Область техники

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и касается новых гидратированных аминокислотных производных фуллерена С ₆ о формулы (I), а также способа их полу- чения и создание фармацевтических композиций на их основе.

Предшествующий уровень техники

Возможность использования фуллеренов, как биологически активных соединений вызвало интенсивное развитие химии функ- циональных производных фуллерена, особенно после того, как бы- ло показано, что ряд водорастворимых производных фуллерена проявляют высокую антивирусную активность (Partha R, Conyers JL, "Biomedical applications of functionalized fullerene-based nanomaterials" Int.J.Nanomedicine, 2009, 4, 261-75 Pat US 6204391, 2005, "Water soluble fullerenes with antiviral activity", R.Bakry et al., "Medicinal application of fullerenes" International Journal of Nanomedecine, 2007 (4) 639-649, Z.Zhu, D.I.Schuster, M.Tuckermann, "Molecular Dynamics Study of the Connection between Flap Closing and Binding of Fulleren-Based Inhibitors of the HIV-1 Protease", Bio- chemistry, 2003, v.42, 1326-1333). Применение производных фуллерена в медицине основано на ли- пофильных свойствах фуллеренового ядра, позволяющих фуллере- новым производным проникать через клеточные мембраны, и спо- собности фуллерена с высоким квантовым выходом генерировать синглетный кислород, расщепляющий ДНК. Эти свойства обеспе- чивают функциональным производным фуллерена проявление ци- тотоксических, антивирусных и других свойств (Bedrov D., Smith G.D., Davande Н., " Passive transport of fullerenes through a lipid membrane." J.Phys.Chem., B, 2008, v. l 12., p.2078-84, Qiao R., Roberts A.E., "Translocation of fullerene and its derivatives across a lipid bilay- er", Nano Lett., 2007, v.7, p.614-9. Nelsen G.D., и др., "In vivo biology and toxicology of fullerenes and their derivatives", Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 2008, v.103, p.197-208).

Гидратированные формы фуллерена проявляют высокую био- логическую активность как биоантиоксиданты, что обусловлено образованием активных структурных форм водных кластеров, ко- ординированных на сфере фуллерена (Andrievsky G.V., Brushkov V.L, Tykhonov A.A., Gudkov S.V. "Peculiarities of the antioxidant and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene nanostructures in vitro and in vivo". Free Radical Biology and Medicine, 2009, v.47, p.786- 793).

Основной проблемой, затрудняющей биологические исследо- вания фуллеренов и их производных и создания лечебных препара- тов на их основе, является сложность введения фуллереновых сис- тем в водные растворы.

Перспективным методом получения водорастворимых фулле- реновых композиций является химическая модификация сферы фуллерена введением гидрофильных солюбилизирующих лигандов. В настоящее время получен большой ряд функционализированных фуллеренов, содержащих гидрофильные фрагменты как в боковой цепи присоединенных к фуллерену лигандов (детергентный тип комплексов), так и сферический тип производных, когда имеются полярные группы, распределенные по фуллереновой сфере (такой тип включает фуллеренолы, аминоаддукты).

Наиболее перспективными для использования являются ами- нокислотные производные фуллерена.

Неприродные аминокислоты алифатического ряда, содержа- щие 6 и более метиленовых групп, проявляют ряд особенностей, проявляющихся в процессах их гидратации и их биохимической ак- тивности. Спектральные исследования структуры воды в водных растворах аминокислот показывают, что увеличение числа метиле- новых групп между амино- и карбоксильной группами приводит к увеличению деструкции водных кластеров. Исследования фармако- логических свойств производных аминокислот широкого ряда R- (СН)пСООН показали более высокую активность систем с п больше и равным 6.

Производные фуллерена С ₆ о сферического типа с аминокис- лотами, полученные по реакции нуклеофильного присоединения аминокислот по аминогруппе к сфере фуллерен описаны в патентах РФ JN .NO 2196602, 2124022, 2236852, которые можно предложить в качестве аналогов настоящего изобретения.

В патенте РФ N° 2196602 предложен способ ингибирования репродукции ВИЧ и ЦМВ-инфекций при помощи соединений на основе аминокислотных и дипептидных производных фуллерена. В качестве аминокислотного производного фуллерена использованы натриевые соли фуллеренаминокапроновой и фуллеренаминомас- ляной кислот.

В патенте РФ N° 2124022 для получения фуллеренаминока- проновой кислоты к раствору фуллерена в о-дихлорбензоле добав- ляют водный раствор калиевой соли аминокапроновой кислоты и 18-краун-6. Реакционную массу перемешивают 6-8 часов при 60°С. Затем растворители отгоняют, остаток обрабатывают насыщенным раствором хлористого калия и остаток фуллеренового производного промывают водой. Выход целевого продукта количественный. По- лученная (моногидро)М-фуллеренаминокапро� �овая кислота раство- рима в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, пиридине. В за- явленном методе синтеза не определены условия выделения конеч- ного продукта.

Основным недостатком полученных соединений, которые представляют собой продукты моноприсоединения, является их не- растворимость в воде. Другим недостатком изобретения является использование в их синтезе краун-эфира в качестве межфазного ка- тализатора, который сложно отделять от получаемых продуктов ре- акции.

В патенте РФ N° 2236852 защищается средство для ингибиро- вания репродукции оболочечных вирусов, представляющее собой фуллеренполикарбоновые анионы общей формулы C ₆ oH _n [NH(CH ₂ ) _m C(0)0 ^" ]n, полученные в результате взаимодействия фуллерена с солью аминокислоты в среде органического раствори- теля в присутствии полиалкиленоксида.

Для получения этих соединений к раствору фуллерена в о-дихлорбензоле (толуоле или любом другом органическом раство- рителе) вносят аминокислоту в виде соли (калиевой или натриевой), затем добавляют солюбилизатор. Порядок внесения в реакционную среду аминокислоты и солюбилизатора не важен, можно вносить их в виде комплекса, предварительно смешав. В качестве солюбилиза- тора используют различные полиалкиленоксиды: полиэтиленглико- ли мол. массы от 150 до 400, и выше 400 (например, ПЭГ- 1500), а также полиэтиленгликоли, имеющие свободные концевые группы, но и с замещенными (например, диметиловый эфир полиэтиленгли- коля мол. массы 500). Для увеличения скорости реакции добавляют любой сильный восстановитель (щелочные металлы). Соотношение ф ллерена и аминокислоты увеличено более чем в 50 раз. Превра- щение в желаемую фармацевтически приемлемую соль, особенно натриевую или калиевую, выполнялась путем обработки кислоты подходящим основанием или путем добавления соли слабой лету- чей кислоты. В частности, не растворимая в воде фуллеренполикар- боновая кислота превращается в более предпочтительные фарма- цевтически приемлемые соли, такие как натриевая соль, которые растворимы в воде. Добавление соли слабой летучей кислоты про- исходит путем обработки раствора солью щелочного металла и сла- бой летучей кислоты. При концентрировании раствора путем выпа- ривания или лиофилизации слабая кислота удаляется, а смесь фул- леренполикарбоновых кислот выделяется в виде смесей их солей щелочных металлов. Целевой продукт по данному изобретению ха- рактеризуется постоянством состава, содержание в целевом про- дукте основного вещества составляет всего 87,8 %.

Основными недостатками фуллеренаминокислотных произ- водных, полученных представленным в патенте методом получения является то, что данным способом получают смесь фуллеренкар- боксилатных анионов, как солевых, так и кислотных форм. Полу- чить индивидуальное соединение способом, описанным в патенте, не представляется возможным. Также фуллеренполиаминокислоты, полученные запатентованным способом, в кислотной форме прак- тически нерастворимы в воде. Получить стабильную фармацевти- ческую композицию с фуллеренполикарбоновыми анионами не удалось, т.к. в процессе хранения соединения выпадают в осадок. Фуллеренполиаминокислоты оказывают влияние на лейкопоэз: вы- зывают сдвиг лейкоцитарной формулы и индуцируют появление молодых форм нейтрофилов - нейтрофильных метамиелоцитов у подопытных животных (крыс и кроликов). С точки зрения безопас- ности (безвредности) это свидетельствует о наличии у данных суб- станций токсичности, вызывающей указанные изменения. Примене- ние в синтезе большого избытка калиевой или натриевой солей аминокислот и больших избытков растворителей приводит к воз- никновению экологических проблем, связанных с утилизацией от- ходов производства, а также к удорожанию процесса производства. Использование щелочных металлов для увеличения скорости реак- ции является технологически невозможным при использовании хлорированных ароматических растворителей.

Раскрытие изобретения

Задачей заявляемого технического решения является получе- ние индивидуальных гидратированных соединений фуллерена С ₆ о с аминокарбоновыми кислотами, обладающих активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, вирусов гриппа различной при- роды, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью, не оказывающих токсического действия на организм; способ получения данных соединений и фармацевтические компо- зиции, включающие данные соединения. Для решения поставленной задачи предложена группа изо- бретений, объединенных единым изобретательским замыслом: со- единение, способ его получения и фармацевтические композиции, содержащие указанное соединение.

Поставленная задача решается индивидуальным гидратиро- ванным соединением фуллерена С ₆ о с аминокарбоновыми кислота- ми общей формулы (II), характеризующееся тем, что на одну моле- кулу фуллерена приходится три ковалентно связанных аминокис- лотных фрагмента, имеющих в своей структуре активные центры гидратации, приводящие к образованию водорастворимых гидра- тов, и длинные углеводородные цепи, позволяющие удерживать молекулы воды во внутренней координационной сфере фуллерено- вых комплексов.

С ₆₀ (Н)з {NH(CH ₂ ) _n COOH} xH ₂ 0,

(П) где С ₆ о - фуллерен, п = 5, 6, 7, х = 8-10

Указанная задача решается тем, что гидратированные фулле- реновые производные аминокислот формулы (II), образуются при взаимодействии фуллерена с 15-кратным мольным избытком без- водных калиевых солей аминокислот в среде органического арома- тического растворителя при медленном добавлении к полученной суспензии межфазного катализатора при перемешивании и нагрева- нии до температуры не выше 60-80°С до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка, который затем выделя- ют, после чего осуществляют обработку 0,8 М водных растворов калиевых солей фуллеренаминокислот 0, 1Н раствором органиче- ских или минеральных кислот с последующим центрифугировани- ем, промывкой и высушиванием осадка. Также, согласно изобретению, безводные калиевые соли ами- нокислот используют в мелкодисперсном состоянии, что позволяет повысить реакционную способность процесса, его эффективность и экономичность, а выделение твердого осадка калиевых солей фул- леренаминокислот осуществляют фильтрованием, промывкой эти- ловым спиртом и высушиванием. В качестве межфазного катализа- тора используют метиловые эфиры полиэтиленоксидов молекуляр- ной массы 200, 400, 500, как наиболее доступные и безопасные ка- тализаторы.

