно уменьшал вес легких и количество метастазов в легких в 1,5-2 раза. Разница меж- ду опытными группами статистически недостоверна.

Таблица 1 Исследование цитотоксичности препарата на модели лимфобласто- идных клеток человека

Количество

Условия опыта, Жизнеспособность

клеток концентрация, мкг/мл клеток, %

х10 ³ /мл

Контроль клеток 98 800

0,5 95 833

1 ,0 94 833

Препарат N°

5,0 98 799

1

10,0 94 767

100 95 600

Таблица 2

Исследование противовирусной активности препарата на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ- 1

Таблица 3

Изучение цитотоксического действия образца фуллеренполиамино- капроновой кислоты на культуру клеток Vero

Примечание: ДМСО в концентрации, применяемой для растворе- ния, не оказывает цитотоксического действия на клетки Таблица JSfo 4

Противогерпетическая активность образца фуллеренполиаминока- проновой кислоты в культуре клеток Vero при инфицирующей дозе вируса герпеса - 100 ТЦИД ₅₀ /0,2мл

Примечание: клетки инфицировали через час после введения образ- цов.

Таблица 5

Защитное действие препарата от цитодеструктивного действия ви- руса герпеса, тип 1 при инфицирующей дозе вируса 100 ТЦИД ₅₀

Препарат Ν» 1

Концентрация

Оптическая плот- Отличия от контро- препарата, мкг/мл

ность ля достоверны при р

0 0,403 ± 0,02

5,0 1 ,110 ± 0,08 < 0,01

10,0 1 ,015 ± 0,07 < 0,01

50,0 1, 153 ± 0,06 < 0,01

100,0 1 ,79 ± 0,05 < 0,01

Контроль клеток 1 , 133 ± 0,07 < 0,01 Таблица 6

Противогерпетическая активность образца фуллеренполиаминока- проновой кислоты в культуре клеток Vero при инфицирующей дозе вируса герпеса -1000 ТЦИД ₅₀ /0,2мл

Примечание: клетки инфицировали через час после введе- ния образцов

Таблица 7

Защитное действие препарата от цитопатического действия вируса герпеса, тип 1 при инфицирующей дозе вируса 1000 ТЦИД ₅₀

Концентрация Оптическая Отличия от контро- препарата, мкг\мл плотность ля достоверны при

Р

0 0,796 ± 0,06

5,0 1,027 ± 0,04 < 0,01

10,0 1,021 ± 0,04 < 0,01

50,0 1,033 ± 0,03 < 0,01

100,0 1 ,083 ± 0,01 < 0,01

Контроль клеток 1, 133 ± 0,07 Таблица 8

Результаты изучения активности препарата N« 1 в отношении са гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl

Различия в показателях 2-х опытов зависели от множественности заражения вирусом культуры клеток MDCK. Таблица 9

Результаты изучения активности препаратов в отношении вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl, средние показатели

Снижение (%) репродукции онцентрац

вируса гриппа в культуре кле-

ИИ

Внесение препарата ток MDCK по отношению к препаратов

контролю в присутствии серий (мкг/мл)

препарата Ν» 1 за 2 часа до 18,0

6,25 инфицирования

одномоментно с 6,0 инфицированием

за 2 часа до 44,0

12,5 инфицирования

одномоментно с 26 инфицированием

за 2 часа до 44,0

25,0 инфицирования

одномоментно с 20,0 инфицированием

за 2 часа до 44,0

50,0 инфицирования

одномоментно с 22,0 инфицированием

за 2 часа до 8

100,0 инфицирования

одномоментно с 29,0 инфицированием Таблица 10

Эффективность фуллеренполиаминокапроновой кислоты на модели гриппозной инфекции у мышей

Примечание: *В опытах смертность в группе вирусного контроля составляла 70%, то есть из 10 мышей погибали 7.

**В опытах смертность в группе вирусного контроля составляла 90%, то есть из 10 мышей погибали 9.

*Схема лечения: за 24 и 1 часа до заражения, далее через 24,48, 72 и 96 часов после заражения

Таблица 11

Изменение веса животных, зараженных вирусом гриппа А/ А и ч и/2/69 (доза LD70) и леченных препаратами

Таблица 12

Влияние препарата на продолжительность жизни мышей с переви- ваемой опухолью лейкемии L 1210

Таблица 13 Влияние препарата на среднюю продолжительность жизни живот- ных с перевиваемой опухолью лейкемии L1210

Примечание: *— достоверные отличия от контроля (при р < 0,05)

Таблица 14

Влияние препарата на развитие асцита у мышей с перевиваемой опухолью лейкемии L1210

Примечание: *— достоверные отличия от контроля (при р < 0,05)

Таблица 15

Влияние препарата на продолжительность жизни мышей с переви- ваемой опухолью лейкемии СА-755

N животного и его продолжительность жизни в

Название

днях

группы

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Контроль 36 39 41 34 35 40 39 38 40 37

Препарат N° 1 ,

79 81 73 82 80 66 63 60 67 68 100 мг/кг

Препарат JSfe 1 _?

77 72 70 78 76 71 73 70 72 75 250 мг/кг Таблица 16

Влияние препарата на среднюю продолжительность жизни живот- ных с перевиваемой опухолью аденокарциномы молочной железы Са-755

Примечание: *— достоверные отличия от контроля (при р < 0,05)

Таблица 17

Влияние препарата на размеры карциномы Льюиса (достижение V =

500 мм ³ )

Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р < 0,05) Таблица 18

Влияние препарата на продолжительность жизни мышей после пе- ревивки карциномы Льюиса

Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р < 0,05)

Таблица 19

Влияние препарата на метастазирование карциномы Льюиса у мы- шей

Примечание: *— достоверные отличия от контроля (при р < 0,05)