Указанная задача решается также созданием фармацевтиче- ских композиций, содержащих в качестве активного вещества водо- растворимые гидратированные фуллерен-аминокислоты формулы (II), обладающих активностью против вируса герпеса, вируса гепа- тита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противо- опухолевой и противопСориатической активностью.

Фармацевтические композиции по предложенному техниче- скому решению содержат соединение общей формулы (II) в количе- стве, эффективном для достижения желаемого результата, и могут быть введены в виде стандартных лекарственных форм (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах), содержащих соедине- ния предложенного технического решения в качестве активного ин- гредиента в смеси с носителем или наполнителем, пригодным для внутримышечного, внутривенного, перорального, сублингвального, ингаляционного, местного, интраназального и интраректального введения. Активный ингредиент может быть включен в компози- цию вместе с обычно используемыми нетоксичными фармацевти- чески приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, драже, суппозиториев, эмуль- сий, суспензий, мазей, гелей и любых других лекарственных форм.

Конкретный уровень дозировок и частота приема лекарства для каждого конкретного пациента будет зависеть от большого чис- ла факторов, включая активность конкретного производного фулле- рена, метаболическую стабильность и длительность действия, ско- рость выделения, возраст пациента, вес тела, общее состояние здо- ровья, пол, лекарственные комбинации, а также тяжесть заболева- ния у данного индивида, подвергаемого лечению.

Для орального применения в виде суспензий композиции го- товят согласно методам, широко известным в области приготовле- ния фармацевтических рецептур, и они могут содержать микрокри- сталлическую целлюлозу или ее производные для обеспечения мас- сы, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспенди- рующего агента, метилцеллюлозу в качестве усилителя вязкости и подслащивающие агенты и/или отдушки, известные в этой области. В форме таблеток такие композиции могут содержать микрокри- сталлическую целлюлозу, кальций фосфат, крахмал, стеарат магния и лактозу и/или другие эксципиенты, связующие вещества, расши- рители, дезинтеграторы, разбавители и смазывающие вещества, из- вестные в данной области.

При применении в виде назальных аэрозолей или путем инга- ляции такие композиции готовят методами, хорошо известными в области фармацевтических рецептур, и они могут выпускаться в виде растворов на физиологическом растворе, с использованием бензойной кислоты или других подходящих консервантов, промо- торов адсорбции для усиления биоприменимости, и/или других со- любилизирующих или диспергирующих агентов, известных в дан- ной области.

Растворы или суспензии для инъекций могут формироваться согласно известным методам, с использованием нетоксичных, па- рентерально применимых разбавителей или растворителей, таких как маннит, 1,3-бутандиол, вода, раствор Рингера или изотониче- ский раствор хлористого натрия или подходящих диспергирующих или смачивающих и суспендирующих агентов, таких как стериль- ные, мягкие, устойчивые масла, включая синтетические моно- или диглицериды, или жирные кислоты, включая олеиновую кислоту.

При ректальном применении в виде свечей такие композиции могут готовиться путем смешивания лекарства с таким нераздра- жающим эксципиентом, как масло какао, синтетические глицерид- ные сложные эфиры или полиэтиленгликоли, которые являются твердыми веществами При обычных температурах, но сжижаются и/или растворяются в ректальной полости с выделением лекарства.

При местном применении в виде мазей, гелей, кремов, лини- ментов и т.д. такие композиции могут готовиться путем смешива- ния активных ингредиентов с приемлемой мазевой основой.

В качестве мазевой основы могут быть использованы жиро- вые, углеводородные или гидрофильные основы, например вазелин, вазелиновое масло, парафин, воск, ланолин, полиэтиленгликоль и др.

В качестве основы для гелей могут быть использованы ме- тилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, оксипро- пилцеллюлоза, полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, карбопол, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт и т.д. Предложенное изобретение касается соединений, способа по- лучения этих соединений и их фармацевтически приемлемых ассо- циатов с полярными реагентами. Полученные соединения не оказы- вают влияния на лейкопоэз: не вызывают сдвига лейкоцитарной формулы и не индуцируют появление молодых форм нейтрофилов - нейтрофильных метамиелоцитов у подопытных животных (крыс и кроликов). С точки зрения безопасности (безвредности) это свиде- тельствует об отсутствии у данных соединений токсичности, вызы- вающей указанные изменения. Заявляемый способ позволяет полу- чить различные по составу композиции на основе фуллеренамино- кислот в зависимости от соотношения реагентов и условий прове- дения процесса, а именно: водорастворимые гидратированные фул- лерен-аминокислоты общей формулы (II).

Способ основан на использовании в стадии синтеза опти- мальных соотношений исходных реагентов, минимальных коли- честв органического растворителя и межфазного катализатора, с последующем выделением заявляемых соединений с использовани- ем концентрированных растворов органических и минеральных ки- слот, что приводит к количественному получению фуллеренамино- кислотных композиций определенного состава и возможности при- менения заявляемого способа для их промышленного синтеза, от- личающегося эффективностью и экологичностью.

Технический результат предлагаемого технического решения состоит в получении устойчивых индивидуальных водораствори- мых гидратированных соединений фуллерена С ₆ о с аминокарбоно- выми кислотами, не оказывающих токсического воздействия на ор- ганизм. Разработан эффективный способ получения индивидуаль- ных устойчивых гидратированных производных фуллерена, обла- дающих противовирусной, противоопухолевой и противопсориати- ческой активностью.

Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими при- мерами.

Варианты осуществления изобретения

Пример 1. Получение гидрата ]М-фуллерен-(трис-8- аминокапроновой кислоты) (по номенклатуре ИЮПАК - гидрат N- фуллерен-(трис-6-аминогексановой кислоты) формулы: N- C ₆ o(H) ₃ {NH(CH ₂ ) ₅ COOH} ₃ - 10 Н ₂ 0.

К раствору 60 г (0,08 моля) фуллерена С ₆ о в 4,5 л о-дихлорбензола добавляют 204 г (1 ,2 молей) тонко измельченной безводной калийной соли ε-аминокапроновой кислоты. К получен- ной суспензии при перемешивании и нагревании не выше 60°С прибавляют в течение 2-х часов смесь о-дихлобензола и метилового эфира полиэтиленгликоля 500 в соотношении 5: 1. Реакционную смесь перемешивают при температуре не выше 60°С в течение 5 ча- сов до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают не- сколькими порциями этилового спирта и высушивают в вакууме при температуре не выше 60°С. Выделенную смесь калиевых солей фуллеренаминогексановой кислоты и аминогексановой кислоты растворяют в 100 л дистиллированной воды. В раствор медленно при перемешивании добавляют 0 Н раствор соляной кислоты до рН 5,1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта, Затем водный слой декантируют. Осадок, представляющий собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, центрифугируют и промывают во- дой до рН 6. Осадок высушивают при температуре не выше 60°С в вакуумном сушильном шкафу. Выход продукта количественный и составляет 1 15 г.

Соединение представляет собой темно-коричневое твердое вещество, растворимое в воде, растворимое в смесях CH ₃ CN:H ₂ 0 - 1 : 10 и ДМФА:Н ₂ <Э - 1 : 100.

По данным термогравиметрического анализа полученное со- единение содержит 10 молей Н ₂ 0. При температуре 350°С происхо- дит интенсивное разрушение комплекса. Остаток после разложения содержит фуллерен и продукты его окисления.

ИК-спектр продукта (I) содержит полосы поглощения, харак- терные для Ν-замещенных аминокислот: группа -СООН- 1704 см ^"1 , 1658 см ^"1 , Ν-Η-валентные колебания 3400 см ^'1 , N-H- деформационные-1552 см ^"1 , полосы поглощения C ₆ o-NH-R- 1 104 см ^" ', 930 см ^"1 , 830 см ^"1 .

Электронный спектр поглощения не содержит полосы погло- щения свободного фуллерена.

Элементный анализ соединения показывает следующие соот- ношения элементов: %С=72,75; %Н=4,70; %N=2,32; рассчитано для брутто-формулы С ₇₈ Нз ₉ О _б Мз10Н ₂ О: %С=72,38, %Н=4,3, %N=3,24.

Количество карбоксильных групп в продукте определялось по реакциям с солями металлов и аминами. По реакции с азотнокис- лым серебром количественно выделен комплекс состава

C60(H) ₃ {NH(CH ₂ ) ₅ COOAg} ₃ 10Н ₂ О. (Найдено: %Ag=20,88,

%С=57,80, %N=2,51 , %Н=3,32; рассчитано для: С ₇₈ Нз ₆ 0 ₆ Мз

Ag ₃ (10H ₂ O) - %Ag=20,00, %С=57,88, %N=2,60, %Н=3,46).

По реакции с трисамином получен водорастворимый ком- плекс состава С ₆₀ (Н) ₃ {NH(CH ₂ ) _n COO ^" NH ₃ ⁺ C(CH ₂ OH) ₃ }3 (найдено %С=64,88, %Н=4,56, %N=5,08, рассчитано для C ₉ oH ₇₂ 0 ₁₅ N ₆ 10Н ₂ О: %С=65,2, %Н=4,34, %N=5,10). Пример 2. Получение гидрата М-фуллерен-(трис-ш- аминоэнантовой кислоты) (по номенклатуре ИЮПАК - гидрат N- фуллерен-(трис-7-аминогептановой кислоты) формулы: N- C ₆₀ (H) ₃ {NH(CH ₂ ) ₆ COOH} ₃ -8 Н ₂ 0.

К раствору 72 г (0,1 моля) фуллерена С ₆ о в 4 л о-дихлорбензола добавляют 182 г (1 ,2 молей) тонко измельченной безводной калийной соли ω-аминоэнантовой кислоты. К получен- ной суспензии при перемешивании и нагревании не выше 80°С прибавляют в течение 3-х часов смесь о-дихлобензола и метилового эфира полиэтиленгликоля 500 в соотношении 5:1. Реакционную смесь перемешивают при температуре не выше 80°С в течение 8 ча- сов до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают не- сколькими порциями этилового спирта и высушивают в вакууме при температуре не выше 60°С. Выделенную смесь калиевых солей фуллеренаминоэнантовой и аминоэнантовой кислот растворяют в 120 л дистиллированной воды. В раствор медленно при перемеши- вании добавляют ОДН раствор соляной кислоты до рН 5,1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта, затем водный слой декантируют. Осадок, представляющий собой тонкую взвесь твер- дого продукта в воде, центрифугируют и промывают водой до рН 6. Осадок высушивают при температуре не выше 60°С в вакуумном сушильном шкафу.

Выход продукта количественный и составляет 130 г.

Соединение представляет собой темно-коричневое твердое вещество, растворимое в воде, растворимое в смесях CH ₃ CN:H ₂ 0 - 1 : 10 и ДМФА:Н ₂ 0 - 1 : 100. По данным термогравиметрического анализа полученное со- единение содержит 8 молей Н ₂ 0. При температуре 450°С происхо- дит интенсивное разрушение комплекса. Остаток после разложения содержит фуллерен и продукты его окисления.

ИК-спектр продукта содержит полосы поглощения, характер- ные для Ν-замещенных аминокислот: группа -СООН- 1707 см ^"1 1650 см ^"1 , Ν-Η-вал.колебания - 3400 см ^"1 , N-H- деформационные - 1552 см ^"1 , полосы поглощения С _б о-NH-R- 1 104 см ^'1 , 930 см ^"1 , 830 см ^"1 .

Электронный спектр поглощения содержит полосу поглоще- ния при 260нм.

Элементный анализ продукта показывает следующие соотно- шения элементов: %С=73,55; %Н=4,60; %N=3,18; рассчитанные значения для брутто-формулы C8iH4 ₅ 0 ₆ N ₃ (8 Н ₂ 0) - %С=74,82, %H=4,69, %N=3,23.

По реакции с азотнокислым серебром выделена серебряная соль фуллеренаминокислоты, количественно доказывающая нали- чие трех аминокислотных фрагментов в составе полученного про- дукта.

Пример 3. Получение гидрата ] -фуллерен-(трис-8- аминооктановой кислоты) формулы: N-

C ₆₀ (H) ₃ {NH(CH ₂ ) ₇ COOH} _r 10 Н ₂ 0.

Проводят аналогично примеру 1 только вместо тонко измель- ченной безводной калийной соли ε-аминокапроновой кислоты (со- аминоэнантовой кислоты) используют калиевую соль аминооктано- вой кислоты. Анализ полученного соединения доказывает пред- ставляемый состав комплекса. Была изучена противовирусная активность соединения в от- ношении ВИЧ, ВПГ, вируса гриппа, а также противоопухолевая ак- тивность. Соединение обладает высокой противоопухолевой и про- тивовирусной активностью в отношении всех названных вирусов. Ниже приведены лучшие примеры осуществления изобретения. В приведенных ниже примерах соединение, полученное способом, описанным в примере 1 , названо по тексту препарат N° 1 (фуллерен- трис-аминокапроновой кислоты гидрат).

Пример 4. Изучение активности фуллерен-трис- аминокапроновой кислоты в отношении вируса иммунодефицита человека.

Исследования проводились в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, г. Москва. В задачу исследований входило изучение активности препарата в отношении вируса иммунодефи- цита человека.

К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали вирусом в дозе 0,01 ТЦИД ₅₀ /клетка. Инкубировали культуры клеток при 37°С в атмосфере с 5% С0 ₂ и 98% влажности 4-5 дней. Учет ре- зультатов проводили окрашиванием клеток с помощью красителя и световой микроскопии: исследование цитопатического эффекта ви- руса (ЦПД) и вирусиндуцируемого синцитийобразования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).

Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по об- щепринятой четырехкрестовой системе знаками + или - соответст- венно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, со- ответствующих одному исследуемому показателю. ++++ -100%^ гибель клеток в четырех лунках, использован- ных в опыте на одно разведение

+++ - 75% ^ω гибель клеток в каждой из четырех лунок, ++ - 50% гибель клеток в каждой из четырех лунок, + - 25%^ гибель клеток в каждой из четырех лунок,

+- - начало дегенерации,

- отсутствие цитодеструкции.

Результаты исследования представлены в таблицах 1-2.

Полученные данные (таблица 1, 2) показали, что препарат N° 1 обладает противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека типа 1 в концентрации 1 - 10 мкг/мл. ЭК ₅₀ (50%-эффективная концентрация) предлагаемого препарата 5,0 мкг/мл.

Пример 5. Изучение активности фуллерен-трис- аминокапроновой кислоты в отношении вируса гриппа.

Исследования проводились в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва. В задачу исследований входило изучение противовирусной активности препарата в культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl )swl.

Препарат разводили в диметилсульфоксиде (ДМСО) (5 мг субстанции + 0,5 мл ДМСО) с последующим добавлением 4,5 мл среды для культур клеток MEM, получая т.о. сток в концентрации 1,0 мг/мл. В последующем проводили разведения стоков средой MEM до рабочих концентраций 6,5 мкг/мл - 12,5 - 25,0 - 50,0 - 100 мкг/мл. Определение противовирусной активности вещества прово- дили по снижению репродукции вируса гриппа в культуре клеток MDCK, выявляемой ИФА.

С этой целью клетки МДСК выращивали в 96-луночных планшетах до полного монослоя, отмывали от ростовой среды и вносили вещества в двукратной концентрации в 100 мкл среды MEM. Инфицирование . вирусом в рабочей дозе 100-1000 ТЦИД ₅₀ проводили в двух режимах: через 2 часа после внесения веществ и одномоментно. Планшеты инкубировали в термостате с С0 ₂ в тече- ние 24 часов при 37°С. После инкубации среду удаляли и клетки фиксировали 80% ацетоном в PBS в течение 15 минут, хорошо вы- сушивали и осуществляли постановку ИФА, проводя последова- тельно адсорбцию специфических реагентов - моноклональных ан- тител, конъюгата и субстрата (ортофенилендиамин). Реакцию учи- тывали по оптической плотности при 492 нМ на спектрофотометре фирмы «Биоком». Каждое разведения вируса исследовали в 3-х по- вторах, для которых вычисляли среднее значение оптической плот- ности (ОП). Процент ингибирования определяли, как отношение между разницей ОП опыта и ОП клеточного контроля, разделенное на разницу ОП вирусного контроля и ОП клеточного контроля, ум- ноженное на 100%. На основании полученных данных определены значения минимальной концентрации вещества, вызывающей 50,0% ингибирование вирусной репродукции (МИК ₅₀ ).

Оценку подавления репродукции вируса гриппа A(H1N1) проводили в 3-х опытах при разной множественности заражения. Результаты представлены в табл. 3 (протоколы 3-х опытов) и табл. 4 (средние значения полученных результатов 3-х опытов). Как видно из таблицы 4, наибольшую активность по сниже- нию репродукции вируса гриппа в культуре клеток MDCK проявила серия препарата 1. Четко прослеживается зависимость степени ре- продукции и концентрации препарата: с повышением концентрации - снижается репродукция вируса. Кроме того, значительных отли- чий в показателях при разных режимах инфицирования (через 2 ча- са после внесения препарата или одномоментно) не отмечено. При этом показатели минимальной ингибирующей репродукцию вируса в 2 раза концентрации (МИК ₅₀ ), составили: в режиме внесения пре- парата за 2 часа - 9,5 мкг/мл и при одномоментном внесении - 12,5 мкг/мл. Расчет проведен при графическом построении полученных данных.

Таким образом, полученные результаты изучения активности разных серий препарата N<> 1 в отношении вируса гриппа A/IIV- Moscow/01/2009 (HlNl)swl выявили высокую активность подавле- ния его репродукции в культуре клеток MDCK серией 1, при сред- ней активности - серии 2. При этом режимы внесения препаратов за 2 часа до инфицирования или одновременно с инфицированием не влияли на их активность в культуре клеток MDCK.

Пример 6. Изучение противовирусной активности фуллерен- трис-аминокапроновой кислоты на модели гриппозной пневмонии мышей.

Исследования выполнялись в центре химии лекарственных средств (ЦХЛС - ВНИХФИ), г. Москва.

В работе использовали препарат Ns 1 в виде темно- коричневого порошка. Для перорального применения готовили не- обходимые дозы препарата, растворяя навески в 1% растворе крах- мала, сваренного на воде. Для внутрибришинного и внутримышеч- ного применения навески препарата N2 1 растворяли в 1 ,5% раство- ре диметилсульфоксида.

В работе был использован вирус гриппа А/Аичи/2/69 (H3N2), адаптированный к мышам. Данный вирус широко используется для определения эффективности противовирусных препаратов на моде- ли гриппозной пневмонии мышей и был получен из музея вирусных штаммов и клеточных культур ГУ НИИ вирусологии РАМН. Для подготовки инфицирующего материала мышей заражали интрана- зально аллантоисным вирусом, после проявления признаков болез- ни их забивали и в стерильных условиях получали гомогенат легоч- ной ткани. Далее этот гомогенат использовали для заражения 10- дневных куриных эмбрионов, из которых получали аллантоисный вирус и после титрования на его мышах использовали для инфици- рования животных.

Белых беспородных мышей (самки) массой 12-14 г получали из питомника «Андреевка» (Московская обл.) и содержали на стан- дартном рационе в регламентированных условиях вивария.

Предварительно взвешенные мыши (самки нелинейные, сред- ний вес 12-14 г) инфицировались интраназально под легким эфир- ным наркозом вирусом гриппа А/Аичи/2/69 (H3N2) (10ЛД ₅₀ в 100 мкл). В предварительном опыте было проведено определение ЛД ₅₀ путем титрования аллантоисного вируса на таких же мышах, кото- рые затем использовались в основном опыте. Была использована следующая схема лечения исследуемым препаратом: за 24 часа до инфицирования, за 1 час до инфицирования, через 24 часа и далее 1 раз в день через 24 часа в течение 5 дней. Для перорального введе- ния использовали одноразовый инсулиновый шприц со специаль- ной иглой (лаваж), каждую дозу вводили в объеме 100 мкл. Для внутрибрюшинного и внутримышечного лечения также каждую до- зу вводили в объеме 100 мкл. Группа вирусного контроля представ- ляла собой 10 мышей, инфицированных вирусом, но не леченных препаратами. Также в опыте было две группы по 10 неинфициро- ванных мышей, которым вводили внутрибрюшинно и внутримы- шечно по 100 мкл 1 ,5% DMSO, который использовался в качестве растворителя препаратов. В остальных группах также изначально было по 10 животных. За леченными и контрольными животными велось ежедневное наблюдение, в первые 5 дней после инфициро- вания мыши взвешивались каждый день, далее - через день. Хи- миотерапевтическую активность препарата N° 1 на модели гриппоз- ной пневмонии мышей оценивали по трем критериям: показатель защиты от смертельной вирусной инфекции, увеличение средней продолжительности жизни и уменьшение снижение веса в группах животных, леченных препаратом по сравнению с контрольной группой.

Лечение препаратом N° 1 было эффективно, уменьшая смерт- ность мышей от гриппозной пневмонии и потерю их веса, и увели- чивая среднюю продолжительность жизни по сравнению с вирус- ным контролем. Эффективность данного лечения зависела от дозы препарата и способа лечения. Эффективность перорального лечения фуллерен-трис-аминокапроновой кислотой гидрат увеличивалась с увеличением дозы препарата. Пероральное лечение препаратом Ns 1 было эффективно, увеличивая среднюю продолжительность жизни в 1 ,6 - 1 ,7 раз. Наиболее эффективным по всем трем параметрам (показатель защиты от смертности, средняя продолжительность жизни и потеря веса) было лечение фуллерен-трис- аминокапроновой кислотой гидрат внутримышечно, которое в до- зах 100 и 200 мг/кг/день предотвращало гибель 70-80% зараженных животных и потерю их веса, а также увеличивало продолжитель- ность их жизни почти в 2 раза.

Внутрибрюшинное лечение фуллерен-трис-аминокапроновой кислотой было эффективно только в дозах 50 и 100 мг/кг/день. Ги- бель животных, значительное снижение средней продолжительно- сти жизни и веса мышей при внутрибрюшинном лечении их препа- ратом N° 1 в дозе 200 мг/кг/день дают основание полагать, что дан- ная доза при этом способе введения является токсичной для инфи- цированных мышей. Результаты представлены в таблицах 5 - 6.

Пример N»7. Изучение протективной активности фуллерен- трис-аминокапроновой кислоты при экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной вирусами раз- личного происхождения.

Исследования выполнялись в научно-исследовательском ин- ституте гриппа, г. Санкт-Петербург.

В работе использовали препарат N° 1 в виде черного мелко- дсперсногопорошка. Навески препарата были растворены в среде для клеточных культур Игла MEM (БиолоТ, Санкт-Петербург, кат. N° 1.3.3). Из полученного раствора были приготовлены серии разве- дений на среде MEM для определения противовирусной активности образцов в опытах на животных.

В качестве референс - препаратов использовали Ремантадин (1-(1-адамантил)-аминоэтил гидрохлорид, Aldrich Chem. Co., Milw.,WI, cat. Jfe 39.059-3) и Тамифлю (3TIUI(3R,4R,5S)-4- ацетамидо-5-амино-3-( 1 -этилпропокси)- 1 -циклогексен- 1 - карбоксилат фосфат, Hoffmann LaRoche, Швейцария). Вирусы. В работе были использованы адаптированные к мы- шам вирусы гриппа следующих штаммов:

- A/Swine/ 1976/31 (H1N1) - свиного происхождения;

- A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) - человеческого происхождения (ремантадин- устойчивый);

- А/Владивосток/2/09 (H1N1) - человеческого происхождения (Тамифлю- устойчивый). Вирусы пассировали в аллантоисной по- лости 10-12 дневных куриных эмбрионов в течение 48 часов при 36°С. Штамм А/Владивосток/2/09 (H1N1) предварительно адапти- ровали к мышам путем трех пар чередующихся пассажей на живот- ных и в куриных _. эмбрионах.

Для заражения животных была использована вируссодержа- щая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов. Из нее готовили серию 10-кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционная активность вируса в заражающем материале была определена в отдельном эксперименте при помощи титрова- ния по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по ме- тоду Рида и Менча (Am.J.Hyg., 1938,27:493-497).

Белых беспородных мышей (самки) массой 14-16 г получали из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.) и содержали на стандартном рационе в регламентированных условиях вивария НИИ гриппа РАМН. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. До начала испытаний животные нахо- дились под наблюдением 2 недели.

Исследуемые препараты вводили животным внутрибрюшин- но в объеме 0,2 мл в следующих дозах: Препарат J » l — 300, 100 и 30 мг/кг, Ремантадин - 50 мг/кг, Тамифлю - 20 мг/кг веса животных. Препараты вводили по лечебно - профилактической схеме: за 24 ча- ca и 1 час до заражения и через 24, 48 и 72 часа после заражения. В качестве плацебо контрольной группе животных вводили физиоло- гический фосфатный буфер. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы.

Вирусы вводили животным интраназально под легким эфир- ным наркозом в дозе 1 и 10 LD ₅ o. В каждую группу наблюдения брали по 25 мышей. На 3 день после заражения 10 животных из ка- ждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие. Из этих 10 легких 5 использовали для выделения вируса (заморажива- ли и хранили при - 20 °С до постановки соответствующих экспери- ментов), оставшиеся 5 фиксировали 10% формалином и использо- вали для гистологического анализа (см. ниже).

Наблюдение за оставшимися животными осуществляли в те- чение 14 дней, т.е. срока, в течение которого при эксперименталь- ном гриппе отмечается смертность животных. Ежедневно фиксиро- вали смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (М, отношение числа павших за 14 дней животных к общему числу зараженных животных в груп- пе), индекс защиты (IP, отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в кон- трольной группе) и среднюю продолжительность жизни животных (DL) из расчета 14 дней наблюдения.

Животных, выживших к 15 суткам после инфицирования, вскрывали и визуально оценивали обширность очагов постгриппоз- ной пневмонии в легких. Размер очагов выражали в процентах от общей поверхности легких. Клинические признаки заболевания были типичными для гриппозной инфекции и включали затрудненное дыхание, атаксию, тремор, а также снижение потребления корма и воды и как следст- вие, веса животных.

Данные по динамике смертности животных в контрольных и опытных группах суммированы в табл. 7 - 9.

Как видно из представленных результатов, вирус гриппа вы- зывал летальную инфекцию у белых мышей, сопровождающуюся гибелью животных начиная с 3-4 суток после инфицирования в за- висимости от дозы вируса. Такой показатель, как продолжитель- ность жизни животных, был связан с использованной дозой вируса обратной зависимостью. Ремантадин, использованный в опыте как референс - препарат, оказывал при этой инфекции весьма умерен- ное протективное действие, что проявлялось некоторым снижением смертности в опытных группах по сравнению с контролем (индекс защиты 13-29 %) и незначительным увеличением продолжительно- сти жизни (на 1 ,1 - 1 ,6 суток в зависимости от дозы вируса). Полу- ченные данные, таким образом, согласуются с ранее полученными результатами экспериментов in vitro и in vivo, свидетельствующих о нечувствительности использованного штамма вируса к ремантади- ну. Некоторый протективный эффект в этом случае можно объяс- нить антитоксическим действием препарата.

В то же время препарат сравнения Тамифлю проявлял выра- женный защитный эффект, как снижая смертность в группах мы- шей, получавших лечение (приблизительно на 70% по сравнению с контролем), так и увеличивая средний срок жизни животных (на 2-6 суток). Таким образом, использованный вирус оказался устойчив к ремантадину, однако чувствителен к Тамифлю. При анализе полученных данных было обнаружено, что ис- следованный образец препарата по своим протективным свойствам приближался к препарату сравнения - Тамифлю (таблица 7).

Полученные результаты были подтверждены при использова- нии модели гриппозной пневмонии, вызванной двумя другими штаммами вируса гриппа. Данные этих опытов суммированы в таб- лицах 8 - 9.

Как видно из приведенных данных, активность химиопрепа- ратов в отношении использованных вирусов существенно различа- лась. Так, в отношении штамма гриппа А/Владивосток/2/09 этио- тропный препарат Тамифлю оказался неактивен. Таким образом, ранее полученные данные об устойчивости этого изолята к Тамиф- лю были подтверждены в опытах на животных. В то же время ак- тивность исследуемого препарата против этого штамма оказалась весьма высокой, что, несомненно, следует рассматривать как пре- имущество препарата.

Показатель активности исследуемого препарата (индекс за- щиты - продление срока жизни) составил - 21-72 % и 0,8 - 4,4 сут., в зависимости от использованного штамма, инфицирующей дозы вируса и дозы препарата.

Для исследования влияния препарата N° 1 на репликативную активность вирусов гриппа в ткани легких инфицированных живот- ных на 3 сутки после заражения из легких животных были приго- товлены гомогенаты, в которых затем определяли инфекционный титр вируса в культуре клеток. Данные об уровне репликации мо- дельных вирусов гриппа в организме животных приведены в табл. 10. Как можно заключить из представленных результатов, все три использованные вируса были способны эффективно реплициро- ваться в легочной ткани мышей, достигая к 3 суткам титров 3,4 - 6,4 logioEID ₅₀ /20 мг в зависимости от использованного штамма и инфицирующей дозы вируса. Применение химиопрепаратов - ис- следуемого препарата и препаратов сравнения - ограничивало раз- множение вируса в различной степени. Так, ремантадин не сущест- венно (на 2-3 порядка) снижал инфекционную активность чувстви- тельных вирусов A/Swine/ 1976/31 и А/Владивосток/2/09, однако не проявлял достоверной ингибирующей активности в отношении ре- мантадин- устойчивого штамма A/Puerto Rico/8/34. Тамифлю ока- зался активен против вирусов A/Swine/ 1976/31 и A Puerto Rico/8/34. В то же время при тестировании его на модели устойчивого штамма А/Владивосток/2/09 было обнаружено некоторое снижение инфек- ционных титров вируса, однако отличия от контроля были недосто- верными.

Препарат исследования проявлял существенную ингибирую- щую активность против всех исследованных вирусов. Уровень ее не превышал, однако оказался сопоставим с активностью препаратов сравнения - Ремантадина и Тамифлю. При использовании вирусов, устойчивых к химиопрепаратам, активность исследуемого препара- та была значительно выше, чем активность Тамифлю против озель- тамивир- устойчивого штамма А/Владивосток/2/09, и чем актив- ность ремантадина против ремантадин-устойчивого штамма A PR 8/34.

При изучении особенностей морфогенеза экспериментальной гриппозной инфекции при лечебно-профилактическом введении препарата N° 1 в дозе 300 мг/кг было отмечено, что морфогенез ин- фекционного процесса в легких животных, получавших препарат, во многом отличался от морфологических изменений в легких кон- трольных животных. Основное отличие на 3 сутки после инфици- рования касалось характера воспалительного экссудата, а именно то, что при одинаковой его интенсивности в нем практически не отмечалось клеток в стадии распада, характерных для острой ста- дии гриппозной пневмонии. Клеточный компонент экссудата был представлен исключительно интактными нейтрофилами, лимфоци- тами и макрофагами. Кроме того, серозный и геморрагический компоненты экссудата были также выражены слабее. Клетки брон- хиального эпителия выглядели более сохранными, чем у контроль- ных животных. Сами очаги воспаления занимали меньшую по сравнению с контролем площадь.

Те же тенденции отмечались и на стадии постгриппозной пневмонии. Очаги поражения легких были существенно ограниче- ны в размерах, при морфологическом исследовании выявлялась умеренная метаплазия эпителия и инфильтрация интерстиция ин- тактными нейтрофилами и круглоклеточными элементами. Следует отметить, что эффект препарата наблюдался при заражении живот- ных любым из трех исследованных вирусов независимо от их чув- ствительности или устойчивости к препаратам сравнения.

Дополнительным критерием протективного действия препа- рата N° 1 служила оценка размеров очагов хронических поражений легких у животных. Результаты этого теста приведены в табл. 1 1.

Как видно из приведенных результатов, все три вируса инду- цировали формирование в легких стойких очагов хронических по- ражений, обнаруживаемых визуально у выживших животных на 15 сутки после инфицирования. Препараты сравнения ремантадин и Тамифлю - достоверно снижали протяженность очагов постгрип- позной пневмонии, вызванной чувствительными к ним вирусами, и были неактивны в случае устойчивых штаммов. В то же время пре- парат N° 1 достоверно снижал этот показатель независимо от ис- пользованного вируса.

Таким образом, показано, что при изученных концентрациях (300-30 мг/кг) препарат N° 1 проявляет дозозависимую протектив- ную активность на использованных моделях. Эта активность прояв- лялась в следующих показателях:

- 6 - 200-кратное снижение инфекционных титров вируса в ткани легких инфицированных животных;

- продление срока жизни зараженных животных (на 0, 1 - 4,4 суток в зависимости от использованного штамма, дозы вируса, пар- тии синтеза и дозы препарата);

- снижение специфической смертности в группах опыта на 7 -

72 % в зависимости от использованного штамма, дозы вируса, пар- тии синтеза и дозы препарата;

- снижение в 2 - 4 раза средней протяженности очагов хрони- ческой постгриппозной пневмонии.

По совокупности показателей протективная активность пре- парата N° 1 при некоторых дозах оказалась сопоставима с активно- стью препарата сравнения - ремантадина.

Полученные данные свидетельствуют о наличии у препарата

Ne 1 высокой противогриппозной активности, в том числе в отно- шении штаммов свиного происхождения, а также в отношении ви- русов, устойчивых к применяемым в клинике противогриппозным препаратам Ремантадину и Тамифлю. Пример 8. Исследование противоопухолевой активности пре- парата фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты на моделях со- лидной и асцитной форм карциномы Эрлиха у белых мышей.

Задачами настоящего исследования являлись:

- исследование эффекта препарата Ν» 1 на динамику роста ас- цитной опухоли при внутрибрюшинном введении раковых клеток;

- исследование действия препарата Ν2 1 на динамику роста солидной опухоли, исследование влияния препаратов на морфоло- гию и морфометрические показатели солидной формы карциномы Эрлиха;

- исследование действия препарата Ν° 1 на апоптотическую активность клеток асцитной формы карциномы Эрлиха.

В работе использовали водный раствор препарата N° 1 в двух дозах - в концентрациях 30 и 10 мг/кг. Животным вводили подкож- но 0,2 мл раствора каждой из концентраций за 24 часа до инокуля- ции и далее ежедневно в течение всего срока эксперимента. Конеч- ные концентрации препарата составили 300 и 100 мг/кг веса.

В качестве препарата сравнения использовали Цисплатин - противоопухолевый препарат, применяемый в практике онкологи- ческой терапии человека. Цисплатин вводили однократно на 2 су- тки после перевивки опухоли, учитывая его высокую токсичность. Конечная концентрация Цисплатина составила 5 мг/кг веса.

Эксперименты проводились на белых беспородных мышах средним весом 20±3 г (животноводческая ферма Рапполово, Лен. область).

Клетки карциномы Эрлиха были получены из музея клеточ- ных линий НИИ онкологии и культивированы в брюшной полости белых мышей. Для этого 0,2 мл клеточной суспензии вводили жи- вотным внутрибрюшинно. Через 7-10 дней после инокуляции жи- вотных умерщвляли, асцитную жидкость собирали через прокол брюшины, разводили физиологическим раствором в 10 раз и поме- щали на лед.

С целью моделирования солидной формы карциномы Эрлиха животным вводили подкожно в область правого бедра 0,2 мл кле- точной суспензии в течение 40 минут после сбора асцитной жидко- сти, помещенной на лед. В ходе опыта в течение 28 дней, дважды в неделю начиная с 8 суток после инокуляции, проводили измерение опухолевых узелков при помощи микрометра. Размер опухоли вы- числяли умножением половины длины узелка на квадрат ширины и выражали в мм ³ . Фиксировали также смертность животных в кон- трольных и опытных группах. На 29 день после перевивки живот- ных умерщвляли.

Для изучения влияния препаратов на асцитную форму опухо- ли животным вводили внутрибрюшинно 0,2 мл клеточной суспен- зии в течение не более чем 40 минут после сбора исходной асцит- ной жидкости. В ходе опыта проводили контроль веса мышей как показателя накопления асцитной жидкости в брюшной полости. Наблюдение за животными осуществляли в течение 16 дней. На 17 день после перевивки животных умерщвляли.

Данные по динамике роста опухоли и смертности животных с асцитной формой корциномы в контрольной и опытных группах представлены в таблице 12.

Как видно из приведенных результатов, инокуляция опухоле- вых клеток в брюшную полость животных вызывала быстрое нако- пление в полости асцитной жидкости. Использование лечебных препаратов имело выраженный терапевтический эффект и приводи- ло к торможению накопления асцита.

Лечение животных предлагаемым препаратом и препаратом сравнения - Цисплатином - приводило к существенному торможе- нию динамики увеличения веса животных. На поздних стадиях раз- вития процесса эти различия достигали статистически значимых величин.

Влияние препарата на процессы апоптоза в клетках среднего размера и гранулярности асцитной формы карциномы Эрлиха у бе- лых мышей приведены в таблицах 13 - 14.

Как следует из представленных результатов, лишь небольшая часть клеток в обеих опухолевых субпопуляциях находилась в ста- дии обратимого или необратимого апоптоза у контрольных живот- ных. Применение цисплатина приводило к резкому возрастанию доли клеток в ранней стадии апоцтоза среди иммунных клеток (табл. 13) и позднего апоптоза и некроза - среди опухолевых клеток (табл. 14).

Препарат N° 1 действовал на уровне Цисплатина: подобно препарату сравнения, он стимулировал ранний апоптоз в иммунных клетках и поздний апоптоз - в субпопуляции опухолевых клеток. Живых (AnV ^" 7AAD ^" ) клеток опухоли при воздействии препарата практически не оставалось. По уровню индукции некроза в клетках опухоли он даже превосходил Цисплатин (30,2 % против 26,6 % для Цисплатина). Механизм противоопухолевого действия препарата N2 1 , как и действия Цисплатина, заключался в индуцировании апоптотических процессов в опухолевых и иммунных клетках, со- ставляющих асцит. Процесс апоптоза шел избирательно и досто- верно быстрее в клетках опухоли, чем в нейтрофилах и лимфоци- тах, находящихся в асцитной жидкости.

Результаты цитофлюорометрического анализа позволяют го- ворить об избирательности действия препарата сравнения - Цис- платина - на клетки опухоли по сравнению с нормальными лейко- цитами, также присутствующими в составе асцитной жидкости. На одном и том же сроке после введения препарата нормальные клет- ки, составляющие фракцию среднего размера и гранулярности - нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты и др. - находились в стадии раннего апоптоза, а опухолевые клетки - позднего (необратимого) апоптоза или некроза.

Данные по динамике развития солидной опухоли под дейст- вием исследуемого препарата и препарата Цисплатин в сравнении с контрольной группой животных представлены в таблице 15.

Как видно из представленных результатов, все использован- ные препараты в той или иной степени тормозили рост опухоли на протяжении всего опыта. В целом, наиболее выраженным противо- опухолевым действием обладал Цисплатин. Достоверное ингибиро- вание роста опухоли отмечалось при его применении вплоть до 17 суток после перевивки.

В то же время обе серии препарата также проявляли дозоза- висимый антитуморогенный эффект. Достоверное снижение разме- ров опухоли и торможение ее роста отмечалось до 8 суток экспери- мента. В дальнейшем препараты также сдерживали рост опухоли на всех сроках исследования, хотя различия с контролем и не достига- ли статистической достоверности. В целом следует отметить препа- рат JNs 1 в дозе 100 мг/кг веса как наиболее близкий по эффективно- сти к Цисплатину практически на всех сроках эксперимента. Полученные результаты не позволяют рассматривать препа- рат j\ 1 как ведущий препарат для направленной терапии онколо- гической патологии. Однако на основании этих данных можно го- ворить о нем как о перспективном для дальнейшей разработки средстве комплексной терапии для совместного применения с дру- гими противоопухолевыми препаратами, в особенности при асцит- ных формах опухолей.

Фармацевтические готовые формы предлагаемого препарата могут применяться орально, парентерально (включая подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутриягодичные инъ- екции или вливания), путем ингаляционного распыления или рек- тально для терапии или профилактики вирусных инфекций таких, как ВИЧ, герпес, грипп различного происхождения, а также в каче- стве противоопухолевых препаратов для проведения комплексной терапии.

Соединения смешивают с обычными фармацевтическими но- сителями и эксципиентами и используют в форме таблеток, капсул, свечей, мазей, эмульсий, растворов, спреев. Следует отметить, что для приготовления растворов, спреев, а также мягких лекарствен- ных форм (мазей, свечей) соединения предварительно разводят в смеси ДМСО с водой.

Лечение инфекционных заболеваний путем воздействия фар- мацевтически приемлемых доз соединениями по формуле II осуще- ствляется одновременно на несколько вирусов (в случае микст- инфекций) и затрагивает различные стадии репликации вируса. По- казано, что лечение сопровождается снижением стрессового эффек- та на введение препарата, усилением антиоксидантной защиты ор- ганизма от инфекций, выведением из организма токсинов. Инток- сикация организма характерна для течения ряда вирусных инфек- ций и обуславливает тяжесть заболевания.

Возможны сочетания соединений формулы II с другими анти- вирусными агентами, иммуномодуляторами, противоинфекцион- ными агентами или вакцинами в различных комбинациях с любыми фармацевтическими составами, предназначенными для лечения.

Таблица 1

Исследование цитотоксичности предлагаемого препарата на модели лимфобластоидных клеток человека

Таблица 2

Исследование противовирусной активности препарата N° 1 на мо- дели клеток человека, инфицированных ВИЧ- 1

Таблица 3

Результаты изучения активности препарата N> 1 в отношении са гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl

Концен- Снижение (%) репродукции виру- трации са гриппа в культуре клеток препара- Внесение препарата MDCK по отношению к контролю тов в присутствии серий предлагаемо- (мкг/мл) го препарата

за 2 часа до инфици- 24,0 - 80,0 - 0

6,25 рования

одномоментно с ин- 54,0 - 21,0 фицированием

за 2 часа до инфици- 45,0 - 100 - 6,0

12,5 рования

одномоментно с ин- 78,0 -37,0 фицированием

за 2 часа до инфици- 40,0 - 100 - 43,0

25,0 рования

одномоментно с ин- 88,0 - 35,0 фицированием

за 2 часа до инфици- 47,0 - 77,0 - 69,0

50,0 рования

одномоментно с ин- 96,0 - 43,0 фицированием

за 2 часа до инфици- 72,0 - 88,0 - 66,0

100,0 рования

одномоментно с ин- 69,0 - 76,0 фицированием

Таблица 4

Результаты изучения активности препарата N° 1 в отношении виру- са гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl, средние показатели

Снижение (%) репродукции

Концентра- вируса гриппа в культуре кле- ции препа-

Внесение препарата ток MDCK по отношению к ратов

контролю в присутствии серий (мкг/мл)

предлагаемого препарата за 2 часа до инфи- 35,0

6,25 цирования

одномоментно с 38,0

инфицированием

за 2 часа до инфи- 50,0

12,5 цирования

одномоментно с 58,0

инфицированием

за 2 часа до инфи- 61,0

25,0 цирования

одномоментно с 62,0

инфицированием

за 2 часа до инфи- 64,0

50,0 цирования

одномоментно с 70,0

инфицированием

за 2 часа до инфи- 75,0

100,0 цирования

одномоментно с 73

инфицированием

Таблица 5

Эффективность фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты гидрат на модели гриппозной инфекции у мышей

Примечание: * - схема лечения: за 24 и 1 часа до заражения, далее через 24, 48, 72 и 96 часов после заражения

** Среднюю продолжительность жизни определяли по формуле f(d-\)/n, где f-количество мышей умерших

на день d (выжившие мыши включены в f и d в этом случае равно 16), η-количество мышей в группе

Таблица 6

Изменение веса животных, зараженных вирусом гриппа А/Аичи/2/69 и леченных препаратом 1

Таблица 7

Протективная активность фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты на модели экспериментальной леталь- ной гриппозной пневмонии, вызванной ремантадин- устойчивым вирусом гриппа A/Puerto Rico/8/34 (HlNl).

Продолжение табл. 7

Таблица 8

Протективная активность фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты на модели экспериментальной

летальной гриппозной пневмонии, вызванной вирусом гриппа A/swine/1976/31 (H1N1).

Продолжение табл. 8

Таблица 9

Протективная активность фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты на модели экспериментальной летальной гриппозной пневмонии, вызванной озельтамивир устойчивым вирусом гриппа А/Владивосток/02/09 (H1N1).

Продолжение табл. 9

Таблица 10

Инфекционная активность вирусов гриппа в ткани легких белых мышей в условиях применения химиопрепаратов.

Примечание: * - отличия от контроля достоверны при р<0,05

Таблица 1 1

Инфекционная активность вирусов гриппа в ткани легких белых мышей в условиях применения химиопрепаратов

Примечание: * - отличия от контроля достоверны при р<0,05

Таблица 12

Динамика веса животных с асцитной формой карциномы Эрлиха при лечении препаратами.

Примечание: * - отличия от контроля без препарата на соответствующем сроке достоверны при р<0,05 Таблица 13

Таблица 14

Влияние препаратов на процессы апоптоза в клетках крупного размера и гранулярности асцитной формы карциномы Эрлиха у белых мышей.

Таблица 15

Динамика размера солидной опухоли карциномы Эрлиха у белых мышей при лечении исследуемыми препаратами.

Примечание: * - отличия от контроля без препарата достоверны при р<0,05

5 Пример 9. Исследование хронической токсичности фуллерен-

(трис-аминокапроновой кислоты) гидрат на крысах при внутримы- шечном введении в течении 30 дней.

Эксперимент проводился в ФГУН «Научно- исследовательском центре токсикологии и гигиенической регла- ю ментации биопрепаратов» (ФГУН НИЦ ТБП ФМБА России), г.

Серпухов.

Целью исследования явилась экспериментальная оценка уровня и характера возможного повреждающего действия фулле- рен-(трис-аминокапроновой кислота) гидрат на организм крыс при 15 внутримышечном введении в течении 30 дней.

Опыты проводили на крысах линии Вистар, приобретенных в питомнике ГУ НЦБТ РАМН (филиал «Столбовая»). Содержание животных соответствовало санитарным правилам, утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., по устройству, оборудованию содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Кормили жи- вотных натуральными и брикетированными кормами в соответст- вии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР N° 755 от 12.08.77 г. Животные прошли карантин и акклиматизацию в усло- виях вивария в течение 5 дней.

Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего пока- зателя.

Исследуемую субстанцию вводили крысам внутримышечно ежедневно в течение 30 дней в дозах 3, 9 или 20 мг/кг в виде рас- творов различных концентраций в 20 % растворе диметилсульфок- сида (ДМСО). Животным контрольных групп вводили 20 % раствор ДМСО. Рабочие растворы субстанции и ДМСО готовили ежедневно непосредственно перед применением. Вводимые объемы доз кор- ректировали с учетом индивидуальной массы тела животного после каждого взвешивания. Каждая доза испытана на 20 животных (10 самок и 10 самцов).

Для оценки токсического действия фуллерен-(трис- аминокапроновая кислота) гидрата, через 24 часа после окончания курса введения субстанции, половину животных из каждой группы вывели из эксперимента для проведения гематологических, биохи- мических и патоморфологических исследований. Вторую половину опытных животных вывели из эксперимента после периода отмены введения субстанции и провели аналогичные исследования.

В период введения субстанции и в течение 14 дней после ее отмены ежедневно оценивали общее состояние и клинические сим- птомы интоксикации животных. Общее состояние животных оце- нивали по их двигательной активности, потреблению корма и воды, состоянию шерсти и видимых слизистых оболочек, массе тела.

Гематологический анализ проводили с помощью полуавтома- тического двухканального кондуктометрического счетчика клеток Hema-screen 13 (Hospitex Diagnostics, Италия), а также с помощью световой микроскопии.

Биохимические показатели сыворотки крови определяли с помощью полуавтоматического анализатора «Stat Fax 3300».

Биохимические показатели мочи определяли с помощью по- луавтоматического анализатора «Urisys 1 100».

Морфологическое состояние внутренних органов животных определяли визуально при патологоанатомическом вскрытии и микроскопическим изучением гистологических препаратов (пара- финовые срезы 4-5 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином).

Статистическую обработку полученных результатов исследо- ваний проводили методами вариационной статистики по критерию Стьюдента.

1. Результаты исследований.

1.1. Результаты клинического наблюдения.

Крысам ежедневно в течение месяца внутримышечно вводили фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат в дозах 3, 9 или 20 мг/кг. На всех дозах клинические симптомы отравления отсутст- вовали, общее состояние животных опытных и контрольных групп не различалось. Прирост массы тела крыс в течение всего опыта в экспериментальных группах достоверно не отличался от контроля (табл. 16). Таблица 16

Масса тела крыс в период введения и отмены фуллерен-(трис- аминокапроновая кислота) гидрата

1.2. Результаты биохимического анализа сыворотки крови

По окончании введения фуллерен-(трис-аминокапроновая ки- слота) гидрата у самцов крыс показано достоверное снижение уровня мочевины на максимальной испытанной дозе (табл. 17). По- казанные изменения концентрации холестерина на минимальной и средней дозе не связаны с действием исследуемой субстанции и не выходят за пределы физиологической нормы. У самок крыс показа- но незначительное, но достоверное повышение активности алани- наминотрансферазы на максимальной испытанной дозе. Выявлен- ные изменения уровня глюкозы на минимальной дозе, концентра- ции общего белка и холестерина на средней дозе субстанции не имеют дозовой зависимости и не выходят за пределы физиологиче- ской нормы.

Таблица 17

Биохимические показатели сыворотки крови крыс по оконча- нии введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата фуллерен-(трис-аминокапроновой ки-

Параметр, Контроль

слота) гидрат, мг/кг

ед. измерения (ДМСО)

3 9 20

Самцы (М ± т)

1 2 3 4 5

Общий белок,

95,6±9,59 86,88±5,28 102,1±34,65 82,08±9,28 г/л

Глюкоза,

6,28±0,29 6,88±0,73 6,4±1,02 7,0±1,26 ммоль/л

Мочевина,

12,94±1 ,77 10,66±2,89 1 1,36±2,71 9,22±1,56* ммоль/л

Холестерин,

5,42±0,71 4,17±0,68* 3,88±0,75* 4,96±1 ,03 ммоль/л

Билирубин,

8,96±2,84 9,98±1 ,67 9, 16±1,4 8,76±1 ,54 мкмоль/л

Креатинин,

75,36±8,81 85,58±17,46 82,06±21 ,99 75,6±15,51 мкмоль/л

АлАТ, Е/л 15,52±3,17 17,12±1 ,2 14,62±4,22 14,04±3,01

АсАТ, Е/л 28,56±5,94 25,18±3,95 29,34±3,8 24,44±5,48

Щелочная

фосфотаза, 343±89 33 ^' 3±48 300±56 283±67

Е/л

Самки (М ± т)

Общий белок,

79,0±7,18 81,64±1 1,03 68,94±2,97* 83,16±1 1 ,75 г/л

Глюкоза,

5,64±0,72 7,64±1 ,56* 6,36±0,67 6,46±0,51 ммоль/л

Мочевина,

9,88±1 ,8 8,0±4,04 10,02±1 ,46 9,48±1,86 ммоль/л

Холестерин,

3,66±0,34 4,1 1 ±0,45 4,42±0,56* 4,16±0,88 ммоль/л

Билирубин,

7,52±2,86 10,96±2,14 9,46±2,26 7,18±0,95 мкмоль/л Продолжение табл. 17

Примечание: «*» - статистически достоверно по t-критерию Стьюдента

Достоверное снижение концентрации креатинина на макси- мальной испытанной дозе показано по окончании периода отмены фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата у самцов и са- мок крыс. На этой же дозе показано изменение активности аспарта- таминотрансферазы и у самцов и у самок крыс, однако, в случае самцов - это снижение активности, а у самок - повышение активно- сти (табл. 18).

Таблица 18

Биохимические показатели сыворотки крови крыс после от- мены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата фуллерен-(трис-аминокапроновой ки-

Параметр, Контроль

слота) гидрат, мг/кг

ед. измере- (ДМСО)

3 9 20 ния

Самцы (М ± т)

1 2 3 4 5

Общий бе-

70,08±7,1 1 67,20±7,60 68,06±7,27 66,58±2,67 лок, г/л

Глюкоза,

6,04±0,56 6,54±1,03 7, 18±0,80* 6,40±0,93 ммоль/л

Мочевина,

7,52±0,74 7,96±1,05 7,14±1 ,59 8,52±0,99 ммоль/л

Холестерин,

4,70±0,88 4,06±0,25 4,25±0,72 4,57±0,54 ммоль/л

Билирубин,

15,72±7,74 20,32±5, 19 16,06±2,72 17,30±2,1 1 мкмоль/л Продолжение табл. 18

Примечание: «*» - статистически достоверно по t-критерию Стьюдента

Оценивая результаты анализа биохимических показателей сыворотки крови крыс, в период введения субстанции и после пе- риода отмены введения, следует отметить, что величины вышеопи- санных изменений показателей сыворотки крови у самок и самцов крыс не выходят за пределы физиологического диапазона для вида животных.

1.3. Результаты гематологического анализа крови

По окончании введения фуллерен-(трис-аминокапроновая ки- слота) гидрата не выявлены изменения гематологических показате- лей, связанные с исследуемой субстанцией. Так у самок крыс уста- новлено незначительное снижение среднего объема эритроцита на средней дозе и некоторое увеличение доли ретикулоцитов на мини- мальной дозе (табл. 19). Данные изменения не выходят за границы физиологической нормы и не имеют дозовой зависимости.

Таблица 19

Гематологические показатели крови крыс по окончании вве- дения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата

фуллерен-(трис-аминокапроновой

Контроль

Параметр, кислота) гидрат, мг/кг

(Д СО)

ед. измерения 3 9 20

Самцы (М ± т)

1 2 3 4 5

Гемоглобин,

8,4±0,8 7,8±0,3 8,1±1 ,6 8,0±1 ,0 моль/дм ³

Эритроциты,

5,7±1 ,0 6,0±0,6 6,0±0,9 6,3±0,7 млн/мм ³

Гематокрит, % 32,3±7,1 35,4±3,4 35,0±5,3 35,3±4,3

Ср. объем эритр.,

57,0±5,1 59,0±2,7 58,2±4,5 55,6±1,5 мкм ³

Ретикулоциты, % 3,8±0,8 4,0±0,6 3,8±0,9 4,4±0,8

Тромбоциты, 692,6±98, 699,8±181, 766,2±85,

692,6±93,7

тыс. 2 2 1

Лейкоциты,

22,9±4,1 22,8±1 ,5 24,6±5,2 23,3±3,8 тыс/мм ³ , в т.ч.:

Базофилы, % 0 0 0 0

Эозинофилы, % 0,8±1,1 0,8±1 Д 1 ,0±1,2 0,8±1 ,1

Юные, % 0 0 0 0

Палочкоядерные,

1 ,6±1 ,7 1 ,6±0,9 1 ,0±1 ,2 1 ,2±1 , 1 %

Сегментоядер-

24,4±3,6 28,4±7,8 21 ,5±4,4 24,4±3,8 ные, %

Лимфоциты, % 67,6±5,0 64,8±5,8 71,0±2,6 68,0±5,1

Моноциты, % 5,6±2,2 4,8±2,3 5,5±1,9 5,6±0,9

Самки (М ± т)

Гемоглобин,

8,0±0,2 7,7±0,6 7,8±0,9 8,1±1 ,0 моль/дм ³ П одолжение табл. 19

Примечание: «*» - статистически достоверно по t-критерию Стьюдента

Изучение гематологических показателей крыс по окончании периода отмены фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата не выявило достоверных отличий между контрольными и опытны- ми животными (табл. 20).

Таблица 20

Гематологические показатели крови крыс после отмены вве- дения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата

фуллерен-(трис-аминокапроновой

Контроль

Параметр, кислота) гидрат, мг/кг

(ДМСО)

ед. измерения 3 9 20

Самцы (М ± т)

1 2 3 4 5

Гемоглобин,

7,9±0,7 8,3±3,7 7,9±0,3 7,4±0,8 моль/дм ³

Эритроциты,

6,3±0,6 6,5±1 ,2 6,4±0,5 6,3±0,8 млн/мм ³

Гематокрит, % 33,0±2,6 33,7±1 ,7 34,1±2,1 31,2±3,5

Ср. объем эритр.,

52,8±2,5 52,0±1 ,6 53,4±4,6 50,4±1,5 мкм ³

Ретикулоциты, % 4,0±0,6 4,3±1 Д 4,0±0,3 4,2±0,5

Тромбоциты, тыс. 496,6±48,9 445,6±55,8 479,8±43,8 447,0±86,9

Лейкоциты,

22,5±3,6 22,0±6,8 19,6±2,5 24,8±6,2 тыс/мм ³ , в т.ч.:

Базофилы, % 0 0 0 0

Эозинофилы, % 0,8±1 , 1 0,8±1 ,1 0,8±1 ,1 0,8±1 , 1

Юные, % 0 0 0 0

Палочкоядерные,

1 ,6±1,7 1,6±0,9 1 ,6±1 ,7 1 ,2±1,1 %

Сегментоядерные,

24,4±3,6 28,4±7,8 21 ,6±3,8 24,4±3,8 %

Лимфоциты, % 67,6±5,0 64,8±5,8 71 ,0±2,2 68,0±5,1

Моноциты, % 5,6±2,2 4,8±2,3 5,0±2,0 5,6±0,9

Самки 1 ;м ± т)

Гемоглобин,

8,1±0,6 7,7±0,7 8,2±0,3 8,5±0,6 моль/дм ³

Эритроциты,

5,9±0,7 5,8±0,3 6,3±0,5 6,4±0,6 млн/мм ³

Гематокрит, % 31 ,7±3,8 32,3±3,2 32,9±2,0 32,9±2,2

Ср. объем эритр.,

54,4±ί,7 55,2±4,6 52,4±1,5 52,2±3,4 мкм ³

Ретикулоциты, % 4,6±0,6 4,4±0,5 4,3±0,5 4,5±0,4

Тромбоциты, тыс. 459,8±86,0 462,4±95, 1 453,0±67,3 470,8±34,8 П одолжение табл. 20

1.4. Результаты анализа мочи

По окончании периода введения фуллерен-(трис- аминокапроновая кислота) гидрата выявлено повышение рН мочи в группе самцов на дозе 9 мг/кг (табл: 21). Уровень изменившегося показателя не выходит за рамки физиологической нормы, дозовая зависимость отсутствует.

После периода отмены введения фуллерен-(трис- аминокапроновая кислота) гидрата в группе самок на дозе 20,0 мг/кг отмечено понижение относительной плотности мочи в срав- нении с контрольной группой животных. В группах самцов в этот же период наблюдаются статистически достоверные изменения в сравнении с контрольной группой: при дозе 3,0 мг/кг - повышение показателя рН, при дозе 9,0 мг/кг - повышение относительной плотности мочи. Оба показателя не выходят за границы физиологи- ческой нормы и не имеют дозовой зависимости (табл. 22). Таблица 21

Показатели мочи крыс по окончании введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата

Примечание: «*» - статистически достоверно по t-критерию Стьюдента

Таблица 22

Показатели мочи крыс после отмены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата

Примечание: «*» - статистически достоверно по t-критерию Стьюдента

1.5. Результаты патоморфологического исследования

При патологоанатомическом вскрытии, проведенном после окончания периода внутримышечного введения фуллерен-(трис- аминокапроновая кислота) гидрата при внешнем осмотре и иссле- довании не было установлено различий между крысами подопыт- ных и контрольных групп: шерстяной покров был гладкий, блестя- щий, кожа эластичная, подвижная, подкожная клетчатка умеренно выражена, видимые слизистые оболочки бледные, чистые, без изъ- язвлений и посторонних наложений, патологические выделения из естественных отверстий тела отсутствовали. При вскрытии грудной и брюшной полостей отмечалось анатомически правильное распо- ложение внутренних органов. Макроскопически различимых при- знаков патологии внутренних органов не установлено. При рассе- чении скелетных мышц заднебедренной группы (место введения) у животных, получавших фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат во всех испытанных дозах, отмечали коричневатую окраску мышечной ткани, фасций и жировых прослоек. У животных кон- трольной группы такой окраски указанных тканей не было обнару- жено.

При анализе массовых коэффициентов внутренних органов животных после периода внутримышечного введения фуллерен- (трис-аминокапроновая кислота) гидрата не было установлено раз- личий между крысами подопытных и контрольной групп (табл. 23). Таблица 23

Массовые коэффициенты внутренних органов крыс после пе- риода внутримышечного введения фуллерен-(трис- аминокапроновая кислота) гидрата

При микроскопическом исследовании проводили сравнитель- ную оценку гистопатологической картины органов и тканей живот- ных, получавших фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат в максимальной дозе, и крыс контрольной группы. При анализе в обеих группах были выявлены отдельные патологические измене- ния, которые обнаруживали в основном в легких, печени и почках (табл. 24). Степень обнаруженных изменений незначительно варьи- ровала внутри групп, но в основном соответствовала слабой либо умеренной. Учитывая отсутствие какой-либо альтернативной или пролиферативной реакции в участках обнаруженных изменений в органах, а также большое количество случаев острого полнокровия кровеносных сосудов в них, наиболее вероятной причиной их появ- ления является индивидуальная реакция животных на общую ане- стезию и ингаляцию углекислого газа при эвтаназии. Основываясь на примерно одинаковой частоте встречаемости установленных па- тологических изменений в подопытной и контрольной группах, можно сделать вывод об отсутствии их индуцирования исследуемой субстанцией. В связи с этим, указанные изменения рассматривались нами как фоновые.

В месте введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата - скелетной мышце - были обнаружены изменения как вос- палительного характера (небольшие очаги кровоизлияний, очаги сдавленных и отечных мышечных волокон, инфильтрация лимфо- идными клетками пространства между отдельными мышечными волокнами и пучками волокон), так и регенеративного (участки рыхлой или плотной соединительной ткани с вновь образованными сосудами). Данные изменения оказались присущи и контрольной группе крыс. Описанная картина характерна для многократной по- вторяющейся травмы в результате внутримышечных инъекций, в данном исследовании - не зависимо от введенного вещества.

Таблица 24

Результаты микроскопического анализа морфологических изменений в органах и тканях крыс после 30

При патологоанатомическом вскрытии после периода отмены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата при внешнем осмотре и исследовании не было выявлено различий меж- ду крысами подопытных и контрольных групп. Коричневого окра- шивания тканей в месте предыдущих инъекций фуллерен-(трис- аминокапроновая кислота) гидрата не обнаружено. При статистиче- ском анализе массовых коэффициентов органов не было установле- но значимых различий между подопытными и контрольными жи- вотными (табл. 25).

Таблица 25

Массовые коэффициенты внутренних органов крыс после пе- риода отмены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата

При микроскопическом исследовании гистологических пре- паратов органов обнаруженные изменения по характеру и степени выраженности в основном соответствовали описанным после курса введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата, и также, примерно в одинаковой степени, были присущи животным подопытных и контрольной групп (табл. 26). Поэтому и в данном случае был сделан вывод об отсутствии индуцирования выявлен- ных изменений исследуемой субстанцией.

В месте введения исследуемого и контрольного веществ - скелетной мышце - установлены однотипные для подопытных и контрольных животных изменения: немногочисленные тонкие вы- тянутые участки полностью сформированной плотной волокнистой соединительной ткани, расположенные либо вдоль мышечных во- локон, либо - под острым углом к ним. Такая морфологическая кар- тина свидетельствует об отсутствии различий в скорости и характе- ре процесса заживления в местах инъекций растворителя и фулле- рен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата.

Таким образом, в результате проведенного патологоанатоми- ческого исследования морфологических признаков, связанных с воздействием или отменой фуллерен-(трис-аминокапроновая ки- слота) гидрата, не установлено.

Таблица 26

Результаты микроскопического анализа морфологических изменений в органах и тканях крыс после периода отме- ны введения лле ен-т ис-аминокап оновая кислота гид ата

Заключение. На протяжении всего периода введения фулле- рен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата крысам и периода от- мены введения субстанции не было отмечено признаков изменения клинического состояния животных. Введение фуллерен-(трис- аминокапроновая кислота) гидрата не сказывалось на поведении, состоянии шерстяного покрова, видимых слизистых оболочек и приросте массы тела подопытных животных.

Длительное в течение 1 месяца внутримышечное введение фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата крысам не ока- зывало влияния на показатели периферической крови. Отмена вве- дения исследуемой субстанции также не вызывала изменений пока- зателей крови.

По окончании введения фуллерен-(трис-аминокапроновая ки- слота) гидрата у самцов крыс показано достоверное в пределах фи- зиологической нормы снижение уровня мочевины на максимальной испытанной дозе (20 мг/кг), а у самок крыс показано незначитель- ное, но достоверное повышение активности аланинаминотрансфе- разы. Снижение концентрации креатинина на максимальной испы- танной дозе показано по окончании периода отмены исследуемой субстанции у самцов и самок крыс.

При анализе результатов исследования мочи крыс после пе- риода отмены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата в группе самок на дозе 20 мг/кг отмечено понижение отно- сительной плотности мочи в сравнении с контрольной группой жи- ВОТНЫХ.

В результате проведенного патологоанатомического исследо- вания не установлено признаков повреждающего действия фулле- рен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата на организм крыс по- еле одного месяца внутримышечного введения в дозах 20 мг/кг массы тела.

Таким образом, в результате проведенного исследования не установлено существенных признаков повреждающего действия фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата на организм крыс как после 30 дней внутримышечного введения в дозах до 20 мг/кг тела, так и по окончании периода отмены.

Пример 10. Исследование острой токсичности фуллерен- (трис-аминокапроновой кислоты) гидрат на лабораторных живот- ных при однократном внутримышечном введении.

Эксперимент проводился в ФГУН «Научно- исследовательском центре токсикологии и гигиенической регла- ментации биопрепаратов» (ФГУН НИЦ ТБП ФМБА России), г. Серпухов.

В задачи исследования входило определение переносимых и токсических доз, а также изучение характера возможного повреж- дающего действия на организм лабораторных животных субстан- ции при однократном внутримышечном введении.

Опыты проводили на белых беспородных мышах и крысах линии Вистар из питомника ГУ НЦБМТ РАМН. Содержание жи- вотных соответствовало санитарным правилам, утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., по устройству, оборудованию и содержанию экс- периментально-биологических клиник (вивариев). Кормили живот- ных ad libitum экструдированным комбикормом ПК- 120-1, приго- товленным по ГОСТ Р 50258-92. Животные прошли карантин и акклиматизацию в условиях вивария в течение не менее 10 дней. Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего пока- зателя.

Растворы тестируемого вещества в 20 % водном растворе ДМСО для введения животным готовили в асептических условиях ex tempora. Растворы фасовали в соответствующие промаркирован- ные флаконы и до введения хранили при температуре 2-6 °С не бо- лее 2 часов.

Субстанцию вводили мышам и крысам внутримышечно в до- зах 5, 50 и 500 мг/кг. Максимальные испытанные дозы лимитирова- ны максимально допустимыми объемами внутримышечного введе- ния для мышей и крыс. Животным контрольных групп вводили 20 % водный раствор в таком же объеме, как и максимальные дозы субстанции.

Вводимые объемы корректировали с учетом индивидуальной массы тела животного.

В период наблюдения (в течение 14 дней после введения) оценивали общее состояние животных по их двигательной активно- сти, потреблению корма и воды, состоянию шерсти и слизистых оболочек, массе тела.

После окончания периода наблюдения проводили патолого- анатомическое вскрытие мышей и крыс, получавших субстанцию в дозе 500 мг/кг и контрольное вещество (растворитель). Умерщвле- ние животных производили ингаляцией углекислого газа. Патоло- гоанатомическое исследование осуществляли в течение 1 часа по- сле эвтаназии животных. Морфологическое состояние внутренних органов животных определяли визуально при вскрытии. Статистическую обработку полученных результатов исследо- ваний проводили методами вариационной статистики по критерию Стьюдента.

Результаты исследований. На всех испытанных дозах клини- ческие симптомы отравления животных отсутствовали. В период наблюдения гибели не было, общее состояние животных опытных и контрольных групп не различалось. Животные охотно поедали корм, равномерно прибавляли в весе; статистически достоверных различий среднегрупповых значений массы тела животных под- опытных групп относительно контрольных групп не выявлено (табл. 27, 28).

Таблица 27

Масса тела мышей

Установлено, что ЛД ₅₀ субстанции при внутримышечном вве- дении для мышей и крыс обоего пола превышает максимальную испытанную дозу - 500 мг/кг. Таблица 28

Масса тела крыс

Патологоанатомическое вскрытие мышей и крыс проводили через 14 дней после однократного внутримышечного введения суб- станции. Поскольку ни в одной из групп животных, независимо от введенной дозы вещества, за период наблюдения гибели не было, некропсии подвергали только мышей и крыс, получивших субстан- цию в максимальной дозе 500 мг/кг, а также животных контроль- ных групп. Умерщвление животных производили ингаляцией угле- кислого газа.

При внешнем осмотре мышей и крыс в подопытных и кон- трольных группах отмечали общую картину: шерстяной покров был гладкий, блестящий; кожа эластичная, подвижная, подкожная клет- чатка умеренно выражена, видимые слизистые оболочки бледные, без изъязвлений и посторонних наложений, патологические выде- ления из естественных отверстий тела отсутствовали.

При патологоанатомическом вскрытии также не установлено различий между мышами и крысами всех подопытных и контроль- ных групп. Органы грудной и брюшной полостей имели анатомиче- ски правильное расположение и нормальную макроструктуру; ка- ких-либо патологических изменений обнаружено не было. В месте введения субстанции - мышца бедра - признаков повреждения не обнаружено.

Таким образом, в результате проведенного патоморфологиче- ского исследования не установлено признаков повреждающего дей- ствия субстанции при однократном внутримышечном введении мышам и крысам в дозах до 500 мг/кг.

Заключение. Установлено, что все испытанные дозы субстан- ции не вызывали интоксикации и гибели подопытных животных. Значения ЛД ₅ о фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата для мышей и крыс превышают максимальную испытанную дозу - 500 мг/кг и, таким образом, превышают максимальную разовую те- рапевтическую для человека дозу (2,9 мг/кг) более чем в 170 раз. Различий видовой и половой чувствительности к субстанции в до- зах до 170-кратных эквитерапевтических не установлено. Субстан- ция не обладает местным раздражающим действием при однократ- ном внутримышечном введении.

Таким образом, фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат имеет высокий терапевтический индекс и не может вызы- вать острые отравления при случайной передозировке.